DE2415997C2 - Gerät und Verfahren zum Messen der Konzentration eines Substrats in einem Fluid - Google Patents

Description

Bildung eines ersten Reaktionsprodukts geeignet ist 25 überwacht werden kann. Außerdem ist wegen ihres und wenigstens ein anderes Enzym zur Bewirkung großen Volumens und der Notwendigkeit der Verweneiner zweiten Reaktion unter Beteiligung des ersten

Reaktionsprodukts geeignet ist

5. Gerät nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet daß der Bezugswännefühler (U) mit einem von dem auf dem zweiten Wärmefühler (10) verschiedenen Mikroorganismus überzogen ist

6. Gerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß der Bezufeswärmvfühler (11) mit einem Material überzogen ist das eine praktisch gleiche Lösungswärme wie die Lösungswärme einer Matrix aufweist mit der das Enzym oder der Mikroorganismus am zweiten Wärmefühler (10) angebracht ist 7. Verfahren zum Messen der Konzentration eines dung eines Elektrolyts auch ein verhältnismäßig großes Reaktionsmittelvt innen erforderlich, um genaue Ergebnisse zu erzielen.

Außerdem sind Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart und Konzentration eines Substrats in einem Fluid durch kolonmetrische Reaktionen bekannt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Gerät zum biochemischen Messen der Konzentration eines Substrats in einem Fluid zu entwickeln, das von einfacherem und kleinerem Aufbau als die bisher bekannten ist die Messung der Konzentration einer

größeren Vielfalt von Molekülen zuläßt ohne die Anwesenheit eines Elektrolyts auskommt und so auch Substrats in einem Fluid, dadurch gekennzeichnet 40 die Prüfung kleinerer Probec- oiumina. wie z. B. daß man ein Gerät zum Messen der Konzentration physiologischer Fluide in situ, ermöglicht und ein damit eines Substrats in einem Fluid nach einem der durchführbares Meßverfahren antugeben.
Ansprüche 1 bis 6 mit wenigstens zwei Fluiden Diese Aufgabe wird durch das im Patentanspruch 1

kontaktiert deren jedes eine bekannte Konzentra- gekennzeichnete Gerät bzw. durch das im Patentantion dieses Substrats enthält, um das Gerät zu eichen. 45 spruch 7 gekennzeichnete Verfahren gelöst.

und daß man nachher die Wärmefühler des Geräts in ein Fluid gibt das das zu bestimmende Substrat enthält.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Gerät und ein Verfahren zum Messen der Konzentration eines Substrats in einem Fluid.

Enzyme und gewisse Mikroorganismen, wie z. B. Bakterien oder Hefen, sind dafür bekannt, daß sie eine Reaktion selektiv katalysieren, wobei ein bestimmtes Substrat beteiligt ist. Auf Basis dieser Eigenschaft Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Patentansprüchen 2 bis 6 gekennzeichnet.

Die Erfindung erreicht also die Messung der Konzentration von Molekülen durch Überwachung und

Erfassung der lemperaturänderung, die durch die selektive Reaktion der Moleküle bei Katalyse durch ein Enzym oder einen Mikroorganismus hervorgerufen wird. Der mit dem Mikroorganismus oder Enzym überzogene, zweite Fühler erfaßt die durch die Reaktion an der Fühleroberfläche erzeugte Temperaturänderung. Der Bezugswärmefühter, der überzogen oder ohne Überzug sein kann, in jedem Fall aber nicht mit dem gleichen Mikroorganismus oder Enzym wie der zweite Fühler überzogen ist, erfaßt die Umgebungstemperatur.

wurden diese Stoffe in einer weiten Auswahl von 60 Die Fühler sind aus einem Werkstoff gebildet der eine Erfassungsmethoden verwendet, um das Vorliegen und Änderung einer elektrischen Eigenschaft wie z. B. des

elektrischen Widerstandes oder der elektrischen Spannung bei einer Temperaturänderung zeigt, und sind in einen Stromkreis geschaltet, der ein Gerät zum Messen der Änderung der elektrischen Spannung oder des elektrischen Widerstandes in Abhängigkeit von der Temperatur enthält.

