CS238261B1

CS238261B1 - Enzymatic reactions execution and tracing method and device for application of this method

Info

Publication number: CS238261B1
Application number: CS835655A
Authority: CS
Inventors: Jiri Cerkasov; Vaclav Linek
Original assignee: Jiri Cerkasov; Vaclav Linek
Priority date: 1983-07-28
Filing date: 1983-07-28
Publication date: 1985-11-13
Also published as: DE3427444C2; FR2549852A1; GB8419285D0; ATA243484A; CA1218289A; GB2145815B; JPS6091996A; IT8422105A0; GB2145815A; IT1205647B; FR2549852B3; DE3427444A1; AT389317B

Abstract

Enzymatic material is immobilized on the surface of an exchangeable stirrer, e.g. magnetic or mechanical, or on the surface of another easily removable immovable part installed in the reactor either directly or by means of a cloth fixed in a suitable way on to the stirrer or on to the easily removable object in an amount sufficient to keep the concentration of the determined substance on the surface of the enzymatic layer on a value equal or close to zero, in course of many measurements.

Description

Vynález se týká způsobu provádění a sledování enzymatických reakcí za použití immobilizováných enzymů a dále zařízení к provádění způsobu.The invention relates to a method for carrying out and monitoring enzymatic reactions using immobilized enzymes, and to apparatus for carrying out the method.

Kvantitativní stanovení koncentrace substrátů je založeno na experimentálním určení kalibrační křivky, přičemž je účelné, aby kalibrace byla lineární a neměnila se v čase. Používají se kalibrační metody kinetické a ustálené. Kinetické metody užívají ke kalibraci nějaký parametr charakterizující rychlost změny sledované veličiny, která je v reakční směsi monitorována po přidání vzorku. Používá se například počáteční hodnota směrnice závislosti sledované veličiny na čase, za který sledovaná veličina dosáhne po přidání vzorku určité předem zvolené hodnoty, nebo hodnota veličiny, kterou dosáhne po určitém předem zvoleném čase od přidání vzorku. Při metodách ustálených je kalibrační závislost určována z ustálené hodnoty sledované veličiny, dosažené v reakční směsi po přidání vzorku. Kinetické metody kalibrace jsou výhodné, protože umožňují rychlé stanovení příslušného substrátu. Jejich nevýhodou je, že rychlost sledované změny může záviset na kinetice vlastní enzymatické reakce, která se může značně měnit s klesající aktivitou enzymu.Quantitative determination of substrate concentration is based on experimental determination of the calibration curve, it being expedient for the calibration to be linear and not change over time. Kinetic and steady state calibration methods are used. Kinetic methods use some parameter to calibrate the rate of change of the monitored quantity, which is monitored in the reaction mixture after the sample is added. For example, the initial value of the slope of the observed quantity versus the time that the monitored value reaches a certain preselected value after the sample is added is used, or the value of the quantity it reaches after a certain preselected time since the sample is added. In the steady-state methods, the calibration dependence is determined from the steady-state value of the measured quantity reached in the reaction mixture after the addition of the sample. Kinetic calibration methods are advantageous because they allow rapid determination of the respective substrate. Their disadvantage is that the rate of change observed may depend on the kinetics of the enzymatic reaction itself, which may vary considerably with decreasing enzyme activity.

Nejčastěji se používají dva způsoby dávkování enzymu do reakční nádoby a to tak, že se enzym nebo enzymy rozpuštěné nebo rozsuspendované ve vhodném pufru nadávkují do meclia sestávajícího z pufru a kofaktorů. poté se přidá zkoumaný vzorek, glukóza, krev, plasma a podobně a pomocí čidla se registruje průběh enzymatické reakce, například: úbytek kyslíku v reakční nádobce kyslíkovou elektrodou. Porovnáním в kalibrační křivkou se pak stanoví koncentrace látky ve vzorku, při tomto způsobu dávkování je enzymMost commonly, two methods of dosing an enzyme into a reaction vessel are used by dispensing the enzyme or enzymes dissolved or suspended in a suitable buffer into a meclia consisting of a buffer and cofactors. the sample to be examined, glucose, blood, plasma and the like are then added and the course of an enzymatic reaction is registered by means of a sensor, for example: oxygen depletion in the reaction vessel by an oxygen electrode. By comparing in the calibration curve, the concentration of the substance in the sample is determined

- 2 238 261 homogenně rozptýlen v reakčním mediu. Po skončení reakce je s rea^kčním méd:iem odstraněn i enzym. Pro taždé další s^tanovení je třeba použít novou dávku enzymu. Hlavní nevýhodou tohoto způsobu spočívá ve vysoké spotřebě drahých enzymů, které se nevratně spotřebují po jednom, použití.- 2 238 261 homogeneously dispersed in the reaction medium. After the reaction is rea ^CZK him honey: IEM removed and the enzyme. A new batch of enzyme should be used for each additional assay. The main disadvantage of this method is the high consumption of expensive enzymes, which are irreversibly consumed after one use.

