DE2926167C2

DE2926167C2 - Molekülselektiver Sensor

Info

Publication number: DE2926167C2
Application number: DE2926167A
Authority: DE
Inventors: Jenö Dr. Havas; Geza Dr. Nagy; Emma Porjesz; Ernö Dr. Budapest Pungor
Original assignee: RADELKIS ELEKTROKEMIAI MUESZERGYARTO SZOEVETKEZET BUDAPEST HU
Current assignee: RADELKIS ELEKTROKEMIAI MUESZERGYARTO SZOEVETKEZET BUDAPEST HU
Priority date: 1978-06-21
Filing date: 1979-06-28
Publication date: 1981-12-03
Also published as: GB2054859A; SU1034618A3; DE2926167A1; US4354913A

Description

Molekülselektive elektroanalytische Sensoren zur Bestimmung von in Flüssigkeitsproben gelösten Verbindungen sind bekannt. Die elektrochemischen Eigenschaften und die Anwendungsmöglichkeiten der molekülselektiven Sensoren werden in der Literatur (z. B. in P. L Bailey: Analysis with Iron Selective Electrodes, Heycien and Son Ltd., London, 1976) ausführlich beschrieben. Bekanntlich haben die molekülselektiven Sensoren einige gemeinsame Eigenschaften, z. B. daß der Tragkörper des Sensors, welcher die ionenselektive oder Metall-Indikationselektrode und die Bezugselek- gg trode enthält, in einem rohrförmigen, mit Elektrolytlösung gefüllten Umhüllungskörper, dessen Ende an der Seite der aktiven Oberfläche der Indikatorelektrode mit einem für Gase oder für Gase und gelöste Stoffe durchlässigen Häutchen (z. B. mit einem Dialysehäutchen) abgeschlossen ist,* umhüllt wird, und dieses Häutchen in Kontakt ist mit einem für Gase oder für Gase und gelöste Stoffe durchlässigen Häutchen (z. B.

mit einem Häutchen aus segmentierter Hydratzellulose und einer Lösungsschicht, welche das selektive Enzym in suspendierter Form enthält Eine solche Elektrodenzelle ist z. B. aus CH-PS 5 69 973 bekannt

Der Wirkungsmechanismus der bekannten molekülselektiven Sensoren ist der folgende; Die Moleküle der zu bestimmenden Komponente, z. B. die GIucose-Moleküle und gegebenenfalls die Moleküle des Reagens (die Sauerstoffmoleküle) diffundieren in die Schicht, welche das selektive Enzym (z. B. Glucoseoxidase) enthält und welche als wirkungsspezifischer Katalysator dient, in die sogenannte Reaktionsschicht wo sich eine chemische Reaktion abspielt Das Ausgangssignal der Indikatorelektrode ist eine eindeutige Funktion der Konzentration oder der Aktivität des an der Enzymreaktion teilnehmenden Reagens oder einer der teilnehmenden oder entstehenden Komponenten. Der lokale Wert der Aktivität oder der Konzentration ist falls alle Faktoren als konstant angenommen werden können, von der Reaktionsgeschwindigkeit abhängig, welche eine eindeutige Funktion der Konzentration des Substrates ist Deshalb kann in stationärem Zustand durch die Messung der Stromstärke oder des EMK-Wertes die gesuchte Konzentration der Probe direkt bestimmt werden.

Die Herstellung der bekannten ronlekülselektiven Sensoren ist eine komplizierte, zeitraubende und eine außerordentliches Sachverständnis erfordernde Aufgabe, deren Ergebnis nur zufällig reproduzierbar ist

Der größte Nachteil solcher Sensoren besteht in ihrer kurzen Lebensdauer (z. B. einige Tage, ein bis zwei Wochen), die mit den ungünstigen Eigenschaften der Reaktionsschicht in Zusammenhang steht Ein weiterer Nachteil liegt darin, daß die Sensoren, bzw. die Gelschichten, welche das gebundene Enzym enthalten, außer Gebrauch bei niedriger Temperatur (z. B. zwischen -1 bis 2° C) gehalten werden müssen, um die Enzymaktivität zu bewahren.

Ein weiterer Nachteil liegt cjrin, daß in der amperometrischen Indikatorelektrode (z. B. in der Platinelektrode) gelöstes Gas (z.B. Sauerstoff), oder eine an der Oberfläche gebildete Oxidschicht, oder infolge des Gebrauches an der Oberfläche der Indikatorelektrode gebildete Metallverunreinigungen (z. B. Silberverunreinigungen) oder andere Isolationsschichten einen ungünstigen Einfluß auf das Signal-Geräusch-Verhältnis bewirken, weil die aktive Oberfläche der Indikatorelektrode und dadurch das durch die Elektrode gelieferte Signal verringert wird.

