JP2646271B2 - 酵素バイオセンサ - Google Patents

酵素バイオセンサ

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、皮膚の生化学的パラメータを直接測定する
ようにした酵素バイオセンサと共に、これに対応する測
定法と所要の酵素膜の調製法とに関する。
〔発明の背景〕
皮膚の物理的パラメータの非侵入的な生体内測定には
多数の方法が知られている。これ等の物理的パラメータ
には著しいデータが利用できるが、角質層を直接調べる
ことのできる生物学的信号について利用できるデータは
ほとんどない。又このような信号を直接得る測定法は現
在の所実際上存在していない。
しかしこれ等の生化学的要因は診断の見地からは興味
あるものである。たとえば皮膚の強い新陳代謝は焦性葡
萄酸からの乳酸の生成による著しい嫌気性サイクルを生
ずる。この乳酸は表皮の上基層内と共に角質層内に認め
られる。外因性のラクテートについて述べられている役
割の1つは、表皮の吸湿性に基づく表皮に対する天然の
水和剤としての作用である〔バン・スコツト(Van Scot
t)等を著者とする1984年刊行J.Am.Acad.Dermatol第11
巻869頁と高橋氏等による1985年刊行J.Soc.Cosmet.Chem
第36巻177頁との各論文〕。さらにラクテートの量の増
大は深い層における細胞の高増殖の徴候である。
従つて最良の条件のもとで皮膚のラクテートの測定の
できる装置の問題点は、皮膚の水和時のこの代謝生成物
の重要性とその可能な診断又は治療上の役割とを決定で
きることである。問題の最良の条件とは、サンプリング
や皮膚への試薬の付着を行わないで直接測定のできる条
件である。さらに同じ場所でたとえば1分間隔で反復し
て測定を行い、皮膚ラクテートの溶出又は促進された拡
散の現象を観察できるのは興味あることである。
実際に皮膚科学上又は化粧品学上興味ある全部の分子
たとえば尿素、コレステロール又はアミノ酸の皮膚被覆
を直接測定する手段を備えることは一般に有用である。
実施しようとする研究はさらに、又一般に、問題の化合
物のうちの1種類の残留磁気、吸収及び解放に係わるも
のである。
しかしラクテートを例とすると、サンプリング工程を
必要とすること以外にこの物質の正常な定量法は、敏感
であるが比較的遅い〔バーカー(Barker)等によるJ.Bi
ol Chem.1941年刊行の138巻535頁の論文〕。この同じ欠
点はデヒドロゲナーゼラクテート〔以下LDH(E.C.1.1.
1.27)と称する〕を使う酵素法に影響を及ぼす。この方
法は340nmのコエンチームのニコチン酸アミド−アデニ
ン−還元ジヌクレオチドの検出に基づく。さらに試料中
のLDH作動体の存在に関連する干渉は、測定の感度に有
害である〔H.U.Berymeyer(Ed.)のガツトマン(Gutma
n)等による論文酵素分析法、Verlag Chemie,Weinhan.1
974年刊第2巻264頁〕。
さらに酵素を固定したフイルムを粗合せた電気化学的
センサは、生物学的触媒中に認められる化合物を測定す
るのに従来から広く使われている。すなわち農産食品工
業の分野と共に医薬分析の分野に使われる多数のL−ラ
クテート特殊酵素電極が今日存在している。このような
用途に考えられる4つの酵素方式の1つを使う酵素電極
が次の文献に記載されている。
LDH〔デユリアツト(Durliatt)等によるAnal.Chem.1
980年刊行52巻2109頁の論文〕 チトクロームb2(E.C 1.1.2.3)〔シンボ(Shinbo)
等によるAnal.Chem.1979年刊行51巻100頁の論文〕 次の反応 L−ラクテート+O2…>アセテート+CO2+H2Oに触媒
作用を及ぼす恥垢菌の2−モノ・オキシゲナーゼラクテ
ート(E.C.1.13.12.4)にクラーク(Clark)電極を組合
せたもの〔マツシーニ(Mascini)等によるAnal.Chem.A
cta 1984年刊行157巻45頁の論文〕 安定性、感度及び信頼の見地から最良の成績が得られ
次の反応 L−ラクテート+O2…>ピルベート+H2O2 に触媒作用を及ぼし、酸素分圧の検出と組合せたベジオ
コツクスSP.の酸化酵素ラクテート(E.C.1.1.3.2)〔水
谷氏等によるAnal.Chem.Acta 1983年刊行55巻35頁の論
文〕又はH2O2の検出と組合せた酸化酵素ラクテート〔ミ
