JPH03103224A - 酵素バイオセンサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、皮膚の生化学的パラメータを直接測定するよ
うにした酵素バイオセンサと共に、これに対応する測定
法と所要の酵素膜の調製法とに関する。

〔発明の背景〕

皮膚の物理的パラメータの非侵入的な生体内測定には多
数の方法が知られている。これ等の物理的パラメータに
は著しいデータが利用できるが、角質層を直接調べるこ
とのできる生物学的信号について利用できるデータはほ
とんどない。又このような信号を直接得る測定法は現在
の所実際上存在していない。

しかしこれ等の生化学的要因は診断の見地からは興味あ
るものである。たとえば皮膚の強い新陳代謝は焦性葡萄
酸からの乳酸の生戒による著しい嫌気性サイクルを生ず
る。この乳酸は表皮の上基層内と共に角質層内に認めら
れる。外因性のラクテートについて述べられている役割
の１つは、表皮の吸湿性に基づく表皮に対する天然の水
利剤としての作用である〔バン●スコット（　Ｖａｎ　
Ｓｅｏｔｔ）等を著者とする１９８４年刊行Ｊ．　Ａｍ
．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ第１１巻８６９頁と高橋
氏等による１９８５年刊行Ｊ．８ｏｃ，Ｃｏ　ｓｍｅ　
ｔ　，Ｃｈ　ｅｍ第３６巻１７７頁との各論文〕。さら
にラクテートの量の増大は深い層にかける細胞の高増殖
の徴候である。

従って最良の条件のもとて皮膚のラクテートの測定ので
きる装置の問題点は、皮膚の水利時のこの代謝生成物の
重要性とその可能な診断又は治療上の役割とを決定でき
ることである。問題の最良の条件とは、サンプリングや
皮膚への試薬の付着を行わないで直接測定のできる条件
である。さらに同じ場所でたとえば１分間隔で反復して
測定を行い、皮膚ラＪクテートの溶出又は促進された拡
散の現象を観察できるのは興味あることである。

実際に皮膚科学上又は化粧品学上興味ある全部の分子た
とえば尿素、コレステロール又はアミノ酸の皮膚被覆を
直接測定する手段を備えることは一般に有用である。実
施しようとする研究はさらに、又一般に、問題の化合物
のうちの１種類の残留磁気、吸収及び解放に係わるもの
である。

しかしラクテートを例とすると、サンプリング工程を必
要とすること以外にこの物質の正常な定量法は、敏感で
あるが比較的遅い〔バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）等による
Ｊ．　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　１９４１年刊行の１３８
巻５３５頁の論文〕。この同じ欠点はデヒドロゲナーゼ
ラクテート〔以下ＬＤＨ　（　Ｅ．Ｃ．１．１．１．２
７　）と称する〕を使う酵素法に影響を及ぼす。この方
法は３４Ｑｎｍのコエンチームのニコチン酸アミドーア
デニン〜還元ジヌクレオチドの検出に基づく。さらに試
料中のＬＤＨ作動体の存在に関連する干渉は、測定の感
度に有害である（　Ｈ．Ｕ，　Ｂｅｒｙｍｅｙｅｒ（Ｅ
ｄ，）のガットマン（　Ｇｕｔｍａｎ　）等による論文
酵素分析法、Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ，　Ｗｅｉｎ
ｈａｎ．　１９７４年刊第２巻２６４頁〕。

さらに酵素を固定したフィルムを粗合せた電気化学的セ
ンサは、生物学的媒体中に認められる化合物を測定する
のに従来から広く使われている。

すなわち農産食品工業の分野と共に医薬分析の分野に使
われる多数のＬ−ラクテート特殊酵素電極が今日存在し
ている。このような用途に考えられる４つの酵素方式の
ｌつを使う酵素電極が次の文献に記載されている。

ＬＤＨ　（デュリアット（　Ｄｕｒｌｉａｔｔ　）等に
よるＡｎａｌ，Ｃｈｅｍ．　１９８０年刊行５２巻２１
０９頁の論文〕チトクロームｔ）ｚ　（　Ｅ．Ｃ　Ｉ．
１．２．３）　（　’／　７　ホ（Ｓｈｉｎｂｏ）等に
よるＡｎａｌ，　Ｃｈｅｍ．　１９７９年刊行５１巻１
００頁（７）論文〕 次の反応 Ｌ−ラクテート＋０２・・・〉アセテート＋ＣＯ２＋Ｈ
２０に触媒作用を及ぼす恥垢菌の２−モノ・オキシゲナ
ーゼラクテー｝　（　Ｅ．Ｃ．１．ｌ３．１２．４　）
にクラーク（　Ｃｌａｒｋ　）電極を組合せたもＣｌ　
［　マッシ−　＝　（Ｍａｓｃｉｎｉ）等によるＡｎａ
ｌ，　Ｃｈｅｍ．　Ａｃｔａ　１９８４年刊行１５７巻
４５頁の論文〕 安定性、感度及び信頼の見地から最良の成績が得られ次
の反応 Ｌ　−　５クテ−　｝　＋０２−）　ヒルヘ−　ト＋Ｈ
２０２に触媒作用を及ぼし、酸素分圧の検出と組合せた
ベジオコックスＳＰ．の酸化酵素ラクテート（Ｅ．Ｃ．
　１．１．３．２）Ｃ水谷氏等によるＡｎａ１、Ｃｈｅ
ｍ．Ａｃｔａ　１９８３年刊行５５巻あ頁の論文〕又は
Ｈ２０２の検出と組合せた酸化酵素ラクテート〔ミュレ
ン（Ｍｕｌ　ｌｅｎ）等によるＣＩｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ａ
ｃｔａ　１９８６年刊行１５７巻１９１頁の論文〕。

