CN103842518B - 用于电化学生物传感器的氧化还原试剂组合物及包含所述组合物的生物传感器 - Google Patents

用于电化学生物传感器的氧化还原试剂组合物及包含所述组合物的生物传感器 Download PDF

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Abstract

提供了氧化还原试剂组合物以及含有所述组合物的生物传感器，所述组合物含有含金属配合物和硫堇或其衍生物作为电子传递介质，所述组合物用于电化学生物传感器。随着含有含金属配合物和硫堇或其衍生物的氧化还原试剂组合物中氧化还原酶硫堇(或其衍生物)‑含金属配合物之间反应速率的增加，葡萄糖检测效率显著提高，并且所述组合物几乎不受高湿度和干扰物质的影响。因此，所述氧化还原试剂组合物可用于制作用于检测血液中葡萄糖的电化学生物传感器。

Description

用于电化学生物传感器的氧化还原试剂组合物及包含所述组 合物的生物传感器
技术领域
本发明涉及氧化还原试剂(redox-reagent)的组合物以及包含所述组合物的生物传感器，所述组合物包含含金属配合物和硫堇(thionine)或其衍生物作为电子传递介质(electron transfer mediator)，所述组合物用于电化学生物传感器。
背景技术
虽然在过去的30年中已经持续做出了许多努力来改进葡萄糖仪(glucose meter)的精度以治疗糖尿病，但是主要有两种葡萄糖测量方法，即分光光度计测量和电化学测量。
在这两者之间，电化学测量更常见，这是因为由葡萄糖仪上的血污染物导致的电化学测量精度劣化(accuracy deterioration)频率相对较低并且电化学测量需要的血量较少。
虽然进行了如此长之时间阶段的与葡萄糖仪相关的许多研究，但是关于葡萄糖仪精度的许多问题仍未解决，并且问题之一是用于测量的酶所固有的。
例如，FAD-GOx是用于商业电化学传感器的最常见的葡萄糖氧化还原酶，在加热下稳定并且在酶促反应中具有卓越的特异性，但是测量的葡萄糖值受血液中氧浓度的影响。
虽然基于PQQ-GDH酶的传感器不受氧的影响，但是许多单糖和二糖(包括甘露糖、麦芽糖或乳糖)仍影响该传感器(Igarashi，S.和Sode，K.，Engineering PQQ glucosedehydrogenase with improved plate specificity-first site-directed mutagenesisstudies on the active center of PQQ glucose dehydrogenase.Biomol.Engineer.，21，81-89(2004))，并且更具体地，糖尿病界(diabetes community)一直热衷于在糖尿病中发现的高麦芽糖浓度的作用(Mehmet，S.，Quan，G.，Thomas，S.和Goldsmith，D.，Importantcauses of hypoglycemia in patients with diabetes on peritonealdialysis.Diabet.Med.，18，679-682(2001))。
NAD-GDH酶对葡萄糖反应具有卓越的特异性，但是其使用并不方便，这是因为需要向试剂组合物添加NAD+或NADP+。作为对于这一不便之处的解决方案，已经开发了基于FAD-GDH(酶学委员会编号1.1.99.10)的电化学传感器。
基于FAD-GDH酶的传感器不受血液中氧的量影响。因此，该传感器可以有效地应用到从人体中静脉、动脉或毛细血管收集的任意血液样品。虽然该传感器有着与木糖反应的缺点，但是其不与甘露糖、麦芽糖或乳糖反应，因此考虑到葡萄糖特异性反应，这使得该传感器比基于(PQQ-GDH)的传感器相对更好。
传感器的精度不仅受酶影响，还受电子传递介质影响。铁氰化钾([K3Fe(CN)6])、吩嗪甲基硫酸盐(phenazine-methosulfate)、甲氧基吩嗪甲基硫酸盐、吩嗪硫酸甲酯和二氯靛酚是众所周知的FAD-GDH的电子传递介质。但是，所有上述介质的性质在高温或潮湿的条件下容易改变，导致当该传感器长时间贮存时传感器的精度劣化的倾向。为了解决这一问题，提出了用吩噻嗪的亲水衍生物替代铁氰化钾的方法(US20090145775)。
对于基于FAD-GOx(EC No.1.1.3.4)的电化学传感器，已经使用六胺氯化钌(hexaamineruthenium chloride)([Ru(NH3)6Cl3])作为电子传递介质，这是因为该传感器受干扰物质(例如尿酸和龙胆酸)的影响小得多，并且因为与使用铁氰化物的传感器相比，其由潮湿导致的精度劣化低得多(US7288174，US20090280551)。但是，由于六胺氯化钌与FAD-GDH(EC No.1.1.99.10)之间反应相当缓慢，所以制作可用的传感器一直是不容易的。
