CN109781989A - 血糖测试的方法及生物传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种血糖测试的方法，包括以下步骤：(1)在固体基态物质上固定能与转录因子特异性结合的核酸序列，加入样品，形成复合物；(2)在载体上固定转录因子的抗体和蔗糖转化酶等步骤，并用血糖仪来进行检测，血糖仪包括芯片底板、PH值检测传感器、过氧化氢检测传感器、氧检测传感器、氧信号输出触点、过氧化氢信号输出触点和PH值检测信号输出触点。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物检测领域。
背景技术
转录因子是一类DNA结合蛋白，能够与特异的DNA序列结合，在基因表达调控中发挥着重要作用，它们与肿瘤发生、基因修复、细胞分化与凋亡密切相关。传统的方法用于DNA结合蛋白的检测主要有：凝胶迁移滞留法(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)、酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、DNA足迹法(DNAfootprinting)以及蛋白印迹法(Western blotting)。但是，这些方法操作比较麻烦，费时耗力，不利于转录因子的快速检测。近年来，各类新型的传感器用于转录因子的检测不断出现，其检测原理是基于转录因子与特异的核酸序列结合，从而导致一系列的可检测信号的变化，主要有荧光法、比色法、电化学法、电化学发光法以及拉曼散射法等(A.J.Bonham,K.Hsieh,B.S.Ferguson,A.Vallee-Belisle,F.Ricci,H.T.Soh and K.W.Plaxco,J.Am.Chem.Soc.,2012,134,3346-3348)。虽然与传统的方法相比，这些新技术操作方便，检测灵敏度高，但是它们都需要用到实验室特定的仪器，需要专业的技术人员，而且仪器价格昂贵，难以推广到普通人群应用。试纸条生物传感器也有报道用于转录因子的检测，但是只能提供定性分析，难以满足实际定量的需求，因而限制了它的实际应用Z.Fang,C.Ge,W.Zhang,P.Lie and L.Zeng,Biosens.Bioelectron.,2011,27,192-196
血糖检测从有创到微创的发展过程，也是血浆糖测定到毛细血管全血糖测定的发展，目前大多使用葡萄糖生物传感器来检测血糖浓度，按工作原理可分为电化学型、压电型、热电型、光学型等，其中电化学型是血糖检测的主流。大多数上市的血糖仪都是电化学型的测电流葡萄糖传感器。1962年，Clark就提出了葡萄糖生物传感器的原理，他们预示用一薄层葡萄糖氧化酶(GOD)覆盖在氧电极表面，通过氧电极检测溶液中溶解氧的消耗量可以间接测定葡萄糖的含量。1968年Updike和Hikcs根据此原理成功地制成了第一支葡萄糖生物传感器。从此以后，基于酶电极的电流型生物传感器得到了迅速的发展。
葡萄糖氧化酶电极的结构根据生物电化学原理设计的便携式血糖仪是采用一次性使用的葡萄糖氧化酶印刷电极(即血糖试条)作为传感器，将被测血样滴在试条上，电极上的氧化酶促使血样中的葡萄糖与氧发生氧化还原反应，相关化学反应式为：葡萄糖+O2+H2O葡萄糖酸+H2O2该反应所产生的电子被导电介质转移给电极，电极在恒定的工作电压(0.5V)作用下便产生电流。经过一段时间后，酶电极的电流值的大小与血样中葡萄糖浓度呈一定的线性关系，通过检测电流变化与葡萄糖浓度的这个线性关系达到检测血糖浓度的目的。简单地说就是“施加一定电压于经酶反应后的血液产生的电流会随着血液中的血糖浓度的增加而增加"。通过精确测量出这些微弱电流，并根据电流值和血糖浓度的关系，反算出相应的浓度。
下面就从血糖仪的工作原理方面对其进行介绍。
血糖仪是葡萄糖生物传感器的其中一种应用。生物传感器是一种获取外界信息的装置和系统，是人类感官功能的弥补和延伸，它以生物活性物质作为敏感元件，在实现机理上更接近于生物体本身的感官系统，能够对所要检测的物质进行快速分析和追踪。生物传感器的工作原理如图1所示，从图中可知，生物传感器主要由两部分组成：产生信号的敏感组件和处理信号的辅助仪器。其中敏感组件是整个生物传感器的核心。敏感组件又包括两个部分：敏感元件和换能器。敏感元件是指对目标物进行选择性作用的生物活性单元，如具有选择特异性功能的酶、抗体、DNA、核酸、细胞受体和完整细胞等。换能器是指能捕捉敏感元件与目标物之间的作用过程，并将其表达为物理信号的组件，主要有电化学器件、光学器件、热敏器件、声波器件、压电器件等。根据换能器的不同，可以将血糖仪分为两大类：光电型和电极型。
