CN112014447A - 一种简易的蔗糖生物传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及了一种简易的蔗糖生物传感器的制备方法，使用混合法将铁氰化锰Mn3[Fe(CN)6]2纳米油墨与碳油墨按照一定质量配比混合成纳米印刷油墨，然后通过丝网印刷技术制备出微型传感芯片，通过在芯片表面固定一定比例的蔗糖水解酶、葡萄糖变旋酶和葡萄糖氧化酶，以实现蔗糖生物传感器的制备。该生物传感器的制备方法操作简便且可批量生产，所制备的蔗糖生物传感器具有较高的检测灵敏度及宽的检测范围，可用于食品检测、医药分析以及生物发酵过程中葡萄糖和蔗糖组分的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种简易的蔗糖生物传感器的制备方法，该生物传感器适用于食品、医药分析及其生物工程中葡萄糖以及蔗糖的快速检测，其灵敏度高、稳定性强、集成度高，可作为便携式蔗糖检测仪的核心部件，用于现场原位的蔗糖浓度定量测试。
背景技术
蔗糖是食糖的主要成分，其为双糖的一种，由一分子葡萄糖的半缩醛羟基与一分子果糖的半缩醛羟基彼此缩合脱水而成。蔗糖几乎普遍存在于植物界的叶、花、茎、种子及果实中。在甘蔗、甜菜及槭树汁中含量尤为丰富。蔗糖被人食用后，在胃肠中由转化酶转化成葡萄糖和果糖，一部分葡萄糖随着血液循环运往全身各处，在细胞中氧化分解，最后生成二氧化碳和水并产生能量，为脑组织功能、人体的肌肉活动等提供能量并维持体温。但是大量使用蔗糖会引起身体的血糖浓度升高，从而导致疾病，因此其浓度的检测至关重要。
目前，蔗糖的检测方法只有通过将蔗糖进行水解得到葡萄糖和果糖，在通过检测葡萄糖的方法拟合得到蔗糖的浓度，传统方法步骤过于繁琐且检测精度不高，同时，需要添加大量的化学药剂实现检测，造成环境污染。因此，制备一种有效的检测设备和方法能够精确地检测出蔗糖的浓度，对于人类健康、糖果制造业、发酵行业以及医药行业具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简易的蔗糖生物传感器的制备方法，包括铁氰化锰的合成、基底电极的印刷以及酶的配制和固定。
本发明的技术方案为：一种简易的蔗糖生物传感器的制备方法，其具体制备步骤如下：
1)制备铁氰化锰纳米油墨：配制锰盐和铁氰根溶液,将锰盐溶液与铁氰根溶液按照摩尔比例进行混合，将所得到的混合溶液在离心机中进行离心，清洗，得到铁氰化锰纳米油墨；
2)将合成的铁氰化锰纳米油墨与碳油墨按照一定质量配比混合，制备出碳-铁氰化锰混合油墨；
3)通过丝网印刷技术在底板材料上印刷出基底电极，其中区域1工作电极区域，印刷使用的油墨为步骤2)制备的碳-铁氰化锰混合油墨；区域2参比电极区域，印刷使用的油墨为氯化银油墨；区域3对电极区域，印刷使用的油墨为碳油墨；区域4为连接触点，印刷使用的油墨为碳油墨；区域5为印刷基底材料；
4)配制蔗糖水解酶、葡萄糖变旋酶和葡萄糖氧化酶的混合溶液，向溶液中加入交联剂，混合均匀得到酶溶液；取酶溶液滴加到步骤3)中制备的基底电极的工作电极区域，静置待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥即得到简易的蔗糖生物传感器。
优选步骤1)中所述的锰盐溶液为MnSO4、MnCl2或Mn(NO3)2水溶液，铁氰根溶液为Na3Fe(CN)6或K3Fe(CN)6水溶液；锰盐溶和铁氰根溶液的浓度范围均为1-100mM。
优选步骤1)中锰盐溶液与铁氰根溶液混合的摩尔比例为1:(0.3-2)。
优选步骤1)中离心机的转速为1000-12000r/min，离心时间为1-30min。
优选步骤2)中铁氰化锰纳米油墨与碳油墨按照质量比为1:(1-99)均匀混合。
优选步骤3)中区域5的印刷基底材料为PVC、PET、陶瓷或金属。
优选步骤4)中混合得到的酶溶液中蔗糖水解酶的浓度为0.1-10u/μl，葡萄糖变旋酶的浓度为0.1-10u/μl，葡萄糖氧化酶的浓度为0.1-18u/μl。
优选步骤4)中酶混合溶液中的交联剂含量为0.05-0.4％(v/v)。
优选步骤4)中酶混合溶液中的交联剂为戊二醛、丹宁酸、壳聚糖或聚赖氨酸中的一种。
优选步骤4)中所取酶溶液的量为10-150μl/cm2,总量根据工作电极区域面积来调节。
有益效果：