同时，以下是使用两种类型电子传递介质的实例列表。
EP0238322A1教导了用铁氰化物和苯醌提高细菌与电极之间的电子传递速度的方法。
US20070295616A1教导了将锇(Os)和铁氰化物应用于葡萄糖传感器的方法。
A.Amine等(A.Amine，J.M.Kauffmann，G,J.Patriarche，G,D.Christian；Characterization of mediated and non-mediated oxidase enzyme based glassycarbon electrode，Talanta，1993，40，1157-1162.)教导了将吩嗪甲基硫酸盐和铁氰化物应用于葡萄糖氧化酶的方法。
A.Amid和J.M Kaffman(A.Amine和J.M.Kauffmann；Preparation andcharacterization of a fragile enzyme immobilized carbon paste electrode，Bioelectrochem.Bioenerg.，1992，28，117-125.)教导了将吩嗪甲基硫酸盐和铁氰化物应用于谷氨酸脱氢酶的方法。
但是，一直未发现可以与钌配合物一起使用的第二电子传递介质。
在寻找上述问题之解决方案的研究中，本发明人发现包含含金属配合物和硫堇或其衍生物作为电子传递介质的试剂组合物通过以下来改善葡萄糖检测的效率：通过提高氧化还原酶-硫堇(或其衍生物)与含金属配合物之间的反应速度，以及该试剂组合物在高湿度条件下几乎不受影响，并且不受干扰物质影响，并由此完成本发明。
现有技术
专利文件
专利文件1：EP00238322A1
专利文件2：US20070295616A1
非专利文件
非专利文件1：A.Amine，J.M.Kauffmann，G.J.Patriarche，G.D.Christian；Characterization of mediated and non-mediated oxidase enzyme based glassycarbon electrode，Talanta，1993，40，1157-1162.
非专利文件2：A.Amine和J.M.Kauffmann；Preparation and characterizationof a fragile enzyme immobilized carbon paste electrode，Bioelectrochem.Bioenerg.，1992，28，117-125.
公开内容
技术问题
本发明的一个目的是提供用于电化学生物传感器的氧化还原试剂组合物，所述组合物包含含金属配合物和硫堇或其衍生物作为电子传递介质。
本发明的另一个目的是提供平面型生物传感器，其中用氧化还原试剂涂覆工作电极。
本发明的另一个目的是提供逆向型(converse type)生物传感器，其中用氧化还原试剂涂覆工作电极。
技术方案
为了实现以上阐述的目的，本发明提供用于电化学生物传感器的氧化还原试剂组合物，所述组合物包含氧化还原酶和电子传递介质，所述电子传递介质包含含金属配合物和硫堇或其衍生物。
此外，本发明提供平面型电化学生物传感器，其中工作电极和对电极(counterelectrode)共面制备，并且用氧化还原试剂涂覆所述工作电极。
此外，本发明提供逆向型电化学生物传感器，其中工作电极和对电极制备在两个分离的平面上，并且用氧化还原试剂涂覆工作电极。
有益效果
根据本发明，包含含金属配合物和硫堇或其衍生物作为电子传递介质的氧化还原试剂通过提高氧化还原酶-硫堇(或其衍生物)-含金属配合物之间的反应速度来改善葡萄糖敏感性，在高湿度条件下几乎不受影响并且不受干扰物质影响，因此使得其自身理想地用于制作用于血糖测量的电化学生物传感器。
附图说明
在参考附图阅读某些示例性实施方案的描述后，本发明前述和/或其他方面将变得更加明显，其中：
图1举例说明了根据本发明一个实施方案使用的硫堇的化学结构；
图2举例说明了根据本发明一个实施方案使用的硫堇衍生物的化学结构；
图3是举例说明根据本发明实例的平面型生物传感器的分解图；
图4是举例说明根据本发明一个实施方案的逆向型生物传感器的分解图；
图5是举例说明施加到根据本发明一个实施方案的生物传感器之工作电极的相对于时间之电压变化的图表。当样品同时覆盖了工作电极和对电极时，将工作电极设置为0mV。3秒之后，向工作电极施加200mV，并且在4秒时测量电流；
图6是示出使用根据实施例1-1和比较实施例1-1的逆向型生物传感器对数种葡萄糖浓度样品测量之电流的图表；
图7是示出使用根据实施例1-2的平面型生物传感器对数种葡萄糖浓度样品测量之电流的图表；
图8是示出使用根据实施例2-1的逆向型生物传感器对数种葡萄糖浓度样品测量之电流的图表；以及
