CS238261B1 - Enzymatic reactions execution and tracing method and device for application of this method - Google Patents
Enzymatic reactions execution and tracing method and device for application of this method Download PDFInfo
- Publication number
- CS238261B1 CS238261B1 CS835655A CS565583A CS238261B1 CS 238261 B1 CS238261 B1 CS 238261B1 CS 835655 A CS835655 A CS 835655A CS 565583 A CS565583 A CS 565583A CS 238261 B1 CS238261 B1 CS 238261B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- enzyme
- reactor
- enzymatic
- stirrer
- concentration
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 29
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 title claims description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 48
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 48
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 4
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 3
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 abstract description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 46
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 23
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 10
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 10
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 9
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 9
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 9
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 3
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 102000016679 alpha-Glucosidases Human genes 0.000 description 2
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 238000004164 analytical calibration Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N cyanuric chloride Chemical compound ClC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 238000009418 renovation Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000005496 tempering Methods 0.000 description 1
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
- C12M21/18—Apparatus specially designed for the use of free, immobilized or carrier-bound enzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu provádění a sledování enzymatických reakcí za použití immobilizováných enzymů a dále zařízení к provádění způsobu.
Kvantitativní stanovení koncentrace substrátů je založeno na experimentálním určení kalibrační křivky, přičemž je účelné, aby kalibrace byla lineární a neměnila se v čase. Používají se kalibrační metody kinetické a ustálené. Kinetické metody užívají ke kalibraci nějaký parametr charakterizující rychlost změny sledované veličiny, která je v reakční směsi monitorována po přidání vzorku. Používá se například počáteční hodnota směrnice závislosti sledované veličiny na čase, za který sledovaná veličina dosáhne po přidání vzorku určité předem zvolené hodnoty, nebo hodnota veličiny, kterou dosáhne po určitém předem zvoleném čase od přidání vzorku. Při metodách ustálených je kalibrační závislost určována z ustálené hodnoty sledované veličiny, dosažené v reakční směsi po přidání vzorku. Kinetické metody kalibrace jsou výhodné, protože umožňují rychlé stanovení příslušného substrátu. Jejich nevýhodou je, že rychlost sledované změny může záviset na kinetice vlastní enzymatické reakce, která se může značně měnit s klesající aktivitou enzymu.
Nejčastěji se používají dva způsoby dávkování enzymu do reakční nádoby a to tak, že se enzym nebo enzymy rozpuštěné nebo rozsuspendované ve vhodném pufru nadávkují do meclia sestávajícího z pufru a kofaktorů. poté se přidá zkoumaný vzorek, glukóza, krev, plasma a podobně a pomocí čidla se registruje průběh enzymatické reakce, například: úbytek kyslíku v reakční nádobce kyslíkovou elektrodou. Porovnáním в kalibrační křivkou se pak stanoví koncentrace látky ve vzorku, při tomto způsobu dávkování je enzym
- 2 238 261 homogenně rozptýlen v reakčním mediu. Po skončení reakce je s reakčním méd:iem odstraněn i enzym. Pro taždé další s^tanovení je třeba použít novou dávku enzymu. Hlavní nevýhodou tohoto způsobu spočívá ve vysoké spotřebě drahých enzymů, které se nevratně spotřebují po jednom, použití.
