DE2926167A1 - Molekuelselektiver sensor und herstellung desselben - Google Patents
Molekuelselektiver sensor und herstellung desselbenInfo
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Description
PATENTANWÄLTE
DIPL.-ING. K. FDCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN
ARABELIASTRASSE 4 (STERNHAUS) . D-8000 MÖNCHEN 81 . TELEFON (089) 911087 · TELEX 05-29i19 (PATHE)
-A-
32 225 m/fg
"RADELKIS" Elektrokemiai Müszergyärto Szövetkezet,
Budapest / Ungarn
Molekülselektiver Sensor und Herstellung desselben
Die Erfindung betrifft einen molekülselektiven elektroanalytischen
Sensor entsprechend dem vorstehenden Hauptanspruch, der für die Konzentrationsbestimmung von in Plussigkeitsproben (z.B.
im Blut) gelösten Verbindungen (z.B. Glucose) geeignet ist sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben.
Es sind molekülselektive elektroanalytische Sensoren bekannt, die zur Bestimmung von in Flüssigkeitsproben gelösten Verbindungen
geeignet sind. Die elektrochemischen Eigenschaften und die Anwendungsinoglichkeiten der molekülselektiven Sensoren sind
in der Literatur (z.B. in P.L. Bailey: Analysis with Iron Selective
Electrodes, Heyden and Son Ltd. London, 1976) ausführlich behandelt. Bekanntlich haben die molekülselektiven Sensoren,
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... κ: „
die als elektrochemische Messzellen bezeichnet werden können, einige gemeinsame Eigenschaften, z.B. dass der Tragkörper des
Sensors, welcher die ionenselektive oder Metall-Indikatorelektrode und die Bezugselektrode (Elektrode zweiter Art)
enthält, in einem rohrförmigen, mit Elektrolytlösung gefüllten
Umhüllungskörper, dessen Ende an der Seite der aktiven Oberfläche
der Indikatorelektrode mit einem für Gase oder für Gase und gelöste Stoffe durchlässigen Häutchen (z.B. mit einem Dialysehäutchen)
abgeschlossen ist, umhüllt wird, wobei dieses Häutchen mit einer für den zu bestimmenden Stoff selektiven Gelschicht
(z.B. mit einer Acrylamid-Gelschicht), welche den wirkungsspezifischen Katalysator, das chemisch oder physikalisch
gebundene Enzym^ enthält, in Kontakt ist, oder dieses Häutchen ist
aufexnandergeschichtet mit einem für Gase oder für Gase und gelöste Stoffe durchlässigen Häutchen (z.B. mit einem Cellophanhäutchen)
und einer Lösungsschicht, welche das selektive Enzym
in suspendierter Form enthält, und mit einem für Gase und
gelöste Stoffe durchlässigen Häutchen (z.B. mit einem Cellophanhäutchen).
Der Wirkungsmechanismus der bekannten molekülselektiven Sensoren ist der folgende: Die Moleküle der zu bestimmenden Komponente
(die Moleküle der sogenannten Substrate, z.B. die Glucose-Moleküle)
und gegebenenfalls die Moleküle des Reagens (die
Sauerstoffmoleküle) diffundieren in die Schicht, welche das selektive Enzym (z.B. Glucoseoxidase) enthält und welche als
wirkungsspezifischer Katalysator dient, in die sogenannte Reaktionsschicht, wo sich eine chemische Reaktion abspielt. Das Ausgangssignal
der Indikatorelektrode ,ist eine eindeutige Funktion der Konzentration oder der Aktivität des an der Enzymreaktion
teilnehmenden Reagens oder einer der teilnehmenden oder entstehenden Komponenten. Der lokale Wert der Aktivität
oder der Konzentration ist, falls alle Faktoren als konstant
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angenommen werden können, von der Reaktionsgeschwindigkeit abhängig,
welche eine eindeutige Funktion der Konzentration des Substrates ist. Deshalb kann in stationärem Zustand durch die
Messung der Stromstärke oder des EMK-Wertes die gesuchte Konzentration
der Probe direkt bestimmt werden.
Die Herstellung der bekannten molekülselektiven Sensoren ist eine komplizierte, zeitraubende und eine ausserordentliches
Sachverständnis erfordernde Aufgabe, deren Ergebnis nur zufällig reproduzierbar ist.
Der grösste Nachteil solcher Sensoren besteht in ihrer kurzen Lebensdauer (z.B. einige Tage, ein bis zwei Wochen), die mit
den ungünstigen Eigenschaften der Reaktionsschicht in Zusammenhang
steht. Ein weiterer Nachteil liegt darin, dass die Sensoren, bzw. die Gelschichten, welche das gebundene Enzym enthalten,
ausser Gebrauch bei niedriger Temperatur (z.B. zwischen -1 bis 2°C)
gehalten werden müssen, um ihre Enzymaktivität bewahren zu können.
Die bekannten Elektroden sind leicht verletzbar und haben eine geringe mechanische Festigkeit und eine lange Ansprechzeit (z.B.
zwischen 2 bis 8 Minuten).
Ein weiterer Nachteil liegt darin, dass in der amperometrischen Indikatorelektrode (z.B. in der Platinelektrode) gelöstes Gas
(z.B. Sauerstoff), oder eine an der Oberfläche gebildete Oxidschicht,
oder infolge des Gebrauches an der Oberfläche der Indikatorelektrode gebildete Metallverunreinigungen (z.B. Silberverunreinigungen)
oder andere Isolationsschichten einen ungünstigen Einfluss auf das Signal-Geräusch-Verhältnis bewirken, weil
die aktive Oberfläche der Indikatorelektrode und dadurch das durch die Elektrode gelieferte Signal verringert wird.
