DE3784562T2 - Enzyme-sensor. - Google Patents
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Description
- Die Erfindung betrifft einen Enzym-Sensor, der für die Bestimmung der Konzentration von Glucose oder Adenosin-5'-triphosphat (ATP) in einer Probe verwendet wird.
- Ein Enzym-Sensor, mit dem schnell und leicht die Konzentration einer Komponente, die bestimmt werden soll, bestimmt werden kann, umfaßt im allgemeinen ein Enzym für die selektive Identifizierung einer spezifischen chemischen Substanz (wie eines Moleküls und eines Ions) und einen Transducer für die Messung der quantitativen Änderung in der Substanz oder Wärme, die während der Enzymreaktion gebildet oder verbraucht wird. Ein Transducer, der eine elektrochemische Vorrichtung verwendet, wie eine Gaselektrode oder eine ionenselektive Elektrode, wird hauptsächlich auf den Gebieten der klinischen chemischen Prüfung und der Nahrungsmittelindustrie verwendet. Entsprechend den Forderungen für die Verkleinerung und Integration von Enzym-Sensoren bei verschiedenen Gebieten besteht insbesondere Bedarf für einen Transducer, bei dem eine Semileitervorrichtung verwendet wird, insbesondere für einen ionenempfindlichen Feldeffekttransistor (ISFET). In der Literaturstelle Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Bd. 30, Nr. 4 (S. 245 bis 298) wird auf den Seiten 246 und 285 ein Enzym-Sensor vorgeschlagen, bei dem (als Transducer) ein Thermistor für die Messung der Wärme verwendet wird.
- Die meisten Untersuchungen auf dem Gebiet der Enzym-Sensoren betreffen die Entwicklung eines Enzym-Sensors für die Bestimmung der Glucose. Bei einem Vorschlag wurde Glucoseoxidase als Enzym in einem Sensor verwendet, bei dem eine elektrochemische Vorrichtung als Transducer verwendet wird. Bei dieser Art von Sensor wird ein Reaktionssystem verwendet, bei dem die Glucose in Wasserstoffperoxid und Gluconlacton überführt wird und Sauerstoff, bedingt durch die Einwirkung der Glucoseoxidase, verbraucht wird. Enzym-Sensoren, bei denen diese Reaktion verwendet wird, können in zwei Typen eingeteilt werden. Ein Typ ist ein Enzym-Sensor, der die Menge an verbrauchtem Sauerstoff mit einer Sauerstoffelektrode nachweist (die im Verhältnis zu der Konzentration der Glucose in der Probe steht). Der andere ist ein Enzym-Sensor, der die Menge an gebildetem Wasserstoffperoxid mit einer Wasserstoffperoxidelektrode nachweist (die im Verhältnis zu der Konzentration der Glucose in einer Probe steht). Es ist weiterhin bekannt, daß die Menge an Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid unter Verwendung eines ISFET bestimmt werden kann. Zusätzlich zu der obigen Reaktion ist es ebenfalls möglich, ein Reaktionssystem zu verwenden, bei dem Glucose mit Adenosin-5'-triphosphat (ATP) in Anwesenheit von Hexokinase unter Bildung von Glucose-6-phosphat und Adenosin- 5'-diphosphat (ADP) umgesetzt wird. Der Enzym-Sensor, bei dem dieses Reaktionssystem verwendet wird, verwendet als Transducer eine Wärmemeßvorrichtung, und es wird die Menge an Wärme, die während der Reaktion gebildet wird, gemessen (vergleiche Analytische Chemie, Bd. 47, Nr. 6, S. 786 bis 790).