Ausgehend von einem molekülselektiven Sensor gemäß den Merkmalen nach dem Oberbegriff des A nspruchs 1 ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung einen molekülselektiven Sensor zu schaffen, der einfach, in kurzer Zeit, reproduzierbar herzustellen ist, eine lange Lebensdauer (z. B. '/2 bis 1 Jahr) besitzt und eine große mechanische Festigkeit und kurze Ansprechzeit (z. B. von 20 bis 30 Sekunden) aufweist

Diese Aufgabe wird bei einem molekülselektiven Sensor der oben genannten Art durch das Merkmal des Kennzeichens gemäß Anspruch 1 gelöst,

Die mechanische Festigkeit der albuminösen, natürlichen Membranen (z. B, die Luftbalse von Fischen, Hautpartien von Säugetieren und Reptilien oder die Hornhaut und Darmwand einiger Tierarten) ist, trotz ihrer in bezug auf die Ansprechzeit sehr vorteilhaften Dicke (von ΙΟμπι bis 15μιη) ausgezeichnet; außerdem ist die Konzentration der aktiven Aminogruppen an den von Aminosäuren aufgebauten Membranen im Hinblick

auf die chemische Bindung von Enzymen mit albuminöser Struktur, auch optimal und konstant. Auf diese Weise können im breiten Konzentrationsbereich arbeitende Sensoren mit kurzer Ansprechzeit hergestellt werden. Nach dem Immobiiisationsverfahren können die aktivierten, natürlichen Membranen trokken, gegebenenfalls bei Raumtemperatur sehr lange (von '/2 bis 1 Jahr) aufbewahrt werden, ohne daß bemerkenswerte Veränderungen der Enzymaktivität festzustellen sind, weil dem Enzym eine natürliche Umgebung verschafft worden ist.

Die Durchlässigkeit der natürlichen Membranen ist gegenüber Ionen, Wasser-, und Gasmolekülen in meßtechnischer Hinsicht ideal. Eine weitere vorteilhafte Eigenschaft der natürlichen Membranen ist, daß sie sich gegenüber Ionen oder Gasmolekülen, die als Reagens oder Reaktionsprodukt vorkommen können, als durchlässig erweisen und gegenüber Verbindungen mit größerem Molekulargewicht die das Meßergebnis eventuell beeinflussen können (z. B. das Substratum selbst oder andere in der Probe vorkommende Stoffe), undurchlässig sind. Deshalb kann der sogenannte Hysterese-Effekt, welcher oft bei dem Wechsel von Proben mit verschiedener Konzentration entsteht, zum Teil oder ganz beseitigt werden.

Der Sensor gemäß der Erfindung kann auch so aufgebaut werden, daß zum Aufbau der Reaktionsschicht eine Membran mit zwei Reaktionsschichten oder mehrere aufeinandergeschichtete Memb^ranen mit ein oder zwei Reaktionsschichten angewendet werden. Bei dieser Anordnung ist an jeder Membranoberfläche ein anderes Enzym in immobilisierter Form gebunden. Im Falle der 0-Glucosid-Elektrode enthält die Membranoberfläche an der Seite der Probenlösung /?-Glucoseoxidase. Das an der ersten Membran gebundene Enzym, die /7-Glucosidase, ermöglicht eine Hydrolysereaktion zwischen den zu bestimmenden Komponenten, die zwischen dem j3-Glucosid (z. B. Amigdalin und Salizin) und dem Wasser, wodurch unter anderem Glucose eiitsteht. Das an der zweiten Membran gebundene Enzym, die Glucoseoxidase, katalysiert die Reaktion zwischen der Glucose und dem Sauerstoff. An der sich hinter der Membran befindenden Indikatorelektrode kann das der Sauerstoffkonzentration proportionale Signal gemessen werden. Das mit der Verringerung der Sauerstoffkonzenti ation proportionale Signal ist eine eindeutige Funktion der Konzentration der zu bestimmenden Probe. Mit dieser Ausführung kann man einerseits meßtechnische Vereinfachungen durchführen und die Steigerung der Selektivität erreichen, andererseits können auch solche Verbindungen bestimmt werden, die in einer einstufigen Reaktion keine meßbare Komponente produzieren oder die keine Änderung in der Konzentration oder Aktivität der meßbaren Komponenten zustandebringen.

Der Sensor gemäß der Erfindung kann auch so verwirklicht werden, daß an getrennten Oberflächenpartien der Membran natürlicher Struktur, die als Reaktionszone dient, oder an gegebenen Oberflächenpartien in statistisch homogener Verteilung verschiedene Enzyme gebunden sind und zu einer der Oberflächenpartien eine oder mehrere Indikatorelektroden gehören. Mit dieser Anordnung können molekülselektive Sensoren mit mehreren Funktionen ohne Dimensions-/ergrößerung hergestellt werden, wodurch die parallele Bestimmung mehrerer Komponenten in derselben Probenlösung durchführbar wird, oder mit der parallelen Bestimmung der Einfluß der Konzentration der Störkomponenten manuell oder automatisch in Anschlag gebracht werden kann.

