KR102596518B1 - 산화 환원 반응용 시약 조성물 및 이를 포함하는 바이오센서 - Google Patents
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Abstract
산화 환원 효소 및 페리시아나이드 염을 포함하고, 상기 페리시아나이드 염은 페리시아나이드 및 양으로 하전된 상대 이온으로 구성되고, 상기 양으로 하전된 상대 이온은 화학식 1의 화합물로부터 유래되는 것인, 산화 환원 반응용 시약 조성물 및 이를 포함하는 바이오센서가 제공된다.
Description
본 발명은 산화 환원 반응용 시약 조성물 및 이를 포함하는 바이오센서에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 분석 물질 바람직하게는 글루코스(glucose)의 산화 환원 효소에 기반한 검출에 적용되는 산화 환원 반응용 시약 조성물 및 이를 포함하는 바이오센서에 관한 것이다.
최근 당뇨병의 유병율이 높아지면서 글루코스(혈당) 측정에 대한 관심과 측정 장치에 대한 수요가 증가되고 있다. 글루코스는 글루코스의 산화 환원 반응에 관련되는 산화 환원 효소 및 상기 산화 환원 반응시 전자 전달을 매개하는 전자 전달 매개체 간의 상호 반응에 의하여 방출되는 전자를 통해 측정될 수 있다. 방출되는 전자가 많을수록 글루코스의 농도는 높다.
전자 전달 매개체로서 포타슘 페리시아나이드 (K+)3[Fe(CN)6)]가 통상적으로 사용되고 있다. (K+)3[Fe(CN)6)]는 가격이 저렴하고 산화 환원 반응에 대한 반응성이 좋아서, FAD(flavin adenine dinucleotide), NAD(nicotinamide adenine dinucleotide) 또는 PQQ(pyrroloquinoline quinone)와 글루코스 탈수소 효소, 글루코스 산화 효소 등과의 조합에서 전자 전달 매개체로 많이 사용되고 있다.
그러나, (K+)3[Fe(CN)6)]를 이용한 전기 화학적 센서는 혈액에 존재하는 요산(uric acid), 도파민(dopamine), 아스코빅산(ascorbic acid) 또는 산소(O2) 등을 포함하는 간섭 물질에 의한 글루코스의 측정 오차가 발생하고, 온도와 습도에 의하여 변질되기 쉽기 때문에 제조와 보관에 각별히 주의해야 한다. 또한, (K+)3[Fe(CN)6)]는 장시간 보관 후 바탕 전류의 변화(경시 변화)로 낮은 농도의 글루코스를 정확하게 검출하는데 어려움이 있다.
본 발명의 배경 기술은 한국공개특허 제2014-0046913호 등에 개시되어 있다.
본 발명의 목적은 간섭 물질에 의한 분석 물질의 측정 오차를 최소화한 산화 환원 반응용 시약 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 온도 및/또는 습도 변화에 따른 산화 환원 반응의 성능 변화가 적어 분석 물질의 분석 신뢰성을 높인 산화 환원 반응용 시약 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 장기간 보관 한 후에도 산화 환원 반응의 성능 변화가 적어 분석 물질의 분석 신뢰성을 높인 산화 환원 반응용 시약 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 분석 물질의 광범위한 농도 범위에서도 분석 물질의 분석 신뢰성이 우수한 산화 환원 반응용 시약 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 대량 생산이 가능하여 경제적이고 공정성이 우수한 산화 환원 반응용 시약 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 관점은 산화 환원 반응용 시약 조성물이다.
산화 환원 반응용 시약 조성물은 산화 환원 효소 및 페리시아나이드 염을 포함하고, 상기 페리시아나이드 염은 페리시아나이드 및 양으로 하전된 상대 이온으로 구성되고, 상기 양으로 하전된 상대 이온은 하기 화학식 1의 화합물로부터 유래된다:
[화학식 1]
(X1)(X2)N-A-Y
(상기 화학식 1에서,
X1, X2는 각각 독립적으로, 수소 또는 탄소수 1 내지 10의 알킬기,
A는 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기, 탄소수 1 내지 10의 알킬렌옥시기 또는 탄소수 1 내지 탄소수 10의 아미노알킬렌기,
Y는 수산기(-OH), 아민기(-NH2), 2차 아민기 또는 3차 아민기이다).