图9是示出使用根据实施例1-1(10mM硫堇)和实施例3-1至6-1的逆向型生物传感器对数种葡萄糖浓度样品测量之电流的图表。
最佳方式
在下文中，将详细阐述本发明。
本发明提供用于电化学生物传感器的氧化还原试剂组合物，所述组合物包含氧化还原酶和电子传递介质，其中该电子传递介质包含含金属配合物和硫堇或其衍生物。
根据本发明的氧化还原试剂组合物，氧化还原酶通过与其底物反应而被还原，并且经还原的酶与电子传递介质相互反应以量化底物。
虽然参照用于葡萄糖测量的生物传感器阐述本发明的实施方案，但是类似地，使用特异性酶及其合适的介质使得其可能测量多种代谢物(例如有机物质或无机物质，例如胆固醇、乳酸(lactate)、肌酐、过氧化氢、醇、氨基酸或谷氨酸(glutamate)、或者无机物质)的浓度。因此，通过在试剂组合物中转换酶，本发明可以应用于量化多种代谢物。
例如，黄素腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖脱氢酶(flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase，FAD-GDH)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖脱氢酶(nicotinamideadenine dinucleotide-glucose dehydrogenase，NAD-GDH)、葡萄糖脱氢酶(GDH)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase)、胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、乳酸氧化酶(lactateoxidase)、抗坏血酸氧化酶、醇氧化酶、醇脱氢酶或胆红素氧化酶可以用于进行葡萄糖、谷氨酸、胆固醇、乳酸、抗坏血酸、醇或胆红素的定量。
同时，氧化还原酶可以单独地或与其辅因子(cofactor)一同使用。辅因子发挥存储氧化还原酶从其底物获得的氢的作用。辅因子可以是FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)或NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)。
在本发明的氧化还原试剂的配制中，电子传递介质由与经还原的酶的氧化还原反应还原，所述经还原的酶由与其底物的反应产生。形成的电子传递介质以还原态在施加氧化电势的电极表面上产生电流。
在本文中，将含金属配合物和硫堇或其衍生物混合以用作电子传递介质，但这不意味着排除使用传统物质，例如二茂铁、二茂铁衍生物、醌、醌衍生物、有机导电盐和紫罗碱(viologen)。
对于以上电子传递介质，钌配合物或铁氰化物配合物可以用作含金属配合物。钌配合物可以包括Ru(NH3)6Cl3、[Ru(2，2′，2″-三联吡啶)(1,10-二氮杂菲)(OH2)]2+、反式-[Ru(2，2′-联吡啶)2(OH2)(OH)]2+、[(2，2′-联吡啶)2(OH)RuORu(OH)(2，2′-联吡啶)2]4+或[Ru(4，4′-联吡啶)(NH3)5]2+，并且铁氰化物配合物可以包括K3Fe(CN)6。
对于上述电子传递介质，硫堇衍生物可以包括3-氨基-7-(2，3,4,5,6-五羟基己酰胺基)-5-吩噻嗪(硫堇衍生物a)、天青C(azure C)(硫堇衍生物b)、天青A(硫堇衍生物c)、亚甲基蓝(硫堇衍生物d)、甲苯胺蓝(硫堇衍生物e)(参见图2)。
六胺氯化钌(hexaamineruthenium chloride)是本发明中最优选的钌配合物，这是因为其氧化还原状态在水溶液中是稳定且可逆的；其经还原的电子传递介质不与氧反应；经还原的电子传递介质的氧化对pH不敏感；并且干扰物质(例如乙酰氨基酚(acetaminophene)、抗坏血酸、胆红素、多巴胺、尿酸和龙胆酸)不与六胺氯化钌反应(参见实验实施例4)。
根据本发明，钌配合物和硫堇的电极传递介质显著地提高葡萄糖检测效率，并且高湿度和多种干扰物几乎不影响其葡萄糖检测。
例如，参考比较实施例1(Comparative Example1)，当将六胺氯化钌(Ru(NH3)6Cl3)单独用作电子传递介质(不含硫堇)时，该介质几乎不能应用于生物传感器，这是因为其与氧化还原酶的反应速率很慢。相反，当将含金属配合物和硫堇或其衍生物一起用作根据本发明的电子传递介质时，由于在氧化还原酶与硫堇或其衍生物之间以及硫堇或其衍生物与含金属配合物之间的快速反应速率，该介质可以有效用于生物传感器制作(实验实施例1)。
根据本发明的氧化还原试剂组合物优选地含有250至340重量％含金属配合物/100重量％氧化还原酶。当该试剂含有少于250重量％含金属配合物时，该传感器敏感度在高葡萄糖浓度下降低，而当该试剂含有多于340重量％含金属配合物时，该试剂在血液中不快速溶解。