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Aufgrund der aufgezählten Nachteile hat sich die einfache und selektive Messtechnik mittels Sensoren in der Praxis nicht
durchgesetzt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines molekülselektiven Sensors, welcher ohne speziellem Sachverständnis
einfach, in kurzer Zeit, reproduzierbar herzustellen ist, welcher eine viel längere Lebensdauer (z.B. 1/2 bis 1 Jahr)
besitzt als die bekannten Typen und eine grössere mechanische Festigkeit und kürzere Ansprechzeit (z.B. von 2o bis 3o Sekunden)
aufweist.
Die vorstehende Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst,
dass in ihrer Qualität befriedigende Sensoren hergestellt werden, indem der Enzymkatalysator oder Katalysatoren, welche die
Funktion des Sensors ermöglichen, an einer albuminösen Membran natürlicher Struktur (z.B. an Darmwand) gebunden sind und diese
aktivierte Membran beim Aufbau des Sensors als Reaktionsschicht verwendet wird. Die mechanische Festigkeit der albuminösen,
natürlichen Membranen (wie z.B. die Luftblase von Fischen, Hautpartien von Säugetieren und Reptilen oder die Hornhaut und
Darmwand einiger Tierarten) ist, trotz ihrer in bezug auf die Ansprechzeit sehr vorteilhaften Dünne (von 1o,um bis 15 /Um)
ebenfalls infolge ihrer Struktur ausgezeichnet; ausserdem ist
die Konzentration der aktiven Aminogruppen an den von Aminosäuren aufgebauten Membranen im Hinblick auf die chemische Bindung von
Enzymen mit albuminöser Struktur, auch optimal und konstant. Auf diese Weise können im breiten Konzentrationsbereich arbeitende
Sensoren mit kurzer Ansprechzeit hergestellt werden. Nach dem Immobilisationsverfahren können die aktivierten, natürlichen
Membranen trockerv.gegebenenfalls bei Raumtemperatur sehr lange
(von 1/2 bis 1 Jahr) aufbewahrt werden, ohne dass bemerkenswerte Veränderungen der Enzymaktivität festzustellen sind, weil dem
Enzym eine natürliche Umgebung verschafft worden ist.
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Die Durchlässigkeit der natürlichen Membranen ist gegenüber Ionen, Wasser-/ und Gasmolekülen in inesstechnischer Hinsicht
ideal. Eine weitere vorteilhafte Eigenschaft der natürlichen Membranen ist, dass sie sich gegenüber Ionen oder Gasmolekülen,
die als Reagens oder Reaktionsprodukt vorkommen können, als durchlässig erweisen und gegenüber Verbindungen mit grösserem Molekulargewicht,
die das Messergebnis eventuell beeinflussen können (z.B. das Substratum selbst oder andere in der Probe vorkommende
Stoffe), undurchlässig sind. Deshalb kann der sogenannte Hysterese-Effekt, welcher oft bei dem Wechsel von Proben mit
verschiedener Konzentration entsteht, zum Teil oder ganz beseitigt werden.
Der Sensor gemäss der Erfindung kann auch so aufgebaut werden,
dass zum Aufbau der Reaktionsschicht eine Membran mit zwei Reaktionsschichten oder mehrere aufeinandergeschichtete Membranen
mit ein oder zwei Reaktionsschichten angewendet v/erden. Bei dieser Anordnung ist an jeder Membranoberfläche ein anderes Enzym
in immobilisierter Form gebunden. Im Falle der ß-Glucosid-Elektrode
enthält die Membranoberfläche an der Seite der Probenlösung ß-Glucoseoxidase. Das an der ersten Membran gebundene Enzym, die
ß-Glucosidase, ermöglicht eine Hydrolysereaktion zwischen den
zu bestimmenden Komponenten, die zwischen dem ß-Glucosid (z.B. Amigdalin und Salizin) und dem Wasser, wodurch unter anderem
Glucose entsteht. Das an der zweiten Membran gebundene Enzym, die Glucoseoxidase, katalysiert die Reaktion zwischen der Glucose
und dem Sauerstoff. An der sich hinter der Membran befindenden Indikatorelektrode kann das der Sauerstoffkonzentration proportionale
Signal gemessen werden. Das mit der Verringerung der Sauerstoffkonzentration proportionale Signal ist eine eindeutige
Funktion der Konzentration der zu bestimmenden Probe. Mit dieser Ausführung kann man einerseits messtechnische Vereinfachungen
durchführen und die Steigerung der Selektivität erreichen,
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o>
andererseits können auch solche Verbindungen bestimmt werden, die in einer einstufigen Reaktion keine messbare Komponente
produzieren oder die keine Änderung in der Konzentration oder Aktivität der messbaren Komponenten zustandebringen.
Der Sensor gemäss der Erfindung kann auch so verwirklicht werden, dass an getrennten Oberflächenpartien der Membran natürlicher
Struktur, die als Reaktionszone dient, oder an gegebenen Oberflächenpartien
in statistisch homogener Verteilung verschiedene Enzyme gebunden sind und zu einer der Oberflächenpartien eine oder
mehrere Indikatorelektroden gehören. Mit dieser Anordnung können molekülselektive Sensoren mit mehreren Funktionen ohne Dimensionsvergrösserung
hergestellt werden, wodurch die parallele Bestimmung mehrerer Komponenten in derselben Probenlösung
durchführbar wird, oder mit der parallelen Bestimmung der Einfluss
der Konzentration der Störkomponenten manuell oder automatisch in Anschlag gebracht werden kann.