电极型血糖仪的组成部分，包括血糖试纸和用作电化学读数计的血糖仪。血糖试纸即敏感元件，血糖仪集换能器与信号处理系统于一体。当血糖试纸插入血糖仪的插槽并加入血样后，以铁氰化钾/亚铁氰化钾为导电介质实施血糖的电化学测定时血糖试纸的电极上将发生反应。葡萄糖(Glucose)经葡萄糖氧化酶(GO/FAD)催化氧化成为葡萄糖内酯(d-Gluconolactone)，同时葡萄糖氧化酶转化为其还原态(GO/FADH2)。接着，葡萄糖内酯水解为葡萄糖酸(GluconicAcid)，还原态葡萄糖氧化酶将铁氰离子([Fe(CN)6]3-)还原为亚铁氰离子([Fe(CN)6]4-)。当血糖仪施加一定的电压后，亚铁氰离子([Fe(CN)6]4-)还原为铁氰离子([Fe(CN)6]3-),并产生电流，电流大小与葡萄糖浓度成正比，该线性关系由电流-葡萄糖浓度线性方程来描述：
电流＝K[葡萄糖浓度]+B
直线的斜率(K)和截距(B)是二者的相关系数。K和B已经经过校准并存储在血糖仪内,每次测定血糖时产生的电流值就会被转换为血糖浓度值，并直接在血糖仪上显示。
纳米科技的兴起已经为电化学生物传感器的研究开辟了一片新的天地，纳米材料具有比表面积大、催化活性高、吸附能力强、生物相容性好等诸多优点，在传感器构建中具有多方面的作用，如加快响应速度、提高测量精确度和灵敏度等。纳米材料电极检测葡萄糖可以提升传感器响应电流等性能
但现有技术并没有一种生产简便，检测效率较高的生物传感器电极。
发明内容
本发明提供了一种血糖测试的方法，包括以下步骤：(1)在固体基态物质上固定能与转录因子特异性结合的核酸序列，加入样品，形成复合物；(2)在载体上固定转录因子的抗体和蔗糖转化酶；(3)将步骤(1)所得的固体基态物质与步骤(2)所得的载体混合，去除未结合的载体；(4)加入过量蔗糖，反应一段时间后，用血糖仪来检测葡萄糖含量，再换算为样品中转录因子的含量，
其中，所述血糖仪包含生物传感器，该生物传感器包括：芯片底板、PH值检测传感器、过氧化氢检测传感器、氧检测传感器、氧信号输出触点、过氧化氢信号输出触点和PH值检测信号输出触点，其中，所述PH值检测传感器、过氧化氢检测传感器、氧检测传感器并排设置在所述芯片底板上，还包括：氧信号输出触点，与所述氧检测传感器电连接；过氧化氢信号输出触点，与所述过氧化氢检测传感器电连接；氧信号输出触点，与所述氧检测传感器电连接。
可选地，所述的固体基态物质是选自：酶标板、电极、磁珠。
本发明还提供了一种生物传感器，包括：芯片底板、PH值检测传感器、过氧化氢检测传感器、氧检测传感器、氧信号输出触点、过氧化氢信号输出触点和PH值检测信号输出触点，其中，所述PH值检测传感器、过氧化氢检测传感器、氧检测传感器并排设置在所述芯片底板上，还包括：氧信号输出触点，与所述氧检测传感器电连接；过氧化氢信号输出触点，与所述过氧化氢检测传感器电连接；氧信号输出触点，与所述氧检测传感器电连接，其中，所述PH值检测传感器、过氧化氢检测传感器、氧检测传感器分别包括一个电极和导线，且通过所述导线分别与氧信号输出触点、过氧化氢信号输出触点和PH值检测信号输出触点电连接。
可选地，所述PH值检测传感器、过氧化氢检测传感器和氧检测传感器之间覆盖有带保护渗透膜的具备生物活性的葡萄糖氧化酶，申请人发现，采用有活性的酶可以与血液里的糖进行代谢反应，因此，应用具备生物活性的葡萄糖氧化酶相较现有技术的酶检测效率大幅提高。
可选地，所述PH值检测信号输出触点为金属材质触点。
可选地，还包括一分析电路，获得所述PH值检测传感器输出的电信号。
可选地，所述PH值检测传感器、过氧化氢检测传感器、氧检测传感器与氧信号输出触点、过氧化氢信号输出触点、PH值检测信号输出触点的导线表面均覆盖绝缘保护膜，以防止电信号丢失或衰减。
可选地，所述芯片底板为陶瓷材质的基板，通过蚀刻法加工形成。本发明的生物传感器可准确获得受检样本内的葡萄糖的含量数值，提高精准度和检测效率。
发明人通过大量实验发现，本发明采用的血糖检测方法，配合常规的血糖检测仪，检测效果偏离实际结果较大，因此设计了一种针对此种血糖检测方法配置的生物传感器，克服了现有技术检测方法与检测仪配合不兼容等问题，以使检测效率和检测精度大大提高。具体地，传统方法配合常规血糖仪对转录因子Oct4的检测限是0.05ng/mL，而本发明的特定组合，可以达到0.02ng/mL，在本领域范畴内是极大的性能提升。