本发明是基于丝网印刷法的蔗糖生物传感器的制备方法。将合成的铁氰化锰纳米油墨与碳油墨以一定质量比进行混合，制备出碳-铁氰化锰混合油墨来进行印刷，可以通过控制质量比来控制铁氰化锰的量，这样能加快电子传输速率，同时也可调节芯片上负载的酶量来控制检测灵敏度以及检测线性范围。本发明采用丝网印刷技术，制备方法操作简便且可批量生产，成本较为低廉，所制备出的蔗糖生物传感器具有良好的性能，且拥有很好的重现性、适应性以及稳定性，而且能够有效地避免蔗糖传统检测方法步骤过于繁琐以及传统检测方法造成环境污染的问题，对于人类健康、糖果制造业、发酵行业以及医药行业具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1通过化学合成法合成的铁氰化锰的扫描电镜图。
图2为本发明通过丝网印刷技术印刷出特异结构的基底电极的结构示意图；其中：1-工作电极；2-参比电极；3-对电极；4-连接触点；5-印刷基底材料。
具体实施方式
实施例1
一种简易的蔗糖生物传感器的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)配置2mM的MnSO4溶液和1mM的K3Fe(CN)6溶液，通过混合法等体积混合，将混合溶液用离心机进行离心，离心速率为1000r/min,离心时间为30min，得到铁氰化锰纳米油墨，纳米油墨的微观形貌如附图图1所示；
(2)将合成的铁氰化锰纳米油墨与碳油墨按质量比1:1进行混合，并使其混合均匀，制备出碳-铁氰化锰混合油墨；
(3)通过丝网印刷技术制备出蔗糖生物传感器，如附图图2所示区域1为工作电极区域，印刷使用的油墨为碳-铁氰化锰混合油墨；区域2为参比电极区域，印刷使用的油墨料为氯化银油墨；区域3为对电极区域，印刷使用的油墨为碳油墨；区域4为连接触点，印刷使用的油墨为碳油墨；区域5为PVC基底材料；
(4)取蔗糖水解酶500U、葡萄糖变旋酶500U和葡萄糖氧化酶1500U溶于100μl缓冲溶液中，配制蔗糖水解酶、葡萄糖变旋酶和葡萄糖氧化酶的混合酶溶液，向酶溶液加入25％(v/v)的戊二醛交联剂1μl，混匀；
(5)取5μl酶溶液滴加到面积为0.1cm2的工作电极区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥。
通过计时安培电流测试可知：此例所得的传感器对蔗糖的检测灵敏度较高为50μA·mM-1·cm-2，检测极限低为0.5μM。实验后，将丝网印刷电极于4℃下置于pH为7.0的PBS缓冲溶液中一周，其响应信号基本不变；一个月后，其响应信号为初始信号的98％；三个月后，其响应信号仍为初始信号的92％，表明该制备方法可较好地制备蔗糖生物传感器。
实施例2
一种简易的蔗糖生物传感器的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)配置50mM的MnCl2溶液和100mM的Na3Fe(CN)6溶液，通过混合法等体积混合，将混合溶液用离心机进行离心，离心速率为3000r/min,离心时间为20min，得到铁氰化锰纳米油墨，纳米油墨的微观形貌如附图图1所示；
(2)将合成的铁氰化锰纳米油墨与碳油墨按质量比1:22进行混合，并使其混合均匀，制备出碳-铁氰化锰混合油墨；
(3)通过丝网印刷技术制备出蔗糖生物传感器，如附图图2所示区域1为工作电极区域，印刷使用的油墨为碳-铁氰化锰混合油墨；区域2为参比电极区域，印刷使用的油墨料为氯化银油墨；区域3为对电极区域，印刷使用的油墨为碳油墨；区域4为连接触点，印刷使用的油墨为碳油墨；区域5为碳化硅陶瓷基底材料；
(4)取蔗糖水解酶100U、葡萄糖变旋酶100U和葡萄糖氧化酶540U溶于100μl缓冲溶液中，配制蔗糖水解酶、葡萄糖变旋酶和葡萄糖氧化酶的混合酶溶液，向酶溶液加入5％(v/v)的戊二醛交联剂2μl，混匀；
(5)取5μl酶溶液滴加到面积为0.1cm2的工作电极区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥。
通过计时安培电流测试可知：此例所得的传感器对蔗糖的检测灵敏度较高为45μA·mM-1·cm-2，检测极限低为0.5μM。实验后，将丝网印刷电极于4℃下置于pH为7.0的PBS缓冲溶液中一周，其响应信号基本不变；一个月后，其响应信号为初始信号的99％；三个月后，其响应信号仍为初始信号的94％，表明该制备方法可较好地制备蔗糖生物传感器。