Bei anderen Ausführungen der molekülselektiven Sensoren, die gemäss
der Erfindung hergestellt werden,z.B. bei industriellen Sensoren, ist die Membran natürlicher Struktur im Hinblick auf einen erhöhten
Schutz und einer weiteren Vergrösserung der mechanischen Festigkeit der Reaktionszone mit einem inerten Polymernetz oder Gewebe
in Kontakt. Bei weiteren Ausführungsformen ist im Interesse der sehr kurzen Ansprechzeit an der Oberschicht der einen Seite
der Membran natürlicher Struktur die Reaktionszone, welche das Enzym in imrnobiliserter Form enthält, ausgestaltet,und an
der Oberschicht der anderen Seite der Membran natürlicher Struktur ist nach dem Imprägnierverfahren mit Hilfe eines Vernetzungsprozesses eine solche Schicht ausgebildet, die für Gase durchlässig
ist, oder ionenaustauschende Eigenschaften hat.
Die molekülselektiven Sensoren werden gemäss der Erfindung so
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- 1ο -
hergestellt, dass man die Oberfläche der Membran natürlicher
Struktur mit einer Lösung, die das Enzym und den bifunktionellen Reagensstoff, der für die chemische Bindung geeignete Gruppen,
z.B. Glutaraldehyde, enthält, bei Zimmertemperatur behandelt. Nach Beendigung der Kopplungsreaktion werden die Membranen in
ein Wasserbad mit destilliertem Wasser gebracht, wo die in wasserlöslicher Form gebliebenen Komponenten herausgelöst werden.
Nach der Beendigung der Spüloperation sind die Membranen in messfertigem Zustand. Danach wird gegebenenfalls die Metall-Indikatorelektrode
vorbereitet. Zum Zweck der Reinigung der Oberfläche der Indikatorelektrode wird diese für einige Minuten in
Salpetersäure gebracht, dann abgewaschen und schliesslich in einem Bad, welches Reduktionsmittel (z.B. Ascorbinsäure) enthält,
gehalten, wo die Oxidase und der in der Metallelektrode physikalisch gelöste Sauerstoff umgewandelt werden. Die fertige
Membran wird mit dem für Gase oder für Gase und gelöste Stoffe durchlässigen Häutchen zusammen auf den Sensorkörper aufgelegt
und danach wird die Indikatorelektrode und die Bezugselektrode in die sich in dem Sensorkörper befindende Elektrolytlösung so
eingetaucht, dass sich die Oberfläche der Indikatorelektrode in unmittelbarer Nähe der Membran befinden soll. Die Elektroden
werden befestigt. Damit ist der Sensor in messfähigem Zustand.
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292'6Ϊ67
In Fig. 1 ist als Beispiel ein gemäss der Erfindung hergestellter glucoseselektiver Sensor teilweise im Durchschnitt zu sehen.
In dem Hohlraum des Sensorkörpers 1 befindet sich eine Pufferlösung
mit Chloridionen 2, in welche die in dem Gehäuse 3 angebrachte Platin-Indikatorelektrode 4 und die Silber-Silberchlorid-Bezugselektrode
5 eintauchen.
Der Rand des Sensorkörpers 1 ist mit einem gaspermeablen Polypropylen-Häutchen
6, welches die Indikatorelektrode 4 berührt, abgeschlossen. Das gaspermeable Häutchen 6 ist mit einer kommerziellen
Schweinedarmmembran 7 natürlichen Ursprungs in Berührung, auf welches die Glucoseoxidase (E.C.1.1.3.4.) mit Hilfe des GIutaraldehyds
immobilisiert ist. Das gaspermeable Häutchen 6 und die Membran natürlichen Ursprungs 7 sind mit Hilfe eines Gummiringes
8 am Sensorkörper 1 befestigt.
Das andere Ende des Sensorkörpers 1 ist mit einer Plastik-Verschlusskappe
9 abgeschlossen. Die Indikatorelektrode 4 und die Bezugselektrode 5 sind mit der polarisierenden Spannungsquelle
und mit den Eingängen des Strommessers mittels eines Kables 1o
in Verbindung.
Die Herstellung der glucoseselektiven Elektrode erfolgt auf folgende Weise: Ein Teil des im Handel erhältlichen gesalzenen
Schweinedarmes wird für 1o bis 15 Minuten in destilliertem Wasser eingeweicht. Die angeschwollene Membran wird zusammen mit einem
15,um dicken gaspermeablen Häutchen (z.B. aus Polypropylen) in gespanntem Zustand auf den Rand des Sensorkörpers befestigt (das
Polypropylen-Häutchen muss sich auf der Seite des Hohlraumes des Sensorkörpers befinden). Die Membran wird 2o Minuten lang getrocknet.
Dann werden in o,5 ml Pufferlösung mit einem pH-Wert
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von 7,4 6o mg Glucoseoxidase (E.C.1.1.3.4.) suspendiert und 25,ul
25 %-ige Glutaraldehydlösung zugefügt. Von dieser homogenen Suspension werden 2o ,ul an der Oberfläche der Membran in einer
gleichmässigen Schicht aufgetragen. Dann wird die Membran 2o Minuten lang trocknen gelassen, und danach werden durch Waschen
mit destilliertem Wasser das nicht immobiliserte Enzym und der Glutaraldehyd-überschuss entfernt. Die auf diese Weise hergestellte
Membran, die das Enzym Glucoseoxidase in immobilisierter Form enthält, ist in messfertigem oder in aufbewahrbaren Zustand.