ユレン(Mullen)等によるClin.Chem.Acta 1986年刊行1
57巻191頁の論文〕。
皮膚の生化学的パラメータを直接測定によつて定める
ことのできる前記した目的を達成するように、測定しよ
うとする試料を、酵素が固定された膜〔コンピエーヌ大
学のロメツト(Romette)による1986年刊の博士論文に
記載してある〕に接触させる公知の方法を使うのは興味
のあることであつた。この酵素は、とくにラクテートの
場合に酸素消費及びH2O2生成により測定しようとする基
質の変質の触媒となる。又酸素消費又はH2O2生成によつ
て生ずる現象を検出する手段、たとえば酸素分圧の低下
の電流計検出を行う手段(1例はなお詳しく後述するク
ラーク電極である)を設けてある。又酵素膜は電極の感
知性端部に当てがう。
実際上このバイオセンサの感度は著しいことが極めて
多い。しかし皮膚表面に直接当てがうことは、電解質フ
イルムの圧縮と膜の機械的抵抗と物質の溶液中に入れる
こととから生ずる困難によつて不可能であることが示さ
れている。
本出願人は、前記したような酵素バイオセンサに、緩
衝剤のような適当な液体媒体を循環させることができ測
定しようとする基質を溶液に入れる室を組合せることに
より前記のような欠点を除いた。前記室は、測定位置に
おいて測定場所を構成する皮膚被覆区域によりふさがれ
る開口から成つている。
測定の瞬間に皮膚の区域により閉じられるこの室に循
環流体を入れることによつて、測定緩衝剤の注入が自動
的に行われとくに、前記した重要な目標の1つに対応す
る同じ場所で複数の測定サイクルを実施できることにな
る。
従つて本発明の目的は、皮膚の新陳代謝に使われる基
質の変質に触媒作用を及ぼすようにした酵素を固定する
膜と、この酵素膜に接触させる測定しようとする前記基
質の濃度を表わす、前記変質により生ずる現象を検出し
測定する手段とを備え、皮膚の少なくとも1種類の生化
学的パラメータを直接測定するようにした酵素バイオセ
ンサにおいて、開口を持つ測定室を備えこの室の1個所
の壁区域を前記酵素膜により構成し、前記した開口を測
定中は皮膚被覆区域により閉じることができ、前記室内
で循環させる手段を組合せたことを特徴とする酵素バイ
オセンサにある。
このような直接測定方式では得られる結果は、測定し
ようとする皮膚基質の濃度と、測定室への基質の拡散に
対し皮膚により生ずる拡散の制限は皮膚の種類に関連さ
せることができる。
好適な実施例によれば測定しようとする基質の変質
は、酸素を消耗し又はH2O2を生成し或はこれ等の両方が
生ずる反応である。検出測定手段は酸素分圧の低下又は
H2O2の濃度の増加を測定する電極から成つている、駿素
膜はこの電極の端部の感知部分に当てがわれ、溶液に入
れる液体は酸素を供給することのできる緩衝剤である。
測定室は、一端部に前記電極の感知端部部分を密封状態
で取付け他端部には前記室の開口を設けた環状体により
構成するのがよい。
本発明のバイオセンサでは、酵素膜は、ガスに関して
選択的透過性を持つ疎水性物質から成るフソルム支持体
と、グルタルアルデヒドのような架橋剤で少なくとも1
種類の不活性蛋白質を架橋結合させることにより生成す
る酵素含有フイルムとから構成するのがよい。酵素膜の
フイルム支持体は、電極の側に配置され、又酵素含有フ
イルムは測定室の開口に対応して配置する。
皮膚L−ラクテートを測定するようにした本発明によ
るバイオセンサについて述べる。酵素はL−ラクテート
酸化酵素とくにペジオコツクスsp.L−ラクテート酸化酵
素であり、電極は酸素分圧の低下を測定する電極(いわ
ゆるクラーク電極)である。酵素含有フイルムは膜の1c
m2当たり0.15ないし0.50UIのL−ラクテートオキシダー
ゼを含む、担体フイルムの厚さは30ないし50μmが好適
である。不活性蛋白質はたとえガゼラチンである。
前記の特定の場合にフイルム支持体の疎水性構成物質
はポリプロピレン又はポリテトラフルオルエチレンがよ
い。このフイルム支持体の厚さは6ないし15μmがよ
い。
L−ラクテートを測定するようにした本発明によるバ
イオセンサ用の酵素膜を調製するには次の工程による。
(a)ml当たり4ないし20UIのL−ラクテート酸化酵素
と30ないし70mgのゼラチンとを含む水溶液を調製する。
(b)この溶液をフイルム支持体上に10ないし50μm/cm
2の割合で広げ、この被覆を乾燥する。
(c)このようにして得られる乾燥被覆に0.5ないし2
