JPS6091996A - 酵素反応の実施及び追跡方法並びにそのための装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は固定化酵素を使用する場合に酵素反応を実施
し、そして追跡するだめの方法、及びこの方法を実施す
るだめの装置に関する。

（従来の技術） 基質濃度の定量は検量曲線の実験的決定によるが、この
検量曲線が直線的であり、そして時間と共に変化しない
ことが好ましい。検量法には速度法と安定化法が存在す
る。速度法は検量のために追跡される量の変化の速度を
特徴付けるノやラメ−ターを用い、これはサンプルが添
加された後に反応混合物中で監視される。例えば、あら
かじめ定められた量のサンプルを加えた後に得られる、
時間に対する追跡きれる量の勾配の初期値を用い、ある
いは、サンプルが添加されだ後あらかじめ定められた時
間内に達成される量値を用いる。安定化法においては、
検量関係は、サンプルを添加した後に反応混合物中で達
成される追跡される量の安定化値から決定される。速度
的検量法は、それぞれの基質を迅速に測定することがで
きるために有利でちる。この方法の欠点は、追跡変化の
速度が適当な酵素反応の速度に依存し、これは酵素活性
の低下に依存して相当に変化する点にある。

はとんどの場合、酵素を反応器に加えるために２つの方
法が用いられる。すなわち、適商な緩衝液に溶解又は懸
濁した酵素（１種又は複数種）を緩衝剤及びコファクタ
ーを含んで成る媒体に加える。次に試験サンプル、グル
コース、血液、血漿等を加え、そしてセンサー要素によ
り酵素反応の経過を記録する。例えば酸素電極にょシ反
応容器中の酸素の減少を記録する。これを検量曲線と比
較することによシサンノル中の基質濃度を測定する。こ
の添加方法においては、酵素は媒体中に均一に分散され
る。反応が終了した後、酵素は反応媒体と一緒に除去さ
れる。他のすべての測定法のために、新たな酵素を用い
外ければならない。この方法の主な欠点は、高価な酵素
が１回使用できるのみであシ、多量に必要な点にある。

他の方法においては、酵素（１種又は複数種）はセンサ
ー要素を覆う膜の外側表面上に固定化されておシ、ある
いはセンサー要素を覆う膜の上に他の膜又は布が配置さ
れ、その上に酵素が適当な方法で固定される。こうして
、いわゆる「酵素電極」が構成される。固定化された酵
素は多くの分析に使用することができる。酵素電極の主
な欠点は、酵素反応が、電気化学的センサーの近傍にお
いて、追跡される反応生成物又は基質の濃度分布に影響
を与え、そしてこれによりこれがセンサーによるシグナ
ルレベルの発生と関連する点にある。

センサーのシグナルレベルは、固定化された酵素の層を
通る追跡される物質の輸送の速度に依存するからである
。追跡される成分のこの膜を通しての輸送、及びセンサ
ーのシグナルは、反応の一部分をなす物質の層中での内
部拡散、及びｊ層中のにｌ定化酵素の濃度及び活性に依
存する酵素反応速度により決定される。このため、酵素
電極の検量性は、酵素反応の速度パラメーター及びセン
サーを覆う膜における個々の成分の拡散輸送を特徴付け
るパラメーターの両者に依存する。これらのＡラメ−タ
ーは、酵素を固定したセンサーの構成の種類により変化
する。すなわち、担体の単位容積中に固定された酵素の
量、その活性に依存する。しかし、担体による成分の拡
散性は固定化された酵素の量の変化によるのみならず担
体の網目の程度によっても変化する。センサーを使用す
る間に酵素の活性が連続的に低下する。センサーのシグ
ナルレベルに相当な影響を与えるこの効果は簡単な等式
により容易に記載することができず、このためこれらの
方法はシグナルを認識するのに適当でない。言うまでも
なくシグナルの認識とは自動的認識を意味する。上記の
事実により、酵素的電極の使用における従来知られてい
る分析器の次のような欠点が生ずる。通常、多層膜を調
製することが困難であり、このことがセンサーの迅速な
更新を困難にする。センサーを調製して貯蔵すること、
及びそれを必要とするまで低温に保持することが困難で
ある。さらに、センサーのシグナルレベルが酵素反応の
速度及び固定化酵素の層中でのすべての反応成分の内部
拡散に依存し、これらが測定及び認識をさらに複雑化す
る系の幾何学性により生ずることを考慮しなければなら
ない。