Nach der Herstellung der aktivierten Membran wird die in den Tragkörper
in bekannter Weise eingelegte Platin-Indikatorelektrode vorbereitet. Die Oberfläche der Indikatorelektrode wird 2 bis 3
Minuten lang in auf eine Glasplatte aufgetropfte Salpetersäurelösung mit einer Konzentration von 6 Mol/dm eingeweicht. Die
Salpetersäure wird mit destilliertem Wasser abgewaschen. Nach dem Abwaschen wird die Oberfläche der Indikatorelektrode 2o bis
3o Minuten lang in eine frisch hergestellte 2 %-ige Ascorbinsäurelösung
eingeweicht. Nach dem Einweichen wird die Ascorbinsäure von der Oberfläche der Indikatorelektrode durch Waschen mit destilliertem
Wasser entfernt. Nach dem Waschen ist die Indikatorelektrode in messbereitem Zustand (die Einweichungsprozesse in
Salpetersäure und Ascorbinsäure müssen im Laufe des Messens jede zweite bis dritte Woche wiederholt werden).
Nach diesen Vorbereitungsvorgängen wird der glucoseselektive Sensor
gemäss Abbildung 1 zusammengestellt und danach wird er an die polarisierende Spannungsquelle und an die Stromstärkemesseinheit
angeschlossen.
Die Bestimmung der gesuchten Glucosekonzentration der Probe kann mit dem Sensor durch Aufnahme einer Kalibrierungskurve oder
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mittels der Ädditionstechnik durchgeführt werden« Nachfolgend
wird eine vorteilhafte Variation der Ädditionstechnik, die söge
•e nannte Methode der mehrfachen Probenzugabe, beschrieben.
Es wurde festgestellt/ dass zwischen der Abnahme der gemessenen
Stromstärke ( /li) und der Glucosekonzentration der Lösung (c)
folgender Zusammenhang besteht;
V die maximale Reaktionsgeschwindigkeit, K die Michaelis-Konstante der Enzym-Substrat-Reaktion, und
k der Verhältnisfaktor ist.
Aus dem Wert der gemessenen Abnahme der Stromstärke in zwei glucosehaltigen Lösungen mit bekannter Konzentration können die von
den gegebenen Umständen und von dem Sensor abhängigen V- und K-Werte bestimmt werden, aufgrund derer die Konzentration der n-ten
Probenlösung aus der Abnahme der Stromstärke, wie nachfolgend angegeben, auch bestimmt werden kann.
(C _- + K)2
C = i k -2-! (2)
C = i k -2-! (2)
n n κ + v
Aufgrund von Gleichung 2 ist die Konzentration der Probe
an
an das Volumen der η-ten Probe
V7. das Volumen der Probe und des Standards zusammen ist.
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Im Falle von Blut und Urin werden die Messungen mit der Methode
der mehrfachen Probenzugabe in nachfolgend angegebener Weise durchgeführt.
In eine thermostatisierte Zelle von 37 C werden 6,6 ml Pufferlösung
mit einem pH-Wert von 7,4 eingemessen. In die Lösung wird der Sensor eingetaucht. Aus dem nach Zugabe von 5o .- 5o,ul
i.2
glucosehaltigen Lösungen mit einer Konzentration von 2 χ 1o Mol/dm
gemessenen Wert der Stromstärke werden die V- und K-Werte numerisch
oder automatisch bestimmt. Danach werden in die Pufferlösung die bekannten Volumina der Proben eingemessen und es wird die Abnahme
der Stromstärke bestimmt. (Abhängig von dem voraussichtlichen Glucosegehalt der untersuchten Blutprobe variiert das Probenvolumen;
Im Falle von Proben mit einer Konzentration zwischen 6o bis 2oo mg% soll das Probenvolumen 1oo ,ul, im Falle einer
weniger konzentrierten Probe 2oo ,ul und bei einer konzentrierten Probe 5o ,ul sein. Im Falle einer Urinprobe mit einer Konzentration
von 0 bis 1 g% ist die Zugabe 25 ,ul; bei konzentrierteren Proben
wird eine zehnfache Verdünnung gemacht und von der verdünnten Probe werden 25 bis 5o,ul herausgenommen.) Aus dem gemessenen Wert der
Abnahme der Stromstärke wird die gesuchte Konzentration mit Hilfe der Gleichung 2 numerisch oder mit einem Computer berechnet.
Die mit dem glucoseselektiven Sensor gemessenen Werte sind für einige Proben in Tabelle I zusammengestellt.
Aus Tabelle I ist zu ersehen, dass die Streuung der mit dem glucoseselektiven
Sensor gemessenen Werte wesentlich kleiner ist als die Streuungmittels bekannter Methoden, bei welchen der
Wert der Streuung 1o % oft übertrifft.
909885/0657 ORIGINAL INSPECTED
Tabelle | I | der Daten |
Streuung mg % |
|
Konzentration der Standard lösung |
Zahl der parallelen Messungen |
Mittelwert- gemessenen mg % |
5 3 3 |
|
18o 12o 9o |
11 11 11 |
18o 121 91 |
||
Gemäss diesem Beispiel können auch andere molekülselektive Sensoren
hergestellt werden. In Tabelle II werden einige weitere Beispiele vorgestellt. In der ersten Kolonne der
Tabelle wird jene Molekülart aufgeführt, auf welche der Sensor selektiv ist. In der zweiten Kolonne das auf natürlicher
Membran immobilisierte Enzym, welches mit dem gadurchlässigen
Häutchen in Verbindung steht. In der dritten Kolonne wird die Art der Indikatorelektrode aufgeführt.
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zu bestimmende Komponente
i mmobilisiertes Enzym
Indikatorelektrode
Harnsäure Cholesterin L-Aminosäure D-Aminosäure
D-Galaktose
Uricase
Cholesterinoxydase
E.C.1.1 .3,6»
L-Aminosäureoxydase
E.C.1.4.3.2.