重量%の濃度を持つグルタルアルデヒドの水溶液を注ぎ
1.5ないし4minの時間にわたり架橋結合させる。
さらに本発明の目的は、前記したようなバイオセンサ
を使い皮膚の少なくとも1種類の生化学的パラメータを
直接測定する方法において、前記バイオセンサを皮膚被
覆の選定した区域に当てがい、測定室の開口を前記皮膚
被覆区域により閉じるようにし、触媒作用を促進する組
成を持つ測定しようとする皮膚基質を可溶化することの
できる液体を前記室に注入し、の測定室の充満後に前記
膜の酵素の触媒作用に基づく前記基質の変質により生ず
る現象の検出及び測定を行い、前記の基質を可溶化する
液体を循環させる直接測定法にある。
前記した測定サイクルは同じ場所で反復するのがよ
い。この場合酵素膜は2つの逐次のサイクルの間に空気
に露出しない。
バイオセンサによりラクテート酸化酵素を使うことに
よつて皮膚ラクテートを測定するようにした場合に、皮
膚ラクテートを溶液に入れる液体として6ないし8のpH
を持つ緩衝剤を使い、室内の緩衝剤の非循環時限中に時
間による酸素分圧pO2の変化を記録しこの記録の際に緩
衝剤の注入の開始を横座標としpO2の最高値を縦座標と
して持つ点Aを定め、点Aをこの記録曲線の最低点Bに
連結する直線Dを定め、その傾斜Pを皮膚ラクテートの
量を表わす値として使うように傾斜Pを測定するのがよ
い。このような測定では、緩衝剤の循環は3ないし6min
の時間にわたつて停止するのがよい。
本発明によるバイオセンサはとくに皮膚の水和のパラ
メータの測定と汗の分泌の評価とに使うのがよい。皮膚
水和のパラメータを測定する場合には、皮膚の乾燥の診
断に役立てるのにとくに有用である。汗の分泌量を評価
する場合には、バイオセンサにより発刊抑制剤の有効性
の評価ができる。これ等の用途は、ラクテートが汗の分
泌中に高い濃度(15ないし40m/M)で認められ、従つて
ラクテート量の測定により汗の分泌を直接評価できるこ
とに基づくものである。
〔実施例〕
L−ラクテートの測定のための皮膚用の本発明による
バイオセンサの実施例を添付図面について詳細に説明す
る。
第1図は、皮膚のL−ラクテートを測定するために本
発明によるL−ラクテートバイオセンサを作るのに基本
要素として適当な公知の形式のクラーク電極(1)を示
す。電極(1)は、囲い(4)内に収めた本体(3)を
備えている。電極(1)の自由端部は疎水性フイルム
(5)で覆つてある。フイルム(5)は、酸素だけを通
すことができ、たとえばポリプロピレン又はポリテトラ
フルオルエチレンのフイルムである。電極(1)のこの
端部は、ただし測定作用はできるチツプ(2)により保
護してある。フイルム(5)の固定は第1A図になお詳し
く示してある。第1A図は電極(1)の対応する端部部分
をチツプ(2)は除いて拡大して示してある。電極
(1)の囲い(4)は、その端部に近い位置にフイルム
(5)を介在させて円環状のシール(7)を受入れるよ
うにした環状みぞ(6)を形成してある。フイルム
(5)とは反対側の本体端部の近くで電極(1)の本体
(3)は、囲い(4)の対応する支持面(4a)にシール
(9)を介在させて支えた環状肩部(3a)を形成してあ
る。シール(9)と囲い(4)と電極(1)の本体
(3)との間には電解質(10)を満たした空間を設けて
ある。電解質(10)は電極(1)及びフイルム(5)の
間に入れてある。囲い(4)はさらに、電解質の排除を
行い電解質の圧力の平衡が得られるように横穴(11)を
形成してある。穴(11)は通常環(12)により密封して
閉じてある。
第2図は本発明の変型によるバイオセンサを作るため
に第1図及び第1a図に対応するクラーク電極の端部を示
してある。このために本発明によれば底部のない環状体
(14)から成る循環用の測定室(13)を設けてある。電
極(1)の端部は環状体(14)の一端部にシール(14
a)により密封して配置してある。環状体(14)の他端
部は測定中に皮膚表面(15)に支えるようにしてある。
室(13)は、流入管(16)を経て供給され流出管(17)
を経て排出する測定緩衝剤の流れが横切るようにしてあ
る。この流体循環路は、測定緩衝剤の管(16)による注
入を確実にするポンプのような手段(図示してない)を
備えている。
本発明によるバイオセンサを調製するには、先ず適当
な酵素膜を用意し、次いで前記したようなクラーク電極
に前記の酵素膜を設ける。これ等の2つの工程に対する