皮膚の生化学的パラメータを直接測定によって定めるこ
とのできる前記した目的を達成するように、測定しよう
とする試料を、酵素が固定された膜〔コンピエーヌ大学
のロメッ｝　（　Ｒｏｍｅｔｔｅ　）　Ｋよる１９８６
年刊の博士論文に記載してある〕に接触させる公知の方
法を使うのは興味のあることであった。この酵素は、と
くにラクテートの場合に酸素消費及びＨ２０２　　生戒
により測定しようとする基質の変質の触媒となる。又酸
素消費又はＨ２０２　生成によって生ずる現象を検出す
る手段、たとえば酸素分圧の低下の電流計検出を行う手
段（１例はな３詳しく後述するクラーク電極である）を
設けてある。又酵素膜は電極の感知性端部に当てがう。

実際上このバイオセンサの感度は著しいことが極めて多
い。しかし皮膚表面に直接当てがうどとは、電解質フィ
ルムの圧縮と膜の機械的抵抗と物質の溶液中に入れるこ
ととから生ずる困難によって不可能であることが示され
ている。

本出願人は，前記したような酵素バイオセンサに、緩衝
剤のような適当な液体媒体を循環させることができ測定
しようとする基質を溶液に入れる室を組合せることによ
う前記のような欠点を除いた。前記室は、測定位置にか
いて測定場所を構成する皮膚被覆区域によりふさがれる
開口から成っている。

測定の瞬間に皮膚の区域により閉じられるこの室に循環
流体を入れることによって、測定緩衝剤の注入が自動的
に行われとくに、前記した重要な目標の１つに対応する
同じ場所で複数の測定サイクルを実施できることになる
。

従って本発明の目的は、皮膚の新陳代謝に使われる基質
の変質に触媒作用を及ぼすようにした酵素を固定する膜
と、この酵素膜に接触させる測定しようとする前記基質
の濃度を表わす、前記変質によう生ずる現象を検出し測
定する手段とを備え、皮膚の少なくとも１種類の生化学
的パラメータを直接測定するようにした酵素バイオセン
サに釦いて、開口を持つ測定室を備えこの室の１個所の
壁区域を前記酵素膜によυ構成し、前記した開口を測定
中は皮膚被覆区域により閉じることができ、前記室内で
循環させる手段を組合せたことを特徴とする酵素バイオ
センサに６る。

このような直接測定方式では得られる結果は、測定しよ
うとする皮膚基質の濃度と、測定室への基質の拡散に対
し皮膚により生ずる拡散の制限は皮膚の種類に関連させ
ることができる。

好適な実施例によれば測定しようとする基質の変質は、
酸素を消耗し又はＨ２０２　を生成し或はこれ等の両方
が生ずる反応である。検出測定手段は酸素分圧の低下又
はＨ２０２の濃度の増加を測定する電極から成っている
、駿素膜はこの電橿の端部の感知部分に当てがわれ、溶
液に入れる液体は酸素を供給することのできる緩衝剤で
ある。測定室は、一端部に前記電極の感知端部部分を密
封状態で取付け他端部には前記室の開口を設けた環状体
により構成するのがよい。

本発明のバイオセンサでは、酵素膜は、ガスに関して選
択的透過性を持つ疎水性物質から或るフソルム支持体と
、グルタルアルデヒドのような架橋剤で少なくとも１種
類の不活性蛋白質を架橋結合させることによう生或する
酵素含有フィルムとから構成するのがよい。酵素膜のフ
ィルム支持体は、電極の側に配置され、又酵素含有フィ
ルムは測定室の開口に対向して配置する。

皮膚Ｌ−ラクテートを測定するようにした本発明による
バイオセンサについて述べる。酵素はＬ一ラクテート酸
化酵素とくにペジオコツクスＳｐ．Ｌ−ラクテート酸化
酵素であり、電極は酸素分圧の低下を測定する電極（い
わゆるクラーク電極）である。酵素含有フィルムは膜の
１（ｍ当たり０．１５ないし０．５０　０ＩのＬ−ラク
テートオキシダーゼを含む、担体フィルムの厚さは３０
ないし５０μｍが好適である。不活性蛋白質はたとえガ
ゼラチンである。

前記の特定の場合にフィルム支持体の疎水性構成物質は
ポリプロピレン又はポリテトラフルオルエチレンがよい
。このフィルム支持体の厚さは６ないし１５　ｐｍがよ
い。

Ｌ−ラクテートを測定するようにした本発明によるバイ
オセンサ用の酵素膜を調製するには次の工程による。

（ａｌ一当たり４ないし２０ＵＩのＬ−ラクテート酸化
酵素と３０ないし７０１９のゼラチンとを含む水溶液を
調製する。

（ｂｌこの溶液をフィルム支持体上に１０ないし駒μ町
一　の割合で広げ、この被覆を乾燥する。

ｔｃ）このようにして得られる乾燥被覆に０．５ないし
２重量多の濃度を持つグルタルアルデヒドの水溶液を注
ぎ１．５ないし４　ｍｉｎの時間にわたり架橋結合させ
る。

さらに本発明の目的は、前記したようなバイオセンサを
使い皮膚の少なくとも１種類の生化学的パラメータを直
接測定する方法において、前記バイオセンサを皮膚被覆
の選定した区域に当てがい、測定室の開口を前記皮膚被
覆区域により閉じるようにし、触媒作用を促進する組成
を持つ測定しようとする皮膚基質を可溶化することので
きる液体を前記室に注入し、この測定室の充満後に前記
膜の酵素の触媒作用に基づく前記基質の変質により生ず
る現象の検出及び測定を行い、前記の基質を可溶化する
液体を循項させる直接測定法にある。