D-Aminosäureoxydase E.C.1· .4 «3.3»
Galaktoseoxydase E.C.1.1.3.5.
Sulfit | SuIfitoxydase E.C.1.8.3.1. |
Oxalat * |
Oxalatoxydase E.C.1.2.3.4. |
Xanthin | Xanthinoxydase E.C «1 .2»3.2» |
O-Diphenol | O-Diphenoloxyd E.C.1 .10.3.1 . |
p-Diphenol Wasserstoff hyperoxyd |
Katalase E.C.1 .11 .1 .6. |
Laktat | Laktaseoxydase E.C.1 .1 .3.2. |
Fyruvat | Pyruvatoxydase E.C.1 .2.3.3. |
Platin
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Fortsetzung der Tabelle II
zu gestimmende Komponente immobilisiertes Enzym
Indikatorelektrode
Alkohol L-Pheny!alanin
2-Oxosäur0
Oxalacetat Acetoacetat L-VaIiη
L-Glutamat L-Ornithin
L-Lysin Penicillin AlkoholoxydasQ Platin fE.C,i4'.3.1.3« "· ' - '
L-Phenylalaninase - ■"
E.C.1'*14.3.1. ■'"■-..
Pyruvatdekarboxylase E.C.44.1.1.
Oxalacetatdekarboxylase
E.O.4.1.1.3.
Acetoacetat dekarboxylase E.C.4.1.1.4.
Valindekarboxyläse
EeC.4.1.1.14.
Glutämatdekarboxyläse
E.C.4/1.1.15.
Ornithindekarboxylase E.C.4.1.1.17.
Lysin dekarboxylase E.C.4.1.1.18.
-Laktamase E .C .3 «5 .2 «6 ·
Wasserstoffionenselektive Elektrode
Fig. 2 zeigt ein Ausführungsbeisp'iel des. '.gemäss der Erfindung
hergestellten harnstoffselektiven Sensors (teilweise im Durchschnitt)
. In dem Sensorkörper 1 befindet sich eine
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ORIGINAL riSISPECTED
— Ίο —
chloridionenhaltige Elektrolytlösung 2, in welche eine
ammoniumionenselektive Indikatorelektrode 4 und eine Silber-Silberchlorid-Bezugselektrode
5 eintauchen. Die Indikatorelektrode 4 ist am Ende des Sensors mit einem für die Elektrolytlösung
2 nicht permeablen Verschluss,einer scheibenförmigen Abdichtungsschicht 11 befestigt. Die Indikatorenelektrode 4
ist mit einer Membran von natürlicher Struktur 7, welche mit Glutaralehyd immobiliserte Urease (E.C.3.5.1.5.) enthält und
welche aus einer Wandpartie einer Fischluftblase ausgebildet ist, in Berührung Die Membran natürlichen Ursprungs 7 wird
mit einem Gummiring 8 am Umhüllungskörper 1 besfestigt. In der Wand des Umhüllungskörpers 1 ist eine für Elektrolytlösung
durchdringbare Pilterschicht 12 (z.B. ein Keramikstab) untergebracht. Das andere Ende des Umhüllungskörpers 1 ist
durch eine Kunststoff-Verschlusskappe 9 abgeschlossen. Die Indikatorelektrode 4 und die Bezugselektrode 5 sind mit den
Eingängen des elektronischen Spannungsmessers mittels eines Kabels 1o in Verbindung.
Die Ausbildung der Reaktionsschicht des harnstoffselektiven
Sensors auf einer Membran natürlichen Ursprungs geschieht ähnlich wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Der einzige
Unterschied besteht darin, dass in diesem Fall an der Oberfläche der Membran Urease (E.C. 3.5.1.5.) immobilisiert wird.
Die Zusammensetzung des Sensors erfolgt auf die Weise, wie in Fig. 2 gezeigt. Die Konzentration der zu bestimmenden Probe
kann auf bekannte Weise mit Hilfe einer EMK-Konzentrations-Kalibrierungskurve
oder mit Hilfe der Additionstechnik durchgeführt werden.
Andere molekülselektive Sensoren können auch gemäss dem Beispiel
2 hergestellt werden. In Tabelle III werden einige
909885/0657
ORIGINAL INSPECTED
1261-67-
weitere Beispiele zusammengefasst. In der ersten Kolonne der Tabelle wird jene Molekülart dargestellt, auf
welcher der Sensor selektiv anspricht. In der zweiten Kolonne wird das immobilisierte Enzym und in der dritten Kolonne die
selektive Indikatorelektrode, welche für die jeweilige Untersuchung zu verwenden ist, aufgeführt.
zu bestimmende
Komponente
Komponente
immobilisiertes Enzym
Indikatorelektrode
L-Öioxyphenyl "'
alanin
alanin
L-Phenylalanin
L-Aminosäuren
D-Serin
L-Homoserin
L-Threojtin
L-Histidin
Nitrit
L-Aminosäureoxydase
E.C.1.4.3.2.
L-Aminosäureoxydase
E.C.1.4.3.2.
L~Aminosäureoxydase
E.C.1 .4.3.2.
D-Serindehydrafase
E. C. 4.2.1.14..
Homoserindehydratßse E.C.4.2.1 .15.
Threcnindehydratase E.C.4.2.1 .16.
Histidase E.C.4.3.1.3.
Nitritreduktase E.C.1 .6.6.4.