詳細な例を以下に示す。
1) 酵素膜の生成 0.02M、pH6.8のホスフエート緩衝剤中の250ブルーム
シヨーリー(Chaulee)オセインゼラチン〔ルースロー
(Rousselot)フラスコ〕の5%(重量/容積)の溶液
を調製した(この溶液は使用に先だつて最長1週間にわ
たり4℃に保持した)。
100UIのフラスコ(参照:シグマNo.L−0638)中で、
凍結乾燥のペジオコツクスSp.L−ラクテート酸化酵素を
500μの0.1M.pH7.1のホスフエート緩衝剤で溶解し使
用に先だつて4℃に保持した。
0.02M、pH6.8の緩衝剤中の1.25%グルタルアルデヒド
(重量/容積)の溶液を、25重量%の水溶液中の品質1
グルタルアルデヒド(シグマNo.G−5882)から即座に調
製した。
このようにして調製したゼラチン溶液は5minにわたり
45℃に加熱した。次いでこれを30℃まで冷却した。1ml
のこの溶液を取出し、この混合物を50μの酵素溶液
(10UI)と共に均質化した。この物質化混合物をポリプ
ロピレン〔ボロア〔Bollore)〕フイルム上に注ぎこの
フイルムは厚さ6μmに全く平坦なガラスのシート上に
固定した。この溶液は接着剤帯状体により仕切つた正確
に35cm2の表面上に広げた。室温で空気の流れを40minに
わたり吹付けて膜状に乾燥した。
この膜の架橋結合は次いで、10mlのグルタルアルデヒ
ド溶液をこの膜に正確に3minにわたり施すことによりこ
のグルタルアルデヒド溶液によつて生じさせた。次いで
3の蒸溜水により架橋結合を停止し余分な架橋剤を除
くようにこの膜上に連続的に流して洗浄を行つた。
次いで使用するクラーク電極に当てがうことのできる
12枚の膜を切断した。これ等の膜は、これ等の膜を電極
の端部に当てがつて使用するまで0.1M.pH7.1のホスフエ
ート緩衝剤中で4℃に保持した。
2) 酵素を含む電極の準備及び使用 第1図に示すようにクラーク電極〔デンマーク、コペ
ンハーゲン市のレイデイオメーター(Radiometer)社
製、型式E 5046〕を使つた。この電極の酸素感知区域は
先行の工程で調製した酵素膜(8)で覆い、ガス選択性
のポリプロピレンフイルム支持体(5)をこの電極の側
部に当てがつた。
測定のために、このようにして得られる電極をサーモ
スタツト付き測定室(レイデイオメータ社D 616)と組
合せ前記の第2図に示したバイオセンサを構成するよう
にした。
クラーク電極の端部で本発明により生ずる酵素反応は
次の通りであつた。
L−ラクテート+O2−−>ピリユベート+H2O2 このバイオセンサの校正とその研究とのために室(1
3)に既知の濃度のラクテート水溶液の連続流れを供給
した。この連続流れの間にこれ等の測定に対する校正で
きるデータは、電極により記録されるpO2信号(酸素分
圧)の曲線の反曲点におけるSmax傾斜であつた。第3図
は連続流れの間の測定サイクル中に得られる典型的曲線
を示す。横座標は時間Aecを示し、縦座標は緩衝剤の初
めのpO2圧力に対する100分率で表わした酸素分圧(p
O2)を示す。この測定サイクルではL−ラクテートは時
間(1)で0.1M、pH7のホスフエート緩衝剤と共に室に
加えた。この室は時間(2)で緩衝剤で洗浄した。時間
(t3)でこの室に空気を加え使用膜をふたたび100%の
酸素で飽和させた。信号の数学的処理は公知のものであ
る〔ケルネベ(Kernevez)等による1983年刊行Biotech.
Bioeng.25巻845頁の論文〕。信号の自動処理、流体循環
路及び校正曲線の受入れはマイクロコンピユータにより
よく知られているようにして制御した。
前記したようにして調製したバイオセンサの連続流れ
中の測定サイクルは、第3図について前記した時間
(1)ないし(3)に対応する逐次の3つの位相から成
つていた。このサイクルが膜の空気への露出の工程で始
まるのはもちろんである。空気への露出の工程は活性膜
内の酸素濃度を増すようにして実施した。この濃度はこ
の場合同じ酸素分圧に対し水中における場合より20倍高
くなつた〔ベルジス(Belgith,H.)によるコンピエーヌ
大学の博士論文1985年〕。
後述する所から明らかなように同じ皮膚区域への反復
直接測定に対し空気への露出工程は実際的の理由で行わ
れない。
本発明によるバイオセンサの有効な使用はこの例では
次のように行つた。測定室が0.6cm2の使用面に対し100
μの容積を持つバイオセンサを皮膚に当てがつた。0.
