CN104833713A - 一种简易的酶生物传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种简易的酶生物传感器的制备方法，使用混合法将一定配比的普鲁士蓝油墨与碳油墨混合，然后通过丝网印刷技术制备出基底电极，用戊二醛作为交联剂固定被检测物质对应的生物氧化酶，以实现酶传感器的制备。由于该方法操作简单，成本较低，可批量制备，且装载的酶不易泄露，保证生物酶的高活性。该酶生物传感器有较高灵敏度、稳定性的电信号响应，且能批量化生产，易于产业化实现。所制备的酶生物传感器适用于食品分析、临床医学以及生物工程中过氧化氢或葡萄糖的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种简易的酶生物传感器的制备方法，适用于食品分析、临床医学以及生物工程中过氧化氢或葡萄糖的检测。
背景技术
随着科学技术的发展，人们越来越注重自身健康，越发关注对于生理物质的检测。因此，电化学生物传感器的应用得到了空前发展。在电化学生物传感器中，酶传感器又是最具代表性的，具有选择性好、响应速度快和灵敏度高的优点。酶生物传感器是将酶作为生物敏感基元，通过各种物理、化学信号转换器捕捉目标物与敏感基元之间的反应所产生的与目标物浓度成比例关系的可测信号，实现对目标物定量测定的分析仪器。酶生物传感器的应用领域广泛，在环境监测、食品分析、临床医学以及生物工程方面都有较为重要的应用。
血液中的葡萄糖浓度被称为血糖指标。由于体内各组织细胞活动所需的能量大部分来自葡萄糖，所以血糖必须保证一定的水平才能维持体内各器官和组织的需要。因此，对葡萄糖含量的检测显得尤为重要。目前的方法主要是检测过氧化氢，通过其电流变化来间接反应葡萄糖的含量。由于普鲁士蓝这一电子媒介体检测电势低，能够避免例如抗坏血酸和尿酸等干扰物质的影响，又具有令人满意的灵敏度，以及低的检测极限和宽的线性范围，已被成功运用在酶传感器的制备中。
现今，制备酶生物传感器主要有电沉积以及自组装两种主流的方法，但是他们都有各自的缺点。例如电沉积法不适合进行大规模生产；自组装法则需要在基底表面预涂一层聚电解质且制备周期长。
发明内容
本发明的目的是为了改进现有技术的不足而提供一种制作简单，成本低廉且具有较高性能的简易的酶生物传感器的制备方法，适用于食品分析、临床医学以及生物工程中过氧化氢或葡萄糖的检测。
本发明的技术解决方案是:一种简易的酶生物传感器的制备方法，其具体制备步骤如下：
1)制备普鲁士蓝浆料：分别配置一定浓度的K4Fe(CN)6、K3Fe(CN)6、FeCl3和(NH4)2Fe(SO4)2水溶液；将K4Fe(CN)6或K3Fe(CN)6水溶液中的一种，与FeCl3或(NH4)2Fe(SO4)2水溶液中的一种等摩尔混合，将所得到的混合溶液再放入离心机中进行离心，过滤，得到泥状的普鲁士蓝；
2)将合成的普鲁士蓝与碳油墨按质量比为1:(1～99)混合均匀，制备出碳油墨-普鲁士蓝混合油墨；
3)通过丝网印刷技术在支撑体上制备出基底电极：将碳油墨通过丝网印到支撑体上形成对电极和连接体，将氯化银浆通过丝网印到支撑体上形成参比电极，将步骤2)中制得的混合油墨通过丝网印到支撑体上形成工作电极；
4)配制葡萄糖氧化酶溶液，在溶液中加入戊二醛,混合均匀得酶溶液；取出酶溶液均匀涂于步骤3)制得的工作电极上，置于冰箱内，在低温下干燥后即得简易的酶生物传感器。
优选步骤1)中所述的K4Fe(CN)6、K3Fe(CN)6、FeCl3和(NH4)2Fe(SO4)2水溶液的浓度范围均为1～100mM·L-1。
优选步骤1)的离心速率为3000r/min～10000r/min；离心时间为3min～30min。
优选步骤3)的支撑体是PVC、PET、氧化铝、陶瓷、金、银或铂等。
优选步骤4)中葡萄糖氧化酶溶液的浓度为500～5000U/ml；其中戊二醛的加入量为控制戊二醛在酶溶液中的质量百分浓度为1％～10％。