Die Erfindung bringt wesentliche Vorteile gegenüber

die Konzentration dieses Substrats zu bestimmen. Zum Beispiel wurden Enzyme und Mikroorganismen bei kolorimetrischen Reaktionen verwendet, bei denen das Reaktionsprodukt eine unterschiedliche Farbe als das Ausgangsmaterial aufweist und der Grad der Farbänderung durch Lichtextinktion gemessen wird. Diese Messung läßt sich dann zur Konzentration des

den bekannten Verfahren und Vorrichtungen zum Messen der Konzentration von Molekülen. Der tatsächliche Aufbau des Fühlers ist ziemlich einfach, da ss lediglich notwendig ist, daß die in Berührung mit dem das Reaktionsmitte! enthaltenden Fluid befindliche Fühlerspitze vorher mit einem Enzym oder einem Mikroorganismus in einer Matrix überzogen wird, die an der Fühlerspitze gut haftet. Weiter können die Fühler gemäß der Erfindung sehr kleine Volumina in der Größenordnung von 0.001 cm³ oder weniger aufweisen, to Außerdem vermag das Gerät gemäß der Erfindung, die erforderlichen Temperaturmessungen innerhalb einer verhältnismäßig kurzen Zeitdauer durchzuführen, und eignet sich zur Lieferung eines direkten elektrischen Ausgangssignals, das sich mit Hilfe einer Vielzahl verfügbarer elektrischer Meßinstrumente genau messen läßt. Weiterhin erfordert das erfindungsgemäße Gerät nicht die Verwendung von Fluiden mit einer bestimmten chemischext Zusammensetzung, um seine Funktion zu erfüllen. Erforderlich ist nur, daß die physikalischen und chemischen Eigenschaften des umgebenden Fluids es zulassen, daß das Enzym oder der Mikroorganismus die Reaktion mit dem zu prüfenden Reaktionsmitte! katalysiert.

Schließlich ist. da das erfindungsgemäße Gerät nicht voraussetzt, daß die durch das Enzym oder den Mikroorganismus katalysierte Reaktion ein bestimmtes Ion oder eine bestimmte Klasse von Ionen bildet, der besondere Typ des verwendeten Enzyms oder Mikroorganismus' nicht begrenzt. So lassen sich erfindungsgemaß alle Enzyme oder Mikroorganismen verwenden, die sich zum Katalysieren einer Reaktion oder Eintritt in eine Reaktion mit dem zu prüfenden Reaktionsmittel eignen.

Die Erfindung wird anhand des in der Zeichnung veranschaulichten Ausführungsbeispiels näher erläutert; darin zeigt

F i g. 1 eine Schnittansicht des Gerätes: und

F i g. 2 eine Teilansicht des Systems des überzogenen Wärmefühlers.

Nach Fig.l sind Wärmefühler 10 und 11 in eine in einem Behälter 13 befindliche Flüssigkeit 12 eingetaucht. Die Flüssigkeit 12 enthält das Reaktionsmittel, hinsichtlich dessen der Versuch durchgeführt wird. Die Spitze 14 des Fühlers 10 ist mit einem unbeweglich gemachten Mikroorganismus oder Enzym überzogen, der bzw. das die Reaktion des zu prüfenden Reaktionsmittels katalysiert oder mit diesem reagiert Wenn die Reaktion abläuft, ergibt sich eine Temperaturänderung an der Oberfläche der Fühlerspitze 14. Die Spitze 15 des » Fühlers 11 ist entweder ohne Überzug oder vorzugsweise mit einer Matrix überzogen, die im wesentlichen die gleiche Lösungswärme wi*· der Überzug an der Fühlerspitze 14 aufweist. Der gegebenenfalls vorhandene Überzug an der Fühlerspitze 15 kann frei von einem Mikroorganismus eier Enzym sein oder auch einen Mikroorganismus oder ein Enzym enthalten; jedoch enthält dieser Überzug an der Fühlerspitze 15 auf keinen Fall einen Mikroorganismus oder ein Enzym, der bzw. das die gleiche Reaktionsart bewirkt, wie sie an der w Oberfläche der Fühlerspitze 14 abläuft. Nur in dieser Weise läßt sieh eine sinnvolle Temperaturdifferenzablesung erhalten.