プローブのシグナルが電気化学的センサーに密接に隣接
した層中での拡散過程により決定されるという事実によ
り、このプローブは前記の層の小さい幾何学的変化に対
して非常に敏感であり、この幾何学的変化は弾性層のわ
ずかな変形、例えば機械的接触、強力な混合、センサー
への電磁ミキサーのショック等によシ生ずる。従って１
だ、シグナルの相当な不安定性、頻繁な検量曲線の訂正
の必要性、及び酵素電極の機能の非常に複雑な数学的記
載が問題となる。プローブのシグナルを認識するために
マイクロコンピー−ターを用いる場合、複雑なソフトウ
ェア−１及び大容量のメモリーが必要となる。

（発明が解決しようとする問題点） 上記の欠点は、固定化酵素を使用する場合に酵素反応を
実施し、そして追跡するこの発明の方法によシ除去され
る。

（問題点を解決するだめの手段） この発明の原理に従えば、固定化酵素を使用して酵素反
応を実施しそして追跡する方法において、酵素反応を反
応器中で行い、酵素材料が、該反応器中に測定装置のセ
ンサーから分離されて配置されており、攪拌器の表面又
は他の容易に取シ外すことができる不動部分の表面上に
固定されており、その量が、多数の測定中酵素層の表面
上の試験物質の濃度を、もとの溶液の濃度に関して０〜
３％の値に保持するのに十分な量であることを特徴とす
る方法により前記の問題点が解決される。この発明の他
の態様に従えば、液体反応混合物中に増粘物質、例えば
カルボキシメチルセルロース又はポリビニルアルコール
が添加される。

この発明の上記の方法を実施するだめの装置は、表面に
酵素材料の層が固定化される攪拌器を備えた反応器を有
する装置である。この装置の他の態様は固定化酵素材料
の層が設けられた、取外し可能な不動部分を内部に有す
る反応器を有する装置である。

この発明の方法の主たる利点は、これを広範囲の用途に
使用できる点にある。例えば、グルコースオキシダーゼ
及びカフラーゼの存在下でグルコースを酸素によシ酸化
し、そして酸素の消費を酸素電極によって追跡すること
による体液（面液、血清、血漿、尿）中のグルコースの
測定に使用される。酸素電極と組合わされたこの発明の
方法は、他の物質、例えば乳酸、尿酸、Ｌ−アミノ酸、
Ｄ−アミノ酸、ガラクトース、及びそれぞれ特異的なオ
キシダーゼと関連する他の基質の定量のために使用する
ことができる。この発明の方法はさらに、それぞれのオ
キシダーゼが知られていない物質についても、他の酵素
が適用され、その結果酸化可能な物質が生成する物質、
例えばシー−クロース、マルトース又はグリコーゲンの
定量のためにも使用することができる。シー−クロース
の定量のだめには、インベルターゼ及びグルコースオキ
シダーゼを使用し、マルトースの測定のためにはマルタ
ーゼ及びグルコースオキシダーゼを使用し、グリコーゲ
ンを使用するためにはアミラーゼ、マルターゼ及びグル
コースオキシダーゼを使用する。非酸化的基質の定量に
、他の種類のセンサー、例えばＰＨ組電極組合わせた方
法を用いることができる。この発明の方法は、分析目的
のみならず製造目的にも同様に使用することができ、例
えば医薬又は飲料の溶液を不所望の外来性物質又は生成
物から精製することができる。これは、酵素（１種又は
複数）により目的とする変化が得られる場合、及び物理
的パラメーターにより酵素反応の過程及び終了を監視す
ることができる場合に可能である。このような物理的パ
ラメーターは、例えば酸素濃度、過酸化水素濃度、蛍光
、ＰＨ，ｆｆ電性、吸光、色等で代表されよう。

この発明の装置は次の利点を有する。混合器体、及び固
定化酵素を伴う対象を容易に取り外し、これらを容易に
交換又は更新することができ、結果として反応過程を追
跡するために使用されるセンサーの性質を変えることな
く固定化酵素材料を伴う外層を取り換えることができる
。混合器、又は固定化酵素を伴う対象、もしくは混合器
もしくは取υ外し可能な対象上に固定するだめの固定化
酵素材料を伴う箔は、数ケ月間それらの活性を変化せし
めることなくそれらを貯蔵しそして保持するように調製
することができる。表面に酵素材料を固定した混合器を
表面に他の酵素材料を固定した混合器に替えることによ
シ、同じ反応器中で同じセンサーを用いて他の基質を分
析することができる。