Podle druhého způsobu se enzym nebo enzymy immobilizují na vnějším povrchu membrány pokrývající čidlo, nebo se na membránu pokrývající ^čidlo p^řiložyje^ště je^dna membrána ne^bo tkanina, na kterou je vhodným způsobem navázán enzym. Tím se vytvoří tzv. enzymová elektroda. Immobilizovaný enzym lze použít na . mnoho analýz. Hlavní nevýhodou enzymových elektrod je, že enzymatická reakce ovlivňuje koncentrační pole sledovaného produktu reakce nebo substrátu v bezprostřední blízkosti elektrochemického senzoru a tím se spoluúčastní na vytváření úrovně· signálu senzoru, neboř úroveň s^ign^álu senzoru je z^ávisl^á na kinetice trans^portu sledované látky vrstvou kotveného enzymu. Transport sledované složky takovou vrstvou a tedy i signál sondy je určen vnitřní difúzí ostatních reakce se účastnících látek ve vrstvě a rychlostí enzymatické reakce, která je dále závislá na koncentraci a aktivitě vázaného enzymu ve vrstvě. Proto závisí kalibrační vlastnosti enzymových elektrod jak na kinetických parametrech enzymatické re akce, tak i na parametrech charakterizujících difúzní transport jednotlivých složek v membránách pokrývajících senzor. Tyto . parametry se· mohou měnit způsobem přípravy sondy s kotveným enzymem, například s množstvím enzymu vázaného v jednotce objemu nosiče, s jeho- aktivitou, přitom se difuzivita složek nosičem mění nejen změnami množství vázaného enzymu, ale i stupněm zesítění nosiče. Během používání sondy klesá postupně aktivita enzymu. Uvedené jevy, které se rozhodující zpiiso^bem uplatňuj při vytvářeli úrovně signálu sondy se nedaří popsat jednoduchými rovnicemi a nehodí se proto pro automatické vyhodnocování signálu. Z uvedených skutečností vyplývají následující nevýhody dosavadních analyzátorů založených na využívání enzymových elektrod. Jde o obvykle složitou přípravu několikavrstevných membrán, neumožňující rychlou renovaci sond. Sondy obvykle nelze připravit do zásoby a uchovávat je za hlubokých teplot až do chvíle použití. Dále závislost úrovně signálu sondy na kinetice enzymatické reakce a na vnitřní diIn the second method, the enzyme or enzymes are immobilized on the outer surface of the membrane covering the sensor or the ^sensor membrane covering op ^R iložyje ^STE ^d ^b on the membrane not the cloth to which the bound enzyme in a suitable manner. This creates a so-called enzyme electrode. The immobilized enzyme can be used on. many analyzes. The main disadvantage of the enzyme electrode, the enzymatic reaction affects the concentration field of the reference reaction product or substrate in the vicinity of the electrochemical sensor, and thus has been implicated in the creation levels · a sensor signal, monoperoxycarbonate or level s ^ig n and ^l in the sensor is ^plated Vistula ^and on the kinetics of trans ^p of the monitored substance by a layer of anchored enzyme. The transport of the component of interest through such a layer and thus the probe signal is determined by the internal diffusion of the other reactions involved in the layer and the rate of the enzymatic reaction, which is further dependent on the concentration and activity of the bound enzyme in the layer. Therefore, the calibration properties of enzyme electrodes depend both on the kinetic parameters of the enzymatic reaction as well as on the parameters characterizing the diffuse transport of the individual components in the membranes covering the sensor. These. the parameters can be varied by the method of preparation of the anchored enzyme probe, for example, the amount of enzyme bound in a unit volume of the carrier and its activity, wherein the diffusivity of the components by the carrier varies not only by changing the amount of bound enzyme but also the degree of crosslinking. As the probe is used, the enzyme activity decreases gradually. Mentioned phenomena, which are crucial zpiiso ^b em apply when creating signal level probe fails to describe simple equations and is therefore unsuitable for automatic signal evaluation. The above disadvantages of the prior art analyzers based on the use of enzyme electrodes result from these facts. This is usually a complicated preparation of multi-layer membranes, which does not allow rapid probe renovation. Probes are usually not ready for storage and stored at low temperatures until use. Furthermore, the dependence of the signal level of the probe on the kinetics of the enzymatic reaction and on the internal di