Ammoniumionenselektive
Elektrode
9 0 9 8 8 5/0657
- 2ο -
Der Aufbau eines erfindungsgemäss hergestellten argininselektiven
Sensors entspricht im wesentlichen dem in Beispiel 2 beschriebenen Ausführungsbeispiel des harnstoffselektiven
Sensors. Eine Abweichung besteht darin, dass am Ende des Umhüllungskörpers 1 zwei aufeinandergeschichtete
Membranen natürlichen Ursprungs 7 mit Hilfe eines Gummiringes 8 befestigt werden. Auf der Membran, welche an der Seite
der Indikatorelektrode liegt, ist Urease, auf der anderen perforierten Membran ist Arginase in immobiliserter Form gebunden.
Der argininselektive Sensor ist also mit zwei Reaktionsschichten ausgebildet.
Die Herstellung des argininselektiven Sensors gemäss der Erfindung
erfolgt auf folgende Weise: Zuerst wird der harnstoffselektive Sensor auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise
hergestellt. Danach wird auf die natürliche Membran, welche Urease enthält, noch eine aus Schafdarm gefertigte, natürliche,
perforierte Membran gelegt, an deren Oberfläche die Reaktionsschicht, welche Argitiase(E. C. 3 . 5. 3.1 .) enthält, gebildet
wird. Die Herstellung der Reaktionsschicht geschieht wie in Beispiel 1 beschrieben mit dem Unterschied, dass in der Pufferlösung
auch 1o mg Albumin suspendiert werden.
Der argininselektive Sensor kann auch so hergestellt werden, dass zum Aufbau des Sensors nur eine Membran 7 natürlichen
Ursprungs gebraucht wird, auf deren Oberfläche zwei Enzyme, d.h. Arginase und Urease, in statistisch homogener Verteilung
immobilisiert sind. Bei dieser Ausführungsform entsprechei
der weitere Aufbau und die Herstellung des Sensors sinrigemäss dem vorhergehenden Fall.
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Die Funktion des Sensors beruht auf einer zweistufigen Reaktion:
L - Arginin + H2O
L - Ornitin + Harnstoff
*,' Urease
Harnstoff + H0O -g—~—f- Kohlendioxid + Ammoniak
Harnstoff + H0O -g—~—f- Kohlendioxid + Ammoniak
Die Argininkonzentration der zu bestimmenden Probe kann auf bekannte Weise mit Hilfe einer Kalibrierungskurve oder
unter Anwendung der Additionstechnik bestimmt werden.
Über die anderen erfindungsgemäss herstellbaren molekülselektiven
Sensoren, die ähnlich Beispiel 3 mit zwei Reaktionsschichten oder mit einer Reaktionsschicht, welche zwei
Enzyme in statistisch homogener Verteilung enthält, hergestellt werden können, gibt Tabelle IV eine Übersicht.
In der ersten Kolonne der Tabelle ist jenes Molekül dargestellt,
welches mit dem molekülselektiven Sensor bestimmt werden kann. In der zweiten Kolonne ist der auf der äusseren
Membran natürlichen Ursprungs immobilisierte Enzymkatalysator zu finden. In der dritten Kolonne sind die auf der
inneren Membran, die sich auf der Seite der Indikatorelektrode befindet, immobilisierten Enzymkatalysator angegeben.
In der vierten Kolonne sind die Indikatorelektroden aufgeführt.
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zu bestimmende an der oberfläche der Membran
Komponente immobilisiertes
erstes. zweites i Enzym
Inosin Uridinnukleor. idase
E,C.3.2.2.2-
Adenonin Adenosinnukleoöidase
E. C. 3.2.2. a.
Guanosin Guanosinphosphorylase
E.C.2.4.2.15.
Xant inoxydase
E.C.1 .2.3.2.
E.C.1 .2.3.2.
Adenindeaminase
E.C.3.5.4.2.
E.C.3.5.4.2.
Guanase
E.C.3.5.4.3,
Indikatorelektrode
Platin
Ammoniumionenselektive oder Wasserstoff
ionenselektive Elektrode
Guanin
Kreatinin
ß-D Glukoside Disaccharide Amygdalin Salicin
α-D Glukoside (z.B. Maltose)
D-Glukose-1-phosphat
O-Glukose-6-phosphat
Guanase
E.C.3.5.4.3.
Kreatininase E.C.3.5.3.3«
ß-Glukosidase E.C.3.2.1 .21 -
a-Glukosidase E.C.3.2.1 .20.
Xanthinoxydase
E.C.1.2.3.2.
E.C.1.2.3.2.
Urease
E„C.3.5.1 .5.
E„C.3.5.1 .5.
G]ukoseoxydase
E.C.1.1.3.4.
E.C.1.1.3.4.
Glukoseoxydase
E.CU1.3.4.
E.CU1.3.4.
Glukose-1-phopshatase Glukoseoxydase
E.C.3.1 .3.10. £.C#1.1.3,4.
Glukose-6-phosphatase Glukoseoxydase
E.C.3.1.3.9. E.C.1.1.3.4.
Oorbiturat Barbiturase Urease
E.C.3.5--1 ,5.
E.C.3.5--1 ,5.
Platin
Ammoniumionenselektive Elektrode
Platin
Ammoniumionenselektive odef Wasserstüffionenselektive
Elektrode
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In dem Beispiel 4 wird ein Ausführungsbeispiel und die Herstellung
eines erfindungsgeraäss bifunktionellen molekülselektiven
Sensors gezeigt.
In dem Umhüllungskörper 1 befindet sich eine chloridionenhaltige Pufferlösung 2, in welcher zwei Platin-Indikatorelektroden
4,die einzeln in je einem Tragkörper 3 eingebaut sind, eintauchen. Mit den Oberflächen der Indikatorelektroden
4 ist ein auf der Öffnung des Umhüllungskörpers 1 befestigtes gasdurchlässiges Polypropylen-Häutchen 6 in Berührung.