Bei anderen Ausführungen der molekülselektiven Sensoren, die gemäß der Erfindung hergestellt werden, z, B. bei industriellen Sensoren, ist die Membran natürlicher Struktur im Hinblick auf einen erhöhten Schutz und einer weiteren Vergrößerung der mechanischen Festigkeit der Reaktionszone mit einem inerten Polymernetz oder Gewebe in Kontakt Bei weiteren

ίο Ausführungsformen ist im Interesse der sehr kurzen Ansprechzeit an der Oberschicht der einen Seite der Membran natürlicher Struktur die Reaktionszone, welche das Enzym in immobilisierter Form enthält, ausgestaltet, und an der Oberschicht der anderen Seite der Membran natürlicher Struktur ist nach dem Imprägnierverfahren mit Hilfe eines Vernetzungsprozesses eine solche Schicht ausgebildet, die für Gase durchlässig ist, oder ionenaustauschende Eigenschaften hat

Die molekülselektiven Sensoren werden gemäß der Erfindung so hergestellt, daß man die Oberfläche der Membran natürlicher Struktur mit einer Lösung, die das Enzym und den b.'funktionellen Reagensstoff, der für die chemische Bindung geeignete Gruppen, z. B. Giutaraldehyde, enthält, bei Zimmertemperatur behandelt Nach Beendigung der Kopplungsreaktion werden die Membranen in ein Wasserbad mit destilliertem Wasser gebracht wo die in wasserlöslicher Form gebliebenen Komponenten herausgelöst werden. Nach der Beendigung der Spüloperation sind die Membranen in meQfertigem Zustand. Danach wird gegebenenfalls die Metall-Indikatorelektrode vorbereitet Zum Zweck der Reinigung der Oberfläche der Indikatorelektrode wird diese für einige Minuten in Salpetersäure gebracht, dann abgewaschen und schließlich in einem Bad, welches Reduktionsmitte', (z. B. Ascorbinsäure) enthält, gehalten, wo die Oxidase und der in der Metallelektrode physikalisch gelöste Sauerstoff umgewandelt .verden. Die fertige Membran wird mit dem für Gase oder für Gase und gelöste Stoffe durchlässigen Häutchen zusammen auf den Sensorkörper aufgelegt und danach wird die Indikatorelektrode und die Bezugselektrode in die sich in dem Sensorkörper befindende Elektrolytlösung so eingetaucht, daß sich die Oberfläche der Indikatorelektrode in unmittelbarer Nähe der Membran befinden soll. Die Elektroden werden befestigt. Damit ist der Sensor in meßfähigem Zustand.

Beispiel 1

so In F i g. 1 ist ein gemäß der Erfindung hergestellter glucoseselektiver Sensor im Teilschnitt zu sehen.

In dem Hohlraum de*. Sensorkörpers 1 befindet sich eine Pufferlösung mit Chloridionen 2, in weiche die in dem Gehäuse 3 angebrachte Platin-Indikatorelektrode 4 und die Silber-Süberchlorid-Bezugselektrode 5 eintauchen.

Der Rand des Sensorkörpers 1 ist mit einem gaspermeablen Polypropylen-Häutchen 6, welches die Indikatorelektrode 4 berührt, abgeschlossen. Das gaspermea'ole Häutehen 6 ist mit einer kommerziellen Schweinedarmmembran 7 natürlichen Ursprungs in Berührung, auf welches die Glucoseoxiaase mit Hilfe des Glutaraldehyds immobilisiert ist Das gaspermeable Häutchen 6 und die Membran natürlichen Ursprungs 7 sind mit Hilfe eines Gummiringes 8 am Sensorkörper 1 befestigt.

Das andere Ende des Sensorkörpers 1 ist mit einer Plastik-Verschlußkaooe 9 abgeschlossen. Die Indikator-

elektrode 4 und die Bezugselektrode 5 sind mit der polarisierenden Spannungsquelle und mit den Eingängen des Strommessers mittels eines Kabels 10 in Verbindung.

Die Herstellung der glucoseselektiven Elektrode erfolgt auf folgende Weise: Ein Teil des im Handel erhältlichen gesalzenen Schweinedarmes wird für 10 bis 15 Minuten in destilliertem Wasser eingeweicht. Die angeschwollene Membran wird zusammen mit einem 15μΓΠ dicken gaspermeablen Häutchen (z.B. aus Polypropylen) in gespanntem Zustand auf den Rand des Sensorkörpers befestigt (das Polypropylen-Häutchen muß sich auf der Seite des Hohlraumes des Sensorkörpers befinden). Die Membran wird 20 Minuten lang getrocknet. Dann werden in 0.5 ml Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4 60 mg Glucoseoxidase suspendiert und 25 μΙ 25%ige Glutaraldehydlösung zugefügt. Von dieser homogenen Suspension werden 20 μΐ an der Oberfläche der Membran in einer gleichmäßigen Schicht aufgetragen. Dann wird die Membran 20 Minuten lang trocknen gelassen, und danach werden durch Waschen mit destilliertem Wasser das nicht immobilisierte Enzym und der Glutaraldehyd-Überschuß entfernt. Die auf diese Weise hergestellte Membran, die Glucoseoxidase in immobilisierter Form enthält, ist in meßfertigem Zustand.