Podle druhého způsobu se enzym nebo enzymy immobilizují na vnějším povrchu membrány pokrývající čidlo, nebo se na membránu pokrývající čidlo přiložyještě jedna membrána nebo tkanina, na kterou je vhodným způsobem navázán enzym. Tím se vytvoří tzv. enzymová elektroda. Immobilizovaný enzym lze použít na . mnoho analýz. Hlavní nevýhodou enzymových elektrod je, že enzymatická reakce ovlivňuje koncentrační pole sledovaného produktu reakce nebo substrátu v bezprostřední blízkosti elektrochemického senzoru a tím se spoluúčastní na vytváření úrovně· signálu senzoru, neboř úroveň signálu senzoru je závislá na kinetice transportu sledované látky vrstvou kotveného enzymu. Transport sledované složky takovou vrstvou a tedy i signál sondy je určen vnitřní difúzí ostatních reakce se účastnících látek ve vrstvě a rychlostí enzymatické reakce, která je dále závislá na koncentraci a aktivitě vázaného enzymu ve vrstvě. Proto závisí kalibrační vlastnosti enzymových elektrod jak na kinetických parametrech enzymatické re akce, tak i na parametrech charakterizujících difúzní transport jednotlivých složek v membránách pokrývajících senzor. Tyto . parametry se· mohou měnit způsobem přípravy sondy s kotveným enzymem, například s množstvím enzymu vázaného v jednotce objemu nosiče, s jeho- aktivitou, přitom se difuzivita složek nosičem mění nejen změnami množství vázaného enzymu, ale i stupněm zesítění nosiče. Během používání sondy klesá postupně aktivita enzymu. Uvedené jevy, které se rozhodující zpiisobem uplatňuj při vytvářeli úrovně signálu sondy se nedaří popsat jednoduchými rovnicemi a nehodí se proto pro automatické vyhodnocování signálu. Z uvedených skutečností vyplývají následující nevýhody dosavadních analyzátorů založených na využívání enzymových elektrod. Jde o obvykle složitou přípravu několikavrstevných membrán, neumožňující rychlou renovaci sond. Sondy obvykle nelze připravit do zásoby a uchovávat je za hlubokých teplot až do chvíle použití. Dále závislost úrovně signálu sondy na kinetice enzymatické reakce a na vnitřní di
238 261 fUzi všech reagujících složek ve vrstvě kotveného enzymu vyplývající z geometrie systému komplikuje měření i vyhodnocení.
Vzhledem к tomu, že signál sondy je determinován difuzními pochody ve vrstvách těsně přiléhajících к elektrochemickému senzoru, je velmi citlivý na malé změny geometrie těchto vrstev, které jsou vyvolávány nepatrnými deformacemi pružných vrstev, například mechanickým dotekem, intenzívním mícháním, nárazem elektromagnetického míchadla na senzor a jinak. Dále existuje značná nestabilita signálu, nutnost časté rekalibrace a velmi složitý matematický popis chování enzymové elektrody. Při použití mikropočítače к vyhodnocení signálu sondy je potřebný složitý softvér a velký rozsah paměti.
Uvedené nedostatky odstraňuje podle vynálezu způsob provádění a sledování enzymatických reakcí za použití immobilizováných enzymů. Jeho podstata spočívá v tom, že se enzymatické reakce provádějí v reaktoru, přičemž enzymatický materiál se fixuje na povrchu míchadla nebo na povrchu jiné lehce vyjímatelné nepohyblivé součásti instalované uvnitř reaktoru, oddělené od senzoru měřícího zařízení, v množství postačujícím na udržení koncentrace stanovené látky na povrchu enzymové vrstvy v řadě měření na hodnotách mezi 0 a 5 %, vztaženo na koncentraci ve výchozím roztoku. Podle dalšího význaku vynálezu se do kapalné reakční směsi přidají látky zvyšující viskozitu, například karboxymethylceluloza nebo polyvinylalkohol. Podstata zařízení к provádění způsobu spočívá v tom, že sestává z reaktoru, opatřeného míchadlem, výhodně magnetickým, na jehož povrchu je fixována vazba enzymatického materiálu. Podle alternativního provedení sestává zařízení z reaktoru, uvnitř kterého jsou umístěny vyjímatelné nepohyblivé součásti, opatřené vrstvou fixovaného enzymatického materiálu.
Základní výhoda způsobu podle vynálezu spočívá v jeho širokém použití, jako stanovení glukózy v tělních tekutinách - krvi, seru nebo plasmě, moči, oxidací glukózy kyslíkem v přítomnosti enzymů glukozooxidázy a katalázy sledováním spotřeby kyslíku pomocí kyslíkové elektrody. Způsobu podle vynálezu ve spojení s kyslíkovou elektrodou lze použít pro kvantitativní stanovení i ji- 4 238 261 ných látek, například kyseliny mléčné, kyseliny močové, cholesterolu, 1-aminokyselin, d-amiňokyselin, alkoholu, galaktosy a.jiných substrátů ve spojení s příslušnou specifickou oxidasou. Způsobu podle vynálezu lze dále použít pro kvantitativní stanovení i těch látek, pro které příslušná oxidása není známa, například · pro stanovení sacharosy, maltosy nebo glykogenu, když se použije několika různých enzymů, jejichž následným působením se posléze vytvoří oxidovatelný substrát. Pro stanovení sacharosy se použije invertasa a glukosooxidáza, pro stanovení maltosy enzym maltasa a glukosooxidása, pro stanovení glykogenu enzymy amylasa, . maltasa a glukozooxidása. Způsob dle vynálezu ve spojení s jiným druhem čidla, například s pH elektrodou, lze použít ke kvantitativnímu stanovení neoxidovatelných substrátů. Navrženého způsobu lze s výhodou použít nejen pro účely analytické, ale i pro účely výrobní, například čištění roztoků léčiv nebo nápojů od nežádoucích· příměsí nebo produktů, všude tam, kde lze pomocí enzymů nebo enzymu vyvolat žádoucí přeměnu a pomocí změny některého fyzikálního parametru kontrolovat průběh nebo ukončení enzymatické reakce. Takovými fyzikálními parametry jsou například koncentrace kyslíku, peroxidu vodíku, vodíku, fluorescence, pH, vodivost, extinkce, barva a podobně.