根据本发明的氧化还原试剂组合物优选地含有6至20重量％硫堇或其衍生物/100重量％氧化还原酶。当该试剂含有少于6重量％硫堇或其衍生物时，该传感器敏感度在高葡萄糖浓度下劣化，而当该试剂含有多于20重量％硫堇或其衍生物时，该试剂在血液中不快速溶解。
同时，根据本发明的氧化还原试剂组合物可以另外地包含添加剂，例如表面活性剂、水溶性聚合物、季铵盐、脂肪酸和增稠剂。
将表面活性剂用作添加剂导致在试剂分配期间该试剂均匀地铺展在电极上至均一厚度。该表面活性剂可以包括Triton X-100、十二烷基硫酸钠、全氟辛烷磺酸盐或硬脂酸钠。根据本发明，该氧化还原试剂组合物优选地含有10至25重量％表面活性剂/100重量％氧化还原酶。
用作添加剂的水溶性聚合物发挥聚合物支架的作用，这有助于酶的稳定和分散。该水溶性聚合物可以包括，例如，聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、全氟磺酸盐(perfluoro sulfonate)、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)、羧甲基纤维素(CMC)、醋酸纤维素或聚酰胺。根据本发明的氧化还原试剂组合物优选地含有30至70重量％水溶性聚合物/100重量％氧化还原酶。
用作添加剂的季铵盐减小来自血细胞比容的测量误差。季铵盐可以包括，例如，十二烷基三甲基铵、肉豆蔻基三甲基铵、鲸蜡基三甲基铵、十八烷基三甲基铵或四己基铵。根据本发明的氧化还原试剂组合物优选地含有70至130重量％季铵盐/100重量％氧化还原酶。
与季铵盐一样，用作添加剂的脂肪酸也减小血细胞比容相关的测量误差，并且还扩大了高浓度下生物传感器的线性动力学范围。该脂肪酸可以包括C4至C20脂肪酸或其盐，或者优选地，C6至C12烷基链的脂肪酸或其盐。脂肪酸可以包括，例如，己酸、庚酸、辛酸(caprylic acid)、辛酸(octanoic acid)、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸或花生四烯酸。根据本发明的氧化还原试剂组合物优选地含有30至70重量％脂肪酸/100重量％氧化还原酶。
用作添加剂的增稠剂牢固地将该试剂附着到电极上。增稠剂可以包括例如Natrosol或DEAE-葡聚糖盐酸盐。根据本发明的氧化还原试剂组合物优选地含有30至90重量％增稠剂/100重量％氧化还原酶。
根据本发明，该电化学生物传感器可以是平面型生物传感器，其中工作电极和对电极制备在一个平面上，并且根据本发明的氧化还原试剂组合物涂覆在工作电极上。
此外，根据本发明，电化学生物传感器可以是逆向型生物传感器，其中工作电极和对电极制备在分离的平面上并面向彼此，并且将根据本发明的氧化还原试剂组合物涂覆在工作电极上。
可以通过以下文献中公开的已知方法制作所述平面型和逆向型电化学生物传感器：韩国专利申请号10-2003-0036804、10-2005-0010720、10-2007-0020447、10-2007-0021086、10-2007-0025106和10-2007-0030346、以及E.K.Bauman等(AnalyticalChemistry,37卷，1378页，1965)和K.B.Oldham(″Microelectrodes：Theory andApplications,″Kluwer Academic Publishers，1991)。
在下文中，将通过参照图3和图4详细阐述所述平面型和逆向型生物传感器。
参照图3，其中将工作电极2和对电极3制备在一个平面上的平面型电化学生物传感器具有依次堆叠的结构：顶层11，其具有槽10(通过其将血液吸入传感器)；隔片(spacer)9，其两个表面都涂覆粘合剂以使顶层11和底层附着其上，导致所述血液通过毛细作用被吸向电极；根据本发明的氧化还原试剂组合物8，其被涂覆在将在下文阐述的工作电极2上；绝缘层7，其具有限定工作电极2和对电极3之面积的通道；工作电极2和对电极3，其被印刷(print)在底层1上；和底层1，在其上形成工作电极2和对电极3。
参照图4，其中工作电极2和对电极3制备在分离的平面上以面向彼此的逆向型电化学生物传感器具有依次堆叠的结构：顶层11，其具有槽10，血液通过所述槽10被吸入传感器，并且在所述顶层11上印刷对电极3；印刷在顶层11上的对电极3；隔片9，其两个表面都涂覆粘合剂以使顶层11和底层1附着其上，导致所述血液通过毛细作用被吸向电极；根据本发明的氧化还原试剂组合物8，其被涂覆在工作电极2上；绝缘层7，其具有限定工作电极2和对电极3之面积的通道；电路接地(circuit connect ground)5，其将对电极3连接至对电极3的引线4；工作电极2、对电极3的引线4以及用于测量引入血液之速率的流速检测电极6，其全都被印刷在底层上；和底层1，在其上形成工作电极2、对电极3的引线4以及流速检测电极6。