前記した測定サイクルは同じ場所で反復するのがよい。

この場合酵素膜は２つの逐次のサイクルの間に空気に露
出しない。

バイオセンサによりラクテート酸化酵素を使うことによ
って皮膚ラクテートを測定するようにした場合に、皮膚
ラクテートを溶液に入れる液体として６ないし８のｐＨ
を持つ緩衝剤を使い、室内の緩衝剤の非循環時限中に時
間による酸素分圧ｐＯ２の変化を記録しこの記録の際に
緩衝剤の注入の開始を横座標としｐＯ２の最高値を縦座
標として持つ点Ａを定め、点Ａをこの記録曲線の最低点
Ｂに連結する直線Ｄを定め、その傾斜Ｐを皮膚ラクテー
トの量を表わす値として使うように傾斜Ｐを測定するの
がよい。このような測定では、緩衝剤の循環は３ないし
６ｍｉｎの時間にわたって停止するのがよい。

本発明によるバイオセンサはとくに皮膚の水利のパラメ
ータの測定と汗の分泌の評価とに使うのがよい。皮膚水
和のパラメータを測定する場合には、皮膚の乾燥の診断
に役立てるのにとくに有用である。汗の分泌量を評価す
る場合には、バイオセンサにより発汗抑制剤の有効性の
評価ができる。

これ等の用途は、ラクテートが汗の分泌中に高い濃度（
１５ないし４０ｍ／Ｍ）で認められ、従ってラクテート
量の測定により汗の分泌を直接評価できることに基づく
ものである。

〔実施例〕

Ｌ−ラクテートの測定のための皮膚用の本発明によるバ
イオセンサの実施例を添付図面について詳細に説明する
。

第１図は、皮膚のＬ−ラクテートを測定するために本発
明によるＬ−ラクテートバイオセ／サを作るのに基体要
素として適当な公知の形式のクラーク電極（１）を示す
。電極（１）は、囲い（４）内に収めた本体（３）を備
えている。電極（１）の自由端部は疎水性フィルム（５
）で覆ってある。フィルム（５）は、酸素だけを通すこ
とができ、たとえばポリプロピレン又はポリテトラフル
オルエチレンのフィルムである。電極（１）のこの端部
は、ただし測定作用はできるチップ（２）により保護し
てある。

フィルム（５）の固定は第ＩＡ図になか詳しく示してあ
る。第ＩＡ図は電極（１）の対応する端部部分をチップ
（２）は除いて拡大して示してある。電極（１）の囲い
（４）は、その端部に近い位置にフィルム（５）を介在
させて円環状のシール（７）を受入れるようにした環状
みぞ（６）を形成してある。

フィルム（５）とは反対側の本体端部の近くで電極（１
）の本体（３）は、囲い（４）の対応する支持面（４ａ
）にシール（９）を介在させて支えた環状肩部（３ａ）
を形成してある。シール（９）と囲い（４）と電極（１
）の本体（３）との間には電解質（１０）を満たした空
間を設けてある。電解質（１０）は電極（１）及びフィ
ルム（５）の間に入れてある。囲い（４）はさらに、電
解質の排除を行い電解質の圧力の平衡が得られるように
横穴（１１）を形成してある。穴（１１）は通常環（ｌ
２）によう密封して閉じてある。

第２図は本発明の変型によるバイオセンサを作るために
第１図及び第１ａ図に対応するクラーク電極の端部を示
してある。このために本発明によれば底部のない環状体
（１４）から成る循環用の測定室（１３）を設けてある
。電極（１）の端部は環状体（１４）の一端部にシール
（１４ａ）により密封して配置してある。環状体（１４
）の他端部は測定中に皮膚表面（ｌ５）に支えるように
してある。室（１３）は、流入管（１６）を経て供給さ
れ流出管（１７）を経て排出する測定緩衝剤の流れが横
切るようにしてある。この流体循環路は、測定緩衝剤の
管（１６）による注入を確実にするポンプのような手段
（図示してない）を備えている。

本発明によるバイオセンサを調製するには、先ず適当な
酵素膜を用意し、次いで前記したようなクラーク電極に
前記の酵素膜を設ける。これ等の２つの工程に対する詳
細な例を以下に示す。

１）酵素膜の生戒 ０．０２　Ｍ％ｐｌｌ５．Ｂ　　のホスフエート緩衝剤
中の２５０ブルームショーリー（　Ｃｈａｕｌｅｅ　）
オセインゼラチ７　（　／ｌ／　−　，ｘ．　ｏ　−　
（　ＦＬｏｕｓｓｅｌｏｔ　）フラスコ〕の５％（重量
／容積）の溶液を調製した（この溶液は使用に先だって
最長１週間にわたう４゜Ｃに保持した）。

１００ＵＩのフラスコ（参考：シグマＮ，　Ｌ　−　ｏ
６３８）中で、凍結乾燥のべジオコックスｓｐ．　Ｌ−
ラクテート酸化酵素を５００μｔのＱ．ｌ　Ｍ．　ｐＨ
７．１のホスフエート緩衝剤で溶解し使用に先だって４
℃に保持した。

０．０２　Ｍ　，　ｐｔｌ　６，８の緩衝剤中の１．２
５多グルタルアルデヒド（重量／容積）の溶液を、お重
量肇の水溶液中の品質ｌグルタルアルデヒド（シグマＮ
，Ｇ−　５８８２　）から即座に調製した。

このようにして調製したゼラチン溶液は６ｍｉｎにわた
υ６℃に加熱した。次いでこれを刀℃筐で冷却した。１
−のこの溶液を取出し、この混合物を５０μｔの酵素溶
液（　ＩＱ　ＵＩ　）と共に均質化した。