Die Oberfläche des Häutchens 6 ist mit einem Stück Haut, mit einer Membran natürlichen Ursprungs bedeckt. Eine Partie
der Membranoberfläche 7 natürlichen Ursprungs steht mit einer der Indikatorelektroden 4 in Berührung; auf dem gleichen
Teil der Membranoberfläche auf der entgegengesetzten Seite der Membran ist D-Aminosäureoxidase in immobilisierter
Form gebunden. Ein anderer Teil der Membranoberfläche steht
mit der anderen Indikatorelektrode in Berührung; auf dem gleichen Teil der Membranoberfläche auf der entgegengesetzten
Seite der Membran ist L-Aminosäureoxidase in immobilisierter Form gebunden.
Die übrigen Details des Aufbaus des bifunktionellen molekülselektiven
Sensors entsprechen sinngemäss dem Aufbau des in Beispiel 1 beschriebenen Sensors.
Die Herstellung der Reaktionsschichten, die Aminosäureoxidase
enthalten, geschieht auf folgende Weise: Auf das gasdurchlässige Polypropylen-Käutchen wird die nasse Hautmembran
gespannt. Dann wird die Membran 3o Minuten lang bei Zimmertemperatur trocknen gelassen. Danach werden auf einem Teil
der Membranoberfläche 1o,ul einer Phosphat-Pufferlösung
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mit pH-Wert 8,3 verteilt, wobei jeweils o,1 ml 5 mg D-Arainosäureoxidase
in suspendierter Form enthalten (E.C.1.4.3.3., Sygma, kristallisiert). Später werden noch
1O/Ul 25 %-ige Glutaraldehydlösung zugefügt. Anschliessend
werden auf dem anderen Teil der Membranoberfläche 1o ,ul
einer Photphat-Pufferlösung verteilt, welche einen pH-Wert
von 6,5 aufweist, und welche pro o,1 ml 1o mg L-Aminosäureoxidase (E.C.1.4.3.2., Sygma IV) in suspendierter Form enthält.
Später werden dazu ebenfalls die 1o,ul 25 %-ige Glutaraldehydlösung
gegeben.
Die weiteren Schritte entsprechen den. in Beispiel 1 beschriebenen.
Mit dem bifunktionellen molekülselektiven Sensor ist die selektive Bestimmung der D- und L-Isomere
der Aminosäuren parallel möglich. Die Messung wird so durchgeführt,
dass der selektive Sensor zuerst in der L-Form und nur danach in der D-Form der zu bestimmenden Aminosäure
(z.B. Phenylalanin) verfertigte Lösungen kalibriert wird. Bei der Durchführung einer Kalibrierung wird der Sensor von
einer gerührten Phosphat-Pufferlösung (pH 8) in eine mit konstanter Geschwindigkeit gerührte Standardlösung mit
gleichem pH-Wert verlegt und es wird die durch die Wirkung der -o,6 V Polarisationsspannung entstehende Stromintensitätsänderung
gemessen ( JXi). Wenn man die /li-Werte
als Funktion der Konzentration der Standardlösungen darstellt, kann man die Kalibrierungskurve aufstellen und mit
deren Hilfe nach der Messung von .Λ.Ϊ- das Verhältnis der
optischen Isomere der verschiedenen Aminosäuren bestimmen.
Der Gebrauch des beispielgemäss hergestellten komplexen
Sensors ist bei Untersuchungen der Wirksamkeit von Resolvationsprozessen
ausserordentlich vorteilhaft.
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2826167
Zur Bestimmung des Isomerverhältnxsses kann die in dem Beispiel 1 beschriebene Ädditionstechnik ebenfalls gutangewandt
werden. Ähnlich wie in Beispiel 4 können weitere vorteilhaft anwendbare bifunktionelle Sensoren gemäss der
Erfindung_hergestellt werden. Darüber gibt Tabelle V eine
Übersicht.
In der zweiten Kolonne der Tabelle sind die Namen der auf einem Teil der Oberfläche, und in der dritten Kolonne auf
dem anderen Teil der Oberfläche immobilisierten Enzyme aufgezählt.
zu bestimmende auf oinem Teil der zu. bestimmende
Komponente Membran irnmoblli- Komponente
eiertoa Enzym
Glukose
Glukose
Harnstoff
Glukose
Glukose
Harnstoff
Glukose
Glukoeeoxydose
E.C.1,1 .3.4.
Glukoseoxydase
E.C.1.1.3.4.
Urease
Alkohol
Mannose
Kreatinin
Glukoseoxydose
E. C. 1.1 .3.4.
GlukoseoxydasB E.C.1.1 .3.4.
Urease
E »C.3 .5 .1 .5
Glukoseoxydase E.C.1 .1.3.4.
Harnsäure
!-Phenylalanin
Arginin
Amygdalin
auf dem anderen Teil der Membran immobilisiertes Enzym
Alkohoioxydase
E.C.1.1.3.1.9.
Hexoseoxydase E.C.1.1.3.5.
Kreatininase E.C.3.S.3.3»
Urease
E .C .3.5.1.5 ·
Uricase
E.C*1.7«3e%3.
E.C*1.7«3e%3.
L-Phenylalaninaoe
E.C.1 .14.3,1«
Arginindekarboxy-
lase
E.c«4.1 .'i .19.
Glukosidase E.C.3.2.1 .21 ·
Glukoseoxydase E.C.1.1 .3.4.