본 발명의 다른 관점은 바이오센서이다.
바이오센서는 본 발명의 산화 환원 반응용 시약 조성물 또는 본 발명의 산화 환원 반응용 시약 조성물로 형성된 코팅층을 포함한다.
본 발명은 간섭 물질에 의한 분석물의 측정 오차를 최소화한 산화 환원 반응용 시약 조성물을 제공하였다.
본 발명은 온도 및/또는 습도 변화에 따른 산화 환원 반응의 성능 변화가 적어 분석물의 분석 신뢰성을 높인 산화 환원 반응용 시약 조성물을 제공하였다.
본 발명은 장기간 보관 한 후에도 산화 환원 반응의 성능 변화가 적어 분석물의 분석 신뢰성을 높인 산화 환원 반응용 시약 조성물을 제공하였다.
본 발명은 분석물의 광범위한 농도 범위에서도 분석물의 분석 신뢰성이 우수한 산화 환원 반응용 시약 조성물을 제공하였다.
본 발명은 대량 생산이 가능하여 경제적이고 공정성이 우수한 산화 환원 반응용 시약 조성물을 제공하였다.
도 1은 본 발명 일 실시예의 바이오센서의 분해 사시도이다.
도 2는 화학식 2-1의 화합물에 대한 측정 결과이다.
도 3은 화학식 2-3의 화합물에 대한 측정 결과이다.
도 4는 (K+)3[Fe(CN)6)]에 대한 측정 결과이다.
도 5는 [(CH3)4N+]3[Fe(CN)6)]에 대한 측정 결과이다.
도 6은 화학식 2-1의 화합물에 대한 간섭 물질 측정 결과이다.
도 7은 화학식 2-3의 화합물에 대한 간섭 물질 측정 결과이다.
도 8은 화학식 2-1의 화합물에 대한 O2 영향 측정 결과이다.
도 9는 화학식 2-3의 화합물에 대한 O2 영향 측정 결과이다.
도 2는 화학식 2-1의 화합물에 대한 측정 결과이다.
도 3은 화학식 2-3의 화합물에 대한 측정 결과이다.
도 4는 (K+)3[Fe(CN)6)]에 대한 측정 결과이다.
도 5는 [(CH3)4N+]3[Fe(CN)6)]에 대한 측정 결과이다.
도 6은 화학식 2-1의 화합물에 대한 간섭 물질 측정 결과이다.
도 7은 화학식 2-3의 화합물에 대한 간섭 물질 측정 결과이다.
도 8은 화학식 2-1의 화합물에 대한 O2 영향 측정 결과이다.
도 9는 화학식 2-3의 화합물에 대한 O2 영향 측정 결과이다.
첨부한 실시예와 도면에 의해 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예와 도면에 한정되지 않는다.
본 발명의 산화 환원 반응용 시약 조성물은 산화 환원 효소 및 전자 전달 매개체로서 페리시아나이드 염을 포함하고, 상기 페리시아나이드 염은 페리시아나이드 및 양으로 하전된 상대 이온으로 구성되고, 상기 양으로 하전된 상대 이온은 하기 화학식 1의 화합물로부터 유래된다.
이를 통해, 본 발명은 요산, 도파민, 아스코빅산, 겐티식산 또는 산소(O2) 등을 포함하는 간섭 물질에 의한 분석 물질의 측정 오차를 최소화하였고, 온도 및/또는 습도 변화에 따른 산화 환원 반응의 성능 변화가 적으며, 장기간 보관 한 후에도 산화 환원 반응의 성능 변화가 적어 분석 물질의 분석 신뢰성을 높였다. 또한, 본 발명은 분석 물질의 광범위한 농도 범위에서도 분석 물질의 분석 신뢰성이 우수하였다. 또한, 본 발명은 대량 생산이 가능하여 경제적이고 공정성이 우수하였다. 본 발명은 분석물의 분석 신뢰성, 경제성 및 공정성을 모두 개선하였다.