优选步骤4)中涂覆于工作电极上的酶溶液的量占工作电极体积的比为20μl/cm-2～200μl/cm-2。
优选步骤4)中所述的低温干燥的温度为10℃以下，更优选0℃～10℃。
有益效果：
本发明是基于丝网印刷法的酶生物传感器的制备工艺。将合成的普鲁士蓝与碳油墨以一定质量比进行混合，制备出碳油墨-普鲁士蓝混合油墨来进行印刷，可以通过控制质量比来控制普鲁士蓝的量，这样既能加快电子传输速率，又能使得传输阻力不至于过大。本发明采用丝网印刷法，制作方法简单，成本较为低廉，所制备出的酶生物传感器具有良好的性能，且拥有很好的重现性、适应性以及稳定性，能够大批次制造，可以较好的适用于传感试纸、芯片的产品化制造，有利于产业化。
附图说明
图1是本发明的酶生物传感器的结构示意图；其中所示为：1-支撑基底；2-对电极；3-工作电极；4-参比电极；5-连接体。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的技术方案进行详细的说明。
一种简易的酶生物传感器的制备方法，首先分别配置一定浓度的K4Fe(CN)6、K3Fe(CN)6、FeCl3和(NH4)2Fe(SO4)2，通过化学法等摩尔浓度合成普鲁士蓝；将合成的普鲁士蓝与碳油墨以一定质量比进行混合，并使其混合均匀，制备出碳油墨-普鲁士蓝混合油墨；通过丝网印刷技术在支撑体上制备出基底电极，如图1，其中对电极2和连接体5使用碳油墨，工作电极3使用碳-普鲁士蓝混合油墨，参比电极4使用氯化银浆。配制葡萄糖氧化酶溶液，并在其溶液中加入一定量的戊二醛，混合均匀。取出一定量的酶溶液均匀涂于工作电极3上，置于冰箱内低温干燥。
实施例1
一种酶生物传感器的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)配置1mM·L-1的K4Fe(CN)6和FeCl3，通过化学法等摩尔浓度合成普鲁士蓝，离心速率为3000r/min,离心时间为30min；
(2)将合成的普鲁士蓝与碳油墨按质量比1:1进行混合，并使其混合均匀，制备出碳油墨/普鲁士蓝混合油墨；
(3)通过丝网印刷技术在支撑体PVC上制备出酶生物传感器；
(4)配制浓度为500U/ml的葡萄糖氧化酶溶液，并在溶液中加入戊二醛，使得戊二醛在葡萄糖氧化酶溶液中所占质量百分浓度为1％；
(5)移取酶溶液均匀涂于工作电极3上，使之每平方厘米工作电极3上有20μl的酶溶液，置于冰箱内在0℃下干燥。
通过计时安培电流测试可知：此例所得的传感器对H2O2和葡萄糖的检测灵敏度较高为550μA·mM-1·cm-2，检测极限低为0.5μM。实验后，将修饰电极于4℃下置于pH为7.0的PBS缓冲溶液中一周，其响应信号基本不变；一个月后，其响应信号为初始信号的98％；三个月后，其响应信号仍为初始信号的92％，这表明该制备方法可较好地应用于酶生物传感器。
实施例2
一种酶生物传感器的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)配置100mM·L-1的K4Fe(CN)6和FeCl3，通过化学法等摩尔浓度合成普鲁士蓝,离心速率为10000r/min,离心时间为3min；
(2)将合成的普鲁士蓝与碳油墨按质量比1:99进行混合，并使其混合均匀，制备出碳油墨/普鲁士蓝混合油墨；
(3)通过丝网印刷技术在支撑体PET上制备出酶生物传感器；
(4)配制浓度为5000U/ml的葡萄糖氧化酶溶液，并在溶液中加入戊二醛，使得戊二醛在葡萄糖氧化酶溶液中所占质量百分浓度为6％；
(5)移取酶溶液均匀涂于工作电极3上，使之每平方厘米工作电极3上有200μl的酶溶液，置于冰箱内在10℃下干燥。
通过计时安培电流测试可知：此例所得的传感器对H2O2和葡萄糖的检测灵敏度较高为563μA·mM-1·cm-2，检测极限低为0.5μM。实验后，将修饰电极于4℃下置于pH为7.0的PBS缓冲溶液中一周，其响应信号基本不变；一个月后，其响应信号为初始信号的96％；三个月后，其响应信号仍为初始信号的94％，这表明该制备方法可较好地应用于酶生物传感器。
