CS238261B1 - Enzymatic reactions execution and tracing method and device for application of this method - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu provádění a sledování enzymatických reakcí za použití immobilizováných enzymů a dále zařízení к provádění způsobu.

Kvantitativní stanovení koncentrace substrátů je založeno na experimentálním určení kalibrační křivky, přičemž je účelné, aby kalibrace byla lineární a neměnila se v čase. Používají se kalibrační metody kinetické a ustálené. Kinetické metody užívají ke kalibraci nějaký parametr charakterizující rychlost změny sledované veličiny, která je v reakční směsi monitorována po přidání vzorku. Používá se například počáteční hodnota směrnice závislosti sledované veličiny na čase, za který sledovaná veličina dosáhne po přidání vzorku určité předem zvolené hodnoty, nebo hodnota veličiny, kterou dosáhne po určitém předem zvoleném čase od přidání vzorku. Při metodách ustálených je kalibrační závislost určována z ustálené hodnoty sledované veličiny, dosažené v reakční směsi po přidání vzorku. Kinetické metody kalibrace jsou výhodné, protože umožňují rychlé stanovení příslušného substrátu. Jejich nevýhodou je, že rychlost sledované změny může záviset na kinetice vlastní enzymatické reakce, která se může značně měnit s klesající aktivitou enzymu.

Nejčastěji se používají dva způsoby dávkování enzymu do reakční nádoby a to tak, že se enzym nebo enzymy rozpuštěné nebo rozsuspendované ve vhodném pufru nadávkují do meclia sestávajícího z pufru a kofaktorů. poté se přidá zkoumaný vzorek, glukóza, krev, plasma a podobně a pomocí čidla se registruje průběh enzymatické reakce, například: úbytek kyslíku v reakční nádobce kyslíkovou elektrodou. Porovnáním в kalibrační křivkou se pak stanoví koncentrace látky ve vzorku, při tomto způsobu dávkování je enzym

- 2 238 261 homogenně rozptýlen v reakčním mediu. Po skončení reakce je s rea^kčním méd:iem odstraněn i enzym. Pro taždé další s^tanovení je třeba použít novou dávku enzymu. Hlavní nevýhodou tohoto způsobu spočívá ve vysoké spotřebě drahých enzymů, které se nevratně spotřebují po jednom, použití.

Podle druhého způsobu se enzym nebo enzymy immobilizují na vnějším povrchu membrány pokrývající čidlo, nebo se na membránu pokrývající ^čidlo p^řiložyje^ště je^dna membrána ne^bo tkanina, na kterou je vhodným způsobem navázán enzym. Tím se vytvoří tzv. enzymová elektroda. Immobilizovaný enzym lze použít na . mnoho analýz. Hlavní nevýhodou enzymových elektrod je, že enzymatická reakce ovlivňuje koncentrační pole sledovaného produktu reakce nebo substrátu v bezprostřední blízkosti elektrochemického senzoru a tím se spoluúčastní na vytváření úrovně· signálu senzoru, neboř úroveň s^ign^álu senzoru je z^ávisl^á na kinetice trans^portu sledované látky vrstvou kotveného enzymu. Transport sledované složky takovou vrstvou a tedy i signál sondy je určen vnitřní difúzí ostatních reakce se účastnících látek ve vrstvě a rychlostí enzymatické reakce, která je dále závislá na koncentraci a aktivitě vázaného enzymu ve vrstvě. Proto závisí kalibrační vlastnosti enzymových elektrod jak na kinetických parametrech enzymatické re akce, tak i na parametrech charakterizujících difúzní transport jednotlivých složek v membránách pokrývajících senzor. Tyto . parametry se· mohou měnit způsobem přípravy sondy s kotveným enzymem, například s množstvím enzymu vázaného v jednotce objemu nosiče, s jeho- aktivitou, přitom se difuzivita složek nosičem mění nejen změnami množství vázaného enzymu, ale i stupněm zesítění nosiče. Během používání sondy klesá postupně aktivita enzymu. Uvedené jevy, které se rozhodující zpiiso^bem uplatňuj při vytvářeli úrovně signálu sondy se nedaří popsat jednoduchými rovnicemi a nehodí se proto pro automatické vyhodnocování signálu. Z uvedených skutečností vyplývají následující nevýhody dosavadních analyzátorů založených na využívání enzymových elektrod. Jde o obvykle složitou přípravu několikavrstevných membrán, neumožňující rychlou renovaci sond. Sondy obvykle nelze připravit do zásoby a uchovávat je za hlubokých teplot až do chvíle použití. Dále závislost úrovně signálu sondy na kinetice enzymatické reakce a na vnitřní di

238 261 fUzi všech reagujících složek ve vrstvě kotveného enzymu vyplývající z geometrie systému komplikuje měření i vyhodnocení.