１つのセンサーを有する同じ反応器中で、１つのサンプ
ルについて、反応器の容量又はセンサを替えることなく
、それぞれの固定化酵素を有する混合器を替えることに
より複数の基質を測定することができ、例えば固定化グ
ルコースオキシダーゼを用いて血漿中グルコースを測定
することができ、ラクテートオキシダーゼを固定した対
象に替えることにより乳酸を、尿酸オキシダーゼを固定
した対象を用いることにより尿酸を分析することができ
る。混合器の回転を変えることにより、又は増粘剤、例
えばカル、３ｐキシメチルセルロースもしくはポリビニ
ルアルコールを加えて反応混合物の粘度を変えることに
よシ追跡される量の変化の速度に対する外部拡散の効果
を制御し、そしてこの方法によシ分析器の検量範囲を変
えることができる。同定化酵素の表面上の基質の濃度が
０の近くに保持される場合、ある場合にはサンゾル中の
基質の最初の濃度値の３％未満に保持される場合、基質
の外部拡散の対照機能領域が達成される。この領域は種
々の方法によシ達成され、例えば混合器の回転を下げて
酵素利料を有する層の表面上の液膜の厚さを増加するこ
とにより、又は試験液のサンプル粘度を上けて液膜の厚
さを増加し、そしてさらに基質の拡散性を減少せしめる
ことにょシ、又は固定化酵素の活性を高くすることによ
り達成される。測定される物質の外部拡散を制御するた
めの装置を用いることにより他の利点が得られるであろ
う。

追跡される量の時間に対する変化の関係の簡単な数学的
記載は、密閉反応暮について、時間に対する追跡される
量、例えば酸素濃度の値の指数関係によって表わされる
。この性質はいかなる酵素を使用する場合にも、すなわ
ちいかなる基質の濃度を追跡する場合にも同じである。

これは、マイクロコンピュータ−によりシグナルを認証
するために有利に使丁することができる。なぜなら、ソ
フトウェア−装置が簡単であり、そして種々の基質を測
定するだめの多数の測定器について同一だからである。

追跡される量の変化の速度、例えば酸素濃度の変化の速
度に関する検量関係は従って直線的であるが、酵素の濃
度又は活性が十分高い場合にはもちろん直線関係の勾配
は酵素の活性に依存しない。酵素の活性は検量関係が直
線的でちる範囲のみを決定する。直線性の範囲は酵素活
性の低下に依存して低下する。装置の長時間安定性、す
なわちその検量関係の長時間安定性は高濃度の固定化酵
素を用いることによって達成される。酵素が測定される
基質の濃度を酵素層の表面上で、装置の範囲の上限にお
いてＯに近い値に保持することができれば、活性の低下
は検量関係に影響を与えない。溶液の粘度の上昇、又は
混合器の回転の低下は検量の直線範囲の拡大をもたらす
であろう。検量関係は機械的接触に対して感受性でない
。

混合器及び前記の取外し可能な部分は、装置の検量性を
変化せしめることなく反応器から取シ出し、手にとり、
そして再び反応器に入れることができる。

次に、図面と関連させてこの発明をさらに詳細に説明す
る。

（実施例） この発明の方法を実施するだめの第１図に示す装置は調
節ジャケット１、及び酸素プローブ２から成り、このプ
ローブのセンサーは酸素透過性膜４により反応器３中で
サンプルから分離されている。調節シャケ、ト１の内部
にマグネチックスターラ−５が配置されておシ、その上
に、固定化酵素を伴う箔７がリング８によシ固定されて
いる。

マ′グネチックスターラ−５は磁石６により駆動される
。マグネチックスターラ−５のポリアクリルアミド表面
上に直接に、又は第１図に示すように同じ材料の箔７上
に、合計量２０国際単位のグルコースオキシダーゼとカ
タラーゼの混合物が公知の方法によシ、例えばシアヌル
酸クロリドもしくはカルボジイミドによシ、又は酵素と
適尚な不活性蛋白質及びゲルタールアルデヒドとの組合
わせにより固定化されており、サンプル、すなわち酸を
測定すべきグルコースを含有するＰＨ６，６の緩衝液を
反応器中に入れる。表において、第１＠に酸素グローブ
２のシグナルの初期勾配を任意の単位で示し、第２１Ｍ
に反応混合物中のグルコースの最初の濃度をｍＭで示し
、そして第３欄にはもとの溶液のμＭ数を示す。