附图说明
图一为本发明实施例的结构示意图。
附图标记：
1、芯片底板
2、PH值检测传感器
3、过氧化氢检测传感器
4、氧检测传感器
5、氧信号输出触点
6、过氧化氢信号输出触点
7、PH值检测信号输出触点
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明相关的部分而非全部内容。
实施例1：利用本发明所述方法检测转录因子Oct4
在链霉亲和素(streptavidin，SA)修饰的磁珠(magnetic beads，MBs)上固定生物素(biotin)修饰的双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)(通过SA-biotin的相互作用)，通过磁珠分离或用水冲洗去除多余的DNA，得到SA-MBs-biotin dsDNA复合物。
然后向SA-MBs-biotin dsDNA中加入转录因子Oct4，它会结合到双链DNA上，形成SA-MBs-biotin dsDNA-Oct4复合物，通过磁珠分离或用水冲洗去除多余的Oct4后，再加入抗Oct4的抗体(anti-Oct4antibody，Ab)和转化酶(invertase)修饰的金纳米颗粒(goldnanoparticles，AuNPs)，那么Ab/invertase-AuNPs复合物通过抗体-Oct4相互作用固定在磁珠或者酶标板、电极上，形成复合物SA-MBs-biotin dsDNA-Oct4-Ab/invertase-AuNPs。通过磁珠分离或用水冲洗去除多余的Ab/invertase-AuNPs后，再加入过量的蔗糖，反应一段时间后，转化酶会把蔗糖转化成葡萄糖，直接用血糖仪检测生成的葡萄糖。由于转录因子的含量与固定在磁珠上的转化酶的含量呈正比，转化酶能把蔗糖转化成葡萄糖，转化酶的含量因而又与葡萄糖的含量呈正比，所以可以之间通过检测葡萄糖的含量来检测转录因子的含量。以下详述利用血糖仪检测转录因子Oct4的具体步骤。
(1)在100μL2mg/ml的链霉亲和素修饰的磁珠(SA-MBs)中加入biotin修饰的dsDNA(biotin-dsDNA，该双链DNA序列中含有转录因子Oct4的结合位点)，使dsDNA的终浓度是1μM。通过磁珠分离，去除上清，沉淀重悬于100μL PBS缓冲液中(10mM，pH7.4，含有0.01％的吐温-20)。
(2)向步骤(1)所得的溶液中加入一定浓度的转录因子Oct4，混匀，室温反应30分钟，通过磁珠分离，去除上清，沉淀重悬于100μL PBS缓冲液中(10mM，pH7.4，含有0.01％的Twwen-20)。
(3)取1mL金纳米颗粒(直径约为15nm)，用0.1M的K2CO3调节pH值到8.5，然后同时加入9μL的抗Oct4的抗体(10mg/mL)和9μL的蔗糖转化酶(40mg/mL)，室温震荡反应30分钟，12000转离心30分钟，去除上清，沉淀用100μL PBS缓冲液(10mM，pH7.4，含有5％的BSA，0.05％的NaN3)重悬。
(4)取10μL(3)中所制备的重悬液加入到(2)中制备的重悬液中，充分混匀，室温震荡反应30分钟，通过磁珠分离，去除上清，沉淀重悬于100μL PBS缓冲液中(10mM，pH7.4，含有100mM的NaCl)。
(5)在(4)中的重悬液中加入过量的蔗糖，37℃反应40分钟，通过磁珠分离，获得上清，取其中的5μL上清，直接滴加到血糖仪上进行检测，25秒后读取数据，结合图1，血糖仪包括芯片底板1，PH值检测传感器2、过氧化氢检测传感器3、氧检测传感器4、氧信号输出触点5、过氧化氢信号输出触点6、PH值检测信号输出触点7，其中，芯片底板1为陶瓷材质的基板，在其上使用蚀刻法加工出芯片底板1。然后在PH值检测传感器2、过氧化氢检测传感器3、氧检测传感器4处焊接有不同功能的化学传感器组件，PH值检测传感器2电极处为PH值检测传感器，过氧化氢检测传感器3电极上为过氧化氢检测传感器，氧检测传感器4电极上为氧含量检测传感器，PH值检测传感器2、过氧化氢检测传感器3、氧检测传感器4传感器之间覆盖有带保护渗透膜的具备生物活性的葡萄糖氧化酶。氧信号输出触点5、过氧化氢信号输出触点、PH值检测信号输出触点7为金属材质触点，通过与其接触的金属部件，将所获得的电信号传递至仪器的分析电路中。PH值检测传感器2、过氧化氢检测传感器3、氧检测传感器4与氧信号输出触点5、过氧化氢信号输出触点、PH值检测信号输出触点7中间的连线表面均覆盖绝缘保护膜，以防止电信号丢失或衰减。