Die Fühlerspitzen 14 und 15 sind zusammen in einem Schaltkreis mit einem (nicht dargestellten) elektrischen Strom- oder Spannungserzeuger und bestehen aus einem Werkstoff, der ;ine Änderung einer elektrischen Eigenschaft, wie z. B. des elektrischen Widerstandes oder der elektrischen Spannung mit der Temperatur zeigt Die Fühlerspitzen 14 und 15 können auch selbst der Erzeuger des elektrischen Stroms oder der elektrischen Spannung sein. Zum Beispiel erzeugen pyroelektrische Anordnungen oder Thermoelemente den Temperaturänderungen proportionale Spannungsoder Stromwerte. Die beiden Fühler sind in einer Brückenschaltung mit einer elektrischen Stromquelle und ausgeglichenen Widerständen so angeschlossen, daß ein Differenzstrom entsteht, der den Widerständen der Fühler direkt proportional ist Die Brückenschaltung und der elektrische Stromerzeuger sind in einem Behälter 16 als »Differentialthermometer« untergebracht Die besondere Brückenschaltung oder die besondere elektrische Stromquelle, die hier verwendet werden, sind für die Erfindung nicht kritisch, und es lassen sich hier alle geeigneten Schaltungselemente in Verbindung mit den Fühlern verwenden. Das Differentialthermometer 16 ist elektrisch mit irgendeinem geeigneten Speichergerät 17 verbunden, das sich zur Speicherung des Differenzstroms als Funktion der Zeit eignet Das Gefäß 18, das die dau Reaktionsmittel enthaltende Flüssigkeit 12 aufnimmt, wird während der Temperaturmessungen mittels eines magnetischen Rührers 19 und einer magnetischen Rührstange 20 gerührt Das Gefäß 18 ist in ein Konstanttemperaturbad 21 eingemacht, das seinerseits mittels eines Motors 22 und eines Rührflügels 23 gerührt wird. Das Bad 21 wird mit Hilfe eines geeigneten Temperatursteuergerätes 24 mit einem Thermometer 25 auf konstanter Temperatur gehalten, und ein Heizgerät 26 wird in Abhängigkeit von der durch das Thermometer 25 gemessenen und vom Steuergerät 24 erfaßten Temperatur ein- oder ausgeschaltet gehalten.

Das Differentialthermometer 16 kann außer der Brückenschaltung und dem elektrischen Stromerzeuger auch einen Differentialversiärker enthalten.

Die Wärmefühler können irgendeines aus einer Vielfalt von verfügbaren Wärmemeßelementen oder -instrumenten, wie z. B. Thermistoren (heißleiter), piezoelektrischen oder pyroelektrischen Anordnungen. Thermoelementen, Platinwiderstandsdrähten od. dgl. aufweisen.

Das Enzym oder der Mikroorganismus wird mit dem Fühler kontaktiert, indem man es bzw. ihn in emc Matrix einbringt die sich zum Festhaften an der Oberfläche der Fühlerspitze eignet Dies führt dazu, daß das Enzym oder der Mikroorganismus »unbeweglich gemacht« wird, so daß es bzw. er an der Fühleroberfläche festgehalten wird. Es ist nicht erforderlich, daß der Mikroorganismus oder das Enzym in der Matrix für eine unbegrenzt lange Zeildauer festgehalten werden. Nötig ist nur, daß er bzw. es ausreichend fest gehalten wird daß irgendeine Diffusion desselben vom Fühler weg viel länger as die Zeit dauert, die zum Erhalten der Temperaturablesungen erforderlich ist. wenn der Fühler in das geprüfte Fluid eingetaucht wird. Allgemein ist die zum Erhalten der Temperaturablesungen benötigte Zeitdauer weniger als etwa 5 Minuten und insbesondere weniger als etwa 2 Minuten.

Gegenwärtig ist eine große Auswahl von Arbeitsweisen zum Unbeweglichmachen eines Mikroorganismus oder eines Enzyms in einer Matrix verfügbar. Nicht begrenzende beispielsweise Methoden umfassen das Vernetzen eines Enzyms mit einem Dialdehyd, wie z. B. Glutaraldehyd, das Verkoppeln des Enzyms oder Mikroorganismus mit einem Akrylamidpolymeren oder -copolymeren, wie z. B. mit Diazotierungsverkettung,

oder das physikalische Einschließen des Mikroorganismus oder Enzyms in einem Gel oder die chemische oder physikalische Adsorption an der Fühleroberflüche. Diese und andere Verfahren zum Unbeweglichmachen des Mikroorganismus oder Enzyms sind in Fachkreisen an sich bekannt und brauchen im einzelnen nicht näher beschrieben zu werden.