238 261 fUzi všech reagujících složek ve vrstvě kotveného enzymu vyplývající z geometrie systému komplikuje měření i vyhodnocení.238 261 fUziation of all reactants in the anchored enzyme layer resulting from system geometry complicates both measurement and evaluation.

Vzhledem к tomu, že signál sondy je determinován difuzními pochody ve vrstvách těsně přiléhajících к elektrochemickému senzoru, je velmi citlivý na malé změny geometrie těchto vrstev, které jsou vyvolávány nepatrnými deformacemi pružných vrstev, například mechanickým dotekem, intenzívním mícháním, nárazem elektromagnetického míchadla na senzor a jinak. Dále existuje značná nestabilita signálu, nutnost časté rekalibrace a velmi složitý matematický popis chování enzymové elektrody. Při použití mikropočítače к vyhodnocení signálu sondy je potřebný složitý softvér a velký rozsah paměti.Since the probe signal is determined by diffusion processes in the layers closely adjacent to the electrochemical sensor, it is very sensitive to small changes in the geometry of these layers caused by slight deformations of the resilient layers, such as mechanical contact, vigorous agitation, otherwise. Furthermore, there is considerable signal instability, the need for frequent recalibration and a very complex mathematical description of the behavior of the enzyme electrode. When using a microcomputer to evaluate the probe signal, complex software and a large memory range are required.

Uvedené nedostatky odstraňuje podle vynálezu způsob provádění a sledování enzymatických reakcí za použití immobilizováných enzymů. Jeho podstata spočívá v tom, že se enzymatické reakce provádějí v reaktoru, přičemž enzymatický materiál se fixuje na povrchu míchadla nebo na povrchu jiné lehce vyjímatelné nepohyblivé součásti instalované uvnitř reaktoru, oddělené od senzoru měřícího zařízení, v množství postačujícím na udržení koncentrace stanovené látky na povrchu enzymové vrstvy v řadě měření na hodnotách mezi 0 a 5 %, vztaženo na koncentraci ve výchozím roztoku. Podle dalšího význaku vynálezu se do kapalné reakční směsi přidají látky zvyšující viskozitu, například karboxymethylceluloza nebo polyvinylalkohol. Podstata zařízení к provádění způsobu spočívá v tom, že sestává z reaktoru, opatřeného míchadlem, výhodně magnetickým, na jehož povrchu je fixována vazba enzymatického materiálu. Podle alternativního provedení sestává zařízení z reaktoru, uvnitř kterého jsou umístěny vyjímatelné nepohyblivé součásti, opatřené vrstvou fixovaného enzymatického materiálu.According to the invention, the above-mentioned drawbacks are overcome by a method for carrying out and monitoring enzymatic reactions using immobilized enzymes. Its essence is that the enzymatic reactions are carried out in a reactor, the enzymatic material being fixed on the surface of the stirrer or on the surface of another easily removable immovable component installed inside the reactor, separated from the sensor of the measuring device, in an amount sufficient to maintain the concentration of the substance enzyme layers in a series of measurements at values between 0 and 5%, based on the concentration in the starting solution. According to a further feature of the invention, viscosity enhancers such as carboxymethylcellulose or polyvinyl alcohol are added to the liquid reaction mixture. The principle of the apparatus for carrying out the process consists in that it consists of a reactor equipped with a stirrer, preferably magnetic, on the surface of which the binding of the enzymatic material is fixed. According to an alternative embodiment, the device consists of a reactor within which removable immovable components are provided, provided with a layer of fixed enzyme material.