일 구체예에서, 본 발명의 산화 환원 반응용 시약 조성물은 요산, 도파민, 아스코빅산 또는 산소 등을 포함하는 간섭 물질에 의한 분석 물질의 측정 오차를 최소화할 수 있다. 이와 관련하여, 간섭 물질이 요산 0.5mM, 도파민 0.1mM 및/또는 아스코빅산 0.5mM의 농도로 존재하는 혈액에서 글루코스 농도를 측정하였을 때, 상기 조성물 또는 상기 조성물로 형성된 코팅층을 구비하는 바이오센서는 상기 간섭 물질이 존재하지 않은 혈액에서 글루코스 농도를 측정한 경우 대비 글루코스의 측정 오차가 낮을 수 있다.
상기 간섭 물질에 의한 분석 물질의 측정 오차는 Zouhour Hsine, Saber Blili, Rym Milka, Helene Dorizon, Ayoub Haj Said, Hafsa Korri-Youssoufi. Sensor based on redox conjugated poly(para-phenylene) for the simultaneous detection of dopamine, ascorbic acid, and uric acid in human serum sample. 27 April 2020 또는 Morteza Bahram, Khalil Farhadi, Farzin Arjmand. Voltammetric determination of dopamine in the presence of ascorbic and uric acids using partial least squares regression: determination of dopamine in human urine and plasma. 12 February 2009을 참고하여 측정되었다.
일 구체예에서, 본 발명의 산화 환원 반응 시약용 조성물은 온도 및/또는 습도 변화에 따른 산화 환원 반응의 성능 변화가 적어 분석 물질의 분석 신뢰성을 높일 수 있다. 이와 관련하여, 상기 조성물 또는 상기 조성물로 형성된 코팅층을 구비하는 센서는 20℃에서 50℃로 온도가 변화되거나 상대습도 20% 내지 30%에서 80% 내지 90%로 상대습도가 변화되더라도 혈액 중 글루코스의 측정 오차가 낮을 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 산화 환원 반응 시약용 조성물은 장기간 보관 한 후에도 산화 환원 반응의 성능 변화가 적어 분석 물질의 분석 신뢰성을 높일 수 있다. 이와 관련하여, 상기 조성물 또는 상기 조성물로 형성된 코팅층을 구비하는 바이오센서는 20℃ 내지 50℃ 및 상대습도 30% 내지 80%에서 5일 내지 10일, 바람직하게는 7일 보관한 후에도 혈액 내 글루코스의 측정 오차가 낮을 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 산화 환원 반응 시약용 조성물은 분석 물질의 광범위한 농도 범위에서도 분석 물질의 분석 신뢰성이 우수할 수 있다. 이와 관련하여, 혈액 중 글루코스의 농도가 0mg/L내지 600mg/dL으로 범위가 넓어도 글루코스의 분석 신뢰성이 높을 수 있다. 본 명세서에서 "분석 신뢰성"은 분석 물질 예를 들면 글루코스를 측정하였을 때 검출 한계가 18.016mg/dL 이하, RSD ±5% 이하인 경우를 의미한다.
일 구체예에서, 본 발명의 산화 환원 반응 시약용 조성물은 대량 생산이 가능하여 경제적이고 공정성이 우수할 수 있다. 이와 관련하여, 하기 상술되는 화학식 2의 화합물은 하기 상술되는 제조 방법에 의해 고순도 및 고수율로 제조될 수 있어, 경제성과 공정성 모두 우수할 수 있다.
본 명세서에서 "분석 물질"은 분석하고자 하는 시료 내 관심 있는 물질을 의미하며, 예를 들면 글루코스, 콜레스테롤, 아미노산 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 분석 물질은 글루코스가 될 수 있다.