- Ein Enzym-Sensor für die Bestimmung von Adenosin-5'-triphosphat (ATP) verwendet Glucoseoxidase und Hexokinase als Enzyme (EP-A-1-25136 entsprechend der japanischen Patentpublikation (nichtgeprüft) Nr. 17347/1985). Gemäß diesem Sensor existiert die Reaktion Glucoseoxidase und Glucose gleichzeitig mit der Reaktion Hexokinase und Glucose. Das Verhältnis der beiden Reaktionen hängt von der Menge an vorhandenem Adenosin-5'-triphosphat (ATP) ab. Ein anderer Enzym-Sensor für die Bestimmung von Adenosin-5'-triphosphat (ATP) verwendet Adenosin-5'-triphosphathydrolase (AT-Pase), mit dem Adenosin-5'-triphosphat (ATP) unter Bildung von Wasserstoffionen hydrolysiert wird (vergleiche Summary of Lectures, S. 604 (1985), the 50th Annual Meeting in spring of the Chemical Society of Japan; the Summary of Lectures F-4, S. 7, the 52nd Annual Meeting of Electrochemical Society of Japan). Bei diesem Sensor wird die pH-Änderung mittels ISFET gemessen.
- Bei den oben erwähnten Sensoren besitzen die, bei denen Glucoseoxidase verwendet wird, eine lange Ansprechzeit, bedingt durch das Fehlen von gelöstem Sauerstoff in Lösung. Bei dem Sensor, bei dem eine Sauerstoffelektrode verwendet wird, zersetzt sich Wasserstoffperoxid während der Messung zu Sauerstoff und Wasser. Der zersetzte Wasserstoff wird ebenfalls mit der Sauerstoffelektrode nachgewiesen, wobei ein Meßfehler auftritt. Bei dem Sensor, bei dem eine Wasserstoffperoxidelektrode verwendet wird, bedingen reduktive Materialien in der Probe Fehler bei der Messung. Im Falle des Sensors, bei dem Hexokinase verwendet wird, kann die Hexokinase nicht nur auf Glucose sondern ebenfalls auf Mannose und Fructose einwirken, wodurch Meßfehler entstehen. Die oben erwähnten Sensoren besitzen eine lange Ansprechzeit, wenn sie während langer Zeit nicht verwendet werden, und sie werden bei dem Nachweis des Verhältnisses schlecht. Weiterhin wird ihre Genauigkeit verschlechtert, wenn sie nicht wiederholt verwendet werden. In dem Sensor, bei dem Adenosin-5'-triphosphathydrolase (AT-Pase) verwendet wird, fällt die Aktivität an Adenosin-5'-triphosphathydrolase (AT-Pase) in kurzer Zeit ab, und der Nachweisbereich ist sehr gering.
- Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Enzym-Sensor zur Verfügung zu stellen, mit dem die Menge an Glucose oder Adenosin-5'-triphosphat (ATP) selektiv bestimmt werden kann und der ohne Genauigkeitsverlust eine lange Verwendung finden kann.
- Es wurde gefunden, daß ein Enzym-Sensor, bei dem Glucokinase als Enzym verwendet wird, eine erhöhte Ansprechzeit während langer Gebrauchsdauer zeigt und keine Erniedrigung im Nachweisverhältnis besitzt.
- Gegenstand der Erfindung ist ein Enzym-Sensor, der ein Enzym, das auf ein spezifisches Substrat einwirkt und einen Transducer für die Umwandlung der quantitativen Änderung einer Substanz oder der Wärme, die während der Enzymreaktion gebildet wird oder verbraucht wird, in ein elektrisches Signal umfaßt, wobei das Enzym Glucokinase ist.
- Mit dem erfindungsgemäßen Enzym-Sensor ist eine akurate bzw. genaue Bestimmung der Menge an ATP in einer Probe möglich wie auch die genaue Bestimmung von Glucose. Die Ansprechzeit des Sensors ist fast konstant selbst nach langer Verwendung, und die Abnahme in dem Nachweisverhältnis ist sehr gering.
- Anhand der beigefügten Zeichnungen wird die Erfindung näher erläutert. Es zeigen
- Fig. 1 einen Schaltkreis umfassend einen ionenempfindlichen Feldeffekttransistor (ISFET) 1, an den die Glucokinase immobilisiert ist, einen ionenempfindlichen Feldeffekttransistor (ISFET) 2, an dem die Glucokinase nicht immobilisiert ist und eine Ag/AgCl-Elektrode 3;
- Fig. 2 die Beziehung zwischen der Konzentration von Glucose und einem Differentialoutput;
- Fig. 3 die Beziehung zwischen der Konzentration von Adenosin- 5'-triphosphat (ATP) und einem Differentialoutput.