Základní výhoda způsobu podle vynálezu spočívá v jeho širokém použití, jako stanovení glukózy v tělních tekutinách - krvi, seru nebo plasmě, moči, oxidací glukózy kyslíkem v přítomnosti enzymů glukozooxidázy a katalázy sledováním spotřeby kyslíku pomocí kyslíkové elektrody. Způsobu podle vynálezu ve spojení s kyslíkovou elektrodou lze použít pro kvantitativní stanovení i ji- 4 238 261 ných látek, například kyseliny mléčné, kyseliny močové, cholesterolu, 1-aminokyselin, d-amiňokyselin, alkoholu, galaktosy a.jiných substrátů ve spojení s příslušnou specifickou oxidasou. Způsobu podle vynálezu lze dále použít pro kvantitativní stanovení i těch látek, pro které příslušná oxidása není známa, například · pro stanovení sacharosy, maltosy nebo glykogenu, když se použije několika různých enzymů, jejichž následným působením se posléze vytvoří oxidovatelný substrát. Pro stanovení sacharosy se použije invertasa a glukosooxidáza, pro stanovení maltosy enzym maltasa a glukosooxidása, pro stanovení glykogenu enzymy amylasa, . maltasa a glukozooxidása. Způsob dle vynálezu ve spojení s jiným druhem čidla, například s pH elektrodou, lze použít ke kvantitativnímu stanovení neoxidovatelných substrátů. Navrženého způsobu lze s výhodou použít nejen pro účely analytické, ale i pro účely výrobní, například čištění roztoků léčiv nebo nápojů od nežádoucích· příměsí nebo produktů, všude tam, kde lze pomocí enzymů nebo enzymu vyvolat žádoucí přeměnu a pomocí změny některého fyzikálního parametru kontrolovat průběh nebo ukončení enzymatické reakce. Takovými fyzikálními parametry jsou například koncentrace kyslíku, peroxidu vodíku, vodíku, fluorescence, pH, vodivost, extinkce, barva a podobně.The main advantage of the method according to the invention lies in its wide application, such as the determination of glucose in body fluids - blood, serum or plasma, urine, by oxidation of glucose with oxygen in the presence of glucose oxidase and catalase enzymes by monitoring oxygen consumption by an oxygen electrode. The method of the invention in conjunction with an oxygen electrode can also be used to quantify other 4,238,261 substances, such as lactic acid, uric acid, cholesterol, 1-amino acids, d-amino acids, alcohol, galactose, and other substrates in conjunction with the corresponding specific oxidase. The method according to the invention can furthermore be used for the quantitative determination of those substances for which the respective oxidase is not known, for example for the determination of sucrose, maltose or glycogen when several different enzymes are used, which subsequently form an oxidizable substrate. Invertase and glucose oxidase are used for the determination of sucrose, maltase and glucose oxidase for the determination of maltose, amylase enzymes for the determination of glycogen,. maltase and glucose oxidase. The method of the invention in conjunction with another type of sensor, for example a pH electrode, can be used to quantify non-oxidizable substrates. The proposed method can advantageously be used not only for analytical but also for manufacturing purposes, for example purification of drug or beverage solutions from undesirable impurities or products, wherever the desired conversion can be induced by enzymes or enzymes and by changing some physical parameter or terminating the enzymatic reaction. Such physical parameters are, for example, oxygen concentration, hydrogen peroxide, hydrogen, fluorescence, pH, conductivity, extinction, color and the like.

Zařízení podle vynálezu má následující výhody. Těleso míchadla nebo předmět se zakotveným enzymem lze snadno vyjmout, vyměnit nebo obnovit, případně vyměnit vnější vrstvu se zakotveným enzymatickým materiálem, aniž bychom změnili charakteristiky sensoru použitého k sledování průběhu reakce. Míchadlo nebo předmět se zakotveným enzymem nebo folii s enzymatickým materiálem k upevnění na povrch míchadla nebo vyjímatelného předmětu lze připravit do zásoby a uchovávat beze změny aktivity po několik měsíců. Záměnou míchadla s enzymatickým materiálem immobilizováným.na jeho povrchu za .míchadlo s jiným enzymatickým materiálem ukotveným na jeho povrchu lze ve stejném reaktoru/ za pomoci stejného čidla analyzovat jiný substrát. V jediném vzorku, v tomtéž reaktoru s jediným čidlem, lze po.uhou záměnou míchadélka s příslušným immobilizovaným enzymem stanovit několik látek, například glukózu v plasmě krevní předmětem s immobilizovanou glukozooxidázou, výměnou za předmět s immobilizovanou laktátooxidázou kyselinuThe device according to the invention has the following advantages. The agitator body or anchored enzyme article can be easily removed, replaced or recovered, or replaced with an anchored enzyme material without altering the characteristics of the sensor used to monitor the progress of the reaction. An agitator or object with an embedded enzyme or foil of enzymatic material to be attached to the surface of the agitator or removable object can be stocked and kept unchanged for several months. By interchanging the agitator with the enzyme material immobilized on its surface with the agitator with another enzyme material anchored on its surface, another substrate can be analyzed in the same reactor / using the same sensor. In a single sample, in the same reactor with a single sensor, several substances, for example, glucose in plasma by a blood object with immobilized glucose oxidase, can be determined by swapping the stirrer with the respective immobilized enzyme, in exchange for an object with immobilized lactatooxidase acid.

