DE3427444A1 - Verfahren und einrichtung zur durchfuehrung und verfolgung von enzymatischen reaktionen - Google Patents
Verfahren und einrichtung zur durchfuehrung und verfolgung von enzymatischen reaktionenInfo
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Description
VERFAHREN UND EINRICHTUNG ZUR DURCHFÜHRUNG UND VERFOLGUNG VON ENZYMATISCHEN REAKTIONEN
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Einrichtung zur Durchführung und Verfolgung von enzymatischen Reaktionen
bei der Verwendung von immobilisierten Enzymen.
Die quantitative Feststellung einer Substratkonzentration basiert auf der experimentalen Ermittlung einer
Kalibrierungskurve, wobei es zweckmäßig ist, daß die Kalibrierung linear und über der Zeit unveränderlich ist.
Man kennt kinetische und stabilisierte Kalibrierverfahren.
Bei der kinetischen Methode wird zur Kalibrierung ein Parameter genutzt, der die Ä'nderungsgeschwindigkeit
der verfolgten Kenngröße kennzeichnet, die in dem Reaktionsgemisch nach der Probezugabe überwacht wird.
Dabei wird der Anfangswert der Abweichung der verfolgten Kenngröße von einer Kennlinie zu einem Zeitpunkt, in welchem
die verfolgte Kenngröße nach der Probezugabe einen bestimmten, vorher gewählten Wert erzielt, oder der Kenngrößewert
verwendet, den sie nach einer bestimmten, vorher gewählten Zeit von der Probezugabe an erzielt. Bei
den stabilisierten Methoden wird die Kalibrierabhängigkeit aus dem stabilisierten Wert der verfolgten Kenngröße
bestimmt, der in dem Reaktionsgemisch nach der Probezugabe erzielt wird. Die kinetischen Kalibriermethoden
sind vorteilhaft, weil sie eine schnelle Feststellung des zugehörigen Substrats ermöglichen. Ihr Nachteil
liegt darin, daß die Geschwindigkeit der verfolgten Änderung von der Kinetik der eigenen enzymatischen Reaktion
abhängig werden kann, die sich stark mit der sinkenden Enzymaktivität ändern kann.
Im allgemeinen werden zwei Verfahren der Enzymdosierung
in ein Reaktionsgefäß angewendet. Bei dem einen werden das Enzym oder die Enzyme, die in einem geeigneten Puffer
gelöst oder suspendiert sind, in einem aus den Puffern und Kofaktoren bestehenden Medium dosiert. Danach
wird die geprüfte Probe, wie Glukose, Blut, Plasma oder eine ähnliche Probe, zugegeben. Mit einem Fühler wird
der Verlauf der enzymatischen Reaktion, z.B. der Sauerstoffabfall in dem Reaktionsgefäß durch eine Sauerstoffelektrode
registriert. Durch einen Vergleich mit der Kalibrierkurve wird dann die Stoffkonzentration in der
Probe festgestellt. Bei diesem Dosierungsverfahren ist das Enzym in dem Reaktionsmedium homogen verteilt. Nach
dem Reaktionsende wird mit dem Reaktionsmedium auch das Enzym beseitigt. Für jede weitere Feststellung ist eine
neue Enzymdosis notwendig. Der Hauptnachteil dieses Verfahrens liegt also in dem hohen Verbrauch von teuren
Enzymen, die nicht mehr genutzt werden können.