如以上所阐述的，根据本发明的含有含金属配合物和硫堇或其衍生物作为电子传递介质的氧化还原试剂组合物可以在制造用于测量血液中葡萄糖水平的电化学生物传感器中被有用地实施，这是因为根据本发明的氧化还原试剂组合物提高氧化还原酶硫堇(或其衍生物)-含金属配合物之间的反应速率并显著提高葡萄糖检测速率，并且还几乎不受高湿度或干扰物质的影响。
发明方式
下文中，将参考实施例和实验实施例详细阐述本发明。但是，所书写的实施例仅用于举例说明的目的，因此本发明不受限于任何具体实施例。<实施例1>制备包含六胺氯化钌和硫堇作为电子传递介质的氧化还原试剂组合物
每100重量％黄素腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)作为氧化还原酶，290.4重量％六胺氯化钌(Ru(NH3)6Cl3)作为含金属配合物；14.6重量％(8mM)或18.3重量％(10mM)的硫堇；52重量％辛酸钠作为脂肪酸；104.3重量％的肉豆蔻基三甲基溴化铵作为季铵盐；11.7重量％DEAE-葡聚糖盐酸盐和52重量％Natrosol作为增稠剂；52重量％聚乙烯醇作为水溶性聚合物；以及17.4重量％表面活性剂(Triton X-100)；以上溶解在磷酸钠缓冲溶液(pH6.4，0.1M1249ml)与去离子水(1614.6ml)中，将残留在溶液中的固体颗粒过滤除去。将该溶液放置在气动式分散器(EFD XL100)的注射器中直至其使用。
分别制备了两种试剂组合物，一种含有8mM的硫堇含量，而另一种含有10mM的硫堇含量。在下文中，在叙述实施例1的试剂组合物的任何时候，硫堇含量在括号内指出。
<实施例1-1>制作含有实施例1之试剂组合物的逆向型生物传感器
参照图4，制备了具有平均为0.5μl样品引入部分的逆向型生物传感器。该逆向型生物传感器通过参考公开于以下文献的方法制备：韩国专利申请号10-2003-0036804、10-2005-0010720、10-2007-0020447、10-2007-0021086、10-2007-0025106和10-2007-0030346以及E.K.Bauman等在Analytical Chemistry，卷37，1378页，1965中，和K.B.Oldham在″Microelectrodes：Theory and Applications,″Kluwer Academic Publishers，1991中。
参照图4，图标(reference numeral)1表示由聚酯形成的底层塑料，在其上丝网印刷(screen-printed)工作电极(面积：1.95mm2)，对电极的引线和流速检测电极；2、3、4、6表示通过丝网印刷碳石墨形成的电极，其中图标2表示工作电极，3是对电极，4是对电极的引线，并且6是用于测量进入之血液的速率的黏度测量电极；5是由银和氯化银(Ag/AgCl)形成的电路接地，其用于连接工作电极和对电极3和4；7是绝缘体，其限定工作电极2的面积；8是在实施例1中制备并涂覆在工作电极2上的氧化还原试剂组合物(硫堇8mM或10mM)；9是0.07mm厚的隔片，血液通过毛细作用经过该隔片而被吸向电极，并在两个表面上都涂覆粘合剂以结合顶层和底层；10是通气孔；11是由聚酯形成的顶层塑料，在其上丝网印刷对电极。
在下文中，在阐述实施例1-1的逆向型生物传感器中，实施例1的试剂组合物的硫堇含量也会在括号中确定。
<实施例1-2>制作含有实施例1之试剂组合物的平面型生物传感器
参照图3，制备了具有平均为0.5μl样品引入部分的平面型生物传感器。该平面型生物传感器特别地根据公开于以下文献中的方法制作：韩国专利申请号10-2003-0036804、10-2005-0010720、10-2007-0020447、10-2007-0021086、10-2007-0025106和10-2007-0030346以及E.K.Bauman等在Analytical Chemistry,卷37，1378页，1965中，和K.B.Oldham在″Microelectrodes：Theory and Applications,″Kluwer Academic Publishers，1991中。
参照图3，图标1表示由聚酯形成的底层塑料，包括在其上形成的工作电极(面积：1.05mm2)和对电极；2和3是通过丝网印刷碳石墨制造的电极，其中2是工作电极，3是对电极；7是绝缘体，其限定工作电极和对电极的面积；8是在实施例1中制备并涂覆在工作电极上的氧化还原试剂组合物(硫堇8mM或10mM)；9是0.10mm厚的隔片，血液通过毛细作用经过该隔片被吸向电极，并且在两个表面上都涂覆粘合剂以结合顶层和底层；10是用于将血液吸入传感器的通气孔；以及11是由聚酯形成的顶层塑料。