Nach der Hersteilung der aktivierten Membran wird die in den Tragkörper in bekannter Weise eingelegte Platin-Indikatorelektrode vorbereitet. Die Oberfläche der Indikatorelektrode wird 2 bis 3 Minuten lang in auf eine Glasplatte aufgetropfte .Salpetersäurelösung mit einer Konzentration von 6 Mol/dm³ eingeweicht. Die Salpetersäure wird mi! destilliertem Wasser abgewaschen. Nach dem Abwaschen wird die Oberfläche der Indikatorelektrode 20 bis 30 Minuten lang in eine frisch hergestellte 2°/oige Ascorbinsäurelösung eingeweicht. Nach dem Einweichen wird die Ascorbinsäure von der Oberfläche der Indikatorelektrode durch Waschen mit destilliertem Wasser entfernt. Nach dem Waschen ist die Indikatorelektrode in meßbereitem Zustand (die Einweichungsprozesse in Salpetersäure und Ascorbin- cänrp m'"icc/*n im I aitfi» Ae>c MactAnt ie*Af* -rxno'ita Wie

dritte Woche wiederholt werden).

Nach diesen Vorbereitungsvorgängen wird der glucoseselektive Sensor gemäß Abb.l zusammengestellt und danach wird er an die polarisierende Spannungsquelle und an die Stromstärkemeßeinheit angeschlossen.

Die Bestimmung der gesuchten Glucosekonzentraiion der Probe kann mit dem Sensor durch Aufnahme einer Kaiibrierung^kurve oder mittels der Additionstechnik durchgeführt werden. Nachfolgend wird eine vorteilhafte Variation der Additionstechnik die sogenannte Methode der mehrfachen Probenzugabe, beschrieben.

Es wurde festgestellt, daß zwischen der Abnahme der gemessenen Stromstärke (4;7und der Glucosekonzentration der Lösung (c) folgender Zusammenhang bestehr:

Ai = k

Π)

wobei

V die maximale ReaktionsgeschwinigkeiL

K die Michaelis-Konstante der Enzym-Substrat-Re aktion, und
k der Verhältnisfaktor ist.

Aus dem Wert der gemessenen Abnahme der Stromstärke in zwei glucosehaltigen Lösungen mit bekannter Konzentration können die von den gegebenen Umständen und von dem Sensor abhängigen V- und K-Werte bestimmt werden, aufgrund derer die Konzentration der n-ten Probenlösung aus der Abnahme der Stromstärke, wie nachfolgend angegeben, auch bestimmt werden kann.

C„ = /,A

κ + y

Auigrunci von uieicnung^ ist üic Konzentration der Probe

r, = c-.

+ Σ "„

wobei

a„ das Volumen der n-ten Probe
V.\ das Volumen der Probe und des Standards zusammen ist.

Im Falle von Blut und Urin werden die Messungen mit der Methode der mehrfachen Probenzugabe in nachfolgend angegebener Weise durchgeführt.

In eine thermostatisierte Zelle von 37°C werden 6,6 ml Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4 eingemessen. In die Lösung wird der Sensor eingetaucht. Aus dem nach Zugabe von 50—50 μΙ glucosehaltigen Lösungen mit einer Konzentration von On/ 1Π2 Mnl/Hm3 Dpmpccpnpn Wprt Hpr .^trnmctärlfρ

— - ■ - ο

werden die V- und K-Werte numerisch oder automatisch bestimmt. Danach werden in die Pufferlösung die bekannten Volumina der Proben eingemessen und es wird die Abnahme der Stromstärke bestimmt. (Abhängig von dem voraussichtlichen Glucosegehalt der untersuchten Blutprobe variiert das Probenvolumen. Im Falle von Proben mit einer Konzentration zwischen 60 bis 200 mg% soll das Probenvolumen 100 μΐ, im Falle einer weniger konzentrierten Probe 200 μΙ und bei einer konzentrierten Probe 50 μΙ sein. Im Falle einer Urinprobe mit einer Konzentration von 0 bis 1% ist die Zugabe 25 μΐ; bei konzentrierteren Proben wird eine zehnfache Verdünnung gemacht und von der verdünnten Probe werden 25 bis 50 μ! herausgenommen.) Aus dem gemessenen Wert der Abnahme der Stromstärke wird die gesuchte Konzentration mit Hilfe der Gleichung 2 numerisch oder mit einem Computer berechnet

Die mit dem glucoseselektiven Sensor gemessenen Werte sind für einige Proben in Tabelle I zusammengestellt.