jedes verfügbare Enzym, ob natürlich auftretend oder synthetisch hergestellt und ob in reiner Form oder nicht, läßt sich erfindungsgemäß verwenden. Repräsentative Enzyme umfassen Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen. Repräsentative geeignete spezifische Enzyme sind Hexokinase, Trypsin, Urease, Pepsin, Amylase, Chymotrypsin, Karboxypeptidase, Feigenprotase, Papoin, Lysozymer. Chymopapain, Invertase.Glukoamylase, Glukoseoxydase, Galaktose-(Cerebrose-)oxydase, Uricase, Penicillinase, Äthanoldehydrogenase, Aminosäurenoxydase od. dgl. Repräsentative geeignete Mikroorganismen sind Hefen, Pilze, anaerobe Bakterien und aerob»:· Bakterien, die sich zum Messen von Substraten in Flüssigkeit, Gasen oder mit Gasen gesättigten Flüssigkeiten verwenden lassen. Repräsentative geeignete Mikroorganismen umfassen Escherichia coli. Bacillus subtiliis. Clostridium sporogenes. Klebsieila aerogenes, Pseudomonas species, Candida species, Saccharomyces species. Pilzsporen, wie ζ. B. von Aspergillis niger, Actinomyces species.

Während die Erfindung oben unter Bezugnahme auf die Verwendung von zwei Wärmefühlern beschrieben wurde, sei darauf hingewiesen, daß auch mehr als ein mit dem Enzym oder dem Mikroorganismus überzogener Fühler zusammen mit einem Bezugswärmefühler verwendet werden können. Die Verwendung von mehr als einem mit einem Enzym oder einem Mikroorganismus überzogenen Wärmefühler hat den Vorteil, irgendwelche Fehler aufgrund äußerer Faktoren hinsichtlich der Temperatur auszugleichen. Die zusätzlich überzogenen Wärmefühler lassen sich ebenfalls in die Brückenschaltung in irgendeiner an sich bekannten Art einschalten, um Außentemperatureinflüsse auszugleichen.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß bei mäßiger Substratkonzentration die von dem Bezugsfühler und dem einen oder den mehreren das Enzym oder den Mikroorganismus enthaltenden Fühlern gemessene Temperaturdifferenz im wesentlichen von der Dicke einer ungerührten Grenzschicht zwischen der Fühleroberfläche und der das Reaktionsmittel enthaltenden Flüssigkeitsmasse und von der Konzentration des aktiven Enzyms oder Mikroorganismus an der Fühleroberfläche unabhängig ist. Dementsprechend ist weder die Konzentration des Enzyms oder Mikroorganismus je Flächeneinheit noch der Grad des Rührens für den Erfolg der Erfindung wesentlich.

Nach einer Ausführungsart der Erfindung können beide Wärmefühler mit einem unterschiedlichen Mikroorganismus oder Enzym überzogen werden bzw. sein, sofern das Reakiionsmittelfluid nur an einer Fühleroberfläche reagiert, während die andere Fühleroberfläche als Bezugsfühler fungiert Dieser Aufbau hat den Vorteil, daß er sich zur Bestimmung der Konzentration zweier verschiedener Arten von Molekülen in zwei verschiedenen Fluiden verwenden läßt.

Außerdem kann der überzogene Fühler auch mit mehr als einem Enzym oder Mikroorganismus überzogen werden. Wenn er z. B. mit zwei Enzymen überzogen wird, katalysiert ein Enzym eine erste Reaktion mit der Entwicklung eines ersten Reaktionsprodukts, und dieses Produkt tritt in eine von einem zweiten Enzym katalysierte Reaktion ein. Jede Reaktion bewirkt so eine Temperaturänderung an der Fühleroberfläche, und man mißt die gesamte Temperaturänderung. Zum Beispiel können Hexokinase und eine Phosphatase im Überzug enthalten sein, um die Reaktion von Glukose zu G lukose-6-Phosphat unier Verbrauch von ATP(Adenosintriphosphat) zu katalysieren. Anschließend wandelt

ίο die Phosphatase das Glukose-6-Phosphat zu Glukose um. So bewirkt der Kreislauf von Glukose in der

Reaktion eine erwünschte Verstärkung des durch die Reaktionswärme erzeugten Signals. Zur Verwendung werden die Wärmefühler zunächst

kalibriert, indem man die Temperaturdifferenz mißt, die an den Fühleroberflächen in Fluiden auftritt, die eine bekannte Konzentration des zu überprüfenden Moleküls enthalten. In dieser Weise erhält man eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Temperaturdifferenz ~A Λ»- U-.,rv,„r..,^.;^r. -Ie. MnloUftl.