본 명세서에서 "시료"는 분석 물질을 함유하는 액상 또는 고상을 포함할 수 있다. 예를 들면, 시료는 혈액, 간질액, 소변 또는 침일 수 있다.
본 명세서에서 "전자 전달 매개체"는 분석 물질과의 반응에 의해 형성되는 비활성 효소로부터 산화 환원 효소를 재생시키는 능력을 갖는 화학적 화합물을 지칭한다.
본 명세서에서 "산화 환원 효소"는 전자 전달 매개체와 산화 환원 반응을 매개할 수 있는 효소라면 특별히 제한되지 않지만, 글루코스 탈수소효소, 글루코스 산화효소, 락테이트 산화효소, 콜레스테롤 산화효소, 알코올 산화 환원 효소 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 산화 환원 효소는 글루코스 탈수소효소(GDH)가 될 수 있다.
본 명세서에서 "바이오센서"는 적어도 하나의 분석물의 전기 화학적 검출에 적합한 전극 및 시약을 포함하는 부분을 포함하는 조립체를 의미할 수 있다. 바람직하게는, 바이오센서는 일회 사용 또는 다회 사용을 위해 고안되는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "페리시아나이드"는 Fe와 CN을 포함하는 음이온을 의미할 수 있다. 바람직하게는, 페리사아나이드는 [Fe(CN)6)]3-를 의미할 수 있다.
이하, 본 발명 일 실시예에 따른 산화 환원 반응용 시약 조성물은 산화 환원 효소 및 전자 전달 매개체로서 페리시아나이드 염을 포함하고, 상기 페리시아나이드 염은 페리시아나이드 및 양으로 하전된 상대 이온으로 구성되고, 상기 양으로 하전된 상대 이온은 하기 화학식 1의 화합물로부터 유래된다:
[화학식 1]
(X1)(X2)N-A-Y
(상기 화학식 1에서,
X1, X2는 각각 독립적으로, 수소 또는 탄소수 1 내지 10의 알킬기,
A는 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기, 탄소수 1 내지 10의 알킬렌옥시기 또는 탄소수 1 내지 탄소수 10의 아미노알킬렌기,
Y는 수산기(-OH), 아민기(-NH2), 2차 아민기 또는 3차 아민기이다).
상기 화학식 1에서, 2차 아민기는 *-NHR1이고, 3차 아민기는 *-NR1R2 이다(여기에서, *은 원소의 연결 부위, R1, R2는 각각 독립적으로, 탄소수 1 내지 10의 알킬기이다). 바람직하게는, R1, R2는 각각 독립적으로, 탄소수 1 내지 3의 알킬기일 수 있다.
상기 화학식 1에서, '탄소수 1 내지 탄소수 10의 아미노알킬렌기'는 -*R3-N(R4)-R5-*이다(*은 원소의 연결 부위, R3, R5는 각각 독립적으로, 단일 결합, 탄소수 1 내지 탄소수 10의 알킬렌기, R4는 수소 또는 탄소수 1 내지 탄소수 10의 알킬기이고, R3, R4 및 R5에 포함된 탄소의 전체 개수는 1 내지 10인 작용기를 의미한다).
상기 화학식 1에서, '탄소수 1 내지 10의 알킬렌옥시기'는 -*R6-O-R7-*이다(*은 원소의 연결 부위, R6, R7는 각각 독립적으로, 탄소수 1 내지 탄소수 10의 알킬렌기이고, R6, R7에 포함된 탄소의 전체 개수는 1 내지 10인 작용기를 의미한다).
화학식 1의 화합물은 양으로 하전되는 (X1)(X2)N- 부분과 산소(O) 또는 질소(N) 원자를 구비하는 Y 부분을 동시에 갖는 구조를 갖는다. 상기 구조는 상술된 본원 발명의 모든 효과를 제공하는데 용이할 수 있다. 본 발명자는 전자 전달 매개체에 종래 양으로 하전되는 (X1)(X2)N- 부분에 추가로 산소(O) 또는 질소(N) 원자를 구비하는 Y 부분을 추가로 구비함으로써 상술 본원 발명의 모든 효과를 제공하는데 용이하였음을 발견하였다.