- Der erfindungsgemäß verwendete Transducer kann eine elektrochemische Vorrichtung, eine Semileitervorrichtung oder eine Wärmemessungsvorrichtung sein. Bevorzugt ist der Transducer eine Semileitervorrichtung, wie ein ionenemfindlicher Feldeffekttransistor (ISFET), der verkleinert und leicht integriert werden kann.
- Die Glucokinase, welche bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kann aus verschiedenen Quellen erhalten werden. Beispielsweise kann sie aus Mikroorganismen oder aus Tieren stammen. Die bevorzugte Glucokinase für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung wird aus Mikroorganismen gebildet, die bei einer Temperatur im Bereich von 50 bis 85ºC gezüchtet werden. Beispiele für die Mikroorganismen sind Bacillus sp. wie Bacillus stearothermophilus, Bacillus thermoproteolyticus, Bacillus acidocaldarius, Thermoactinomyces sp., Thermus sp. und Thermomicrobium sp. Typische Beispiele für Mikroorganismen sind Bacillus stearothermophilus, wovon spezifische Beispiele ATCC 7933 Stamm (ATCC, The American Type Culture Collection, Maryland, USA), ATCC 7954 Stamm, ATCC 10194 Stamm, ATCC 12980 Stamm, NCA 1503 Stamm (NCA, National Canner's Association, Washington, D.C., USA) und UK 563 Stamm (PERM P-7275 Stamm, hinterlegt beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ibaragi, Japan, am 29. September 1983).
- Die bei der vorliegenden Erfindung verwendete Glucokinase ist im allgemeinen auf einem wasserunlöslichen Träger, wie einer Membran, einem Teilchen, einer Faser, einer Hohlfaser oder einem Rohr, immobilisiert. Der wasserunlösliche Träger, auf dem die Glucokinase immobilisiert ist, kann in einen Reaktionsbehälter, beispielsweise in einen Rührkessel, in einen gepackten Kessel, in einen Strömungskessel oder einen Röhrenkessel gegeben werden und in ein Strömungssystem mit einer Outputströmung, die zu der empfindlichen Oberfläche des Transducers führt, eingebaut werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform liegt der wasserunlösliche Träger in Form einer Membran vor, auf der die Glucokinase immobilisiert ist. Die Membran kann direkt die empfindliche Oberfläche einer Elektrode, die den Transducer ergibt, bedecken. Dieses letztere Verfahren (bei dem die empfindliche Oberfläche der Elektrode der Glucokinasemembran bedeckt ist) ist wegen der Verkleinerung und der Integration des Enzym-Sensors bevorzugt. Die Dicke der Glucokinasemembran beträgt beispielsweise 1 bis 100 um, bevorzugt 10 bis 50 um.