实施例3
一种简易的蔗糖生物传感器的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)配置100mM的MnSO4溶液和100mM的K3Fe(CN)6溶液，通过混合法等体积混合，将混合溶液用离心机进行离心，离心速率为5000r/min,离心时间为15min，得到铁氰化锰纳米油墨，纳米油墨的微观形貌如附图图1所示；
(2)将合成的铁氰化锰纳米油墨与碳油墨按质量比1:50进行混合，并使其混合均匀，制备出碳-铁氰化锰混合油墨；
(3)通过丝网印刷技术制备出蔗糖生物传感器，如附图图2所示区域1为工作电极区域，印刷使用的油墨为碳-铁氰化锰混合油墨；区域2为参比电极区域，印刷使用的油墨料为氯化银油墨；区域3为对电极区域，印刷使用的油墨为碳油墨；区域4为连接触点，印刷使用的油墨为碳油墨；区域5为铜基底材料；
(4)取蔗糖水解酶75U、葡萄糖变旋酶75U和葡萄糖氧化酶360U溶于100μl缓冲溶液中，配制蔗糖水解酶、葡萄糖变旋酶和葡萄糖氧化酶的混合酶溶液，向酶溶液加入15％(v/v)的丹宁酸交联剂2.5μl，混匀；
(5)取5μl酶溶液滴加到面积为0.1cm2的工作电极区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥。
通过计时安培电流测试可知：此例所得的传感器对蔗糖的检测灵敏度较高为55μA·mM-1·cm-2，检测极限低为0.5μM。实验后，将丝网印刷电极于4℃下置于pH为7.0的PBS缓冲溶液中一周，其响应信号基本不变；一个月后，其响应信号为初始信号的99％；三个月后，其响应信号仍为初始信号的96％，表明该制备方法可较好地制备蔗糖生物传感器。
实施例4
一种简易的蔗糖生物传感器的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)配置90mM的MnSO4溶液和30mM的Na3Fe(CN)6溶液，通过混合法等体积混合，将混合溶液用离心机进行离心，离心速率为8000r/min,离心时间为10min，得到铁氰化锰纳米油墨，纳米油墨的微观形貌如附图图1所示；
(2)将合成的铁氰化锰纳米油墨与碳油墨按质量比1:80进行混合，并使其混合均匀，制备出碳-铁氰化锰混合油墨；
(3)通过丝网印刷技术制备出蔗糖生物传感器，如附图图2所示区域1为工作电极区域，印刷使用的油墨为碳-铁氰化锰混合油墨；区域2为参比电极区域，印刷使用的油墨料为氯化银油墨；区域3为对电极区域，印刷使用的油墨为碳油墨；区域4为连接触点，印刷使用的油墨为碳油墨；区域5为氧化铝基底材料；
(4)取蔗糖水解酶25U、葡萄糖变旋酶25U和葡萄糖氧化酶90U溶于100μl缓冲溶液中，配制蔗糖水解酶、葡萄糖变旋酶和葡萄糖氧化酶的混合酶溶液，向酶溶液加入15％(v/v)的聚赖氨酸交联剂0.5μl，混匀；
(5)取15μl酶溶液滴加到面积为0.1cm2的工作电极区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥。
通过计时安培电流测试可知：此例所得的传感器对蔗糖的检测灵敏度较高为35μA·mM-1·cm-2，检测极限低为0.5μM。实验后，将丝网印刷电极于4℃下置于pH为7.0的PBS缓冲溶液中一周，其响应信号基本不变；一个月后，其响应信号为初始信号的94％；三个月后，其响应信号仍为初始信号的91％，表明该制备方法可较好地制备蔗糖生物传感器。
实施例5
一种简易的蔗糖生物传感器的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)配置100mM的Mn(NO3)2溶液和60mM的K3Fe(CN)6溶液，通过混合法等体积混合，将混合溶液用离心机进行离心，离心速率为12000r/min,离心时间为5min，得到铁氰化锰纳米油墨，纳米油墨的微观形貌如附图图1所示；
(2)将合成的铁氰化锰纳米油墨与碳油墨按质量比1:99进行混合，并使其混合均匀，制备出碳-铁氰化锰混合油墨；
(3)通过丝网印刷技术制备出蔗糖生物传感器，如附图图2所示区域1为工作电极区域，印刷使用的油墨为碳-铁氰化锰混合油墨；区域2为参比电极区域，印刷使用的油墨料为氯化银油墨；区域3为对电极区域，印刷使用的油墨为碳油墨；区域4为连接触点，印刷使用的油墨为碳油墨；区域5为PET基底材料；