- 5 238 261 mléčnou a výměnou za předmět s immobilizovanou urátooxidázou kyselinu močovou, aniž bychom měnili obsah reakční nádobky či senzor· Změnou otáček míchadla nebo změnou viskozity reakční směsi přídavkem látek ovlivňujících viskozitu, například karboxymethylcelulosy nebo polyvinylalkoholu, lze řídit míru vlivu vnější difúze na rychlost změny sledované veličiny a tím měnit kalibrační rozsah analyzátoru· ' Oblast řídící role vnější difúze substrátu k povrchu filmu enzymu je dosaženo, jestliže koncentrace substrátu- na povrchu ukotveného enzymu je udržována na hodnotě blížící se nule, v každém případě na hodnotě nižší než 5 % hodnoty původní koncentrace substrátu ve vzorku· Této oblasti lze dosáhnout různými postupy, například snížením otáček míchadla, čímž roste tlouštka kapalného filmu na povrchu vrstvy s enzymatickým materiálem, nebo zvýšením viskozity vzorku měřené kapaliny, čímž opět roste tloušíka kapalného filmu a navíc klesá difuzivita substrátu, anebo zvýšením aktivity immobilizováného enzymu. Pokud lze přístroj použít v oblasti řídící role vnější.difúze stanovené látky', má přístroj další níže uvedené přednosti: Jednoduchý matematický popis rychlosti změny sledované veličiny na čase, daný pro uzavřený reaktor exponenciální závislostí hodnoty sledované veličiny, například koncentrace kyslíku na čase· Tento charakter závislosti je stejný aí byl použit jakýkoliv enzym, tedy aí je sledována koncentrace jakéhokoliv substrátu. To lze s výhodou využít při mikropočítačovém zpracování signálu, nebot softvérové vybavení je jednoduché a shodné pro celou řadu přístrojů pro stanovení různých substrátů· Kalibrační závislost, založená na hodnotě počáteční rychlosti změny sledované veličiny, například rychlosti změny koncentrace kyslíku,je potom lineární, přitom/směrnice lineární závislosti nezávisí na aktivitě enzymu, pokud ovšem je koncentrace nebo aktivita enzymu dostatečně vysoká· Aktivita enzymu určuje pouze rozsah, ve kterém je kalibrační závislost lineární· S klesající aktivitou enzymu se snižuje rozsah linearity· Dlouhodobé stability kalibrace přístroje lze dosáhnout tím, že se použije vysoké koncentrace kotveného enzymu· Potom pokles aktivity se neprojeví na kalibraci, pokud je enzym schopen udržet koncentraci stanoveného substrátu na povrchu enzymové vrstvy na hodnotě blízké nule při horní mezi rozsahu přístroje · i· By changing the stirrer speed or changing the viscosity of the reaction mixture by adding viscosity-modifying agents such as carboxymethylcellulose or polyvinyl alcohol, the degree of external diffusion on the rate of external diffusion can be controlled The area of control of the external diffusion of the substrate to the surface of the enzyme film is achieved if the substrate concentration on the surface of the anchored enzyme is maintained at a value close to zero, in any case less than 5% of the value original substrate concentration in the sample · This area can be achieved by various methods, for example by reducing the stirrer speed, thereby increasing the thickness of the liquid film on the surface of the enzyme material layer, or by increasing the sample viscosity measured by the liquid. thus increasing the thickness of the liquid film and decreasing the diffusivity of the substrate or increasing the activity of the immobilized enzyme. If the device can be used in the area of control of the external diffusion of a given substance, the device has the following additional advantages: Simple mathematical description of the rate of change of the monitored quantity over time given to the closed reactor by exponential dependence of the value of the monitored quantity, dependence is the same and any enzyme used, i.e. the concentration of any substrate is monitored. This can be advantageously used in microcomputer signal processing, since the software is simple and identical for a variety of instruments for determining various substrates. • The calibration dependence based on the initial rate of change of the measured quantity, e.g. slope does not depend on the activity of the enzyme, provided the concentration or activity of the enzyme is sufficiently high · Enzyme activity only determines the extent to which the calibration dependence is linear · With decreasing enzyme activity the linearity range decreases · Long term instrument calibration stability can be achieved use a high concentration of anchored enzyme · Then the decrease in activity is not reflected in the calibration if the enzyme is able to maintain the concentration of the specified substrate on the surface of the enzyme layer at a value close to zero at the upper instrument range.