Aus der Tabelle I ist zu ersehen, daß die Streuung der mit dem glucoseselektiven Sensor gemessenen Werte wesentlich kleiner ist als die Streuungsmittel bekannter Methoden, bei weichen der Wert der Streuung 10% oft übertrifft.

Tabelle I

Konzentration Zahl der
der Standard- parallelen
lösung Messungen

Il
11
11

Tabelle Il

Mittelwert der Streuung

gemessenen

Daten

(nig%) (mg %)

I80 5

12I 3

91 3

IO

Gemäß diesem Beispiel können auch andere molekülselektive Sensoren hergestellt werden. In Tabelle Il werden einige weitere Beispiele vorgestellt. In der ersten Kolonne der Tabelle wird jene Molekülart aufgeführt, auf welche der Sensor selektiv ist. In der zweiten Kolonne das auf natürlicher Membran immobilisierte Enzym, welches mit dem gasdurchlässigen Häutchen in Verbindung steht. In der dritten Kolonne wird die Art der Indikatorelektrode aufgeführt.

Zn bestimmende Komponente	Immobilisiertes Iin/ym	Inuikator-
		elcktrode
Harnsäure	Uricase	Platin
Cholesterin	C'holesterinoxydase	Platin
L-Aminosäure	L-Arninosüureoxydasc	Platin
I)- Aminosäure	n-Aminosäureoxydase	Platin
D-Galaktosc	Galaktoseoxydase	Platin
Sulfit	Sulfitoxydase	Platin
Oxalat	Oxalatoxydase	Platin
Xanthin	Xanthinoxydase	Platin
O-Diphenol	O-Diphenoloxydase	Platin
p-DiphenoI Wasserstoffhyperoxyd	Katalase	Platin
Laktat	Laktaseoxydase	Platin
Pyruvat	Pyruvatoxydase	Platin
Alkohol	Alkoholoxydase	Platin
L-Phenylalanin	L-Phenylalaninase	Platin
2-Oxosäure	Pyruvatdekarboxylase	Wasserstoff-
		ionenselektive
		Elektrode
Oxalacetat	Oxalacetatdekarboxylase	desgl.
Acetoacetat	Acetoacetatdekarboxylase	desgl.
L-Valin	Valindekarboxylase	desgl.
L-Glutamat	Glutamatdekarboxylase	desgl.
L-Ornithin	Ornithindekarboxylase	desgl.
L-Lysin	Lysin dekarboxylase	desgl.
Penicillin	-Laktamase I.	desgl.
Beispiel 2

F i g. 2 zeigt ein Ausführungsbeispiel des gemäß der Erfindung hergestellten harnstoffselektiven Sensors (im >n Teilschnitt).

In dem Sensorkörper 1 befindet sich eine chloridionenhaltige Elektrolytlösung 2, in welche eine ammoniumionenselektive Indikatorelektrode 4 und eine Silber-Silberchlorid-Bezugselektrode 5 eintauchen. Die Indikatorelektrode 4 ist am Ende des Sensors mit einem für die Elektrolytlösung 2 nicht permeablen Verschluß, einer scheibenförmigen Abdichtungsschicht 11 befestigt Die Indikatorenelektrode 4 ist mit einer Membran aus einem natürlichen Stoff 7, welcher mit Glutaralehyd immobilisierte Urease enthält und aus einer Wandpartie einer Fischluftblase ausgebildet ist, in Berührung. Die Membran natürlichen Ursprungs 7 wird mit einem Gummiring 8 am Umhüllungskörper 1 befestigt In der Wand des Umhüllungskörpers 1 ist eine für elektrolytlösung durchdringbare Filterschicht 12 (z. B. ein Keramikstab) untergebracht Das andere Ende des Umhüllungskörpers 1 ist durch eine Kunststoff-Verschlußkappe 9 abgeschlossen. Die Indikatorelektrode 4 und die Bezugselektrode 5 sind mit den Eingängen des elektronischen Spannungsmessers mittels eines Kabels 10 in Verbindung.

Die Ausbildung der Reaktionsschicht des harnstoffselekti'.-en Sensors auf einer Membran natürlichen Ursprungs geschieht ähnlich wie es in Beispiel 1 beschrieben ist Der einzige Unterschied besteht darin, daß in diesem Fall an der Oberfläche der Membran Urease immobilisiert wird. Die Konzentration der zu bestimmenden Probe kann auf bekannte Weise mit Hilfe einer EMK-Konzentrations-Kalibrierungskurve oder mit Hilfe der Additionstechnik durchgeführt werden.