(4)取蔗糖水解酶900U、葡萄糖变旋酶1000U和葡萄糖氧化酶1600U溶于100μl缓冲溶液中，配制蔗糖水解酶、葡萄糖变旋酶和葡萄糖氧化酶的混合酶溶液，向酶溶液加入25％(v/v)的壳聚糖交联剂1μl，混匀；
(5)取1μl酶溶液滴加到面积为0.1cm2的工作电极区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥。
通过计时安培电流测试可知：此例所得的传感器对蔗糖的检测灵敏度较高为75μA·mM-1·cm-2，检测极限低为0.5μM。实验后，将丝网印刷电极于4℃下置于pH为7.0的PBS缓冲溶液中一周，其响应信号基本不变；一个月后，其响应信号为初始信号的98％；三个月后，其响应信号仍为初始信号的94％，表明该制备方法可较好地制备蔗糖生物传感器。
Claims (10)
1.一种简易的蔗糖生物传感器的制备方法，其具体制备步骤如下：
1)制备铁氰化锰纳米油墨：配制锰盐和铁氰根溶液,将锰盐溶液与铁氰根溶液按照摩尔比例进行混合，将所得到的混合溶液在离心机中进行离心，清洗，得到铁氰化锰纳米油墨；
2)将合成的铁氰化锰纳米油墨与碳油墨按照一定质量配比混合，制备出碳-铁氰化锰混合油墨；
3)通过丝网印刷技术在底板材料上印刷出基底电极，其中区域1工作电极区域，印刷使用的油墨为步骤2)制备的碳-铁氰化锰混合油墨；区域2参比电极区域，印刷使用的油墨为氯化银油墨；区域3对电极区域，印刷使用的油墨为碳油墨；区域4为连接触点，印刷使用的油墨为碳油墨；区域5为印刷基底材料；
4)配制蔗糖水解酶、葡萄糖变旋酶和葡萄糖氧化酶的混合溶液，向溶液中加入交联剂，混合均匀得到酶溶液；取酶溶液滴加到步骤3)中制备的基底电极的工作电极区域，静置待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥即得到简易的蔗糖生物传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1)中所述的锰盐溶液为MnSO4、MnCl2或Mn(NO3)2水溶液，铁氰根溶液为Na3Fe(CN)6或K3Fe(CN)6水溶液；锰盐溶和铁氰根溶液的浓度范围均为1-100mM。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1)中锰盐溶液与铁氰根溶液混合的摩尔比例为1:(0.3-2)。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1)中离心机的转速为1000-12000r/min，离心时间为1-30min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤2)中铁氰化锰纳米油墨与碳油墨按照质量比为1:(1-99)均匀混合。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3)中区域5的印刷基底材料为PVC、PET、陶瓷或金属。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤4)中混合得到的酶溶液中蔗糖水解酶的浓度为0.1-10u/μl，葡萄糖变旋酶的浓度为0.1-10u/μl，葡萄糖氧化酶的浓度为0.1-18u/μl。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤4)中酶混合溶液中的交联剂含量为0.05-0.4％(v/v)。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤4)中酶混合溶液中的交联剂为戊二醛、丹宁酸、壳聚糖或聚赖氨酸中的一种。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤4)中所取酶溶液的量为10-150μl/cm2,总量根据工作电极区域面积来调节。
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2020
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