바람직하게는, X1, X2는 각각 독립적으로, 수소 또는 탄소수 1 내지 3의 알킬기, 가장 바람직하게는 메틸기일 수 있다. 바람직하게는, A는 탄소수 1 내지 3의 알킬렌기, 탄소수 1 내지 5의 알킬렌옥시기 또는 탄소수 1 내지 5의 아미노알킬렌기일 수 있다.
일 구체예에서, 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 1-1 내지 화학식 1-10 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
[화학식 1-1](1,5-비스(메틸아미노)-3-옥사펜탄)
(CH3)NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH(CH3)
[화학식 1-2](에탄올아민)
NH2-CH2-CH2-OH
[화학식 1-3](N,N,N',N'-테트라메틸-1,4-디아미노부탄)
(CH3)2N-CH2-CH2-CH2-CH2-N(CH3)2
[화학식 1-4](비스[2-(N,N-디메틸아미노)에틸] 에테르)
(CH3)2N-CH2-CH2-O-CH2-CH2-N(CH3)2
[화학식 1-5]((2-히드록시에틸)디메틸아민)
(CH3)2N-CH2-CH2-OH
[화학식 1-6](디에틸렌트리아민)
NH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH2
[화학식 1-7](1,1-디메틸에틸렌디아민)
(CH3)2N-CH2-CH2-NH2
[화학식 1-8](에틸렌디아민)
NH2-CH2-CH2-NH2
[화학식 1-9](2,2'-옥시비스(에틸아민))
NH2-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH2
[화학식 1-10](테트라메틸에틸렌디아민)
(CH3)2N-CH2-CH2-N(CH3)2
바람직하게는, 화학식 1의 화합물은 화학식 1-1 내지 1-10 중 1종 이상을 포함할 수 있고, 더 바람직하게는 화학식 1-1, 화학식 1-3중 1종 이상을 포함할 수 있다.
화학식 1의 화합물은 당업자에게 알려진 통상의 방법으로 제조되거나 상업적으로 판매되는 제품을 구입하여 사용될 수 있다.
양으로 하전된 상대 이온은 (X1)(X2)N-A-Y 에서 (X1)(X2)N- 부분 중 질소 원자(N)에 수소 또는 탄소수 1 내지 10의 알킬기 바람직하게는 탄소수 1 내지 5의 알킬기 더 바람직하게는 메틸기의 결합에 의해 1가 양이온이 될 수 있다.
양으로 하전된 상대 이온은 (X1)(X2)N-A-Y 에서 (X1)(X2)N- 부분 중 질소 원자(N)에 수소 또는 탄소수 1 내지 10의 알킬기 바람직하게는 탄소수 1 내지 5의 알킬기 더 바람직하게는 메틸기의 결합; 및 -A-, -Y- 중 1종 이상에 포함된 산소 원자 또는 질소 원자에 수소 또는 탄소수 1 내지 10의 알킬기 바람직하게는 탄소수 1 내지 5의 알킬기 더 바람직하게는 메틸기의 결합에 의해 2가 양이온 또는 3가 양이온이 될 수 있다.
양으로 하전된 상대 이온은 페리사아나이드염에 1개 내지 3개 포함될 수 있다. 이것은 화학식 1의 화합물이 형성할 수 있는 양이온 하전 수에 따라 달라질 수 있다.
일 구체예에서, 페리시아나이드 염은 하기 화학식 2로 표시될 수 있다:
[화학식 2]
(Bm+)n[Fe(CN)6]
(상기 화학식 2에서,
Bm+은 상기 화학식 1로부터 유래되는 m가 양이온이고
m은 1 내지 3의 정수,
n은 1 내지 3의 정수,
m과 n의 곱은 3 또는 2).