1M、pH7.1のホスフエート緩衝剤を、1.2ml/minの程度の
充てん流量を生ずる蠕動ポンプ(Gilson Minipuls 3)
を使い測定室内に室温で注入した。このポンプ流量は一
定で十分な再現性を持つていた。室に充満すると、ポン
プを停止した。PO2値は時間の関数として記録した(第1
2図参照)。初めにpO2は空気に対応する値を持つていた
(pO2空気)。時間0で緩衝剤を加えた(曲線上の点
A0)。pO2値は減少して緩衝剤の酸素分圧(pO2緩衝剤)
の値で安定するようになつた。次いで時間t1で停止し
た。pO2が増大し緩衝剤温度が皮膚温度と平衡するよう
になる。しかし時間0以降酵素膜はその作用を開始し電
極により与えられたpO2値を低下させるようになる。こ
の作用は前記した現象に隠される。従つてpO2値は、2
つの同時の拮抗作用から生ずる最高値A1を通過した。こ
の最高値には時間t2で達した。次いでpO2は酵素作用に
より低下した。しかしこの低下は緩衝剤からの酸素の供
給により停止した。従つて各瞬間に平衡状態が生じた。
しかし測定室内のラクテート濃度は、皮膚の被覆からの
時間にわたるラクテートの拡散によつて増大した。従つ
て得られる曲線は逐次の静止状態に移つた。十分な時間
たとえば約4min後に緩衝剤を再循環させた。pO2は短時
間で急速に低下し測定セル内の媒体の不均質を転移さ
せ、次いで最低値Bの後にふたたび増加し測定緩衝剤中
のpO2の値にほぼ戻つた。
皮膚のラクテートの量の最も代表的なデータは、第12
図の線図の2点A及びBを通過する直線Dの傾斜pであ
る。
点A:横座標=時間0 縦座標=時間t2における最高値A 点B:緩衝剤の再循環後に曲線の達する最低値B 値Pは、静止モードで、すなわち酵素反応で消費され
る酸素が測定媒体により供給される酸素を正確に補給さ
れるときに得られるpO2の平坦値において実施される標
準に関連する場合に、nモル/min/cm2で拡散するラクテ
ートの量を表わすのに使うことができる。
前記したように各測定に次いで緩衝剤循環位相が生ず
るから、複数回の逐次の測定サイクルを同じ場所で実施
することができる。
たとえば第13図は9人の各女性の前腕に実施した測定
により得られた値(傾斜P)を示す。これ等の値は、個
人当たり4回の測定(各前腕の同じ区域に対する逐次の
2回の測定)から得られる累積値である。
前記した最適のバイオセンサの開発とその最適の使用
とができる若干の例を後述する。
I.バイオセンサの活用 1) 酵素固定工程の活用 活性酵素膜の良好な機械的生化学的安定性は、バイオ
センサの分析的使用を可能にする必要条件である。この
安定性は若干の物理的、化学的又は生化学的の要図によ
る。
a) 活性膜内の酵素濃度 添付図面の第4図は、次の共通の条件すなわち、 ホスフエート緩衝剤:0.1M、pH7.1、 グルタルアルデヒドの1.25%溶液(重量/容積)を使う
架橋結合の時間:3min ゼラチン溶液の濃度:5%(重量/容積)、温度:21℃ のもとで種種の濃度のL−ラクテート酸化酵素を含む膜
で生じた種種の校正曲線(1)ないし(5)を示す。
第4図の説明 横座標:L−ラクテートの濃度mM、 縦座標:第3図の曲線で定まるSmax傾斜、 各曲線(1)ないし(5)に対するL−ラクテート酸化
酵素の量(ゼラチンフイルムの35cm2に対しUIで表わし
てある):それぞれ1、4、10、20及び30 この結果は、高い酵素濃度(>4UI/35cm2)が比較的
低いラクテート濃度(1×10-5及び1×10-3Mの間に位
置する直線応答区域)を測定するのに使用できることを
示す。ラクテート濃度が1ないし3mMの間で変るときは4
UIを含む膜を使わなければならない。
さらに酵素が過剰(>4UI)であると、電極の応答に
酵素の量に無関係になる。このことは2つの要因に関連
する。すなわち 活性の場所における蛋白質膜の飽和と、酵素蛋白質質
量従つて膜の厚さの増加(膜内の酵素活性の増加は一定
の酵素蛋白質質量では得られない) 電極応答の制限要因はこの場合基質拡散係数になる。
このような実験的条件(酵素飽和)は、電極に一層安定
な応答、酵素活性の小損失又は信号に対しわすがな影響
だけしかない酵素の部分的解放を生じさせると有利に使
うことができる。
これ等の結果によつて次の研究において又研究された
各パラメータに対し35cm2当たり10UIの酵素濃度を選定
した。
b) グルタルアルデヒドを使う架橋結合時間 酵素膜のこの調製工程は、活性位置に含まれるアミノ
酸の若干の遊離アミン基を阻止することのできるグルタ
ルアルデヒドを一定の時限にわたり蛋白質フイルムに加
えるので極めて重要である。
添付図面の第5図は、次の共通の条件、すなわち、 ホスフエート緩衝剤:0.1M、pH7.1、 ゼラチン溶液の濃度:5%(重量/容積)、 温度:21℃ のもとで1.25%グルタルアルデヒド水溶液(重量/容
積)を使い種種の架橋結合時間に対するL−ラクテート
酸化酵素バイオセンサの種種の応答曲線(1)ないし
(5)を示す(3minの架橋結合に対し100%の応答)。
第5図の説明 横座標:L−ラクテートの濃度(mM)、 縦座標:3minの架橋結合時間に得られる応答に対する応