In Tabelle III werden einige weitere Beispiele zusammengefaßt In der ersten Kolonne der Tabelle wird die Molekülart dargestellt auf welcher der Sensor selektiv anspricht In der zweiten Kolonne wird das immobilisierte Enzym und in der dritten Kolonne die selektive Indikatorelektrode, welche für die jeweilige Untersuchung zu verwenden ist aufgeführt

Tabelle III

Zu bestimmende Komponente

L-Dioxy phenylalanin

L-Phenylalanin

L-Aminosäuren

D-Serin

L-Ilomoserin

L-Threchir)

L-Histidin

Nitrit

Beispiel 3

Der Aufbau eines erfindungsgemäß hergestellten argininselektiven Sensors entspricht im wesentlichen dem in Beispiel 2 beschriebenen Ausführungsbeispiel des harnstoffselektiven Sensors. Eine Abweichung besteht darin, daß am Ende des Umhüllungskörpers 1 zwei aufeinandergeschichtete Membranen natürlichen Ursprungs 7 mit Hilfe eines Gummiringes 8 befestigt werden. Auf der Membran, welche an der Seite der Indikatorelektrode liegt, ist Urease, auf der anderen perforierten Membran ist Arginase in immobiliserter Form gebunden. Der argininselektive Sensor ist also mit zwei Reaktionsschichten ausgebildet.

Die Herstellung des argininselektiven Sensors gemäß der Erfindung erfolgt auf folgende Weise: Zuerst wird der harnstoffselektive Sensor auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise hergestellt. Danach wird auf die natürliche Membran, welche Urease enthält, noch eine aus Schafdarm gefertigte, natürliche perforierte Membran gelegt, an deren Oberfläche eine Arginase enthaltende Schicht gebildet wird. Die Herstellung der Reaktionsschicht geschieht wie in Beispiel 1 beschrieben mit dem Unterschied, daß in der Pufferlösung zusätzlich 10 me Albumh. iuspendiert werden.

Der argininselektive Sensor kann auch so hergestellt werden, daß zum Aufbau des Sensors nur eine Membran 7 natürlichen Ursprungs gebraucht wird, auf deren Oberfläche zwei Enzyme, d. h. Arginase und Urease, in statistisch homogener Verteilung immobilisiert sind. Bei dieser Ausfühmngsform entsprechen der weitere

29 26 167	10
	Indikatorelektrode
Immobilisiertes Enzym	Ammoniumionen-
L-Aminosäureoxydase	selektive
	Elektrode
	desgl.
L-Aminosäureoxydase	desgl.
L-Aminosäureoxydase	desgl.
D-Serindehydratase	desgl.
I Inmnscrindehydratase	desgl.
Threchindehydratase	desgl.
11 isttda.se	desgl.
Nitritredukta.se

äü UMU CliC I iCTSlClIUIlg UC.-> JCIISUI Λ 3IMM£CllldlJ UCIII

vorhergehenden Fall.

Die Funktion des Sensors beruht auf einer zweistufigen Reaktion:

!.-Arginin + 11,0 L-Ornitin + Harns

;irnstofl

Harnstoff+ 11,0 — Kohlendioxid + Ammoniak

Die Argininkonzentration der zu bestimmenden Probe kann auf bekannte Weise mit Hilfe einer Kalibrierungskurve oder unter Anwendung der Additionstechnik bestimmt werden.

Über die anderen erfindungsgemäß herstellbaren molekülselektiven Sensoren, die ähnlich Beispiel 3 mit zwei Reaktionsschichten oder mit einer Reaktionsschicht, welche zwei Enzyme in statistisch homogener Verteilung enthält, hergestellt werden können, gibt Tabelle IV eine Übersicht.

In der ersten Kolonne der Tabelle ist jenes Molekül dargestellt, welches mit dem molekülselektiven Sensor bestimmt werden kann. In der zweiten Ko jnne ist der auf der äußf*rpn Mpmhran natfirlirhpn I lrcnnint»c immobilisierte Enzymkatalysator zu finden. In der dritten Kolonne sind die auf der inneren Membran, die sich auf der Seite der Indikatorelektrode befindet, immobilisierten Enzymkatalysator angegeben. In der vierten Kolonne sind die Indikatorelektroden aufgeführt.

Tabelle IV

Zu bestimmende Komponente

An der Oberfläche der Membran immobilisiertes erstes Enzym zweites Enzym

Indikatorelektrode

Inosin
Adenosin

Guanosin

Guanin

Kreatinin

ß-D Glukoside Disaccharide
Amygdalin Salicin

Uridinnukleosidase	Xantinoxydase	Platin
Adenosinnukleosidase	Adenindeaminase	Ammoniumionen-
		selektive oder
		Wasserstoffionen-
		selektive Elektrode
Guanosinphosphorylase	Guanase	desgl.
Guanase	Xanthinoxydase	Platin
Kreatininase	Urease	Ammoniumionen-
		selektive Elektrode
Ä-Glukosidase	Glukoseoxydase	Platin

Fortsetzung

Zu bestimmende Komponente	Λη der Oberfläche der Me	mbrari immobilisiertes	Indikatorelektrode
	erstes Enzym	zweites Enzym
α-D Glukoside (z. B. Maltose)	ff-Glukosidase	Glukoseoxydase	Platin
D-Glukose-1-phosphat	Glukose-l-phosphatase	Glukoseoxydase	Platin
D-Glukose-6-phosphat	Glukose-6-phosphatase	Glukoseoxydase	Platin
Barbiturat	Barbiturase	Urease	Ammoniumionen-
			selektive oder
			Wasserstoffionen-
			selektive Elektrode

Beispiel 4

Irr: Beispiel 4 wird ein Ausführungsbeispiel und die ! !crstcllung eines erfiMuüngsgeiiiaö uiiunkiiuneiieri molekülselektiven Sensors gezeigt.