Zařízení podle vynálezu má následující výhody. Těleso míchadla nebo předmět se zakotveným enzymem lze snadno vyjmout, vyměnit nebo obnovit, případně vyměnit vnější vrstvu se zakotveným enzymatickým materiálem, aniž bychom změnili charakteristiky sensoru použitého k sledování průběhu reakce. Míchadlo nebo předmět se zakotveným enzymem nebo folii s enzymatickým materiálem k upevnění na povrch míchadla nebo vyjímatelného předmětu lze připravit do zásoby a uchovávat beze změny aktivity po několik měsíců. Záměnou míchadla s enzymatickým materiálem immobilizováným.na jeho povrchu za .míchadlo s jiným enzymatickým materiálem ukotveným na jeho povrchu lze ve stejném reaktoru/ za pomoci stejného čidla analyzovat jiný substrát. V jediném vzorku, v tomtéž reaktoru s jediným čidlem, lze po.uhou záměnou míchadélka s příslušným immobilizovaným enzymem stanovit několik látek, například glukózu v plasmě krevní předmětem s immobilizovanou glukozooxidázou, výměnou za předmět s immobilizovanou laktátooxidázou kyselinu
- 5 238 261 mléčnou a výměnou za předmět s immobilizovanou urátooxidázou kyselinu močovou, aniž bychom měnili obsah reakční nádobky či senzor· Změnou otáček míchadla nebo změnou viskozity reakční směsi přídavkem látek ovlivňujících viskozitu, například karboxymethylcelulosy nebo polyvinylalkoholu, lze řídit míru vlivu vnější difúze na rychlost změny sledované veličiny a tím měnit kalibrační rozsah analyzátoru· ' Oblast řídící role vnější difúze substrátu k povrchu filmu enzymu je dosaženo, jestliže koncentrace substrátu- na povrchu ukotveného enzymu je udržována na hodnotě blížící se nule, v každém případě na hodnotě nižší než 5 % hodnoty původní koncentrace substrátu ve vzorku· Této oblasti lze dosáhnout různými postupy, například snížením otáček míchadla, čímž roste tlouštka kapalného filmu na povrchu vrstvy s enzymatickým materiálem, nebo zvýšením viskozity vzorku měřené kapaliny, čímž opět roste tloušíka kapalného filmu a navíc klesá difuzivita substrátu, anebo zvýšením aktivity immobilizováného enzymu. Pokud lze přístroj použít v oblasti řídící role vnější.difúze stanovené látky', má přístroj další níže uvedené přednosti: Jednoduchý matematický popis rychlosti změny sledované veličiny na čase, daný pro uzavřený reaktor exponenciální závislostí hodnoty sledované veličiny, například koncentrace kyslíku na čase· Tento charakter závislosti je stejný aí byl použit jakýkoliv enzym, tedy aí je sledována koncentrace jakéhokoliv substrátu. To lze s výhodou využít při mikropočítačovém zpracování signálu, nebot softvérové vybavení je jednoduché a shodné pro celou řadu přístrojů pro stanovení různých substrátů· Kalibrační závislost, založená na hodnotě počáteční rychlosti změny sledované veličiny, například rychlosti změny koncentrace kyslíku,je potom lineární, přitom/směrnice lineární závislosti nezávisí na aktivitě enzymu, pokud ovšem je koncentrace nebo aktivita enzymu dostatečně vysoká· Aktivita enzymu určuje pouze rozsah, ve kterém je kalibrační závislost lineární· S klesající aktivitou enzymu se snižuje rozsah linearity· Dlouhodobé stability kalibrace přístroje lze dosáhnout tím, že se použije vysoké koncentrace kotveného enzymu· Potom pokles aktivity se neprojeví na kalibraci, pokud je enzym schopen udržet koncentraci stanoveného substrátu na povrchu enzymové vrstvy na hodnotě blízké nule při horní mezi rozsahu přístroje · i
- 6 238 261
Zvýšení viskosity roztoku nebo snížením otáček míchadla lze rozšířit lineární oblast kalibrace. Kalibrační závislost není citlivá na mechanické dotyky..Míchadlo nebo zmíněné'vyjímatelné součásti lze z reaktoru vyjmout a vzít do ruky a znovu je vložit do reaktoru aniž se kalibrace přístroje změní.