实施例3
一种酶生物传感器的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)配置80mM·L-1的K3Fe(CN)6和(NH4)2Fe(SO4)2，通过化学法等摩尔浓度合成普鲁士蓝,离心速率为8000r/min,离心时间为15min；
(2)将合成的普鲁士蓝与碳油墨按质量比2:3进行混合，并使其混合均匀，制备出碳油墨/普鲁士蓝混合油墨；
(3)通过丝网印刷技术在支撑体氧化铝上制备出酶生物传感器；
(4)配制浓度为2500U/ml的葡萄糖氧化酶溶液，并在溶液中加入戊二醛，使得戊二醛在葡萄糖氧化酶溶液中所占质量百分浓度为10％；
(5)移取酶溶液均匀涂于工作电极3上，使之每平方厘米工作电极3上有120μl的酶溶液，置于冰箱内在5℃下干燥。
通过计时安培电流测试可知：此例所得的传感器对H2O2和葡萄糖的检测灵敏度较高为580μA·mM-1·cm-2，检测极限低为0.5μM。实验后，将修饰电极于4℃下置于pH为7.0的PBS缓冲溶液中一周，其响应信号基本不变；一个月后，其响应信号为初始信号的98％；三个月后，其响应信号仍为初始信号的95％，这表明该制备方法可较好地应用于酶生物传感器。
Claims (7)
1.一种简易的酶生物传感器的制备方法，其具体制备步骤如下：
1)制备普鲁士蓝浆料：分别配置K4Fe(CN)6、K3Fe(CN)6、FeCl3和(NH4)2Fe(SO4)2水溶液；将K4Fe(CN)6或K3Fe(CN)6水溶液中的一种，与FeCl3或(NH4)2Fe(SO4)2水溶液中的一种等摩尔混合，将所得到的混合溶液再放入离心机中进行离心，过滤，得到泥状的普鲁士蓝；
2)将合成的普鲁士蓝与碳油墨按质量比为1:(1～99)混合均匀，制备出碳油墨-普鲁士蓝混合油墨；
3)通过丝网印刷技术在支撑体上制备出基底电极：将碳油墨通过丝网印到支撑体上形成对电极和连接体，将氯化银浆通过丝网印到支撑体上形成参比电极，将步骤2)中制得的混合油墨通过丝网印到支撑体上形成工作电极；
4)配制葡萄糖氧化酶溶液，在溶液中加入戊二醛,混合均匀得酶溶液；取出酶溶液均匀涂于步骤3)制得的工作电极上，置于冰箱内，在低温下干燥后即得简易的酶生物传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1)中所述的K4Fe(CN)6、K3Fe(CN)6、FeCl3和(NH4)2Fe(SO4)2水溶液的浓度范围均为1～100mM·L-1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1)的离心速率为3000r/min～10000r/min；离心时间为3min～30min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3)的支撑体是PVC、PET、氧化铝、陶瓷、金、银或铂。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤4)中葡萄糖氧化酶溶液的浓度为500～5000U/ml；其中戊二醛的加入量为控制戊二醛在酶溶液中的质量百分浓度为1％～10％。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤4)中涂覆于工作电极上的酶溶液的量占工作电极体积的比为20μl/cm-2～200μl/cm-2。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤4)中所述的低温干燥的温度为在10℃以下。
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