この物質化混合物をポリプロピレン〔ポロア（Ｂｏｌ　
ｌｏｒｅ））フィルム上に注ぎこのフィルムは厚さ６μ
ｍに全く平坦なガラスの１シート上に固定した。この溶
液は接着剤帯状体により仕切った正確に３５ｃＩＩ？の
表面上に広げた。室温で空気の流れを４９　ｍ　ｉ　ｎ
にわたＤ吹付けて膜状に乾燥した。

この膜の架橋結合は次いで、１０−のグルタルアルデヒ
ド溶液をこの膜に正確に３　ｍｉｎにわたう施すことに
よりこのグルタルアルデヒド溶液によって生じさせた。

次いで３ｔの蒸溜水により架橋結合を停止し余分な架橋
剤を除くようにこの膜上に連続的に流して洗浄を行った
。

次いで使用するクラーク電極に当てかうことのできる１
２枚の膜を切断した。これ等の膜は、これ等の膜を電極
の端部に当てがって使用するまで０．１　Ｍ．　ｐＨ　
７．１　　のホスフエート緩衝剤中で４℃に保持した。

２）酵素を含む電極の準備及び使用 第１図に示すようにクラーク電極〔デンマーク、コペン
ハーゲン市のレイディオメーター（Ｒａｄ　ｉ　ｏｍｅ
ｔ．ｅｒ　）社製、型式Ｅ　５０４６）を使った。この
電極の酸素感知区域は先行の工程で調製した酵素膜（８
）で覆い、ガス選択性のポリプロピレンフィルム支持体
（５）をこの電極の側部に当てかった。

測定のために、このようにして得られる電極をサーモス
タット付き測定室（レイディオメータ社Ｄ　６１６　）
と組合せ前記の第２図に示したバイオセンサを構戒する
ようにした。

クラーク電極の端部で本発明により生ずる酵素反応は次
の通シであった。

Ｌ−ラクテート＋０２　−−　：）ピリュベート＋Ｈ２
０２このバイオセンサの校正とその研究とのために室（
１３）に既知の濃度のラクテート水溶液の連続流れを供
給した。この連続流れの間にこれ等の測定に対する校正
できるデータは、電極によう記録されるｐＯｚ信号（酸
素分圧）の曲線の反曲点に訃けるＳｍａｘ　　傾斜であ
った。第３図は連続流れの間の測定サイクル中に得られ
る典型的曲線を示す。

横座標は時間Ａｅｃを示し、縦座標は緩衝剤の初めのｐ
Ｏ２圧力に対する１００分率で表わした酸素分圧（　＋
）０２　）を示す。この測定サイクルではＬ−ラクテー
トは時間（１）で０．１Ｍ，ａｌｌ７のホスフエート緩
衝剤と共に室に加えた。この室は時間（２）で緩衝剤で
洗浄した。時間（ｔ３）でこの室に空気を加え使用膜を
ふたたびｉｏｏ　ｓの酸素で飽和させた。

信号の数学的処理は公知のものである〔ケルネペ（　Ｋ
ｅｒｎｅｖｅｚ　）　　等による１９８３年刊行Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ　，Ｂｉｏｅｎｇ．　２５巻８４５頁の論文〕
。信号の自動処理、流体循環路及び校正曲線の受入れは
マイクロコンピュータによυよく知られているようにし
て制御した。

前記したようにして調製したバイオセンサの連続流れ中
の測定サイクルは、第３図について前記した時間（１）
ないし（３）に対応する逐次の３つの位相から成ってい
た。このサイクルが膜の空気への露出の工程で始まるの
はもちろんである。

空気への露出の工程は活性膜内の酸素濃度を増すように
して実施した。この濃度はこの場合同じ酸素分圧に対し
水中に釦ける場合上り加倍高くなった〔ペルジス（　Ｂ
ｅｌｇｉｔｈ，Ｈ．）によるコンビエーヌ犬学の博士論
文１９８５年〕。

後述する所から明らかなように同じ皮膚区域への反復直
接測定に対し空気への露出工程は実際的の理由で行われ
ない。

本発明によるバイオセンサの有効な使用はこの例では次
のように行った。測定室が０．６ＣＩ！Ｌ２の使用面に
対し１００μｔの容積を持つバイオセンサを皮膚に当て
かった。０．１　Ｍ　，　ｐＨ　７．１のホスフエート
緩衝剤を、１．２ｄ／ｍｉｎの程度の充てん流量を生ず
る嬬動ボンプ（　Ｑｉｌｓｏｎ　Ｍｉｎｉｐｕｌｓ　３
　）を使い測定室内に室温で注入した。このポンプ流量
は一定で十分な再現性を持っていた。室に充満すると、
ポンプを停止した。ＰＯＺ値は時間の関数として記録し
た（第ｌ２図参照）。初めにｐＯｚは空気に対応する値
を持っていた（　＋）０２空気）。時間Ｏで緩衝剤を加
えた（曲線上の点ＡＯ）。Ｉ）０２値は減少して緩衝剤
の酸素分圧（　ｐｏｚ緩衝剤）の値で安定するようにな
った。次いで時間ｔｘで停止した。　ｐＯ２が増大し緩
衝剤温度が皮膚温度と平衡するようになる。しかし時間
Ｏ以降酵素膜はその作用を開始し電極によシ与えられた
Ｉ）０２値を低下させるようになる。この作用は前記し
た現象に隠される。従って！）０２値は、２つの同時の
拮抗作用から生ずる最高値Ａ１を通過した。この最高値
には時間ｔ２で達した。次いでＩ）０２は酵素作用によ
う低下した。しかしこの低下は緩衝剤からの酸素の供給
により停止した。従って各瞬間に平衡状態が生じた。し
かし測定室内のラクテート濃度は、皮膚の被覆からの時
間にわたるラクテートの拡散によって増大した。従って
得られる曲線は逐次の静止状態に移った。十分な時間た
とえば約４ｍｉｎ後に緩衝剤を再循環させた。ｐｏｚは
短時間で急速に低下し測定セル内の媒体の不均質を転移
させ、次いで最低値Ｂの後にふたたび増加し測定緩衝剤
中のｐｏ２の値にほぼ戻った。