Vynález je dále blíže popsán na příkladu provedení a podle připojených výkresů, na nichž obr. 1 značí přístroj* k provádění způsobu ve schematickém znázornění a obr. 2 kalibrační křivku.
Příklad ’
Přístroj k provádění způsobu podle vynálezu znázorněný na obr. 1 sestává z temperačního pláště 1, kyslíkové sondy 2, jejíž senzor je od vzorku v reaktoru 2 oddělen membránou propustnou pro kyslík. Ve vnitřku temperačního pláště 1 je umístěno magnetické míchadlo £, na němž je upevněna folie 7 s immobilizovánými enzymy pomocí kroužku 8. Magnetické míchadlo £ je poháněno magnetem 6. Přímo na polyakrylamidový povrch magnetického míchadla £ anebo na fólii 7 z téhož ' materiálu, jak: je to znázorněno na obr. 1, se immobilizuje některou známou metodou, například pomocí kyanurchloridu nebo karbodiimidu nebo sloučením enzymu s vhodnou inertní bílkovinou a glutaraldehydem, směs glukozooxidázy a katalázy v celkovém množství 20 mezinárodních jednotek. Do reaktoru £ hyl vnesen vzorek - roztok pufru s pH 6,6 obsahující glukózu, jejíž množství se má stanovit. V tabulce je v prvním sloupci počáteční směrnice závislosti signálu kyslíkové sondy 2 vlibovolných jednotkách, ve 2. ®soupci počáteční koncentrace glukózy v reakční směsi, v milimolech, a v 5. sloupci počet mikromolů základního roztoku. Z tabulky je zřejmé, že bylo dosaženo, značně rozsáhlé oblasti linearity kalibrační křivky v rozmezí 0 až 0,7407 mM počáteční koncentrace glukózy. Příslušná kalibrační křivka je na obr. 2.
Enzymy byly fixovány na nylonové sítce velikosti ok 50 um na ploše vymezené kroužkem 8 o průměru 10 mm. Na tuto ’ plochu bylo naneseno cca 20 mezin. jednotek surové glukozooxidázy obsahující i katalázu. Příprava roztoku na fixaci glukozooxidázy na nylonovou sítku:
- 7 238 261
100 ul směsi se připraví; 5 mg glukosooxidázy rozpuštěné v 50 ul vody, přidá se 50 ul 10% hovězího albuminu a 20 ml 2% glutaraldehydu v 0,5 M fosfátového pufru pH 6,6. Na sííku do kroužku 8 průměru ,10 mm se nanese 15 až 20 ul této směsi a nechá se uschnout.
Tabulka
Počáteční směrnice závislosti kyslíkové sondy
Počáteční koncentrace yil základního glukózy v reakční roztoku glukózy směsi
| 0,4 | 0,0185 | 1,25 ' | |
| 1,0 | 0,0481 | 3,25 | |
| 1,6 | 0,0741 | 5 | |
| 2,4+ | 0,1111 | 7,5 | |
| 3,2+ | 0,1481 | 10 | i |
| 4,8 . | 0,222 | 15 | |
| 6,4 | 0,2963 | 20 | ’К |
| 8,5 | 0,3703 | 25 | XI |
| 9,9 | 0,444 | 30 | |
| 13,4 | 0,5926 | 40 | |
| 16,5+ | 0,7407 | 50 | |
| 18,7 | 0,8888 | 60 | |
| 24,4 | 1,481 | 100 |
+/ Opakovaná stanovení po 1 dnu.
Způsob podle vynálezu má všechny výhody dosavadních postupů, používajících homogenních roztoků enzymů, tedy rychlou odpověí senzoru a zároveň výhodu immobilizace enzymu, tedy především malou jeho spotřebu.