Bei dem anderen Verfahren wird das Enzym oder werden die
Enzyme auf der äußeren Oberfläche der den Fühler bedeckenden Membran immobilisiert. Auf die den Fühler bedeckende
Membran kann noch eine weitere Membran oder ein Gewebe gelegt werden, auf der bzw. auf dem mit einem geeigneten
Verfahren das Enzym gebunden wird. Dadurch wird eine sogenannte "Enzymelektrode11 ausgebildet. Das immobilisierte
Enzym ist für viele Analysen brauchbar. Der Hauptnachteil von Enzymelektroden liegt darin, daß .die enzymatische Reaktion
das Konzentrationsfeld des verfolgten Reaktionsproduktes oder Substrates in der unmittelbaren Nähe des
elektrochemischen Sensors beeinflußt und sich so an der Pegelausbildung des Sensorsignals beteiligt, weil der
Signalpegel des Sensors von der Transportkinetik des verfolgten Stoffes durch die Schicht des verankerten Enzymes
abhängig ist. Der Transport der verfolgten Komponente durch eine solche Schicht und damit auch das Sondensignal
ist durch die innere Diffusion von anderen, an der Reaktion teilnehmenden Stoffen in der Schicht und durch die
Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion bestimmt, die weiterhin von der Konzentration und der Aktivität des
in der Schicht gebundenen Enzymes abhängig ist. Deshalb sind die Kalibriereigenschaften der Enzymelektroden sowohl
von den kinetischen Parametern der enzymatischen Reaktion als auch von den Parametern abhängig, die den
Diffusionstransport von einzelnen Komponenten kennzeichnen, die den Sensor bedecken. Diese Parameter können sich
wegen der Vorbereitung der Sonde mit dem gebundenen Enzym, z.B. mit der Enzymmenge, die in der Einheit des
Trägervolumens gebunden ist, oder wegen seiner Aktivität
ändern, wobei die Komponentendiffusionsfähigkeit mit Hilfe eines Trägers sich nicht nur mit den Mengenänderungen
des gebundenen Enzymes, sondern auch mit der Trägervernetzungsstufe ändert. Im Verlauf der Sondenanwendung
sinkt allmählich die Enzymaktivität. Diese Erscheinungen ergeben einen starken Einfluß auf die Pegelausbildung
des Sondensignals, sind mit einfachen Gleichungen nicht zu beschreiben und deshalb für eine automatische
Signalauswertung ungeeignet. Dies wirkt sich bei den Analysatoren nachteilig aus, die Enzymelektroden mit
komplizierten mehrschichtigen Membranen verwenden, die eine schnelle Sondenerneuerung nicht ermöglichen. Es ist
auch nicht möglich, einen Sondenvorrat anzulegen und die Sonden bei einer tiefen Temperatur bis zur Verwendung
aufzubewahren. Die Abhängigkeit des Pegels des Sondensignals von der Kinetik der enzymatischen Reaktion und
der inneren Diffusion der abreagierten Komponenten in der Schicht des verankerten Enzymes, die aus der Systemgeometrie
hervorgeht, kompliziert sowohl die Messung als auch die Auswertung.
Dadurch, daß das Sondensignal von den Diffusionsvorgän-
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— O ~"
gen in den dicht an dem elektrochemischen Sensor anliegenden Schichten bestimmt wird, ist dieser sehr empfindlich
bei kleinen Geometrxeanderungen dieser Schichten, die von geringen Deformationen der elastischen Schichten,
z.B. durch eine mechanische Brührung, durch intensive Mischung, durch einen Stofl des elektrischen Rührwerks
gegen den Sensor und dergleichen hervorgerufen werden..Weiter ist eine große Signalinstabilität vorhanden,
ist eine häufige Neueichung erforderlich und das Verhalten der Enzymelektrode mathematisch nur sehr
kompliziert zu beschreiben. Bei der Anwendung eines Mikrorechners für die Auswertung des Sondensignals sind
eine komplizierte Software und ein großer Speicherumfang
notwendig.
Diese Nachteile werden durch das erfindungsgemäße Verfahren
zur Durchführung und Verfolgung von enzymatischen Reaktionen bei der Verwendung von immobilisierten
Enzymen beseitigt.
Erfindungsgemäß werden die enzymatischen Reaktionen in einem Reaktor durchgeführt, wobei der Enzymstoff auf
einer Rührwerksoberfläche oder auf der Oberfläche eines
anderen, leicht herausnehmbaren unbeweglichen, in dem Reaktor installierten Bestandteils, getrennt von dem Sensor
der Meßeinrichtung in einer solchen Menge fixiert wird, die für die Aufrechterhaltung der Konzentration
des zu bestürmenden Stoffs auf der Enzymschichtoberfläche
in einer Meßreihe auf Werten zwischen 0 und 3 %, bezogen auf die Konzentration in der Ausgangslösung ausreicht.