皮膚のラクテートの量の最も代表的なデータは、第１２
図の線図の２点Ａ及びＢを通過する直線Ｄの傾斜ｐであ
る。

点Ａ：横座標二時間Ｏ 縦座標二時間ｔ２にふ・ける最高値Ａ 点Ｂ：緩衝剤の再循環後に曲線の達する最低値Ｂ値Ｐは
、静止モードで、すなわち酵素反応で消費される酸素が
測定媒体により供給される酸素を正確に補給されるとき
に得られるＩ）０２の平坦値にむいて実施される標準に
関連する場合に、ｎモル／ｍｉｎ／ｃｒｒＬ２　　で拡
散するラクテートの量を表わすのに使うことができる。

前記したように各測定に次いで緩衝剤循環位相が生ずる
から、複数回の逐次の測定サイクルを同じ場所で実施す
ることができる。

たとえば第１３図は９人の各女性の前腕に実施した測定
により得られた値（傾斜Ｐ）を示す。これ等の値は、個
人当たり４回の測定（各前腕の同じ区域に対する逐次の
２回の測定）から得られる累積値である。

前記した最適のバイオセンサの開発とその最適の使用と
ができる若干の例を後述する。

■．バイオセンサの活用 １）酵素固定工程の活用 活性酵素膜の良好な機械的生化学的安定性は、バイオセ
ンサの分析的使用を可能にする必要条件である。この安
定性は若干の物理的、化学的又は生化学的の要図による
。

ａ）活性膜内の酵素濃度 添付図面の第４図は、次の共通の条件す々わち、ホスフ
エート緩衝剤：　０．Ｉ　Ｍ％ｐｌｌ７．ｌ，グルタル
アルデヒドの１．２５％溶液（重量／容積）を使う架橋
結合の時間：　３　ｍｉｎゼラチン溶液の濃度：５％（
重量／容積）、温度＝２１℃ のもとて種種の濃度のＬ−ラクテート酸化酵素を含む膜
で生じた種種の校正曲線（１）ないし（５）を示す。

第４図の説明 横座標：Ｌ−ラクテートの濃度附、 縦座標：第３図の曲線で定筐るＳｍａ　ｘ傾斜、各曲線
（１）ないし（５）に対するＬ−ラクテート酸化酵素の
量（ゼラチンフィルムの３５ＣＴｔ２に対しＵＩで表わ
してある）：それぞれ１、４、１０、加及び加 この結果は、高い酵素濃度（　＞　４　０Ｉ／３５α２
）が比較的低いラクテート濃度（　ｉ　ｘ　ｉｏ”−”
及びＩＸＩＯ−３Ｍの間に位置する直線応答区域）を測
定するのに使用できることを示す。ラクテート濃度が１
ないし３ｍＭの間で変るときは４　ＵＩ　　を含む膜を
使わなければならない。

さらに酵素が過剰（　）　４ＵＩ　）であると、電極の
応答に酵素の量に無関係になる。このことは２つの要因
に関連する。すなわち 活性の場所に３ける蛋白質膜の飽和と、酵素蛋白質質量
従って膜の厚さの増加（膜内の酵素活性の増加は一定の
酵素蛋白質質量では得られない）電極応答の制限要因は
この場合基質拡散係数になる。このような実験的条件（
酵素飽和）は、電極に一層安定な応答、酵素活性の小損
失又は信号に対しわすがな影響だけしかない酵素の部分
的解放を生じさせると有利に使うことができる。

これ等の結果によって次の研究にかいて又研究された各
パラメータに対し３５ｃｒｒＬ当たりＩＱ　ＵＩ　　の
酵素濃度を選定した。

ｂ）グルタルアルデヒドを使う架橋結合時間酵素膜のこ
の調製工程は、活性位置に含渣れるアミノ酸の若干の遊
離アミン基を阻止することのできるグルタルアルデヒド
を一定の時限にわたり蛋白質フィルムに加えるので極め
て重要である。

添付図面の第５図は、次の共通の条件、すなわち、 ホスフエート緩衝剤：　０．Ｉ　Ｍ，　ｐＦＪ　７，１
ゼラチン溶液の濃度：５嘩（重量／容積）、温度＝２１
℃ のもとて１．２５４グルタルアルデヒド水溶液（重量／
容積）を使い種種の架橋結合時間に対するＬ−ラクテー
ト酸化酵素バイオセンサの種種の応答曲線（１）ないし
（５）を示す（３ｍｉｎの架橋結合に対しｉｏｏ蝿の応
答）。

第５図の説明 横座標：Ｌ−ラクテートの濃度（ｍＭ）、縦座標：３ｍ
ｉｎの架橋結合時間に得られる応答に対する応答の１０
０分率、 曲線（１）ないし（５）に対する架橋結合時間：それぞ
れ１、．５　　　３、５、７．５及びｌＱｍｉｎこの図
は最高のバイオセンサ応答が１．５ないし３ｍｉｎの架
橋結合時間に対し得られたことを示す。

一層長い架橋結合時間により、酵素の一層高い変性と膜
の一層高い凝集力とを生じラクテートの拡散量を制限す
る。これ等の２つの要因により、３ｍｔｎ以上の接触時
間に対し架橋結合時間に比例する信号の低下を招く。１
．５　ｍｉｎに対する３　ｍｉｎの架橋結合時間に対し
最もよい機械的性質を示すことにより、前記した実施例
で膜を調製するための時間を選択することができた。