- Die Immobilisierung der Glucokinase auf den wasserunlöslichen Träger kann gemäß einem kovalenten Bindungsverfahren oder einem Absorptionsverfahren durchgeführt werden, die allgemein bekannt sind und beschrieben werden in "Immobilized Enzyme" von Ichiro, CHIBATA, Kodan-sha (1975). Sie kann ebenfalls durch ein Vernetzungsverfahren oder ein Einschluß- bzw. Umhüllungsverfahren durchgeführt werden. Das covalente Bindungsverfahren umfaßt: ein Peptidbindungsverfahren, bei dem CNBr-aktivierte Agarose oder aktiviertes Dextran an eine Aminogruppe der Glucokinase gebunden wird, ein Diazoverfahren, bei dem ein wasserunlöslicher Träger mit einer aromatischen Aminogruppe mittels eines Nitrids in ein Diazoniumsalz überführt wird, an das die Tyrosinreste der Glucokinase gekoppelt werden, ein Verfahren mit einer Schiff'schen Base, bei dem ein wasserunlöslicher Träger mit einer Aminogruppe an Glutaraldehyd gebunden wird und an den dann eine Aminogruppe der Glucokinase gebunden wird, und ein Verfahren, bei dem poröses Glas, Siliciumdioxid oder ein Metalloxid mittels gamma-Aminopropyltriethoxysilan aminosilanisiert wird und mit Glutaraldehyd behandelt und dann mit der Aminogruppe der Glucokinase verbunden wird. Das Absorptionsverfahren umfaßt ein Verfahren, bei dem Glucokinase an einen wasserunlöslichen Träger, wie DEAE-Cellulose oder Phenoxyacetylcellulose, über eine Ionenbindung oder durch physikalische Kräfte immobilisiert wird. Das Vernetzungsverfahren umfaßt ein Verfahren, bei dem Glucokinase und eine Aminogruppe von Albumin mittels Glutaraldehyd zur Immobilisierung der Glucokinase an Albumin vernetzt werden. Das Einschließbzw. Einschlußverfahren umfaßt ein Verfahren, bei dem eine Lösung, die Acrylamidmonomere, ein Vernetzungsmittel (beispielsweise N,N'-Methylenbisacrylamid), einen Initiator (beispielsweise Riboflavin und Peroxodisulfat) und einen Polymerisationsaktivator (beispielsweise N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin) enthält, zu einer Glucokinaselösung gegeben wird, und bei dem mit Licht unter einer Stickstoffdecke polymerisiert wird, ein Verfahren, bei dem Glucokinase zu einer Collagenfibrilsuspension gegeben wird, und bei dem nach dem Gießen auf eine Teflonplatte getrocknet wird, und ein Verfahren, bei dem zwei Platinelektroden in eine Suspension, die Collagen und Glucokinase enthält, eingetaucht werden und eine direkte Stromspannung unter Bildung einer Collagenmembran, welche Gluco-kinase an der Kathode enthält, angewendet wird.
- Zur Bestimmung der Menge an Glucose unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzym-Sensors wird eine Pufferlösung, die ein Magnesiumsalz und Adenosin-5'-triphosphat (ATP) enthält, durch den Reaktor bzw. Reaktionsbehälter, der die immobilisierte Glucokinase enthält, geleitet. Eine Outputlösung aus dem Reaktor kann dann mit dem Transducer nachgewiesen werden. In diesem Falle wird eine Änderung in der nachzuweisenden Substanz (die durch Zugabe von Glucoselösung gebildet wird) mittels des Enzym-Sensors bestimmt. Alternativ kann der Enzym-Sensor einen Transducer mit einer empfindlichen Oberfläche , die von immobilisierter Glucokinase bedeckt ist, umfassen. Ein solcher Sensor kann in eine Pufferlösung eingetaucht werden, die ein Magnesiumsalz und Adenosin-5'-triphosphat (ATP) enthält, und eine Änderung in der Substanz, die nachgewiesen werden soll (die durch Zugabe einer Glucoselösung gebildet wird), kann durch den Enzym-Sensor bestimmt werden. In diesem Fall kann eine pH-Änderung, die gemäß der folgenden Reaktion entsteht, mittels einer pH-Elektrode oder einem ionenempfindlichen Feldeffekttransistor (ISFET) nachgewiesen werden; Glucose + Adenosin-5'-triphosphat (ATP) Glucokinase Glucose-6-phosphat + Adenosin-5'-diphosphat (ADP) + (Wärme)
- Weiterhin kann die Änderung der Wärme mittels eines Thermistors nachgewiesen werden. Es ist bevorzugt, daß die pH-Änderung (bedingt durch H+) mittels einer pH-Elektrode oder einen ionenempfindlichen Feldeffekttransistor (ISFET) nachgewiesen wird.