Gemäß einem weiteren Erfindungsmerkmal werden in die
flüssige Reaktionsmischung die Viskosität erhöhende Stoffe, wie Carboxymethylzellulose oder Polyvinylalkohol
zugegeben.
Die erfindungsgemäße Einrichtung zur Durchführung des
Verfahrens besteht aus einem Reaktor, der mit einem Rührwerk, vorzugsweise mit einem magnetischen Rührwerk,
versehen ist, auf dessen Oberfläche eine Schicht des enzymatischen Stoffes fixiert ist.
Alternativ sind in dem Reaktor herausnehmbare unbewegliche und mit einer Schicht des fixierten enzymatischen
Stoffes versehene Bauteile untergebracht.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist vielfältig einsetzbar, beispielsweise bei der Glukosefeststellung in den
Körperflüssigkeiten, im Blut, Serum oder Plasma, im Harn, bei der Glukoseoxydation durch Sauerstoff in der Anwesenheit
von Enzymen der Glukosooxydase und Katalase durch die Verfolgung des Sauerstoffverbrauchs mittels einer
Sauerstoffelektrode. Das erfindungsgemäße Verfahren ist in Verbindung mit einer Sauerstoffelektrode für eine
quantitative Peststellung auch von anderen Stoffen, wie z.B. Milchsäure, Harnsäure, Cholesterin, 1-Aminosäuren,
d-Aminosäuren, Alkohol, Galaktose und anderer Substrate in Verbindung mit der zugehörigen spezifischen Oxydase
anwendbar. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch für die quantitative Feststellung von solchen Stoffen, für
welche die zugehörige Oxydase unbekannt ist, z.B. für die Peststellung von Saccharose, Maltose oder Glykogen
anwendbar, wenn mehrere verschiedene Enzyme verwendet werden, durch deren folgende Einwirkung zuletzt ein oxydierbares
Substrat ausgebildet wird. Für die Saccharosefeststellung werden Invertase und Glukosooxydase, für
die Maltosefeststellung die Enzyme Maltase und Glukosooxydase, für die Glykogenfeststellung die Enzyme Amylase,
Maltase und Glukosooxydase verwendet. Das erfindungsgemäße Verfahren ist außerdem in Verbindung mit einem anderen
Fühler, z.B. mit einer pH-Elektrode, für die quan-
titative Feststellung von unoxydierbaren Substraten einsetzbar. Dies ist nicht nur für analytische Zwecke
sondern auch für die Herstellung von Vorteil, z.B. für die Reinigung von Arzneimittellösungen oder von Getränken
von unerwünschten Beimischungen oder Produkten, und zwar überall dor&, wo mittels der Enzyme oder des Enzyms
die erforderliche Umwandlung stattfindet und aufgrund der Änderung eines physikalischen Parameters der
Verlauf oder die Beendigung einer enzymatischen Reaktion kontrollierbar ist. Solche physikalischen Parameter sind
z.B. die Konzentration des Sauerstoffs, Wasserstoffperoxids, Wasserstoffs, die Fluoreszenz, der pH-Wert, die
Leitfähigkeit, die Extinktion, die Farbe und dergleichen.
Die erfindungsgemäße Einrichtung weist folgende Vorteile auf: Der Rührwerkskörper oder der Gegenstand mit dem
verankerten Enzym ist 1eicht herausnehmbar, austauschbar oder erneuerbar, bzw. die äußere Schicht mit dem verankerten
enzymatischen Material ist ohne Änderung des Sensorkennwertes, der zur Verfolgung des Reaktionsverlaufes
verwendet wurde, austauschbar. Das Rührwerk oder der Gegenstand mit dem verankerten Enzym oder die Folie mit dem
enzymatischen Material zur Festsetzung auf der Oberfläche des Rührwerkes oder des herausnehmbaren Gegenstandes
kann auf Vorrat gehalten und ohne Aktivitätsänderung mehrere Monate aufbewahrt werden. Durch den Austausch
eines Rührwerkes mit einem enzymatischen, auf seiner Oberfläche immobilisierten Materials durch ein Rührwerk
mit einem anderen, auf seiner Oberfläche verankerten enzymatischen Materials, ist es möglich, in demselben Reaktor
mit Hilfe desselben Fühlers ein anderes Substrat zu analysieren. In einer einzigen Probe in demselben Reaktor
mit einem einzigen Fühler sind so durch bloßen Austausch des Rührwerkes mit dem jeweiligen immobilisierten
Enzym mehrere Stoffe feststellbar, z.B. Glukose im Blut-
plasma mit Hilfe eines Gegenstandes mit immobilisierter Glukosooxydase, durch den Austausch des Gegenstands mit
immobilisierter Laktatooxydase die Milchsäure und durch
den Austausch des Gegenstands mit immobiliserter Urato-5 oxydase die Harnsäure, ohne dabei den Inhalt des Reaktionsgefäßes
oder den Sensor zu ändern.