화학식 2의 화합물은 간섭 물질에 의한 분석물의 검출 한계를 최소화하였고, 온도 및/또는 습도 변화에 따른 산화 환원 반응의 성능 변화가 적으며, 장기간 보관 한 후에도 산화 환원 반응의 성능 변화가 적어 분석물의 분석 신뢰성을 높였다. 또한, 화학식 2의 화합물은 분석물의 광범위한 농도 범위에서도 분석물의 분석 신뢰성이 우수하였다. 이와 관련해서는 하기 실험예에서 보여질 수 있다. 또한, 화학식 2의 화합물은 하기 상술되는 바와 같이 손쉽게 제조되고 구입될 수 있는 (K+)3[Fe(CN)6]으로부터 쉽게 제조되며 고형의 분말로서 대량 생산이 가능하여 경제적이고 공정성이 우수하였다. 결국, 화학식 2의 화합물은 분석물의 분석 신뢰성, 경제성 및 공정성을 모두 개선하였다.
화학식 2의 페리시아나이드 염은 글루코스 탈수소효소에 의해 글루코스가 글루콘산으로 산화되며 상기 산화 반응과 동시에 NAD+, FAD 또는 PQQ 등이 각각 NADH, FADH2 또는 PQQH2로 환원되며, 환원된 NADH, FADH 또는 PQQH 등이 다시 NAD+, FAD 또는 PQQ로 산화되며, 상기 산화 반응과 동시에 Fe 양이온이 환원됨으로써 전자를 방출하고, 방출된 전자에 의하여 글루코스 농도를 측정하도록 할 수 있다.
예를 들면, 페리사아나이드 염은 하기 화학식 2-1 내지 화학식 2-10 중 1종 이상을 포함할 수 있다:
[화학식 2-1]
[화학식 2-2]
[화학식 2-3]
[화학식 2-4]
[화학식 2-5]
[화학식 2-6]
[화학식 2-7]
[화학식 2-8]
[화학식 2-9]
[화학식 2-10]
페리시아나이드 염은 하기 상술되는 방법에 의해 제조될 수 있다. 그러나, 하기 상술되는 각각의 단계 내에서 당업자가 통상적으로 허용되는 범위 내에서 변형 등을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 페리시아나이드 염의 제조 방법은 (K+)3[Fe(CN)6]을 양이온 교환시켜 (H+)3[Fe(CN)6] 또는 (Na+)3[Fe(CN)6]을 제조하고(단계 1), 제조된 (H+)3[Fe(CN)6] 또는 (Na+)3[Fe(CN)6] 함유 용액에 상기 화학식 1의 화합물을 첨가하여 화학식 2의 페리사아나이드 염을 제조하는 단계(단계 2)를 포함할 수 있다. 이하, 각 단계를 보다 상세하게 설명한다.
[단계 1]
(K+)3[Fe(CN)6]에서 K+ 이온을 양이온 교환시켜 (H+)3[Fe(CN)6] 또는 (Na+)3[Fe(CN)6]을 제조한다.
K+이온을 H+이온 또는 Na+ 이온으로 양이온 교환시키는 방법은 당업자에게 알려진 통상의 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들면 소정의 반응 용기 예를 들면 컬럼 내에 H+이온 또는 Na+ 이온을 갖는 양이온 교환 수지 비즈를 채운 다음, (K+)3[Fe(CN)6]을 투입하고 용리시켜 수행될 수 있다.
양이온 교환 수지 비즈는 스티렌-디비닐 벤젠폴리머로 형성되고 술폰산기를 표면에 갖는 비즈, 스티렌-디비닐 벤젠 폴리머로 형성되고 술폰산-Na+를 표면에 갖는 비즈, 폴리아크릴레이트-디비닐벤젠 폴리머로 형성되고 카르복시산기를 표면에 갖는 비즈 등을 포함할 수 있다. 양이온 교환 수지 비즈는 반응성 및 양이온 교환성을 높이기 위하여 다공성 타입으로 된 것을 사용함으로써 반응을 위한 표면적을 넓힐 수 있다. 양이온 교환 수지 비즈는 반응성 및 양이온 교환성을 높이기 위하여 초순수 또는 1M 내지 3M 농도의 강산 예를 들면 염산 용액으로 3시간 내지 5시간 동안 세척한 다음 상기 반응 용기에 투입될 수 있다.