In dem ümhüllungskörper 1 befindet sich eine chloridionenhaltige Pufferlösung 2, in welcher zwei Platin-Indikatorelektroden 4, die einzeln in je einem Tragkörper 3 eingebaut sind, eintauchen. Mit den Oberflächen der Indikatorelektroden 4 ist ein auf der öffnung des Umhüllungskörpers 1 befestigtes gasdurchlässiges Polypropylen-Häutchen 6 in Berührung. Die Oberfläche des Häutchens 6 ist mit einem Stück Haut, mit einer Membran natürlich!.η Ursprungs bedeckt. Eine Partie der Membranoberficche 7 natürlichen Ursprungs steht mit einer der Indikatorelektroden 4 in Berührung; auf dem gleichen Teil der Membranoberfläche auf der entgegengesetzten Seite der Membran ist D-Aminosäureoxidase in immobilisierter Form gebunden. Ein anderer Teil der Membranoberfläche steht mit der anderen Indikatorelektrode in Berührung; auf dem gleichen Teil der Membranoberfläche auf der entgegengesetzten Seite der Membran ist L-Aminosäureoxidase in immobilisierter Form gebunden.

Die übrigen Details des Aufbaus des bifunktionellen molekülselektiven Sensors entsprechen sinngemäß dem Aufholt

in R**icr*iol 1

sung verteilt, welche einen pH-Wert von 6,5 aufweist, und welche pro 0,1 ml 10 mg L-Aminosäureoxidase in suspendierter Form enthält. Später werden dazu ebenfalls die 10 μ] 25%ige Glutaraldehydlösung gegeben.

Die wetteret; Schritte entsprechen den in Beispiel 1 beschriebenen. Mit dem bifunktionellen molekülselek.iven Sensor ist die selektive Bestimmung der D- und L-Isomere der Aminosäuren parallel möglich. Die Messung wird so durchgeführt, daß der selektive Sensor zuerst in der L-Form und nur danach in der D-Form der zu bestimmenden Aminosäure (z. B. Phenylalanin) verfertigte Lösungen kalibriert wird. Bei der Durchführung einer Kalibrierung wird der Sensor von einer gerührten Phosphat-Pufferlösung (pH 8) in eine mit konstanter Geschwindigkeit gerührte Standardlösung mit gleichem pH-Wert verlegt und es wird die durch die Wirkung der -0,6 V Polarisationsspannung entstehende Stromintensitätsänderung gemessen {Δι). Wenn man die zl/'-Werte als Funktion der Konzentration der Standardlösungen darstellt, kann man die Kalibrierungskurve aufstellen und mit deren Hilfe nach der Messung von Ai das Verhältnis der optiscnen Isomere der verschiedenen Aminosäuren bestimmen.

Der Gebrauch des beispielsgemäß hergestellten

Die Herstellung der Reaktionsschichten, die Aminosäureoxidase enthalten, geschieht auf folgende Weise: Auf das gasdurchlässige Polypropylen-Häutchen wird die nasse Hautmembran gespannt. Dann wird die Membran 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur trocknen gelassen. Danach werden auf einem Teil der Membranoberfläche 10 μΐ einer Phosphat-Pufferlösung mit pH-Wert 8,3 verteilt, wobei jeweils 0,1 ml 5 mg D-Aminosäureoxidase in suspendierter Form enthalten. Später werden noch 10 1 25°/oige Glutaraldehydlösung zugefügt Anschließend werden auf dem anderen Teil der Membranoberfläche 10 1 einer Phosphat-Pufferlö

50

C

Wirksamkeit von Resolvationsprozessen auße· ordentlich vorteilhaft.

Zur Bestimmung des Isomerverhältnisses kann die in dem Beispiel 1 beschriebene Additionstechnik ebenfalls gut angewandt werden. Ähnlich wie in Beispiel 4 können weitere vorteilhaft anwendbare bifunktionelle Sensoren gemäß der Erfindung hergestellt werden. Darüber gibt Tabelle V eine Übersicht.