Durch eine Drehzahländerung des Rührwerkes oder durch
eine Viskositätsänderung des Reaktionsgemisches durch Zugabe von die Viskosität beeinflussenden Stoffen, wie
Carboxymethylzellulose oder Polyvinylalkohol, ist die Einflußmasse der äußeren Diffusion auf die Änderungsgeschwindigkeit der verfolgten Größe steuerbar und somit
der Analysatorkalxbrierbereich veränderbar. Der Bereich der Steuerrolle der äußeren Substratdiffusion zur
Oberfläche des Enzymfilms wird erreicht, solange die Substratkonzentration auf der Oberfläche des verankerten
Enzymes auf einem sich Null nähernden Wert, in jedem Fall auf einem Wert, der niedriger als 3 % des Wertes
von der ursprünglichen Substratkonzentration in der Probe, gehalten wird. Dieser Bereich ist durch verschiedene
Vorgänge erreichbar, z.B. durch die Drehzahlherabsetzung des Rührwerkes, womit die Dicke des flüssigen Films auf
der Oberfläche der Schicht mit dem enzymatischen Material
anwächst, oder durch die Viskositätserhöhung der Probe der gemessenen Flüssigkeit, womit wieder die Dicke des
flüssigen Films anwächst und dazu hie Substratdiffusivitat
sinkt, oder durch die Aktivitätserhöhung des immobiliserten Enzymes.. Solange das Gerät in dem Bereich der
Steuerrolle der äußeren Diffusion des festgestellten stoffes eingesetzt- ist, hat es die nachstehend angegebenen
Vorteile:
Eine einfache mathematische Beschreibung der Änderungsgeschwindigkeit der verfolgten Größe über der Zeit, ist
- ίο -
für einen geschlossenen Reaktor durch die exponentiale Abhängigkeit der verfolgten Größe, z.B. der Sauerstoffkonzentration
mit der Zeit, gegeben. Diese Abhängigkeitscharakteristik ist für ein beliebiges Enzym die
gleiche, also auch bei der Konzentrationsverfolgung von einem beliebigen Enzym. Es ist vorteilhaft, bei der
Signalverarbeitung einen Mikrorechner zu verwenden, weil die Softwareausrüstung einfach und für eine ganze Gerätereihe
für die Feststellung von verschiedenen Substraten kongruent ist. Die Kalibrierabhängigkeit, die auf dem
Wert der Anfangsgeschwindigkeit der Veränderung der verfolgten
Größe, z.B. der Geschwindigkeitsänderung der Sauerstoffkonzentration basiert, ist dann linear, wobei
die Richtlinie der linearen Abhängigkeit nicht von der Enzymaktivität abhängig ist, soweit die Enzymkonzentration
oder -aktivität hoch genug ist. Die Enzymaktivität bestimmt nur den Bereich, in dem die Kalibrierabhängigkeit
linear ist. Mit der Enzymaktivitätssenkung vermindert sich der Linearitätsbereich. Eine langzeitige Stabilität
der Gerätekalibrierung ist durch eine hohe Konzentration des verankerten Enzymes erreichbar. Dann
wirkt die Aktivitätssenkung auf die Kalibrierung nicht ein, solange das Enzym die Konzentration des festgestellten
Substrates auf der Oberfläche der Enzymschicht auf einem Wert nahe Null bei der Obergrenze des Gerätebereiches
halten kann. Durch eine Lösungsviskositätsvergrößerung oder durch eine Rührwerkdrehzahlverminderung
wird der lineare Kalibrierbereich erweitert. Die Kalibrierabhängigkeit ist auf mechanische Berührung
nicht empfindlich. Das Rührwerk oder die herausnehmbaren Bauteile sind aus dem Reaktor herausnehmbar, mit der
Hand greifbar und in den Reaktor ohne eine Änderung der Gerätekalibrierung einlegbar.