在下文中，在阐述实施例1-2的平面型生物传感器中，实施例1的试剂组合物的硫堇含量也会在括号中确定。
<实施例2>制备含有六胺氯化钌和硫堇衍生物作为电子传递介质的氧化还原试剂组合物#1
以与上述实施例1中阐述的方式相同的方式制备试剂组合物，除了以下事实，即：实施例1的试剂组合物的硫堇被3-氨基-7-(2，3,4,5,6-五羟基己酰胺基)-5-吩噻嗪(“硫堇衍生物a”)替代，后者是图2中列出的硫堇衍生物之一。
<实施例2-1>制作含有实施例2之试剂组合物的逆向型生物传感器
以与上述方式相同的方式制作逆向型生物传感器，除了使用实施例2而不是实施例1的试剂组合物涂覆在实施例1-2的工作电极上。
<实施例3>制备含有六胺氯化钌和硫堇衍生物作为电子传递介质的氧化还原试剂组合物#2
以与实施例1中阐述的方式相同的方式制备试剂组合物，除了使用10mM天青C(“硫堇衍生物b”，其是图2中列出的硫堇衍生物之一)替代硫堇。
<实施例3-1>制作含有实施例3之试剂组合物的逆向型生物传感器
以与实施例1-1中阐述的方式相同的方式制作逆向型生物传感器，除了在工作电极上使用实施例3而不是实施例1的试剂组合物。
<实施例4>制备含有六胺氯化钌和硫堇衍生物作为电子传递介质的氧化还原试剂组合物#3
以与实施例1中阐述的方式相同的方式制备试剂组合物，除了使用10mM天青A(“硫堇衍生物c”，图2中列出的硫堇衍生物之一)替代硫堇。
<实施例4-1>制作含有实施例4之试剂组合物的逆向型生物传感器
以与实施例1-1中阐述的方式相同的方式制作逆向型生物传感器，除了使用实施例4而不是实施例1的试剂组合物。
<实施例5>制备含有六胺氯化钌和硫堇衍生物的氧化还原试剂组合物#4
以与实施例1中阐述的方式相同的方式制备试剂组合物，除了使用10mM亚甲基蓝(“硫堇衍生物d”，图2中列出的硫堇衍生物之一)替代硫堇。
<实施例5-1>制作含有实施例5之试剂组合物的逆向型生物传感器
以与实施例1-1中阐述的方式相同的方式制作逆向型生物传感器，除了在工作电极上使用实施例5而不是实施例1的试剂组合物。
<实施例6>制备含有六胺氯化钌和硫堇衍生物作为电子传递介质的氧化还原试剂组合物#5
以与实施例1中阐述的方式相同的方式制备试剂组合物，除了使用10mM甲苯胺蓝(“硫堇衍生物e”，图2中列出的硫堇衍生物之一)替代硫堇。
<实施例6-1>制作含有实施例6之试剂组合物的逆向型生物传感器
以与实施例1-1中阐述的方式相同的方式制作逆向型生物传感器，除了在工作电极上使用实施例6而不是实施例1的试剂组合物。
<实施例7>制备含有铁氰化钾和硫堇作为电子传递介质的氧化还原试剂组合物
以与实施例1中阐述的方式相同的方式制备试剂组合物，除了使用铁氰化钾(K3Fe(CN)6)和硫堇替代六胺氯化钌(Ru(NH3)6Cl3)。
<实施例7-1>制作含有实施例7之试剂组合物的逆向型生物传感器
以与实施例1-1中阐述的方式相同的方式制作逆向型生物传感器，除了在工作电极上使用实施例7而不是实施例1的试剂组合物。
<比较实施例1>制备含有六胺氯化钌作为电子传递介质的氧化还原试剂组合物
以与实施例1中阐述的方式相同的方式制备试剂组合物，除了不使用硫堇。
<比较实施例1-1>制作含有比较实施例1之试剂组合物的逆向型生物传感器
以与实施例1-1中阐述的方式相同的方式制作逆向型生物传感器，除了在工作电极上使用比较实施例1而不是实施例1的试剂组合物。
<比较实施例2>制备含有铁氰化钾作为电子传递介质的氧化还原试剂组合物
以与实施例1中阐述的方式相同的方式制备试剂组合物，除了使用铁氰化钾(K3Fe(CN)6)替代六胺氯化钌(Ru(NH3)6Cl3)和硫堇。
<比较实施例2-1>制作含有比较实施例2之试剂组合物的逆向型生物传感器
以与实施例1-1中阐述的方式相同的方式制作逆向型生物传感器，除了在工作电极上使用比较实施例2而不是实施例1制备的试剂组合物。
<实验实施例1>使用逆向型生物传感器对葡萄糖标准溶液的电流测量
使用实施例1-1(10mM的硫堇)制作的逆向型生物传感器和比较实施例1-1制作的逆向型生物传感器测量用于葡萄糖标准溶液的电流。本文中，“葡萄糖标准溶液”是指来自静脉血的血液样品，使用葡萄糖分析仪(制造商：YSI，模式名称：2300Stat Plus)将其调节至42％血细胞比容和数种葡萄糖浓度。
具体地，在69、97、148、201、304、399或503mg/dL葡萄糖浓度的各个标准溶液覆盖工作电极和对电极二者的时刻，向工作电极施加0mV，并且等待3秒后，向工作电极施加200mV，并且在1秒后测量电流(参见图5)。每个葡萄糖浓度进行10次测量并在图6中列出平均值。
将0.5μl的样品量施加到实施例1-1和比较实施例1-1之逆向型生物传感器的引入部分，直至42％血细胞比容的全血填充了该引入部分花费约0.2秒或更少。