In der zweiten Kolonne der Tabelle sind die Namen der auf einem Teil der Oberfläche, und in der dritten Kolonne auf dem anderen Teil der Oberfläche immobilisierten Enzyme aufgezählt

Tabelle V

Zu bestimmende Komponente

Auf einem Teil der Membran immobilisiertes Enzvm Zu bestimmende Komponente

Auf dem anderen Teil der Membran immobilisiertes Enzym

Glukose
Glukose
Harnstoff"

Glukose

Glukoseoxydase	Alkohol
Glukoseoxydase	Mannose
Urease	Kreatinin
Glukoseoxydase	Harnsäure

Alkoholoxydase

Hexoseoxydase

Kreatininase

Urease

Uricase

Fortsetzung

Zu bestimmende Komponente

Auf einem Teil der Membran immobilisiertes Enzym Zu bestimmende Komponente

Auf dem anderen Teil der Membran immobilisiertes Enzym

Glukose
Harnstoff

Glukose

Glukoseoxydase
Urease

Glukoseoxydase

Beispiel 5

In Beispiel 5 werden der Aufbau und die Herstellung eines erfindungsgemäß hergestellten multifunktionellen molekülselektiven Sensors beschrieben, der zur parallelen Bestimmung verschiedener Aminosäuren geeignet ist.

Der Aufbau des multifunktionetlen Sensors ist ähnlich dem in Beispiel 4 vorgestellten bifunktionellen Sensors. Ein Unterschied besteht darin, daß dieser kein gasdurchlässiges Häutchen 6 enthält, und weiterhin daß in der in dem Umhüllungskörper 1 befindlichen Elektrolytlösung 2 drei wasserstoffionenselektive Glaselektroden eingetaucht sind, die mit einer Membran 7 na·'irlichen Ursprungs in Kontakt stehen, an welcher auf drei gut getrennte Oberflächenteile die drei verschiedenen Reaktionsschichten ausgebildet sind, die die drei selektiven Amiinosäuredecarboxylasen (L-Ly-I-I'henylalanin
Arginin

Amygdalin

L-Phenylalaninase

Argicindekarboxylase

Glukosidase Giukoseoxydase

sindecarboxylase, L-Thyrosindecarboxylase, L-Phenyl alanindecarboxylase) in immobilisierter Form gebundei enthalten.

Die Herstellung der Reaktionsschichten geschieh wie in !Beispiel 4 beschrieben.

Mit Hilfe dieses Sensors kann der L-Thyrosin-L-Lysiin- und Phenylalanin-Gehalt von Proben mi Aminosäuregehalt selektiv bestimmt werden. Dii Bestimmungen können mit Hilfe von drei (entsprechen! den drei Aminosäuren) Potential-Konzentration-Kali brierungskurven durchgeführt werden.

Nach dem in Beispiel gezeigten multifunktionellei molekülselektiven Sensor können ähnliche Variantei hergestellt werden. Die einzelnen Reaktionsschichtteil« enthalten die folgenden Enzyme in immobolisierte Form: L-Arginindecarboxylase, L-Glutaminsäuredecar boxylase, L-Glutamindecarboxylase, L-Histidindecar boxylase. Urease.

Hierzu 2 Blatt Zeichnuntien

Claims

Patentansprüche:

1. Molekülselektiver Sensor zur Bestimmung der Konzentration von in Lösungen anwesenden Molekülen oder Ionen, mit einem offenen hohlen, mit Elektrolytlösung (2) gefüllten Umhüllungskörper (1), einer in die Elektrolytlösung eintauchenden potentiometrischen, voltammetrischen Indikatorelektrode (4) und einer Referenzelektrode (5), einem für Gase oder für Gase und gelöste Stoffe durchlässigen Häutchen (6), welches die an der Seite der Indikatorelektrode (4) befindliche öffnung verschließt, einer mit dem Häutchen (6) in Kontakt stehende Schicht (7), die das für den zu bestimmenden Stoff selektive Enzym in chemisch gebundenem Zustand enthält, und einer Spannungsquelle und einer Stromstärke- oder Spannungsmeßeinheit, die mit den Elektroden (4,5) des Sensors in Verbindung stehen, woboi die an der Seite der Indikatorelektrode (4) befindliche Öffnung des Umhüüungskörpers (1) mit einer oder mehreren kontinuierlichen oder perforierten Membranen (7), welche an deren Oberflächenschicht eine oder mehrere Enzyme in chemisch immobilisierter Form gebunden enthält, abgeschlossen ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran (7) aus einem natürlichen Material, wie Schweineblasen, besteht

2. Sensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran natürlichen Ursprungs (7) mit einem aus inertem Stoff hergestellten Schutznetz oder Gewebe in Kontakt ist

3. Sensor nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß er mehrere Indikatorelektroden (4) umfaßt

4. Sensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß die Membran (7) mit einem für Gase oder gelöste Stoffe durchlässigen Häutchen in Kontakt steht

5. Sensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem Umhüllungskörper (1) und der Indikatorelektrode (4) eine Isolationsschicht (If) und in der Wand des Umhüllungskörpers (1) ein für die Elektrolytlösung durchlässiges Filter eingebaut

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