lassen diese Kurven eine anfänglich lineare Beziehung zwischen der Temperaturdifferenz und der Konzentration erkennen, die sich mehr und mehr zu einer Asymptote abflacht. Nachdem einmal die Standardkur-

:> ve für eine bestimmte Gruppe von Fühlern aufgestellt ist, läßt sich das Gerät mit dieser Gruppe verwenden, um die Konzentration eines Substrats zu messen, indem man die Temperaturdifferenz am linearen Teil der Kur*· irbliest.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne sie beschränken zu sollen.

Beispiel I Dieses Beispiel erläutert die Verwendung eines

)5 Hexokinase enthaltenden Fühlers zum Messen entwe der der Glukose- oder der ATP- Konzentration.

Das Enzym Hexokinase katalysiert den Übergang eines Phosphats von Adenosintriphosphat (ATP). Die Gleichgewichtskonstante für diese Reaktion ist 3.86 ■ IO², und die Enthalpie für die Reaktion beträgt 16 587 J/Mol. Von Hefe abgeleitete Hexokinase wurde auf der Oberfläche eines Thermistors durch Glutaraldehydvernetzung unbeweglich gemacht. Der Thermistor wurde in 0,25 ml einer 1,025 mg Protein je ml enthaltenden Hexokinaselösung gegeben. Nach 20 Minuten Inkubationszeit bei Raumtemperatur wurden 25 μΐ eines 2^prozentigen Glutaraldehyds der Lösung zugesetzt und damit vermischt- Der Fühler wurde für zusätzliche 80 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert

so und dann mit einem Überschuß von kaltem 0,1 M »Tris«-Puffer bei pH 7,5 gewaschen. Der Fühler wurde dann in 0,2 ml Hexokinaselösung gegeben, um mit unreagiertem Glutaraldehyd zu reagieren.

Der Fühler wurde geeicht, indem man seine

katalytische Aktivität in folgender Weise bestimmte: Zu 1,75 ml von einem pH-Wert von 7,5 aufweisendem 0,1 M »Tris«-Puffer, der 1OmM MgQ₂ und 5 mM EDTA enthielt, wurden 0,01 ml 1,0Ml Glukose, 0,01 ml einer 6,8-10-³mg Protein enthaltenden GIukose-6-Phosphat-Dehydrogenaselösung, 0,1 ml einer Nikotinsäufe-

amid-Adenin-DinukIeotid-Phosphat(NADP)- Lösung mit 40 mg NADP je ml des »Tris«-Puffers und 0,50 ml einer Adenosintriphosphat(ATP)-Lösung mit 0,080 mg ATP je 10 ml des pH 7,5-»Tris«-Puifers zugesetzt Die Lösung wurde in einer Küvette gut gemischt Der mit Hexokinase überzogene Fühler wurde in die gerührte Küvette eingetaucht, und die Extinktion bei 340 mm wurde alle Minuten gemessen. Die Geschwindigkeit der

Extinktionsänderung ist der Aktivität der Hexokinase proportional. In vorstehender Weise hergestellte Fühler katalysieren die Bildung von Glukose-6-Phosphat mit einer Geschwindigkeit von 0,005 mMolen/ml/min oder mehr.

Dieser mit Hexokinasc überzogene Thermistorfühier wurde in die oben beschriebene Brückenschaltung eingeschaltet und mit einem /weiten identischen Therm'.i-or, der mit Kuhpockenserumalbumin (BSA) überzogen war, abgeglichen. Der Fühler wurde mit BSA überzogen, um nichtspezifische Effekte, wie z. B. eine Absorption von Proteinen auszuschalten. Der mit BSA überzogene Fühler hat keine kitalytische Aktivität in der Reaktionsmischung. Der mit BSA überzogene Fühler wurde in einer dem mit Hexokinase überzogenen Fühler identischen Weise mit der Ausnahme hergestellt, daß BSA die Hexokinase beim Vernetzungsreaktions-Vorgang ersetzte.