- 6 238 261- 6 238 261

Zvýšení viskosity roztoku nebo snížením otáček míchadla lze rozšířit lineární oblast kalibrace. Kalibrační závislost není citlivá na mechanické dotyky..Míchadlo nebo zmíněné'vyjímatelné součásti lze z reaktoru vyjmout a vzít do ruky a znovu je vložit do reaktoru aniž se kalibrace přístroje změní.By increasing the viscosity of the solution or by reducing the stirrer speed, the linear calibration area can be extended. The calibration dependence is not sensitive to mechanical contact. The stirrer or the removable components can be removed from the reactor and taken into hand and reinserted into the reactor without altering the calibration of the apparatus.

Vynález je dále blíže popsán na příkladu provedení a podle připojených výkresů, na nichž obr. 1 značí přístroj* k provádění způsobu ve schematickém znázornění a obr. 2 kalibrační křivku.The invention will now be described in more detail by way of example and with reference to the accompanying drawings in which: Figure 1 shows a schematic representation of the apparatus for carrying out the method; and Figure 2 shows a calibration curve.

Příklad ’Example '

Přístroj k provádění způsobu podle vynálezu znázorněný na obr. 1 sestává z temperačního pláště 1, kyslíkové sondy 2, jejíž senzor je od vzorku v reaktoru 2 oddělen membránou propustnou pro kyslík. Ve vnitřku temperačního pláště 1 je umístěno magnetické míchadlo £, na němž je upevněna folie 7 s immobilizovánými enzymy pomocí kroužku 8. Magnetické míchadlo £ je poháněno magnetem 6. Přímo na polyakrylamidový povrch magnetického míchadla £ anebo na ^fólii 7 z ^tého^ž ' materiálu, jak: je to znázorn^ěno na obr. 1, se immobilizuje některou známou metodou, například pomocí kyanurchloridu nebo karbodiimidu nebo sloučením enzymu s vhodnou inertní bílkovinou a glutaraldehydem, směs glukozooxidázy a katalázy v celkovém množství 20 mezinárodních jednotek. Do reaktoru £ hyl vnesen vzorek - roztok pufru s pH 6,6 obsahující glukózu, jejíž množství se má stanovit. V tabulce je v prvním sloupci počáteční směrnice závislosti signálu kyslíkové sondy 2 vlibovolných jednotkách, ve 2. ®soupci počáteční koncentrace glukózy v reakční směsi, v milimolech, a v 5. sloupci počet mikromolů základního roztoku. Z tabulky je zřejmé, že bylo dosaženo, značně rozsáhlé oblasti linearity kalibrační křivky v rozmezí 0 až 0,7407 mM počáteční koncentrace glukózy. Příslušná kalibrační křivka je na obr. 2.The apparatus for carrying out the process according to the invention shown in FIG. 1 consists of an annealing jacket 1, an oxygen probe 2, the sensor of which is separated from the sample in the reactor 2 by an oxygen permeable membrane. In the interior of a tempering jacket 1 is positioned a magnetic stirrer £, to which is fixed a film 7 using immobilized enzymes ring 8. The magnetic stirrer is driven magnet £ sixth surface directly on a polyacrylamide or a magnetic stirrer £ 7 on the ^film from ^that it ^{consist of} a material, as shown ⁱⁿ Fig. 1, immobilized by any known method, for example by cyanuric chloride or carbodiimide or by combining the enzyme with a suitable inert protein and glutaraldehyde, a mixture of glucose oxidase and catalase in a total of 20 international units. A sample - buffered solution of pH 6.6 containing glucose was to be introduced into the reactor. In the table, the first column of the initial oxygen probe signal dependence is 2 arbitrary units, in the 2nd column of the initial glucose concentration in the reaction mixture, in millimoles, and in the 5th column, the number of micromoles of the stock solution. It is apparent from the table that a very large linearity range of the calibration curve was achieved in the range of 0 to 0.7407 mM initial glucose concentration. The calibration curve is shown in Figure 2.