- Die bevorzugte Pufferlösung für die Bestimmung enthält 0,1 bis 20 mM, bevorzugt 0,3 bis 5 mM Adenosin-5'-triphosphat (ATP), und 0,5 bis 50 mM, bevorzugt 2 bis 30 mM Magnesiumsalz. Die Pufferlösung wird durch Auflösen von Adenosin-5'-triphosphat (ATP) und des Magnesiumsalzes in einer Pufferlösung (pH 4 bis 10, bevorzugt pH 5,5 bis 9,5), wie Tris-Chlorwasserstoffsäure oder Imidazol-Essigsäure durchgeführt.
- Die Bestimmung von Adenosin-5'-triphosphat (ATP) erfolgt durch Verwendung von Glucose anstelle von ATP in der Pufferlösung. In diesem Falle beträgt die Menge an Glucose 0,1 bis 30 mM, bevorzugt 0,8 bis 15 mM in der Pufferlösung.
- Die Temperatur liegt für die Bestimmung bevorzugt im Bereich von 5 bis 75ºC, bevorzugt 15 bis 55ºC.
- Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
- 20 ul (23 Einheiten) von Glucokinase, die aus Bacillus stearothermophilus stammt, werden mit 2 ul von 25 Gew./Vol.-% Rinderserumalbumin vermischt. 2 ul des so erhaltenen Gemisches werden tropfenweise auf das Fenster eines ionenempfindlichen Feldeffekttransistors (ISFET) gegeben und bei Raumtemperatur während 20 Minuten an der Luft getrocknet. 2 ul von 1 Gew./Vol.-% Glutaraldehyd werden tropfenweise auf das Fenster gegeben und bei 4ºC während eines ganzen Tages und einer Nacht unter Bildung einer immobilisierten Membran umgesetzt. Diese wird in eine 0,1 M Glycin-Natriumhydroxid-Pufferlösung bei pH 8,5 während 15 Minuten eingetaucht und mit destilliertem Wasser gespült, wobei ein ionenempfindlicher Feldeffekttransistor (ISFET) erhalten wurde, auf dem Glucokinase immobilisiert ist.
- Der immobilisierte Glucokinase enthaltende ionenempfindliche Feldeffekttransistor (ISFET) 1 und ein nichtimmobilisierter ionenempfindlicher Feldeffekttransistor (ISFET) 2 für die Kontrolle werden in 25 ml Reaktionslösung eingetaucht, die 20 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 9,0), 20 mM Magnesiumchlorid und 4 mM Adenosin-5'-triphosphat (ATP) enthält. Eine Ag/AgCl-Elektrode wird in die Reaktionslösung eingetaucht, um an die Lösung eine Spannung anzulegen. Der ionenempfindliche Feldeffekttransistor (ISFET) besitzt die in Fig. 1 dargestellte Schaltung, wobei die Spannung zwischen den Anflußquellen der beiden ISFETs auf 3,0 eingestellt wurde und die an die Ag/AgCl-Elektrode angelegte Spannung 6,5 V betrug. Wenn eine Glucoselösung zu der Reaktionslösung an der Grenzoberfläche der ISFET zugegeben wurde, änderte sich der pH teilweise. Die Änderung wurde mit einem Differentialoutput zwischen den beiden ISFETs nachgewiesen. Die Temperatur für die Reaktion betrug 30ºC und das Rühren der Reaktionslösung erfolgte bei 200 UpM.
- Die Konzentration der Glucoselösung wurde auf 2, 5, 10, 30, 100 und 200 mg/dl eingestellt, und die Beziehung zwischen Glucosekonzentration und dem Differentialoutput ist in Fig. 2 dargestellt. Aus Fig. 2 ist offensichtlich, daß der Enzym- Sensor gute Ansprecheigenschaften in einem Konzentrationsbereich von 2 bis 200 mg/dl aufweist. Es wurde gefunden, daß der erfindungsgemäße Enzym-Sensor die Glucosemenge wirksam bestimmen kann.
- Zur Prüfung der Stabilität des erfindungsgemäßen Enzym-Sensors wurde eine Bestimmung während langer Zeit durchgeführt, wobei eine Glucoselösung von 10 mg/dl verwendet wurde, und die Prüfung nach dem Stehenlassen während einem Monat, 3 Monaten und 6 Monaten bei 37ºC erfolgte. Die Ansprechzeit und das Glucosenachweisverhältnis sind in Tabelle 1 aufgeführt.