Anhand von Zeichnungen wird die Erfindung näher erläu-
tert. Es zeigt:
Fig. 1 schematisch eine Einrichtung zur Durchführung
des Verfahrens und
Fig. 2 eine Kalibrierkurve.
Fig. 2 eine Kalibrierkurve.
Die in Fig. 1 gezeigte Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens besteht aus einem Mantel 1 und einer Sauerstoff
sonde 2, deren Sensor von einer Probe in einem Reaktor 3 durch eine für den Sauerstoff durchlässige Membran
4 abgetrennt ist. Im Inneren des Mantels 1 ist ein magnetisches Rührwerk 5 gelagert, auf welchem eine Folie
7 mit immobilisierten Enzymen mit einem Ring 8 befestigt ist. Das magnetische Rührwerk 5 wird von einem Magnet
6 angetrieben. Auf die Polyacrylamidoberflache des magnetischen Rührwerkes 5 oder auf der Folie 7 aus demselben
Stoff wird z.B. mit Hilfe von Zyanurchlorid oder Carbodiimiden oder durch Verbindung des Enzymes mit
einem geeigneten Eiweißstoff und Glutaraldehyd ein Gemisch aus Glukosooxydase und Katalase in einer Gesamtmenge von 20 internationalen Einheiten immobilisiert.
einem geeigneten Eiweißstoff und Glutaraldehyd ein Gemisch aus Glukosooxydase und Katalase in einer Gesamtmenge von 20 internationalen Einheiten immobilisiert.
In den Reaktor wird eine Probe in Form einer Lösung eines Puffers mit einem pH-Wert von 6,6, die Glukose enthält,,
eingetragen, deren Menge ermittelt werden soll. In der Tabelle ist in der ersten Spalte die Anfangsrichtlinie
der .Signalabhängigkeit der Sauerstoffsonde 2 in den gewählten
Einheiten, in der zweiten Spalte die Anfangskonzentration der Glukose in dem Reaktionsgemisch in
Millimol und in der dritten Spalte die Menge der Grundlösung in Millimol angegeben. Aus der Tabelle ergibt
sich, daß ein sehr umfangreicher Linearitatsbereich der Kalibrierkurve in den Grenzen 0 bis 0,7407 mMol der anfänglichen Glukosenkonzentration erreicht wird. Die zugehörige Kalibrierkurve ist in Fig. 2 dargestellt.
Millimol und in der dritten Spalte die Menge der Grundlösung in Millimol angegeben. Aus der Tabelle ergibt
sich, daß ein sehr umfangreicher Linearitatsbereich der Kalibrierkurve in den Grenzen 0 bis 0,7407 mMol der anfänglichen Glukosenkonzentration erreicht wird. Die zugehörige Kalibrierkurve ist in Fig. 2 dargestellt.
Die Enzyme werden auf einem Nylonnetz mit einer Maschengröße von 50 pm auf der durch den Ring 8 begrenzten
Fläche mit einem Durchmesser von 10 mm fixiert. Auf diese Fläche werden ca. 20 internationale Einheiten roher
Glukosooxydase, die auch Katalase beinhaltet, aufgetragen. Die Lösungsvorbereitung für die Fixation der
Glukosooxydase auf dem Nylonnetz erfolgt so:
Es werden 100 ul folgenden Gemisches vorbereitetr 5 mg
Glukosooxydase, die in 50 ul Wasser gelöst ist; dann werden 50 ul 10%-iges Rindalbumin und 20 ml 2%-iger
Glutaraldehyd in 0,5 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert
von 6,6 zugegeben. Auf das Netz in dem Ring 8 mit dem Durchmesser von 10 mm werden 15 bis 20 ul dieses Gemisches
aufgetragen und getrocknet.