Claims (3)
- PŘEDMĚT VYNÁLEZU238 261Způsob provádění a sledování enzymatických reakcí za použití immobilizovaných enzymů, vyznačený tím, že se enzymatická reakce provádějí v reaktoru, přičemž enzymatický materiál se fixuje na povrchu míchadla nebo na povrchu jiné lehce vyjímatelné nepohyblivé součásti instalované uvnitř reaktoru, odděleně od senzoru měřícího zařízení, v množství postačujícím na udržení koncentrace stanovované látky na povrchu enzymové vrstvy v řadě měření na hodnotách mezi 0 a 3 %, vztaženo na.koncentraci ve výchozím . roztoku.
- 2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že do kapalné raakční smě si se přidají látky zvyšující viskozitu, například karboxymethylceluloza nebo polyvinylalkohol.5. Zařízení k provádění způsobu podle bodu lfvyznačené tím, že sestává z reaktoru /5/ opatřeného míchadlem /5/, výhodně magnetickým, na jehož povrchu je fixována vrstva enzymatického materiálu.
- 4. Zařízení k provádění způsobu podle bodu 1/vyznačené tím, že' sestává z reaktoru /3/, uvnitř kterého jsou umístěny vyjímatelné nepohyblivé součásti, opatřené vrstvou fixovaného enzymatického materiálu.
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS835655A CS238261B1 (en) | 1983-07-28 | 1983-07-28 | Enzymatic reactions execution and tracing method and device for application of this method |
| DE19843427444 DE3427444A1 (de) | 1983-07-28 | 1984-07-25 | Verfahren und einrichtung zur durchfuehrung und verfolgung von enzymatischen reaktionen |
| CA000459834A CA1218289A (en) | 1983-07-28 | 1984-07-27 | Method for performing and tracing enzymatic reactions and a device for carrying out the said method |
| GB08419285A GB2145815B (en) | 1983-07-28 | 1984-07-27 | Method for performing and tracing enzymatic reactions and a device for carrying out the method |
| JP59155675A JPS6091996A (ja) | 1983-07-28 | 1984-07-27 | 酵素反応の実施及び追跡方法並びにそのための装置 |
| AT0243484A AT389317B (de) | 1983-07-28 | 1984-07-27 | Verfahren zur durchfuehrung und ueberwachung von enzymatisch gesteuerten reaktionen und einrichtung zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| FR8411999A FR2549852B3 (fr) | 1983-07-28 | 1984-07-27 | Procede de realisation et de la suite des reactions enzymatiques et l'appareillage pour la mise en oeuvre du procede |
| IT8422105A IT1205647B (it) | 1983-07-28 | 1984-07-27 | Metodo per condurre e seguire reazioni enzimatiche e dispositivoper l'esecuzione di questo metodo. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS835655A CS238261B1 (en) | 1983-07-28 | 1983-07-28 | Enzymatic reactions execution and tracing method and device for application of this method |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS238261B1 true CS238261B1 (en) | 1985-11-13 |
Family
ID=5401824
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS835655A CS238261B1 (en) | 1983-07-28 | 1983-07-28 | Enzymatic reactions execution and tracing method and device for application of this method |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6091996A (cs) |
| AT (1) | AT389317B (cs) |
| CA (1) | CA1218289A (cs) |
| CS (1) | CS238261B1 (cs) |
| DE (1) | DE3427444A1 (cs) |
| FR (1) | FR2549852B3 (cs) |
| GB (1) | GB2145815B (cs) |
| IT (1) | IT1205647B (cs) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0884392B1 (en) * | 1997-06-03 | 2002-12-18 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Cholesterol sensor |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1568111A (en) * | 1975-07-22 | 1980-05-29 | Phosphor Prod Co Ltd | Electroluminescent devices |
| SE396819B (sv) * | 1975-12-31 | 1977-10-03 | Gambro Ab | Sett och anordning for bestemning av koncentrationen av en lagmolekyler forening i ett komplext medium genom dialys |
| DE2642232C3 (de) * | 1976-09-20 | 1980-05-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Vorrichtung zur laufenden Bestimmung der Konzentration eines Enzymsubstrates |