909885/0657 ORIGINAL INSPECTBD
In Beispiel 5 werdender Aufbau und die Herstellung eines
erfindungsgemäss hergestellten multifunktionellen molekülselektiven
Sensors beschrieben, der zur parallelen Bestimmung verschiedener Aminosäuren geeignet ist.
Der Aufbau des multifunktionellen Sensors ist ähnlich dem in Beispiel 4 vorgestellten bifunktionellen Sensor. Ein Unterschied
besteht darin, dass dieser kein gasdurchlässiges Häutchen 6 enthält, und weiterhin dass in der in dem Umhüllungskörper 1 befindlichen Elektrolytlösung 2 drei wasserstoffionenselektive
Glaselektroden eingetaucht sind, die mit einer Membran 7 natürlichen Ursprungs in Kontakt stehen, an welcher'
auf drei gut getrennte^ Oberflächenteile, die drei verschiedenen
Reaktionsschichten ausgebildet sind, die die drei selektiven Aminosäuredecarboxylasen (L-Lysindecarboxylase,
L-Thyrosiidecarboxylase, L-Fhenylalanindecarboxylase) in
immobilisierter Form gebunden enthalten.
Die Herstellung der Reaktionsschichten geschieht wie in Beispiel 4 beschrieben.
Mit Hilfe dieses Sensors kann der L-Thyrosin-, L-Lysin- und Phenylalanin-Gehalt von Proben mit Aminosäuregehalt selektiv
bestimmt werden. Die Bestimmungen können mit Hilfe von drei (entsprechend den drei Aminosäuren) Potential-Konzentration-Kalibrierungskurven
durchgeführt werden.
Nach dem in Beispiel gezeigten multifunktionellen molekülselektiven
Sensor können ähnliche Varianten hergestellt v/erden. Die einzelnen Reaktionsschichtteile enthalten die folgenden
Enzyme in immobolisierter Form: L-Arginindecarboxylase, L-Glutaminsäuredecarboxylase, L-Glutamindecarboxylase,
L-Histidindecarboxylase, Urease.
909885/0657
ORIGINAL INSPECTED
eerse
ite
Claims (5)
- PATENTANWÄLTEDR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) · DIPL.-ING. V/.EIUE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · D1PL.-I NG. W. LEHNDlPL.-ING. K. FDCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN
ARABEUASTRASSE-i (STERNHAUS) · D-8000 MD NCHEN 81 - TELEFON (089) 911087 · TELEX 05-29619 (PATHE)32 225 m/fg"RADELKIS" Elektrokemiai Müszergyärto Szövetkezet,
Budapest / UngarnMolekülselektiver Sensor und Herstellung desselbenPatentansprüche1 .J Molekülselektiver Sensor, welcher einen offenen,
hohlen, mit Elektrolytlösung gefüllten Umhüllungskörper, der eine in die Elektrolytlösung eintauchende potentiometrische, voltairr* metrische Indikatorelektrode und die Referenzelektrode trägt, ein für Gase oder für Gase und gelöste Stoffe durchlässiges Häutchen,- welches die an der Seite der Indikatorelektrode befindliche öffnung verschliesst, eine mit dem Häutchen in Kontakt
stehende Gelschicht, die das für den zu bestimmenden Stoff
selektive Enzym in chemisch gebundenem Zustand enthält, und eine Spannungsquelle und Stromstärke-Messeinheit oder eine Spannungsmesseinheit, die mit den Elektroden des Sensors in Verbindung909885/0657stehen, umfasst, zur Bestimmung der Konzentration von in Lösungen anwesenden Molekülen oder Ionen, dadurch gekennzeichnet , dass die an der Seite der Indikatorelektrode (4) befindliche öffnung des Umhüllungskörpers (1) mit einer oder mehreren kontinuierlichen oder perforierten Membranen (7), die aus einem Stoff natürlichen Ursprungs ausgebildet ist und welche an deren Oberflächenschicht eine oder mehrere Enzyme in chemisch immobilisierter Form gebunden enthält, abgeschlossen ist, welche gegebenenfalls mit einem für Gase oder für Gase und gelöste Stoffe durchlässigen Häutchen in Kontakt steht, und ausserdem gegebenenfalls zwischen dem Umhüllungskörper (1) und der Indikatorelektrode (4) eine Isolationsschicht (11) und in der Wand des Umhüllungskörpers (1) ein für die Elektrolytlösung durchlässiges Filter eingebaut ist. - 2. Sensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran natürlichen Ursprungs (7) mit einem aus inertem Stoff hergestelltem Schutznetz oder Gewebe in Kontakt ist.
- 3. Sensor nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet , dass er mehrere Indikatorelektroden (4) umfasst.
- 4. Sensor nach Anspruch 1, 2 und/oder 3, dadurch gekennzeichnet , dass in der Oberschicht der Membran (7), die kein Enzym in immobilisierter Form enthält, eine für Gase oder für Gase und gelöste Stoffe durchlässige Schicht ausgebildet ist.'
- 5. Verfahren zur Herstellung eines molekülselektiven Sensors, dadurch gekennzeichnet , dass in der Oberschicht der Membran natürlichen Ursprungs mit Hilfe909885/0657chemischer Bindung eines oder mehrere Enzyme immobilisiert werden und die Membran, welche das immobilisierte Enzym enthält, gegebenenfalls mit einem für Gase oder für Gase und gelöste Stoffe durchlässigen Häutchen zusammen auf die Öffnung des hohlen Umhüllungskörpers fixiert wird, und in die Elektrolytlösung in der Höhlung des Sensors eine oder mehrere Indikatorelektroden und die Bezugselektrode eingesetzt werden.909885/0657
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