Enzymy byly fixovány na nylonové sítce velikosti ok 50 um na ploše vymezené kroužkem 8 o průměru 10 mm. Na tuto ’ plochu bylo naneseno cca 20 mezin. jednotek surové glukozooxidázy obsahující i katalázu. Příprava roztoku na fixaci glukozooxidázy na nylonovou sítku:Enzymes were fixed to nylon sieves with a mesh size of 50 µm on the area delimited by a ring 8 with a diameter of 10 mm. Approximately 20 interstices were applied to this area. units of crude glucose oxidase containing catalase. Preparation of solution for fixation of glucose oxidase on nylon strainer:

- 7 238 261- 7 238 261

100 ul směsi se připraví; 5 mg glukosooxidázy rozpuštěné v 50 ul vody, přidá se 50 ul 10% hovězího albuminu a 20 ml 2% glutaraldehydu v 0,5 M fosfátového pufru pH 6,6. Na sííku do kroužku 8 průměru ,10 mm se nanese 15 až 20 ul této směsi a nechá se uschnout.100 µl of the mixture is prepared; 5 mg of glucose oxidase dissolved in 50 µl of water, 50 µl of 10% bovine albumin and 20 ml of 2% glutaraldehyde in 0.5 M phosphate buffer pH 6.6 are added. Apply 15 to 20 µl of this mixture to a 8 mm diameter, 10 mm ring and allow to dry.

TabulkaTable

Počáteční směrnice závislosti kyslíkové sondyInitial slope of oxygen probe dependence

Počáteční koncentrace yil základního glukózy v reakční roztoku glukózy směsiInitial glucose concentration of the basic glucose in the glucose reaction solution of the mixture

0,4 0.4 0,0185 0.0185 1,25 ' 1,25 ' 1,0 1.0 0,0481 0,0481 3,25 3.25 1,6 1.6 0,0741 0,0741 5 5 2,4+ 2,4+ 0,1111 0,1111 7,5 7.5 3,2+ 3,2+ 0,1481 0.1481 10 10 i and 4,8 . 4.8. 0,222 0.222 15 15 Dec 6,4 6.4 0,2963 0.2963 20 20 May ’К ’К 8,5 8.5 0,3703 0.3703 25 25 XI XI 9,9 9.9 0,444 0.444 30 30 13,4 13.4 0,5926 0.5926 40 40 16,5+ 16,5+ 0,7407 0.7407 50 50 18,7 18.7 0,8888 0.8888 60 60 24,4 24.4 1,481 1,481 100 100 ALIGN!

+/ Opakovaná stanovení po 1 dnu.+/- Repeat determinations after 1 day.

Způsob podle vynálezu má všechny výhody dosavadních postupů, používajících homogenních roztoků enzymů, tedy rychlou odpověí senzoru a zároveň vý^ho^du ⁱmmo^bilⁱzace enz^ymu, te^{dy p}ře^devším malou jeho spotřebu.The method according to the invention has all the advantages of existing processes using homogeneous enzyme solution thus a quick response of the sensor while above ^h o ^d u ⁱ ⁱ il MMO ^b enz ^y sation him that ^dy ^d ^Pla evším small consumption thereof.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

238 261

Method for carrying out and monitoring enzymatic reactions using immobilized enzymes, characterized in that the enzymatic reaction is carried out in a reactor, wherein the enzymatic material is fixed on the surface of a stirrer or on the surface of another readily removable immovable component installed inside the reactor separately from the sensor of the measuring device. sufficient to maintain the concentration of the analyte on the surface of the enzyme layer in a series of measurements at values between 0 and 3% relative to the initial concentration. solution.

2. Process according to claim 1, characterized in that viscosity-increasing substances, for example carboxymethylcellulose or polyvinyl alcohol, are added to the liquid reaction mixture.

5. Apparatus for performing the method according to point _f l, characterized in that comprises a reactor / 5 / equipped with a stirrer / 5 /, preferably magnetic, the surface of which is fixed to layer of enzyme material.

4. An apparatus for carrying out the process according to claim 1, characterized in that it comprises a reactor (3) within which removable immovable components provided with a layer of fixed enzymatic material are located.