| GB1571466A (en) * | 1976-12-14 | 1980-07-16 | Univ California | Assay mehtod |
| JPS6029B2 (ja) * | 1978-09-06 | 1985-01-05 | 藤沢薬品工業株式会社 | 固定化酵素カラム |
| IT1113361B (it) * | 1979-05-08 | 1986-01-20 | Italfarmaco Spa | Reattore a flusso ad enzimi immobilizzati su matrici solide a superficie piana |
| JPS56164797A (en) * | 1980-05-21 | 1981-12-17 | Toyo Jozo Co Ltd | Improved method of determining components in samples |
| JPS5718979A (en) * | 1980-07-09 | 1982-01-30 | Olympus Optical Co Ltd | Measuring container for use in analysis with immobilized enzyme |
| IT1137262B (it) * | 1981-06-26 | 1986-09-03 | Erba Farmitalia | Metodo automatico su flusso continuo per il dosaggio della creatinina con creatinina desimidasi immobilizzata |
-
1983
- 1983-07-28 CS CS835655A patent/CS238261B1/cs unknown
-
1984
- 1984-07-25 DE DE19843427444 patent/DE3427444A1/de active Granted
- 1984-07-27 IT IT8422105A patent/IT1205647B/it active
- 1984-07-27 CA CA000459834A patent/CA1218289A/en not_active Expired
- 1984-07-27 JP JP59155675A patent/JPS6091996A/ja active Pending
- 1984-07-27 AT AT0243484A patent/AT389317B/de not_active IP Right Cessation
- 1984-07-27 FR FR8411999A patent/FR2549852B3/fr not_active Expired
- 1984-07-27 GB GB08419285A patent/GB2145815B/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATA243484A (de) | 1989-04-15 |
| FR2549852A1 (fr) | 1985-02-01 |
| DE3427444C2 (cs) | 1989-09-07 |
| GB2145815B (en) | 1987-07-29 |
| GB2145815A (en) | 1985-04-03 |
| IT1205647B (it) | 1989-03-23 |
| DE3427444A1 (de) | 1985-02-07 |
| IT8422105A0 (it) | 1984-07-27 |
| FR2549852B3 (fr) | 1985-11-22 |
| CA1218289A (en) | 1987-02-24 |
| JPS6091996A (ja) | 1985-05-23 |
| AT389317B (de) | 1989-11-27 |
| GB8419285D0 (en) | 1984-08-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5171689A (en) | Solid state bio-sensor | |
| EP0255291B1 (en) | Method and apparatus for electrochemical measurements | |
| Zhang et al. | Development and analytical application of an uric acid biosensor using an uricase-immobilized eggshell membrane | |
| US4374013A (en) | Oxygen stabilized enzyme electrode | |
| AU754095B2 (en) | Microfabricated aperture-based sensor | |
| CN101849180B (zh) | 多区域分析物测试传感器 | |
| US6444115B1 (en) | Electrochemical method for measuring chemical reaction rates | |
| US5066372A (en) | Unitary multiple electrode sensor | |
| EP0136362A1 (en) | Biosensor | |
| US5773270A (en) | Three-layered membrane for use in an electrochemical sensor system | |
| US4897173A (en) | Biosensor and method for making the same | |
| Crumbliss et al. | A carrageenan hydrogel stabilized colloidal gold multi-enzyme biosensor electrode utilizing immobilized horseradish peroxidase and cholesterol oxidase/cholesterol esterase to detect cholesterol in serum and whole blood | |
| JPH0640086B2 (ja) | バイオセンサ | |
| EP0080601A1 (en) | Enzyme electrode membrane, method of making same and polarographic cell structure | |
| EP1303758A2 (en) | Electrochemical method for measuring chemical reaction rates | |
| AU2001273197A2 (en) | Electrochemical method for measuring chemical reaction rates | |
| AU2001273197A1 (en) | Electrochemical method for measuring chemical reaction rates | |
| JPS6267442A (ja) | 酵素電極型のセンサ− | |
| CN101878428A (zh) | 用于生物传感器的多孔颗粒试剂组合物、装置和方法 | |
| Mor et al. | Assay of glucose using an electrochemical enzymatic sensor | |
| JPH046907B2 (cs) | ||
| Wollenberger et al. | Laccase/glucose oxidase electrode for determination of glucose | |
| Reddy et al. | Ion exchanger modified PVC membranes—selectivity studies and response amplification of oxalate and lactate enzyme electrodes | |
| CS238261B1 (en) | Enzymatic reactions execution and tracing method and device for application of this method | |
| JPH043500B2 (cs) |