この表は、グルコースの初期濃度Ｏ〜０．７４０７ｍＭ
の範囲において、検量曲線の広範囲の直線性が達成され
ることを示している。対応する検量曲線を第２図に示す
。

５０１１ｍ目のナイロン網の直径１０門のリング８によ
り限定された領域上に酵素を固定した。この領域上に、
約２０国際単位のカタラーゼ含有粗グルコースオキシダ
ーゼを適用した。グルコースオキシダーゼをナイロン網
上に固定するだめの溶液の調製は次のようにして行った
。１００μｔの混合物をｆＡ製する場合：５ｍ９のグル
コースオキシダーゼを５０μｔの水に溶解し、１０チの
ウシアルブミン５０μを及び０．５Ｍ燐酸緩衝液（ｐ）
１６．６　）中２チグルタルアルデヒド２’０７１１１
！を加える。この混合物１０〜２０μｔを網上直径１０
．のリング８中に適用し、そしてこれを乾燥する。

以下余白 酸素グローブ　反応混合物中　グルコースのの初期勾配
　のグルコース　もとの溶液の−の初期濃度　μｔ Ｏ，４０，０１８５１，２５ １，００，０４８１３，２５ １，６０，０７４１５ ２，３５；２．４”）０．１１１１　７．５３．１　；
３．２（ト）　０．１４８１　１０４．８　０．２２２
　１５ ６．４　０．２９６３　２０ ８．５０．３７０：う２５ ９．９　０．４４４　３０ １３．４　０．５９２６　４０ １６．１　；　１６．５（ト）　０．７４０７　５０１
８．７　０．８８８８　６０ ２．４．４　１．４８１　１００ 注　（＋）：ｉ目抜に反復測定。

この発明の方法は、酵素の均一溶液を用いる従来方法の
すべての利点、すなわちセンサーの迅速な応答、及び酵
素の固定化の利点、すなわち酵素の少ない消費を同時に
もたらす。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の方法を実施するだめの装置の略図で
あり、そして第２図は検量曲線を示す。 第１図中、１は調節ジャケット、２は酸素グローブ、３
は反応器、４は酸素透過性膜、５はマグネチ、クスクー
ラー、６は磁石、７は箔、そして８はリングを示す。 特Ｗ「出願人 ビッカ　シュコラ　ケミツコーテクノロジツカ特許出願
代理人 弁理士　青　木　朗 弁理士　西　舘　和　之 弁理士　福　本　積 弁理士　山　口　昭　之 弁理士　西　山　雅　也 手続補正書（方式） 昭和５９年１１月１？日 特許庁長官志　賀　学　殿 １、事件の表示 昭和５９年　特許願　第１５５６７５号２、発明の名称 酵素反応の実施及び追跡方法並びにそのための装誇３、
補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称ビンカ　シュコラ　ヶミッコ−テクノロジッカ代理
人 （外４　名） ６　補ｊトの対象 図　面 ７、補正の内容 図面の浄書（内容に変更なし） ８、　添伺霜類の目録 浄引図面　１通

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■、　固定化酵素を使用して酵素反応を実施しそして追
   跡する方法において、酵素反応を反応器中で行い、酵素
   材料が、該反応器中に測定装置のセンサーから分離され
   て配置されておシ、攪拌器の表面又は他の容易に取シ外
   すことができる不動部分の表面上に固定されておシ、そ
   の量が、多数の測定中に、酵素層の表面上の試験物質の
   濃度を、もとの溶液の濃度に関してθ〜３チの値に保持
   するのに十分な量であることを特徴とする方法。 ２、液体反応混合物中に増粘剤を添加する特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３、表面に酵素材料の層が固定化される攪拌器を備えた
   反応器を有する、固定化酵素を用いて酵素反応を行いそ
   して追跡するだめの方法を実施するだめの装置。 ３、固定化酵素材料の層が設けられた、取外し可能な不
   動部分を内部に有する反応器を有する特許請求の範囲第
   ３項記載の装置。