答の100分率、 曲線(1)ないし(5)に対する架橋結合時間:それぞ
れ1.5、3、5、7.5及び10min この図は最高のバイオセンサ応答が1.5ないし3minの
架橋結合時間に対し得られたことを示す。一層長い架橋
結合時間により、酵素の一層高い変性と膜の一層高い凝
集力とを生じラクテートの拡散量を制限する。これ等の
2つの要因により、3min以上の接触時間に対し架橋結合
時間に比例する信号の低下を招く。1.5minに対する3min
の架橋結合時間に対し最もよい機械的性質を示すことに
より、前記した実施例で膜を調製するための時間を選択
することができた。
c) ゼラチン濃度 可変の各量のゼラチン(前記の例で述べた処理による
膜の調製のための3ないし7%の溶液)と共に互いに同
じ量の酵素(35cm2に対し10UI)を含む各膜を試験し
た。第6図は、次の共通の条件すなわち、 ホスフエート緩衝剤:0.1M、pH7.1 1.25%グルタルアルデヒド溶液(重量/容積)を使う架
橋結合時間:3min 温度:21℃ のもとで、種種の100分率のゼラチンの使用に対する校
正曲線を示す。
第6図の説明 横座標:L−ラクテートの濃度mM 縦座標:Smax傾斜(第3図で定められる) 曲線(3)ないし(5)に対し使つたゼラチン溶液中の
ゼラチンの100分率:それぞれ3、4、5、6及び7 種種の要因を考慮しなければならない。
第1に最終の酵素蛋白質濃度はゼラチンの100分率増
加に伴つて低下する。従つて論理的には蛋白質フイルム
は一層薄い膜中では一層高い活性を持たなければならな
い。
第2に膜の厚さはゼラチン濃度が増すと増加するから
ラクテート拡散係数従つて電極応答が変る。
第3にグルタルアルデヒドの不活性化性(3minに等し
い架橋結合時間)に対する保護作用はゼラチンの100分
率に平行して増すから、厚い方のフイルムにおいて触媒
活性が最もよく保持される。
従つてこれ等の種種の要因の間に妥協点を見付けなけ
ればならない。第6図は5%ゼラチンを含む膜で0.2mM
より高い基質濃度に対し最良の電極応答の得られること
を示す。
本発明による酵素電極を作る上での一般的勧告は、最
良の基質拡散割合が確実に得られるだけ薄い膜内に高速
の活力が確実に生ずるようにできるだけ高い特殊な活性
を持つ酵素を使うことである。しかし活用工程は新らた
な系ごとに実施しなければならない。膜の機械的抵抗の
ような結果は最適条件の最終選択に或る程度役立つ。
2) 測定条件の活用 前記した最適の条件(35cm2に対し10UI、架橋結合時
間:3min、ゼラチンの100分率:5%、0.5mMの基質濃度)
のもとで作つた膜を使い、次のことを研究した。
a) ホスフエート緩衝剤のモル濃度の影響 第7図は、次の共通の条件すなわち、 1.25%グルタルアルデヒドの溶液(重量/容積)を使う
架橋時間:3min ゼラチン溶液の濃度:5%(重量/容積)、 温度:21℃ L−ラクテートの濃度:0.5mM のもとで種種の量の酵素を使い互いに異なる3つの膜に
対しホスフエート緩衝剤(pH7.1)の濃度の関数として
本発明によるバイオセンサの応答を与える曲線(1)な
いし(3)を表わす。
第7図の説明 横座標:ホスフエート緩衝剤の濃度(mM) 縦座標:Smax傾斜(第3図に定めてある) 曲線(1)ないし(3)に対する酵素の量(35cm2に対
するUI):それぞれ1、4及び10 すなわち調べた濃度における緩衝剤のモル濃度は電極
の応答にわずかな影響だけしか及ぼさない。
さらに0.1M、pH7.1のホスフエート緩衝剤のイオン強
度をNaCl(0.1ないし2.0M)を量を増しながら加えるこ
とにより高めても、電極応答は変らない(曲線を示して
ない)。しかし膜洗浄工程の長さは増さなければならな
い。この場合おそらく溶液の粘度の増加を伴う。
緩衝剤のイオン強度又はpHの変化がたとえば角質層の
塩分濃度と同様に可変の塩分濃度のときに直接測定中に
生ずるのは明らかである。前記の結果は、このような変
化が電極応答に極めてわずかな影響だけしか及ぼさない
ことを示す。
b) 電極応答に対する測定緩衝剤のpHの影響電極応答 第8図は、次の共通の条件すなわち35cm2に対し10UI
の膜、 ホスフエート緩衝剤:0.1M、 1.25%グルタルアルデヒド(重量/容積)の溶液を使う
架橋結合時間:3min、 ゼラチン溶液の濃度:5%(重量/容積)、 L−ラクテートの濃度:0.5mM のもとでpHの関数としてバイオセンサの応答(第3図に
示したSmax傾斜値)を示し各点は4つの測定値の平均を
表わす。
すなわちpHが6.5ないし8の間で変るときは電極応答
に著しい変化が認められない。この応答は試験条件のも
とで7.1のpHに対し最大になる。
c) 測定媒体の温度の影響 第9図は、次の共通の条件のもとで、35cm2に対し10U
Iの膜、 ホスフエート緩衝剤:0.1M、pH7.1 1.25%グルタルアルデヒド(重量/容積)の溶液を使う
架橋結合時間:3min ゼラチン溶液の濃度:5%(重量/容積) L−ラクテートの濃度:0.5mM のもとで温度の関数としてバイオセンサ応答(第3図に
示したSmax傾斜値)を示し、各黒点は4つの測定値の平
均を表わす。