图5是举例说明施加到根据本发明一个实施方案的生物传感器之工作电极的相对于时间之电压变化的图表：当样品同时覆盖工作电极和对电极二者时，向工作电极施加0mV。3秒后，向工作电极施加200mV，并且在4秒时测量电流。
图6是举例说明使用实施例1-1和比较实施例1-1的逆向型生物传感器作为葡萄糖浓度之函数测量的电流的图表。
参照图6，含有六胺氯化钌和硫堇二者作为电子传递介质的实施例1-1的逆向型生物传感器展示出良好的线性，其中测量的电流随葡萄糖浓度逐渐增大。但仅含有六胺氯化钌(即，不合硫堇)作为电子传递介质的比较实施例1-1的逆向型生物传感器示出对于葡萄糖浓度的不良线性。使用实施例1-1之逆向型生物传感器测量的电流/单位面积工作电极的斜率为41.7nA/mm2/(mg/dL)，意味着与葡萄糖非常高的反应速率。
因此，由于应用根据本发明之氧化还原试剂的逆向型生物传感器与葡萄糖反应非常迅速，所以根据本发明的氧化还原试剂组合物在制作用于检测血液中葡萄糖的生物传感器中非常有用。
<实验实施例2>使用平面型生物传感器对葡萄糖标准溶液的电流测量
以与实验实施例1中阐述的方式相同的方式对葡萄糖标准溶液测量电流，使用实施例1-2的平面型生物传感器(8mM的硫堇)。
图7是示出使用根据实施例1-2的平面型生物传感器作为葡萄糖浓度之函数测量的电流的图表。
参照图7，类似于在实验实施例1中使用的实施例1-1的逆向型生物传感器，实施例1-2的平面型生物传感器也表现出良好的线性，其中所测量的电流随葡萄糖浓度逐渐增大。使用根据实施例1-2之平面型生物传感器测量的电流的斜率为35.4hA/mm2/(mg/dL)/单位面积工作电极，从而表现出与葡萄糖非常高的反应速率。
因此，由于应用到平面型生物传感器的根据本发明的氧化还原试剂组合物与葡萄糖反应非常迅速，所以该组合物在制作用于检测血液中葡萄糖的生物传感器中非常有用。
<实验实施例3>使用根据实施例2-1至6-1的逆向型生物传感器对葡萄糖标准溶液的电流测量
使用经图2的硫堇衍生物涂覆的实施例2-1至6-1之逆向型生物传感器，并使用实施例1-1的逆向型生物传感器(10mM的硫堇)，以与实验实施例1中阐述的方式相同的方式对葡萄糖标准溶液测量电流。
具体地，在实施例1的条件下，硫堇溶解至多10mM(最大值)而不在试剂组合物中产生沉淀。相反，在实施例2中使用的具有5个亲水(-OH)基团的3-氨基-7-(2，3,4,5,6-五羟基己酰胺基)-5-吩噻嗪(“硫堇衍生物a”)可以溶解至多约50mM而不产生沉淀。因此，实施例1-1和实施例3-1至6-1的逆向型生物传感器含有10mM硫堇或其衍生物(“硫堇衍生物b至e”)，实施例2-1的逆向型生物传感器使用50mM的硫堇衍生物a。
图8是示出使用实施例2-1的逆向型生物传感器对数种葡萄糖浓度样品测量之电流的图表。
图9是示出使用根据实施例1-1(10mM硫堇)和实施例3-1至6-1的逆向型生物传感器对数种葡萄糖浓度样品测量之电流的图表。
参照图8和9，含有根据实施例2-1之硫堇衍生物a的逆向型生物传感器示出的电流斜率为31.5hA/mm2/(mg/dL)/单位面积工作电极，由此表明与葡萄糖的高反应速率。实施例2-1的逆向型生物传感器的电流示出的斜率比含有根据实施例3-1至6-1之硫堇衍生物b至e的逆向型生物传感器的斜率显著更高。
因此，由于应用于逆向型生物传感器的根据本发明的氧化还原试剂组合物与葡萄糖反应非常迅速，所以该组合物在制作用于检测血液中葡萄糖的生物传感器中非常有用。
<实验实施例4>根据对电子传递介质的选择来评价来自干扰物质的影响
为了研究来自由临床实验室标准协会(CLSI)列出的物质中的严重干扰物质(例如乙酰氨基酚、抗坏血酸、胆红素、多巴胺、尿酸和龙胆酸)的干扰程度，使用实施例1-1的逆向型生物传感器(8mM的硫堇)和比较实施例2-1的逆向型生物传感器进行以下测试。
具体地，对80mg/dL葡萄糖样品测量电流。接下来，对分别掺入乙酰氨基酚(20mg/dL)、抗坏血酸(20mg/dL)、胆红素(40mg/dL)、多巴胺(2.5mg/dL)、尿酸(20mg/dL)和龙胆酸(50mg/dL)的样品测量电流。然后将掺入干扰物之前和之后之间的电流差异转变为葡萄糖值并且其结果列表如下。
表1
如表1中所示，在实施例1-1中的情况下，来自所有干扰物的影响显著低于比较实施例2-1。
因此，由于根据本发明的氧化还原试剂组合物几乎不受干扰物质影响，所以该组合物在制作用于检测血液中葡萄糖的生物传感器中非常有用。
前述实施方案和益处仅仅是示例性的，不能解释为限制本发明。本教导可以容易地应用到其他类型的装置。此外，本发明构思的示例性实施方案的描述旨在举例说明，而非限制权利要求的范围，并且许多替换、修改和变化对本领域的技术人员将是明显的。
工业实用性
根据本发明，包含含金属配合物和硫堇或其衍生物作为电子传递介质的氧化还原试剂通过提高氧化还原酶-硫堇(或其衍生物)-含金属配合物之间的反应速度来改善葡萄糖敏感性，并几乎不受高湿度条件和干扰物质的影响，并且因此使得其自身理想地用于制作用于血液葡萄糖测量的电化学生物传感器。