Diese beiden Fühler stellen die Temperaturerfassungsvcrrichiürtg für die Analyse von Adcnosir.triphGS-phat oder Glukose dar. Wenn entsprechend obiger Beschreibung in d*e Brückenschaltung eingefügt, zeigt der Fühler mit Hexokinase eine Temperaturdifferenz gegenüber dem mit BSA überzogenen Fühler, sofern ATP und Glukose anwesend sind. Um dies zu prüfen, wurden die Fühler in ein gut gerührtes Reaktionsgefäß mit 8 ml einer 12 mg ATP 1OmM MgCI₂ und SmM EDTA in pH 7,5 0,15 M »Tris«-Puffer enthaltenden Reaktionsmischung gegeben. Die Temperatur wurde auf 28,5°C gehalten. Das Differentialthermometer wurde auf 0 eingestellt, als es im obigen System war. Um den Ver.jch zu beginnen, wurden dem Reaktionsgefäß 0,050 ml 1,0 M Glukose zugesetzt. Die Fühler sprachen infolge des Zusatzes einer kühleren Flüssigkeit und der Mtschwirkungen unverzüglich mit einer Temperatursenkung an. Dann stieg die Temperatur des mit dem Enzym überzogenen Fühlers innerhalb 45 s auf einen neuen Gleichgewichtswert auf einer Spitze von 0.0008⁰C über dem des mit BSA überzogenen Fühlers. Nach 20 Minuten kehrte das System zu einem beständigen Zustand von etwa 0,0003° C über dem ursprünglichen beständigen Zustand zurück. Das Enzym an dem Hexokinasefühler konnte die Bildung von Glukose-6-Phosphat mit einer Geschwindigkeit von 0,013 mMolen je Minute katalysieren.

Beispiel II

Das proteolytische Enzym Trypsin, das eine Esterase-Aktivität aufweist, wurde an der Oberfläche eines Thermistors durch Glutaraldehydvernetzung unbeweglich gemacht. Es wurde eine 1-mg/ml-Lösung von Trypsin hergestellt, die in pH 8,0 »Tris«-Puffer mit 2,22 mg/ml von CaCl₂ aufgelöst war. Der Thermistorfühler wurde für 20 Minuten in 0,4 ml dieser Lösung gegeben. Dann wurden 0,005 ml einer 2^prpzentigen Glutaraldehydlösung zwecks Vernetzung des Enzyms zugesetzt Dieses System wurde einer Inkubation für eine Stunde bei Raumtemperatur (etwa 25° C) unterworfen, und dann wurde der Fühler aus der Reaktionsmischung entnommen und in 0,4 ml der oben beschriebenen Trypsin- und Pufferlösung für 20 Minuten bei Raumtemperatur gegeben, um unreagiertes Glutaraldehyd mit dem überschüssigen Trypsin reagieren zu lassen. Alternativ kann man, wie auch von anderen bereits vorgenommen, den Fühler in eiskaltes 0,5 M Natriumborhydrid geben, um unreagiertes Glutaraldehyd zu reduzieren. In beiden Fällen werden die Fühler dann gut mit Überschuß-pH-8-»Tris«-Puffer gewaschen.

Um den Fühler zu eichen, wird seine katalytische Aktivität durch spektralfotometrisches Verfolgen der

"' Hydrolyse des N-Benzoyl-Arginin-Äthylesters (BAEE) gemessen. Eine Versuchsmischung wird hergestellt, indem man 0,05 ml einer Lösung von »Tris«-pH-8,0-Puffer mit 17 mg BAEE/ml 2.45 ml von 0,05 M pH 8,0- »Tris«-Puffer in einer Küvette zusetzt. Die anfängliche

'"' Extinktion dieser Lösung bei 253 ηm wird gemessen. Der mit Trypsin überzogene Thermistorfühler wird in die gerührte Küvette eingetaucht, und man bestimmt die Extinktion bei 253 nm alle 5 Minuten. Nach 20 Minuten wird der Fühler entnommen, und man unterwirft die

"' VerVüChämisCmmg είίίέΓ iiikübaiiüii für HüsSUiiciic 5 Minuten, bevor eine letzte Ablesung erfolgt. Dieser letztere Schritt wird durchgeführt, um die Aktivität irgendwelchen Trypsins zu messen, das am Fühler nicht dauerhaft unbeweglich gemacht wurde. In vorstehender

^:> Weise hergestellte Fühler eignen sich zur Hydrolyse von BAEE mit einer Geschwindigkeit über 5 mMole/min bei Raumtemperatur und einem pH-Wert von 8,0.