Vzhledem к tomu, že signál sondy je determinován difuzními pochody ve vrstvách těsně přiléhajících к elektrochemickému senzoru, je velmi citlivý na malé změny geometrie těchto vrstev, které jsou vyvolávány nepatrnými deformacemi pružných vrstev, například mechanickým dotekem, intenzívním mícháním, nárazem elektromagnetického míchadla na senzor a jinak. Dále existuje značná nestabilita signálu, nutnost časté rekalibrace a velmi složitý matematický popis chování enzymové elektrody. Při použití mikropočítače к vyhodnocení signálu sondy je potřebný složitý softvér a velký rozsah paměti.

Uvedené nedostatky odstraňuje podle vynálezu způsob provádění a sledování enzymatických reakcí za použití immobilizováných enzymů. Jeho podstata spočívá v tom, že se enzymatické reakce provádějí v reaktoru, přičemž enzymatický materiál se fixuje na povrchu míchadla nebo na povrchu jiné lehce vyjímatelné nepohyblivé součásti instalované uvnitř reaktoru, oddělené od senzoru měřícího zařízení, v množství postačujícím na udržení koncentrace stanovené látky na povrchu enzymové vrstvy v řadě měření na hodnotách mezi 0 a 5 %, vztaženo na koncentraci ve výchozím roztoku. Podle dalšího význaku vynálezu se do kapalné reakční směsi přidají látky zvyšující viskozitu, například karboxymethylceluloza nebo polyvinylalkohol. Podstata zařízení к provádění způsobu spočívá v tom, že sestává z reaktoru, opatřeného míchadlem, výhodně magnetickým, na jehož povrchu je fixována vazba enzymatického materiálu. Podle alternativního provedení sestává zařízení z reaktoru, uvnitř kterého jsou umístěny vyjímatelné nepohyblivé součásti, opatřené vrstvou fixovaného enzymatického materiálu.

Základní výhoda způsobu podle vynálezu spočívá v jeho širokém použití, jako stanovení glukózy v tělních tekutinách - krvi, seru nebo plasmě, moči, oxidací glukózy kyslíkem v přítomnosti enzymů glukozooxidázy a katalázy sledováním spotřeby kyslíku pomocí kyslíkové elektrody. Způsobu podle vynálezu ve spojení s kyslíkovou elektrodou lze použít pro kvantitativní stanovení i ji- 4 238 261 ných látek, například kyseliny mléčné, kyseliny močové, cholesterolu, 1-aminokyselin, d-amiňokyselin, alkoholu, galaktosy a.jiných substrátů ve spojení s příslušnou specifickou oxidasou. Způsobu podle vynálezu lze dále použít pro kvantitativní stanovení i těch látek, pro které příslušná oxidása není známa, například · pro stanovení sacharosy, maltosy nebo glykogenu, když se použije několika různých enzymů, jejichž následným působením se posléze vytvoří oxidovatelný substrát. Pro stanovení sacharosy se použije invertasa a glukosooxidáza, pro stanovení maltosy enzym maltasa a glukosooxidása, pro stanovení glykogenu enzymy amylasa, . maltasa a glukozooxidása. Způsob dle vynálezu ve spojení s jiným druhem čidla, například s pH elektrodou, lze použít ke kvantitativnímu stanovení neoxidovatelných substrátů. Navrženého způsobu lze s výhodou použít nejen pro účely analytické, ale i pro účely výrobní, například čištění roztoků léčiv nebo nápojů od nežádoucích· příměsí nebo produktů, všude tam, kde lze pomocí enzymů nebo enzymu vyvolat žádoucí přeměnu a pomocí změny některého fyzikálního parametru kontrolovat průběh nebo ukončení enzymatické reakce. Takovými fyzikálními parametry jsou například koncentrace kyslíku, peroxidu vodíku, vodíku, fluorescence, pH, vodivost, extinkce, barva a podobně.