工作时，将受检的血样或经稀释后的样本液滴在PH值检测传感器2、过氧化氢检测传感器3、氧检测传感器4三个化学传感器之间范围，受检样本内所含的葡萄糖(C6H12O6)大分子透过渗透膜，与内部的葡萄糖氧化酶(GOD)发生反应，其被葡萄糖氧化酶(GOD)氧化后生成葡萄糖酸(C6H12O7)和过氧化氢(H2O2)两种成份，氧检测传感器4检测样本内氧(O2)的消耗值，PH值检测传感器2检测样本液内的酸度变化值，过氧化氢检测传感器3检测过氧化氢(H2O2)的产生量，并通过检测电信号将相应的测量值传递至仪器内部的分析电路中，经过计算后，即可获得受检样本内的葡萄糖的含量数值。
效果实施例1：利用实施例1所述方法对不同物质的检测
配制50ng/mL不同物质的标准溶液，它们分别是凝血酶、溶菌酶、BSA和IgG。
将50ng/mL不同物质标准溶液和0.5ng/mLOct4标准溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应，最后取5μL上清用血糖仪来检测，25后秒记录血糖仪读数。
结果：50ng/mL的凝血酶、溶菌酶、BSA和IgG对检测没有影响，只有当加入转录因子Oct4后才会在血糖仪上出现读数，且检测极限达到0.02ng/mL。
以上仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种血糖测试的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在固体基态物质上固定能与转录因子特异性结合的核酸序列，加入样品，形成复合物；(2)在载体上固定转录因子的抗体和蔗糖转化酶；(3)将步骤(1)所得的固体基态物质与步骤(2)所得的载体混合，去除未结合的载体；(4)加入过量蔗糖，反应一段时间后，用血糖仪来检测葡萄糖含量，再换算为样品中转录因子的含量，
其中，所述血糖仪包含生物传感器，该生物传感器包括：芯片底板、PH值检测传感器、过氧化氢检测传感器、氧检测传感器、氧信号输出触点、过氧化氢信号输出触点和PH值检测信号输出触点，其中，所述PH值检测传感器、过氧化氢检测传感器、氧检测传感器并排设置在所述芯片底板上，还包括：氧信号输出触点，与所述氧检测传感器电连接；过氧化氢信号输出触点，与所述过氧化氢检测传感器电连接；氧信号输出触点，与所述氧检测传感器电连接。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固体基态物质是选自：酶标板、电极、磁珠。
3.一种生物传感器，其特征在于，包括：芯片底板、PH值检测传感器、过氧化氢检测传感器、氧检测传感器、氧信号输出触点、过氧化氢信号输出触点和PH值检测信号输出触点，其中，所述PH值检测传感器、过氧化氢检测传感器、氧检测传感器并排设置在所述芯片底板上，还包括：
氧信号输出触点，与所述氧检测传感器电连接；
过氧化氢信号输出触点，与所述过氧化氢检测传感器电连接；
氧信号输出触点，与所述氧检测传感器电连接，
其中，所述PH值检测传感器、过氧化氢检测传感器、氧检测传感器分别包括一个电极和导线，且通过所述导线分别与氧信号输出触点、过氧化氢信号输出触点和PH值检测信号输出触点电连接。
4.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述PH值检测传感器、过氧化氢检测传感器和氧检测传感器之间覆盖有带保护渗透膜的具备生物活性的葡萄糖氧化酶。
5.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述PH值检测信号输出触点为金属材质触点。
6.如权利要求5所述的生物传感器，其特征在于，还包括一分析电路，获得所述PH值检测传感器输出的电信号。
7.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述PH值检测传感器、过氧化氢检测传感器、氧检测传感器与氧信号输出触点、过氧化氢信号输出触点、PH值检测信号输出触点的导线表面均覆盖绝缘保护膜，以防止电信号丢失或衰减。
8.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述芯片底板为陶瓷材质的基板，通过蚀刻法加工形成。
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