符号(小円)は、50℃まで上昇し25℃に戻る温度試験
サイクルの終りに前記した条件のもとで酵素の安定性を
立証するものである。50℃までの高い温度増加(この温
度に保持された時間:約15min)は25℃に戻された電極
の応答に著しい変化を生じない。
第9図に示すように0.5mMのラクテート濃度に対し20
℃から40℃まで温度を高めると電極の応答を改良する。
しかし35℃以上の温度に対して測定の変化の100分率は
極めて高くなり(40℃において10%より大きい)、この
ことはおそらく電解質のガス抜き処理に関連する。従つ
て連続流れ実験はすべて21℃で行われる。このことは本
発明によるバイオセンサの酵素膜の重要な熱的及び機械
的安定性を示す。
IIバイオセンサの使用 1) 安定性 a) 貯蔵条件のもとでの安定性 第10図は膜の調製後種種の時間におけるバイオセンサ
の直線の区域応答を示す。
第10図の説明 横座標:L−ラクテートの濃度mM 縦座標:第3図に示したSmax傾斜 曲線(1)ないし(4):それぞれ膜の調製後1、
9、35及び75日 酵素膜はアジ化ナトリウムなしで測定緩衝剤中に4℃
において貯蔵した。第1の月中には電極応答には変化が
認められなかつた。貯蔵の3個月までは検出限度と直線
応答区域とは保持され、そして測定はなお、適当な校正
曲線によつて精密に行うことができた。
b) 連続操作中の安定性 第11図は、15日間の操作後に直線区域のバイオセンサ
応答を示す。
第11図の説明 横座標:L−ラクテートの濃度mM 縦座標:第3図に示したSmax傾斜 (1):基準校正曲線 (2):15日後 バイオセンサの応答の安定性を2mMの標準濃度のL−
ラクテートにより連続サイクルで試験した。応答にあま
り変化を伴わないで800回の測定サイクル(それぞれ約1
min)を実施することができた(2系列の実験)。この
連続流れ方式で操作上の特別の安定性は、L−ラクテー
トとの接触時間を10sec/サイクルまで短縮するのに役立
つた。酸化酵素は、共同因子(FAD)の欠乏により、H2O
2により又は酵素反応中に生ずる酸素の活動種により自
動不活性化力を持つことが多い。自動不活性化は、2種
類の基質の濃度を増すときはそれだけ一層さびしくな
る。最大時限の安定性を得るには従つて、L−ラクテー
ト溶液との接触時間をできるだけ制限することが大切で
ある c)不連続の操作中の安定性 バイオセンサの安定性を、交互の周期の貯蔵(ホスフ
エート緩衝剤中で4℃)及び測定(皮膚測定、21℃の連
続流れ内)に対して試験した。感度が著しく低下したと
きでも(15日後そして500回以上の測定後)、検出限度
及び直線性が保持され、限定はなお精密に実施すること
ができた。
これ等の成績により本発明バイオセンサは、感度の変
動を単に日常の校正により制御でき得られる成績の信頼
性を確実にできる。
2) 測定の精度 マイクロコンピユータの制御のもとに連続流れで実施
される測定の変動性は4%以下であつた(測定に影響を
及ぼす条件の完全な再現性、試料の一定の注入圧力、完
全に再現できるサイクル)。
3) 特異性 本発明バイオセンサにより得られる成績を液相クロマ
トグラフーを使いラクテート測定を行う試料から得られ
る成績と比較した。本発明バイオセンサの完全な作用と
そのL−ラクテートの測定に対する特異性とを皮膚被覆
に存在する他の化合物からの干渉を受けないで指示する
0.999の相関係数が得られた。
以上本発明をその実施例について詳細に説明したが本
発明はなおその精神を逸脱しないで種種の変化変型を行
うことができるのはもちろんである。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明バイオセンサを作るのに使う電極の軸断
面図、第1A図は第1図の要部の拡大軸断面図、第2図は
第1A図の変型の軸断面図である。 第3図、第4図、第5図、第6図、第7図、第8図、第
9図、第10図、第11図、第12図及び第13図はとくに前記
電極を最高に活用するように、実施される測定中に得ら
れるそれぞれ互いに異なる曲線の線図である。 1……検出測定手段(電極)、8……酵素膜、13……測
定室、15……皮膚被覆区域、16、17……管
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特公 平4−65976(JP,B2) 特公 平2−37768(JP,B2) 特公 平2−30250(JP,B2)

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】皮膚の新陳代謝に使われる基質の変質に触
    媒作用を及ぼすようにした酵素を固定する膜(8)と、
    この酵素膜に接触させる測定しようとする前記基質の濃
    度を表わす、前記変質により生ずる現象を検出し測定す
    る手段とを備え、皮膚の少なくとも1種類の生化学的パ
    ラメータを直接測定するようにした酵素バイオセンサに
    おいて、開口を持つ測定室(13)を備えこの室の1個所
    の壁区域を前記酵素膜(8)により構成し、前記した開
    口を測定中は皮膚被覆区域(15)により閉じることがで