Anfangsricht1inie Anfangskonzentration
der Abhängigkeit von der Glukose in dem der Sauerstoffsonde Reaktionsgemisch
18,7 24,4
0,8888 1,481
ul der GIu-Tcosegrund-1 ös u ng
35; | 0,4 | 0,0185 | 1 | ,25> | \ | 1V | Linea rität |
|
1; | 1,0 | 0,0481 | 3 | ,25 | ||||
Ir6 | 0,0741 | ■3 | ||||||
2, | 2,4* | 0,1111 | 7 | ,5 | ||||
3, | 3,2* 4,8 |
0,1481 0,222 |
10 15 |
|||||
6,4 | 0,2963 | 20 | ||||||
1; | 8,5 | 0,3703 | 25 | |||||
9,9 | 0,444 | 30 | ||||||
13,4 | 0,5926 | 40 | ||||||
16, | 16,5* | 0,7407 | 50 | |||||
60 100
* wiederholte Feststellungen nach 1 Tag,
Erfindungsgemäß erhält man also eine schnelle Antwort des Sensors, gleichzeitig ist der Verbrauch bei der Enzymimmobilisierung
gering.
Claims (4)
- ν. FONER EBBINGHAUS FINCKPATENTANWÄLTE EUROPEAN PATENT ATTORNEYS.— . . .'MARIAHILFPLATZ 2 & 3, MÖNCHEN 9O 3 4· 2 7 4- APOSTADRESSE: POSTFACH 95 Oi 6O, D-8OOO MÖNCHEN 95Vysokä skola chemicko-J 25. Juli 1984technologickäDEAC-32108.4VERFAHREN UND EINRICHTUNG ZUR DURCHFÜHRUNG UND VERFOLGUNG VON ENZYMATISCHEN REAKTIONENPatentansprücheVerfahren zur Durchführung und Verfolgung von enzyma- tischen Reaktionen bei der Verwendung von immobilisierten Enzymen, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatisehen Reaktionen in einem Reaktor durchgeführt werden, wobei der Enzymstoff auf einer Rührwerksoberfläche oder auf der Oberfläche von einem anderen, leicht entfernbaren unbeweglichen und in dem Reaktor installierten Bestandteil im Abstand von einem Sensor einer Meßeinrichtung in einer solchen Menge festgesetzt wird, die für die Aufrechterhaltung der Konzentration Urs zu bsstiinirienden Stoffs auf der Enzymschichtoberfläche in einer Meßreihe auf Werten zwischenO und 3 Sf bezogen auf die Konzentration in der Ausgangslösung, ausreicht.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in die flüssige Reaktionsmischung die Viskosität erhöhende Stoffe, wie Carboxymethyl Zellulose oder Polyvinylalkohol zugegeben werden.
- 3. Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Reaktor (3), der mit einem Rührwerk (5), vorzugsweise mit einem magnetischen Rührwerk (5) versehen ist, auf dessen Oberfläche eine Schicht des enzymatischen Stoffes fixiert ist.
- 4. Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Reaktor (3), in welchem herausnehmbare, unbewegliche und mit einer Schicht des fixierten enzymatischen Stoffes versehene Bestandteile angeordnet sind.
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DE3427444C2 DE3427444C2 (de) | 1989-09-07 |
Family
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DE (1) | DE3427444A1 (de) |
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- 1984-07-25 DE DE19843427444 patent/DE3427444A1/de active Granted
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- 1984-07-27 JP JP59155675A patent/JPS6091996A/ja active Pending
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- 1984-07-27 AT AT0243484A patent/AT389317B/de not_active IP Right Cessation
- 1984-07-27 GB GB08419285A patent/GB2145815B/en not_active Expired
- 1984-07-27 IT IT8422105A patent/IT1205647B/it active
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IT1205647B (it) | 1989-03-23 |
AT389317B (de) | 1989-11-27 |
GB8419285D0 (en) | 1984-08-30 |
JPS6091996A (ja) | 1985-05-23 |
DE3427444C2 (de) | 1989-09-07 |
FR2549852B3 (fr) | 1985-11-22 |
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CA1218289A (en) | 1987-02-24 |
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