- Zum Vergleich wurde der gleiche Test durchgeführt, wobei Hexokinase, die aus Hefe stammt, anstelle von Glucokinase, die aus Bacillus stearothermophilus stammt, verwendet wurde. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 als Vergleichsbeispiel 1 aufgeführt. Ein anderer Vergleich wurde durchgeführt, bei dem ein im Handel erhältlicher Enzym-Sensor verwendet wurde, bei dem Glucoseoxidase an einer Wasserstoffperoxidelektrode immobilisiert war. Es wurde der gleiche Test durchgeführt. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 als Vergleichsbeispiel 2 aufgeführt. Tabelle 1 Beispiel Ansprechzeit (Min.) Nachweisverhältnis Vergleichsbeispiel Unmittelbar nach der Herstellung oder dem Kauf Nach einem Monat Nach 3 Monaten
- Aus Tabelle 1 folgt, daß der erfindungsgemäße Enzym-Sensor im Vergleich mit den anderen Sensoren sehr stabil ist. Für die Prüfung der Stabilität des erfindungsgemäßen Sensors nach wiederholter und kontinuierlicher Verwendung wurde der gleiche Versuch durchgeführt, wobei eine Serumprobe verwendet wurde, die eine Glucosekonzentration von 50 mg/dl besaß, und wobei der Sensor 50 mal pro Tag während 10, 20 und 30 Tagen verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
- Zum Vergleich wurden die für die Vergleichsbeispiele verwendeten Sensoren verwendet, und der gleiche Versuch wurde durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2 Beispiel Ansprechzeit (Min.) Nachweisverhältnis Vergleichsbeispiel Unmittelbar nach der Herstellung oder dem Kauf Nach 10 Tagen
- Aus Tabelle 2 folgt, daß der erfindungsgemäße Enzym-Sensor sich in seiner Qualität im Vergleich mit den anderen Sensoren nicht verschlechtert.
- Eine Beziehung zwischen den Differentialoutputs und den Konzentrationen wurde erhalten, wie es allgemein in Beispiel 1 dargestellt wurde, mit der Ausnahme, daß 12 mM Glucose anstelle von 4 mM Adenosin-5'-triphosphat (ATP) verwendet wurden und daß die Konzentration der ATP-Lösung im Gegensatz zu der Glucoselösung auf 50, 100, 200, 300 und 500 mg/dl eingestellt wurde.
- Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Aus Fig. 3 ist erkennbar, daß der erfindungsgemäße Sensor gute Ansprecheigenschaften im Bereich von 50 bis 500 mg/dl aufweist, und es wurde gefunden, daß mit dem erfindungsgemäßen Sensor Adenosin- 5'-triphosphat (ATP) bestimmt werden kann.
Claims (6)
1. Enzym-Sensor, dadurch gekennzeichnet,
daß er ein Enzym, das auf ein spezifisches Substrat einwirkt,
und einen Transducer für die Umwandlung entweder der
quantitativen Änderung der Substanz oder der Wärme, die während der
Enzymreaktion gebildet oder verbraucht wird, in ein
elektrisches Signal umfaßt, wobei das Enzym Glucokinase ist.
2. Enzym-Sensor nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das Substrat Glucose ist.
3. Enzym-Sensor nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das Substrat Adenosin-5'-triphosphat
(ATP) ist.
4. Enzym-Sensor nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die während der Enzymreaktion
gebildete Substanz ein Wasserstoffion ist.
5. Enzym-Sensor nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß sich die Glucokinase von einem
Mikroorganismus ableitet, der bei einer Temperatur im Bereich von
50 bis 85ºC gezüchtet wurde.
6. Enzym-Sensor nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß der Transducer eine Elektrode ist und
daß die Glucokinase auf einer Membran, die die empfindliche
Oberfläche der Elektrode bedeckt, immobilisiert ist.
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