Der mit Trypsin überzogene Fühler wird an die im

^!0 Beispiel I beschriebene Brückenschaltung angeschlossen. Zusätzlich wurde ein ähnlicher, mit Serumalbumin, d. h. einem Protein ohne Enzymaktivität in der Reaktionsmischung, überzogener Thermistor an die Schaltung angeschlossen. Dieser Fühler war gemäß der Beschreibung im Beispiel I hergestellt. Diese beiden Fühler bilden die Temperaturdifferenzerfassungsvorrichtung, da in der Gegenwart eines Substrats für Trypsin die Trypsin-katalysierte Reaktion nur an einem Fühler stattfindet und so der Wärmeeffekt auch nur an diesem einen Fühler auftritt.

Unter Verwendung der oben beschriebenen Vorrichtung wurden diese Fühler in ein 8 ml 0,05 M »Tris«-Puffer enthaltendes Reaktionsgefäß gegeben. Man ließ das Reaktionssystem zu einem Temperatur-

gleichgewicht gelangen. Als zusätzliche 0,2 ml des »Tris«-Puffers zugesetzt wurden, reagierten die Thermistorfühler mit einem kurzen vorübergehenden Ansprechen aufgrund der unterschiedlichen Temperatur der zugesetzten Lösung und der Mischungseffekte. Inner-

halb von 18 s zeigten die Fühler eine NuII-Temperaturdifferenz an. die mit der identisch war, die vor Zusatz des Puffers beobachtet wurde. Als 0,2 ml des Puffers mit einem Gehalt von 10~⁵ Molen BAEE dem Reaktionssystem zugesetzt wurden, beobachtete man eine vorüber-

gehende Temperaturanderung, die nur 12 s dauerte, bevor die Fühler eine beständige Temperaturdifferenz von 0,5 m ⁰C registrierten. Die Reaktionswärme von der Trypsin-katalysierten BAEE-Hyerolyse beschleunigte die nach Probenzugabe beobachtete Obergangsperiode

und führte zu einer beständigen Temperaturdifferenz zwischen den beiden Fühlern von 0,5 m ⁰C

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Gerät zum Messen der Konzentration eines Substrats in einem Fluid, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Bezugswärmefühler (11), einen zweiten, mit einem unbeweglich gemachten Mikroorganismus oder Enzym überzogenen Wärmefühler (10), weiche Fühler aus einem Material sind, das eine Änderung einer meßbaren elektrischen Eigenschaft als Funktion der Temperatur zeigt und Mittel (16) zum Messen der Differenz dieser elektrischen Eigenschaft der Fühler umfaßt

Z Gerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß jeder Fühler (iO bzw. 11) mit einem unterschiedlichen Enzym überzogen ist

3. Gerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß es eine Mehrzahl von zweiten Wärmefühlern (10) umfaßt deren jeder mit dem gleichen Mikroorganismus oder Enzym überzogen ist

4. Gerät nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet da£ der zweite Wärmefühler (10J einen wenigstens zwei Enzyme enthaltenden Überzug aufweist wovon ein Enzym zur Hervorrufung der Reaktion eines Substrats mit der begleitenden Reaktionsmittels auf Basis einer vorher erhaltenen Eichkurve in Beziehung setzen. Außerdem wurden biochemische Fühler zum Bestimmen der Konzentration der Moleküle verwendet wobei der Einsatz einer Bezugselektrode und einer biochemischen Elektrode erforderlich war, um eine Potentialänderung zu messen und diese Änderung zur Konzentration des Moleküls in Beziehung zu setzen (US-PS 34 03 081). Die biochemische Elektrode ist bzw. wird eng mit eine-n Enzym oder

ίο Bakterien kontaktiert welches bzw. welche selektiv mit dem zu untersuchenden Molekül reagieren, um eine Potentialänderung zwischen der biochemischen Elektrode und der Bezugselektrode hervorzurufen. Die Verwendung dieser biochemischen Fühler ist begrenzt

ts da sie den Einsatz von Elektroden erfordern, die zur Messung der Gegenwart eines bestimmten, während der Reaktion erzeugten Ions geeignet sind, und außerdem von etwas kompliziertem Aufbau und voluminös sind. Weiter müssen sie in Verbindung mit

-jo einem Elektrolyt verwendet werden, der je nach der Art der Elektrode und der Art der durchgeführten Reaktion unterschiedlich ist. Daher sind diese biochemischen Fühlersysteme insofern unerwünscht begrenzt als damit nur eine beschränkte Anzahl von Reaktionsmitteln