Ｃ）ゼラチン濃度 可変の各量のゼラチン（前記の例で述べた処理による膜
の調製のための３ないし７多の溶液）と共に互いに同じ
量の酵素（３５（ｍに対しＩＯＵＩ）を含む各膜を試験
した。第６゛図は、次の共通の条件すなわち、 ホスフエート緩衝剤；０．ＩＭ％ｐＨ７．１温度二２１
°Ｃ のもとで、種種の１００分率のゼラチンの使用に対する
校正曲線を示す。

第６図の説明 横座標：Ｌ−ラクテートの濃度ｍＭ 縦座標：　Ｓｍａｘ傾斜（第３図で定められる）曲線（
３）ないし（５）に対し使ったゼラチン溶液・′中のゼ
ラチンの１００分率：それぞれ３、４、５、６及び７ 種種の要因を考慮しなければならない。

第１に最終の酵素蛋白質濃度はゼラチンの１００分率増
加に伴って低下する。従って理論的には蛋白質フィルム
は一層薄い膜中では一層高い活性を持たなければならな
い。

第２に膜の厚さはゼラチン濃度が増すと増加するからラ
クテート拡散係数従って電極応答が変る。

第３にグルタルアルデヒドの不活性化性（　３ｍｉｎに
等しい架橋結合時間）に対する保護作用はゼラチンの１
００分率に平行して増すから、厚い方のフィルムに訃い
て触媒活性が最もよく保持される。

従ってこれ等の種種の要因の間に妥協点を見付けなけれ
ばならない。第６図は５％ゼラチンを含む膜で０．２　
ｒｒＭ　より高い基質濃度に対し最良の電極応答の得ら
れることを示す。

本発明による酵素電極を作る上での一般的勧告は、最良
の基質拡散割合が確実に得られるだけ薄い膜内に高速の
活力が確実に生ずるようにできるだけ高い特殊な活性を
持つ酵素を使うことである。

しかし活用工程は新らたな系ごとに実施しなければなら
ない。膜の機械的抵抗のような結果は最適条件の最終選
択に或る程度役立つ。

２）測定条件の活用 前記した最適の条件（３５ｃｉｔに対しＩＯＵＩ、架橋
結合時間：３ｍｉｎ，ゼラチンの１００分率：５％、０
．５ｍＭの基質濃度）のもとで作った膜を使い、次のこ
とを研究した。

ａ）ホスフエート緩衝剤のモル濃度の影響第７図は、次
の共通の条件すなわち、 １．２５％グルタルアルデヒドの溶液（重量／容積）を
使う架橋時間：　３　ｍｉｎ ゼラチン溶液の濃度：５蝿（重量／容積）、温度＝２１
℃ Ｌ−ラクテートの濃度：　ｏ．ｓ　ｍＭのもとて種種の
量の酵素を使い互いに異なる３つの膜に対しホスフエー
ト緩衝剤（ｐＨ７．１）の濃度の関数として本発明によ
るバイオセンサの応答を与える曲線（１）ないし（３）
を表わす。

第７図の説明 横座標：ホスフエート緩衝剤の濃度（　ｒｒｉＭ）縦座
標：　Ｓｍａｘ傾斜（第３図に定めてある）曲線（１）
ないし（３）に対する酵素の量（３５二に対するＵＩ）
：それぞれ１、４及び１０すなわち調べた濃度に釦ける
緩衝剤のモル濃度は電極の応答にわずかな影響だけしか
及ぼさない。

さらに０−Ｉ　Ｍ　，　ｐＨ　７．１のホス７エート緩
衝剤のイオン強度をＮａＣｔ（　０．１ないし２．０　
Ｍ　）を量を増しながら加えることにより高めても、電
極応答は変らない（曲線を示してない）。しかし膜洗浄
工程の長さは増さなければならない。この場合３そらく
溶液の粘度の増加を伴う。

緩衝剤のイオン強度又はｐＨの変化がたとえば角質層の
塩分濃度と同様に可変の塩分濃度のときに直接測定中に
生ずるのは明らかである。前記の結果は、このような変
化が電極応答に極めてわずかな影響だけしか及ぼさない
ことを示す。

ｂ）電極応答に対する測定緩衝剤のｐ■の影響電極応答 第８図は、次の共通の条件すなわち ３５ｃ！ＩＬ２に対し１０　ＵＩ　（７）膜、ホスフエ
ート緩衝剤：　０．Ｉ　Ｍ、 １．２５％グルタルアルデヒド（重量／容積）の溶液を
使う架橋結合時間：３ｍｉｎ ゼラチン溶液の濃度：５多（重量／容積）、Ｌ−ラクテ
ートの濃度；０．５ｍＭ のもとてｐｎの関数としてバイオセンサの応答（第３図
に示したＳｍａｘ傾斜値）を示し各点は４つの測定値の
平均を表わす。

すなわちｐＨが６．５ないし８の間で変るときは電極応
答に著しい変化が認められない。この応答は試験条件の
もとて７．１のｐＨに対し最犬になる。

Ｃ）測定媒体の温度の影響 第９図は、次の共通の条件のもとで、 ３５０ｌに対しＩＯＵＩの膜、 ホスフエート緩衝剤：　０．Ｉ　Ｍ，　ｐｔ１　７．１
１．２５％グルタルアルデヒド（重量／容積）の溶液を
使う架橋結合時間：３ｍｉｎ ゼラチン溶液の濃度：５多（重量／容積）Ｌ−ラクテー
トの濃度：　０．５　ｍＭのもとて温度の関数としてバ
イオセンサ応答（第３図に示したＳｍａｘ傾斜値）を示
し、各黒点は４つの測定値の平均を表わす。

符号（小円）は、５０　℃−ｉで上昇し２５℃に戻る温
度試．験サイクルの終りに前記した条件のもとて酵素の
安定性を立証するものである。５０’Ｃ−１での高い温
度増加（この温度に保持された時間：約１６ｍｉｎ）は
２５℃に戻された電極の応答に著しい変化を生じない。