Zařízení podle vynálezu má následující výhody. Těleso míchadla nebo předmět se zakotveným enzymem lze snadno vyjmout, vyměnit nebo obnovit, případně vyměnit vnější vrstvu se zakotveným enzymatickým materiálem, aniž bychom změnili charakteristiky sensoru použitého k sledování průběhu reakce. Míchadlo nebo předmět se zakotveným enzymem nebo folii s enzymatickým materiálem k upevnění na povrch míchadla nebo vyjímatelného předmětu lze připravit do zásoby a uchovávat beze změny aktivity po několik měsíců. Záměnou míchadla s enzymatickým materiálem immobilizováným.na jeho povrchu za .míchadlo s jiným enzymatickým materiálem ukotveným na jeho povrchu lze ve stejném reaktoru/ za pomoci stejného čidla analyzovat jiný substrát. V jediném vzorku, v tomtéž reaktoru s jediným čidlem, lze po.uhou záměnou míchadélka s příslušným immobilizovaným enzymem stanovit několik látek, například glukózu v plasmě krevní předmětem s immobilizovanou glukozooxidázou, výměnou za předmět s immobilizovanou laktátooxidázou kyselinu

- 5 238 261 mléčnou a výměnou za předmět s immobilizovanou urátooxidázou kyselinu močovou, aniž bychom měnili obsah reakční nádobky či senzor· Změnou otáček míchadla nebo změnou viskozity reakční směsi přídavkem látek ovlivňujících viskozitu, například karboxymethylcelulosy nebo polyvinylalkoholu, lze řídit míru vlivu vnější difúze na rychlost změny sledované veličiny a tím měnit kalibrační rozsah analyzátoru· ' Oblast řídící role vnější difúze substrátu k povrchu filmu enzymu je dosaženo, jestliže koncentrace substrátu- na povrchu ukotveného enzymu je udržována na hodnotě blížící se nule, v každém případě na hodnotě nižší než 5 % hodnoty původní koncentrace substrátu ve vzorku· Této oblasti lze dosáhnout různými postupy, například snížením otáček míchadla, čímž roste tlouštka kapalného filmu na povrchu vrstvy s enzymatickým materiálem, nebo zvýšením viskozity vzorku měřené kapaliny, čímž opět roste tloušíka kapalného filmu a navíc klesá difuzivita substrátu, anebo zvýšením aktivity immobilizováného enzymu. Pokud lze přístroj použít v oblasti řídící role vnější.difúze stanovené látky', má přístroj další níže uvedené přednosti: Jednoduchý matematický popis rychlosti změny sledované veličiny na čase, daný pro uzavřený reaktor exponenciální závislostí hodnoty sledované veličiny, například koncentrace kyslíku na čase· Tento charakter závislosti je stejný aí byl použit jakýkoliv enzym, tedy aí je sledována koncentrace jakéhokoliv substrátu. To lze s výhodou využít při mikropočítačovém zpracování signálu, nebot softvérové vybavení je jednoduché a shodné pro celou řadu přístrojů pro stanovení různých substrátů· Kalibrační závislost, založená na hodnotě počáteční rychlosti změny sledované veličiny, například rychlosti změny koncentrace kyslíku,je potom lineární, přitom/směrnice lineární závislosti nezávisí na aktivitě enzymu, pokud ovšem je koncentrace nebo aktivita enzymu dostatečně vysoká· Aktivita enzymu určuje pouze rozsah, ve kterém je kalibrační závislost lineární· S klesající aktivitou enzymu se snižuje rozsah linearity· Dlouhodobé stability kalibrace přístroje lze dosáhnout tím, že se použije vysoké koncentrace kotveného enzymu· Potom pokles aktivity se neprojeví na kalibraci, pokud je enzym schopen udržet koncentraci stanoveného substrátu na povrchu enzymové vrstvy na hodnotě blízké nule při horní mezi rozsahu přístroje · i

- 6 238 261

Zvýšení viskosity roztoku nebo snížením otáček míchadla lze rozšířit lineární oblast kalibrace. Kalibrační závislost není citlivá na mechanické dotyky..Míchadlo nebo zmíněné'vyjímatelné součásti lze z reaktoru vyjmout a vzít do ruky a znovu je vložit do reaktoru aniž se kalibrace přístroje změní.

Vynález je dále blíže popsán na příkladu provedení a podle připojených výkresů, na nichž obr. 1 značí přístroj* k provádění způsobu ve schematickém znázornění a obr. 2 kalibrační křivku.