반응 용기 내에 양이온 교환 수지 비즈가 채워진 다음, (K+)3[Fe(CN)6]이 상기 반응 용기 내에 투입된다. (K+)3[Fe(CN)6]은 소정의 용매 예를 들면 초순수에 용해시킨 용액 상태로 상기 반응 용기 내에 투입될 수 있다. 이를 통해 (K+)3[Fe(CN)6]의 반응 용기 내에서 이동을 용이하게 할 수 있다. 상기 용액은 농도 10mg/ml 내지 100mg/ml가 될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 용액을 상기 반응 용기 내로 투입한 다음 용리시킴으로써 (K+)3[Fe(CN)6]에서 K+ 이온이 양이온 교환되어 (H+)3[Fe(CN)6] 또는 (Na+)3[Fe(CN)6]을 제조한다. 상기 용리 단계는 반복적으로 수행될 수 있다. 즉, 상기 반응 용기 내로 투입된 다음 용리되어 최종적으로 나온 용액을 다시 상기 반응 용기 내로 투입하는 과정을 반복함으로써 (K+)3[Fe(CN)6]으로부터 (H+)3[Fe(CN)6] 또는 (Na+)3[Fe(CN)6]의 제조 수율을 높일 수 있다.
[단계 2]
제조된 (H+)3[Fe(CN)6] 또는 (Na+)3[Fe(CN)6] 함유 용액에 상기 화학식 1의 화합물 또는 상기 화학식 1의 화합물의 수산화물을 첨가하여 화학식 2의 페리사아나이드 염을 제조한다.
상술 단계 2를 수행하기 전에 단계 1로부터 얻은 (H+)3[Fe(CN)6] 또는 (Na+)3[Fe(CN)6] 함유 용액의 pH를 측정하는 단계를 수행할 수 있다. 상기 pH를 측정함으로써, 단계 2에서 투입되는 상기 화학식 1의 화합물 또는 상기 화학식 1의 화합물의 수산화물 함유 용액의 투입량, 반응 시간 등을 결정할 수 있다.
일 구체예에서, 단계 1로부터 얻은 (H+)3[Fe(CN)6] 또는 (Na+)3[Fe(CN)6] 함유 용액의 pH는 2 내지 4인 것이 바람직하다. 상기 범위에서, 단계 2에서 투입되는 상기 화학식 1의 화합물 또는 상기 화학식 1의 화합물의 수산화물 함유 용액 투입시 화학식 2의 화합물 제조 수율이 높아질 수 있다. 단계 1로부터 얻은 (H+)3[Fe(CN)6] 또는 (Na+)3[Fe(CN)6] 함유 용액의 pH가 상술 범위를 만족하지 못하는 경우 당업자에게 알려진 유기산, 무기산, 유기 염기 또는 무기 염기를 투입하여 pH를 상술 범위로 조정할 수 있다.
얻은 (H+)3[Fe(CN)6] 또는 (Na+)3[Fe(CN)6] 함유 용액에 상기 화학식 1의 화합물 또는 상기 화학식 1의 화합물의 수산화물 함유 용액이 투입되고, 얻은 용액의 pH를 6.5 내지 7이 되도록 조절함으로써 상기 화학식 2의 화합물을 제조할 수 있다.
pH를 6.5 내지 7로 조절하는 것은 당업자에게 알려진 통상의 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 용액에 무기산, 유기산, 무기 염기 또는 유기 염기를 추가로 투입하면서 pH 미터로 측정하여 수행될 수 있다. 무기산은 염산, 황산, 질산 등을 포함할 수 있고, 유기산은 아세트산, 젖산 등을 포함할 수 있다. 무기 염기는 암모니아수 등을 포함할 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물 또는 상기 화학식 1의 화합물의 수산화물 함유 용액이 투입된 후, 얻은 용액은 25℃ 에서 1시간 내지 10시간 동안 교반 됨으로써 상술 반응이 더 잘 수행될 수 있다.