第９図に示すように０．５　ｍＭのラクテート濃度に対
し２０゜Ｃから４０℃まで温度を高めると電極の応答を
改良する。しかし３５°Ｃ以上の温度に対して測定の変
化の１００分率は極めて高くなり（４０’（：，に釦い
て１０％より大きい）、このことはトそらく電解質のガ
ス抜き処理に関連する。従って連続流れ実験はすべて２
１℃で行われる。このことは本発明によるバイオセンサ
の酵素膜の重要な熱的及び機械的安定性を示す。

■バイオセンサの使用 １）安定性 ａ）貯蔵条件のもとての安定性 第１０図は膜の調製後種種の時間にお・けるバイオセン
サの直線の区域応答を示す。

第１０図の説明 横座標：Ｌ−ラクテートの濃度ｍＭ 縦座標：第３図に示したＳｍａｘ傾斜 曲線（１）ないし（４）：それぞれ膜の調製後１、９、
お及び７５日 酵素膜はアジ化ナ｝　ＩＪウムなしで測定緩衝剤中に４
℃にかいて貯蔵した。第１の月中には電極応答には変化
が認められなかった。貯蔵の３個月１では検出限度と直
線応答区域とは保持され、そして測定はな釦、適当な校
正曲線によって精密に行うことができた。

ｂ）連続操作中の安定性 第１１図は、１５日間の操作後に直線区域のバイオセン
サ応答を示す。

第１ｌ図の説明 横座標：Ｌ−ラクテートの濃度ｍＭ 縦座標二第３図に示したＳｍａｘ傾斜 ｛ｌ｝：基準校正曲線 ｆ２１　：　１５日後 バイオセンサの応答の安定性を２ｒＴ′ｌＭの標準濃度
のＬ−ラクテートにより連続サイクルで試験した。応答
にあ１り変化を伴わないで８００回の測定サイクル（そ
れぞれ約１　ｍｉｎ　）を実施することができた（２系
列の実験）。この連続流れ方式で操作上の特別の安定性
は、Ｌ−ラクテートとの接触時間をｌ　Ｑ　Ｓ　ｅ　ｃ
／ｆイクル１で短縮するのに役立った。

酸化酵素は、共同因子（　ＦＡＤ　）の欠乏により、Ｈ
２０２により又は酵素反応中に生ずる酸素の活動種によ
り自動不活性化力を持つことが多い。自動不活性化は、
２種類の基質の濃度を増すときはそれだけ一層さびしく
なる。最大時限の安定性を得るには従って、Ｌ−ラクテ
ート溶液との接触時間をできるだけ制限することが大切
であるＣ）不連続の操作中の安定性 バイオセンサの安定性を、交互の周期の貯蔵（ホスフエ
ート緩衝剤中で４℃）及び測定（皮膚測定、２１℃の連
続流れ内）に対して試験した。感度が著しく低下したと
きでも（１５日後そして５００回以上の測定後）、検出
限度及び直線性が保持され、測定はな釦精密に実施する
ことができた。

これ等の戒績により本発明バイオセンサは、感度の変動
を単に日常の校正により制御でき得られる或績の信頼性
を確実にできる。

２）測定の精度 マイクロコンピュータの制御のもとに連続流れで実施さ
れる測定の変動性は４多以下であった（測定に影響を及
ぼす条件の完全な再現性、試料の一定の注入臣力、完全
に再現できるサイクル）。

３）將異性 本発明バイオセンサにより得られる戎績を液相クロマト
グラフーを使いラクテート測定を行う試料から優られる
成績と比較した。本発明バイオセンサの完全な作用とそ
のＬ−ラクテートの測定に対する特異性とを皮膚被覆に
存在する他の化合物からの干渉を受けないで指示する０
．９９９の相関係数が得られた。

以上本発明をその実施例について詳細に説明したが本発
明はなおその精神を逸脱しないで種種の変化変型を行う
ことができるのはもちろんである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明バイオセンサを作るのに使う電極の軸断
面図、第ＩＡ図は第１図の要部の拡大軸断面図、第２図
は第ＩＡ図の変型の軸断面図である。 第３図、第４図、第５図、第６図、第７図、第８図、第
９図、第１０図、第１１図、第１２図及び第１３図はと
くに前記電極を最高に活用するように、実施される測定
中に得られるそれぞれ互いに異なる曲線の線図である。 １・・・検出測定手段（電極）、８・・・酵素膜、１３
・・・測定室、１５・・・皮膚被覆区域、１６、１７・
・・管図面の浄書（内容に変更なし） Ｎ！ ＋４ＪＬＪ１Ｌ／’　　ＩＪ”　　％Ｊ　ＬＩＭ　　ρ
−１　　１ＪＩ　　Ｎｕ　Ｌ　ｒ　　Ｌｌ　＋　　（ノ
Ｕイ−ｊｒｒイ　　　Ｎ　　　ｒ　　　　０Ｕｌ　ｑＪ
　　Ｌｎ　　Ｌ／１　　ｕ：　　％Ｊ　　Ｕ％　　ＩＴ
Ｉ　　Ｌ／ｌ−　〜　ｌＪ＋　　ｒ−　　ｕ＋　　（ｕ
Ｕイ　　　Ｑ　　　門　　　Ｎｒ−　　　　Ｃ）しＵ 手続補正書（斌〉 待 ｌ午 庁 長 官 殿 １．事件の表示 平成１年特許願第３２５７２８号 ２，発明の名称 酵素バイオセンサ ３．補正をする者 事件との関係 ４ｄ午出臥 ロ レ ア ル （平或２年３月２７日発送） ７．肴１ｉｉＥの内容 別紙 の と お り