Příklad ’

Přístroj k provádění způsobu podle vynálezu znázorněný na obr. 1 sestává z temperačního pláště 1, kyslíkové sondy 2, jejíž senzor je od vzorku v reaktoru 2 oddělen membránou propustnou pro kyslík. Ve vnitřku temperačního pláště 1 je umístěno magnetické míchadlo £, na němž je upevněna folie 7 s immobilizovánými enzymy pomocí kroužku 8. Magnetické míchadlo £ je poháněno magnetem 6. Přímo na polyakrylamidový povrch magnetického míchadla £ anebo na ^fólii 7 z ^tého^ž ' materiálu, jak: je to znázorn^ěno na obr. 1, se immobilizuje některou známou metodou, například pomocí kyanurchloridu nebo karbodiimidu nebo sloučením enzymu s vhodnou inertní bílkovinou a glutaraldehydem, směs glukozooxidázy a katalázy v celkovém množství 20 mezinárodních jednotek. Do reaktoru £ hyl vnesen vzorek - roztok pufru s pH 6,6 obsahující glukózu, jejíž množství se má stanovit. V tabulce je v prvním sloupci počáteční směrnice závislosti signálu kyslíkové sondy 2 vlibovolných jednotkách, ve 2. ®soupci počáteční koncentrace glukózy v reakční směsi, v milimolech, a v 5. sloupci počet mikromolů základního roztoku. Z tabulky je zřejmé, že bylo dosaženo, značně rozsáhlé oblasti linearity kalibrační křivky v rozmezí 0 až 0,7407 mM počáteční koncentrace glukózy. Příslušná kalibrační křivka je na obr. 2.

Enzymy byly fixovány na nylonové sítce velikosti ok 50 um na ploše vymezené kroužkem 8 o průměru 10 mm. Na tuto ’ plochu bylo naneseno cca 20 mezin. jednotek surové glukozooxidázy obsahující i katalázu. Příprava roztoku na fixaci glukozooxidázy na nylonovou sítku:

- 7 238 261

100 ul směsi se připraví; 5 mg glukosooxidázy rozpuštěné v 50 ul vody, přidá se 50 ul 10% hovězího albuminu a 20 ml 2% glutaraldehydu v 0,5 M fosfátového pufru pH 6,6. Na sííku do kroužku 8 průměru ,10 mm se nanese 15 až 20 ul této směsi a nechá se uschnout.

Tabulka

Počáteční směrnice závislosti kyslíkové sondy

Počáteční koncentrace yil základního glukózy v reakční roztoku glukózy směsi

0,4	0,0185	1,25 '
1,0	0,0481	3,25
1,6	0,0741	5
2,4+	0,1111	7,5
3,2+	0,1481	10	i
4,8 .	0,222	15
6,4	0,2963	20	’К
8,5	0,3703	25	XI
9,9	0,444	30
13,4	0,5926	40
16,5+	0,7407	50
18,7	0,8888	60
24,4	1,481	100

+/ Opakovaná stanovení po 1 dnu.

Způsob podle vynálezu má všechny výhody dosavadních postupů, používajících homogenních roztoků enzymů, tedy rychlou odpověí senzoru a zároveň vý^ho^du ⁱmmo^bilⁱzace enz^ymu, te^{dy p}ře^devším malou jeho spotřebu.

Claims (3)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   238 261

   Způsob provádění a sledování enzymatických reakcí za použití immobilizovaných enzymů, vyznačený tím, že se enzymatická reakce provádějí v reaktoru, přičemž enzymatický materiál se fixuje na povrchu míchadla nebo na povrchu jiné lehce vyjímatelné nepohyblivé součásti instalované uvnitř reaktoru, odděleně od senzoru měřícího zařízení, v množství postačujícím na udržení koncentrace stanovované látky na povrchu enzymové vrstvy v řadě měření na hodnotách mezi 0 a 3 %, vztaženo na.koncentraci ve výchozím . roztoku.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že do kapalné raakční smě si se přidají látky zvyšující viskozitu, například karboxymethylceluloza nebo polyvinylalkohol.

   5. Zařízení k provádění způsobu podle bodu l_fvyznačené tím, že sestává z reaktoru /5/ opatřeného míchadlem /5/, výhodně magnetickým, na jehož povrchu je fixována vrstva enzymatického materiálu.
3. 4. Zařízení k provádění způsobu podle bodu 1/vyznačené tím, že' sestává z reaktoru /3/, uvnitř kterého jsou umístěny vyjímatelné nepohyblivé součásti, opatřené vrstvou fixovaného enzymatického materiálu.