Claims (15)

1.氧化还原试剂组合物，其用于电化学生物传感器，所述组合物包含氧化还原酶和电子传递介质，其中所述电子传递介质包含钌配合物和硫堇。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述氧化还原酶选自以下之一：黄素腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶、胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、乳酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、醇氧化酶、醇脱氢酶和胆红素氧化酶。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述钌配合物选自以下之一：Ru(NH3)6Cl3、[Ru(2，2′，2″-三联吡啶)(1，10-二氮杂菲)(OH2)]2+、反式-[Ru(2，2′-联吡啶)2(OH2)(OH)]2+、[(2，2′-联吡啶)2(OH)RuORu(OH)(2，2'-联吡啶)2]4+和[Ru(4，4′-联吡啶)(NH3)5]2+。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述氧化还原试剂组合物还包含一种或更多种选自以下的添加剂：表面活性剂、水溶性聚合物、季铵盐、脂肪酸和增稠剂。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述表面活性剂选自以下之一：Triton X-100、十二烷基硫酸钠、全氟辛烷磺酸盐和硬脂酸钠。
6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述水溶性聚合物为选自以下的一种或更多种：聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、多氟磺酸盐、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、醋酸纤维素和聚酰胺。
7.根据权利要求4所述的组合物，其中所述季铵盐为选自以下的一种或更多种：十二烷基三甲基铵、乙基三甲基铵、肉豆蔻基三甲基铵、鲸蜡基三甲基铵、十八烷基三甲基铵和四己基铵。
8.根据权利要求4所述的组合物，其中所述脂肪酸为选自以下的一种或更多种：己酸、庚酸、辛酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸和花生四烯酸。
9.根据权利要求4所述的组合物，其中所述增稠剂为二乙基氨基乙基-葡聚糖盐酸盐(DEAE-葡聚糖盐酸盐)。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生物传感器是葡萄糖生物传感器。
11.平面型电化学生物传感器，其包括：
在一个平面上提供的工作电极和对电极；以及
涂覆在所述工作电极上的根据权利要求1所述的氧化还原试剂组合物。
12.逆向型生物传感器，其包括：
在分离的平面上提供的并且面向彼此的工作电极和对电极；以及
涂覆在所述工作电极上的根据权利要求1所述的氧化还原试剂组合物。
13.平面型电化学生物传感器，其包括：
顶层，其具有槽，血液通过所述槽被吸入所述生物传感器；
隔片，其两个表面都涂覆粘合剂以使所述顶层和底层附着其上，导致所述血液通过毛细作用被吸向电极；
根据权利要求1所述的氧化还原试剂组合物，其被涂覆在工作电极上；
绝缘层，其具有限定工作电极和对电极之面积的通道；
所述工作电极和所述对电极，其被印刷在所述底层上；和
所述底层，在其上形成所述工作电极和所述对电极。
14.逆向型生物传感器，其包括：
顶层，其具有槽，血液通过所述槽被吸入所述生物传感器，并且在所述顶层上印刷对电极；
印刷在所述顶层上的所述对电极；
隔片，其两个表面都涂覆粘合剂以使所述顶层和底层附着其上，导致所述血液通过毛细作用被吸向电极；
根据权利要求1所述的氧化还原试剂组合物，其被涂覆在工作电极上；
绝缘层，其具有限定工作电极和对电极之面积的通道；
电路接地，其将所述对电极连接至对电极的引线；
所述工作电极、所述对电极的引线以及用于测量引入血液之速率的流速检测电极，其全都被印刷在所述底层上；和
所述底层，在其上形成所述工作电极、所述对电极的引线以及所述流速检测电极。
15.根据权利要求1所述的组合物，其中所述氧化还原酶包含黄素腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖脱氢酶。
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