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、皮膚の新陳代謝に使われる基質の変質に触媒作用を
   及ぼすようにした酵素を固定する膜（８）と、この酵素
   膜に接触させる測定しようとする前記基質の濃度を表わ
   す、前記変質により生ずる現象を検出し測定する手段と
   を備え、皮膚の少なくとも１種類の生化学的パラメータ
   を直接測定するようにした酵素バイオセンサにおいて、
   開口を持つ測定室（１３）を備えこの室の１個所の壁区
   域を前記酵素膜（８）により構成し、前記した開口を測
   定中は皮膚被覆区域（１５）により閉じることができ、
   前記室（１３）に測定しようとする基質を溶液に入れる
   ために液体を前記室内で循環させる手段を組合せたこと
   を特徴とする酵素バイオセンサ。 ２、測定しようとする基質の変質を、酸素を消費し又は
   Ｈ＿２Ｏ＿２を生成し或はこれ等の両方が生ずる反応と
   し、検出し測定する手段を、酸素分圧の低下又はＨ＿２
   Ｏ＿２の濃度の増加を測定する電極（１）により構成し
   、前記酵素膜（８）を前記電極（１）の端部の感知部分
   に当てがい、溶液中に入れる液体として酸素を供給する
   ことのできる緩衝剤を使つた請求項１記載のバイオセン
   サ。 ３、測定室（１３）を、一端部には前記電極（１）の感
   知端部部分を密封状態で取付け、他端部には前記の室の
   開口を設けた環状体（１４）により構成した請求項２記
   載のバイオセンサ。 ４、皮膚のＬ−ラクテートの測定に使われ、酵素として
   Ｌ−ラクテート酸化酵素とくにペジオコツクスＳＰ．Ｌ
   −ラクテート酸化酵素を使い、前記電極として酸素分圧
   の低下を測定する電極を使つた請求項２記載のバイオセ
   ンサ。 ５、酵素膜（８）を、ガスに対し選択的透過性を持つ疎
   水性物質から成るフィルム支持体（５）と架橋剤で少な
   くとも１種類の不活性蛋白質を架橋結合させることによ
   り生成する酵素含有フィルムとにより構成し、前記の酵
   素膜（８）のフィルム支持体（５）は前記電極（１）の
   側に配置すると共に、前記酵素含有フィルムは前記測定
   室（１３）の開口に対向して配置した請求項１記載のバ
   イオセンサ。 ６、前記の不活性蛋白質としてゼラチンを使つた請求項
   ５記載のバイオセンサ。 ７、前記架橋剤としてグルタルアルデヒドを使つた請求
   項５記載のバイオセンサ。 ８、前記フィルム支持体（５）の疎水性構成物質として
   ポリプロピレン又はポリテトラフルオルエチレンを使つ
   た請求項５記載のバイオセンサ。 ９、前記フィルム支持体（５）の厚さを６ないし１５μ
   ｍとした請求項５記載のバイオセンサ。 １０、前記酵素含有フィルムの厚さを３０ないし５０μ
   ｍとした請求項５記載のバイオセンサ。 １１、前記酵素含有フィルムに１ｃｍ＾２の膜当たり０
   ．１５ないし０．５０ＵＩのＬ−ラクテート酸化酵素を
   含ませた請求項５記載のバイオセンサ。 １２、請求項５記載のバイオセンサ用の酵素膜を調製す
   る方法において、 ａ）ｍｌ当り４ないし２０ＵＩのＬ−ラクテート酸化酵
   素と３０ないし７０ｍｇのゼラチンとを含む水溶液を調
   製し、 ｂ）この溶液をフィルム支持体（５）上に１０ないし５
   ０μｌ／ｃｍ＾２の量で広げ、この被覆を乾燥し、ｃ）
   ０．５ないし２重量％の濃度を持つグルタルアルデヒド
   の水溶液を前記のようにして得られた乾燥被覆上に注ぎ
   １．５ないし４ｍｉｎの時限にわたり架橋結合させる酵
   素膜調製法。 １３、請求項１記載のバイオセンサを使い皮膚の少なく
   とも１種類の生化学的パラメータを直接測定する方法に
   おいて、前記バイオセンサを皮膚被覆の選定した区域に
   当てがい、前記測定室（１３）の開口を前記の皮膚被覆
   区域により閉じるようにし、触媒作用を促進する組成を
   持つ測定しようとする皮膚基質を可溶化することのでき
   る液体を前記室（１３）に注入し、この測定室（１３）
   の充満後に前記膜（８）の酵素の触媒作用に基づく前記
   基質の変質により生ずる現象の検出及び測定を行い、前
   記の基質を可溶化する液体を循環させる直接測定法。 １４、測定サイクルを、逐次の２回のサイクルの間に酵
   素膜（８）を空気に露出しないで同じ場所で反復する請
   求項１３記載の測定法。 １５、皮膚ラクテートを溶液に入れるための液体として
   、６ないし８のｐＨを持つ緩衝剤を使い、酸素分圧ｐＯ
   ＿２の変動を前記の室内の緩衝剤の非循環周期中に時間
   の関数として記録し、この記録時に横座標を緩衝剤注入
   の開始時とし縦座標をｐＯ＿２の最高値とする点Ａを定
   め、この点Ａを記録曲線の最低値Ｂに連結する直線Ｄを
   定め、この直線の傾斜Ｐを皮膚ラクテートの量を表わす
   値として使うように測定する請求項１３記載の測定法。 １６、緩衝剤の循環を３ないし６ｍｉｎの時限にわたり
   停止する請求項１５記載の測定法。 １７、皮膚の水和の評価に使う請求項１ないし１１のい
   ずれかに記載のバイオセンサの利用法。 １８、汗の分泌の評価に使う請求項１ないし１１のいず
   れかに記載のバイオセンサの利用法。