    き、前記室(13)に測定しようとする基質を溶液に入れ
    るために液体を前記室内で循環させる手段を組合せたこ
    とを特徴とする酵素バイオセンサ。
  2. 【請求項2】測定しようとする基質の変質を、酸素を消
    費し又はH2O2を生成し或はこれ等の両方が生ずる反応と
    し、検出し測定する手段を、酸素分圧の低下又はH2O2
    濃度の増加を測定する電極(1)により構成し、前記酵
    素膜(8)を前記電極(1)の端部の感知部分に当てが
    い、溶液中に入れる液体として酸素を供給することので
    きる緩衝剤を使つた請求項1記載のバイオセンサ。
  3. 【請求項3】測定室(13)を、一端部には前記電極
    (1)の感知端部部分を密封状態で取付け、他端部には
    前記の室の開口を設けた環状体(14)により構成した請
    求項2記載のバイオセンサ。
  4. 【請求項4】皮膚のL−ラクテートの測定に使われ、酵
    素としてL−ラクテート酸化酵素とくにペジオコツクス
    SP.L−ラクテート酸化酵素を使い、前記電極として酸素
    分圧の低下を測定する電極を使つた請求項2記載のバイ
    オセンサ。
  5. 【請求項5】酵素膜(8)を、ガスに対し選択的透過性
    を持つ疎水性物質から成るフイルム支持体(5)と架橋
    剤で少なくとも1種類の不活性蛋白質を架橋結合させる
    ことにより生成する酵素含有フイルムとにより構成し、
    前記の酵素膜(8)のフイルム支持体(5)は前記電極
    (1)の側に配置すると共に、前記酵素含有フイルムは
    前記測定室(13)の開口に対向して配置した請求項1記
    載のバイオセンサ。
  6. 【請求項6】前記の不活性蛋白質としてゼラチンを使つ
    た請求項5記載のバイオセンサ。
  7. 【請求項7】前記架橋剤としてグルタルアルデヒドを使
    つた請求項5記載のバイオセンサ。
  8. 【請求項8】前記フイルム支持体(5)の疎水性構成物
    質としてポリプロピレン又はポリテトラフルオルエチレ
    ンを使つた請求項5記載のバイオセンサ。
  9. 【請求項9】前記フイルム支持体(5)の厚さを6ない
    し15μmとした請求項5記載のバイオセンサ。
  10. 【請求項10】前記酵素含有フイルムの厚さを30ないし
    50μmとした請求項5記載のバイオセンサ。
  11. 【請求項11】前記酵素含有フイルムに1cm2の膜当たり
    0.15ないし0.50UIのL−ラクテート酸化酵素を含ませた
    請求項5記載のバイオセンサ。
  12. 【請求項12】請求項5記載のバイオセンサ用の酵素膜
    を調製する方法において、 a)ml当り4ないし20UIのL−ラクテート酸化酵素と30
    ないし70mgのゼラチンとを含む水溶液を調製し、 b)この溶液をフイルム支持体(5)上に10ないし50μ
    /cm2の量で広げ、この被覆を乾燥し、 c)0.5ないし2重量%の濃度を持つグルタルアルデヒ
    ドの水溶液を前記のようにして得られた乾燥被覆上に注
    ぎ1.5ないし4minの時限にわたり架橋結合させる酵素膜
    調製法。
  13. 【請求項13】請求項1記載のバイオセンサを使い皮膚
    の少なくとも1種類の生化学的パラメータを直接測定す
    る方法において、前記バイオセンサを皮膚被覆の選定し
    た区域に当てがい、前記測定室(13)の開口を前記の皮
    膚被覆区域により閉じるようにし、触媒作用を促進する
    組成を持つ測定しようとする皮膚基質を可溶化すること
    のできる液体を前記室(13)に注入し、この測定室(1
    3)の充満後に前記膜(8)の酵素の触媒作用に基づく
    前記基質の変質により生ずる現象の検出及び測定を行
    い、前記の基質を可溶化する液体を循環させる直接測定
    法。
  14. 【請求項14】測定サイクルを、逐次の2回のサイクル
    の間に酵素膜(8)を空気に露出しないで同じ場所で反
    復する請求項13記載の測定法。
  15. 【請求項15】皮膚ラクテートを溶液に入れるための液
    体として、6ないし8のpHを持つ緩衝剤を使い、酸素分
    圧pO2の変動を前記の室内の緩衝剤の非循環周期中に時
    間の関数として記録し、この記録時に横座標を緩衝剤注
    入の開始時とし縦座標をpO2の最高値とする点Aを定
    め、この点Aを記録曲線の最低値Bに連結する直線Dを
    定め、この直線の傾斜Pを皮膚ラクテートの量を表わす
    値として使うように測定する請求項13記載の測定法。
  16. 【請求項16】緩衝剤の循環を3ないし6minの時限にわ
    たり停止する請求項15記載の測定法。
  17. 【請求項17】皮膚の水和の評価に使う請求項1ないし
    11のいずれかに記載のバイオセンサの利用法。
  18. 【請求項18】汗の分泌の評価に使う請求項1ないし11
    のいずれかに記載のバイオセンサの利用法。
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