[단계 3]
본 발명의 제조 방법은 상기 단계 2에서 얻은 화학식 2의 화합물을 포함하는 용액은 소정의 정제 용매를 사용함으로써 정제되어 순도를 높이는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 정제 용매는 디에틸 에테르, 디메틸 에테르 등을 포함하는 에테르계 용매, 아세톤, 메틸에틸케톤, 디이소부틸케톤 등을 포함하는 케톤계 용매, 에틸 아세테이트 등을 포함하는 에스테르계 용매, 디메틸포름아미드, 테트라히드로푸란 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 정제 용매는 디에틸 에테르를 포함하는 에테르계 용매를 포함할 수 있다.
상기 정제는 재결정을 포함할 수 있다. 재결정은 화학식 2의 화합물의 순도를 높이면서 수율을 높일 수 있다. 재결정은 당업자에게 알려진 통상의 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 재결정은 상기 단계 2에서 얻은 화학식 2의 화합물을 포함하는 용액에 정제 용매를 투입한 다음 교반시키고 화학식 2의 화합물을 침전시키는 단계를 포함하고, 상술 단계는 반복적으로 수행될 수 있다.
산화 환원 반응용 시약 조성물은 페리시아나이드 염을 5mM 내지 40mM, 바람직하게는 5mM 내지 20mM, 더 바람직하게는 10mM 내지 20mM 로 포함할 수 있다. 상기 범위에서, 측정 가능한 포도당 농도 범위를 바람직한 농도 범위로 제공하고 대칭적인 산화 환원 반응 효과가 있을 수 있다.
산화 환원 반응용 시약 조성물은 산화 환원 효소를 254 unit/mL 내지 1012 unit/mL, 바람직하게는 450 unit/mL 내지 1012 unit/mL, 더 바람직하게는 450 unit/mL 내지 506 unit/mL 로 포함할 수 있다. 상기 범위에서, 측정 가능한 포도당의 바람직한 농도 범위 제공하고, 단백질 효소에 의한 신호 감소를 최소한으로 줄일 수 있는 효과가 있을 수 있다.
산화 환원 반응용 시약 조성물은 산화 환원 효소 : 페리시아나이드 염을 부피비 1:0.5 내지 1:2, 구체적으로 1:1 내지 1:2, 더 구체적으로 1:1로 포함할 수 있다. 상기 범위에서, 본 발명의 효과 구현이 용이할 수 있다.
산화 환원 반응용 시약 조성물은 수성 용매를 더 포함할 수 있다. 수성 용매는 초순수, 증류수 등을 포함할 수 있다. 수성 용매는 산화 환원 반응용 시약 조성물 중 잔량으로 포함될 수 있다.
산화 환원 반응용 시약 조성물은 가교제(crosslinker), 계면 활성제, 수용성 고분자, 완충제, 습윤제, 지방산, 4차 암모늄염, 효소 안정제 중 적어도 1종을 더 포함할 수 있다.
가교제는 산화 환원 반응용 시약 조성물을 센서 내 기판에 도포하여 코팅층을 형성할 때 기판에 대한 코팅층의 부착을 높일 수 있다. 가교제는 폴리(에틸렌글리콜) 디글리시딜에테르 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
계면 활성제는 산화 환원 효소가 전극에 고착하는 것을 유의하게 억제·방지하고, 그 결과 전극 근방에서의 산화 환원 효소에 의한 산화형 전자 전달체의 환원형 전자 전달체로의 변환 효율을 향상시킬 수 있어, 분석 시료 중의 기질 농도와의 상관성을 높게 할 수 있다. 계면 활성제의 양 및 형태는 산화 환원 효소 상에서 변성 효과를 피하기 위해 선택적으로 조절할 수 있다.
계면 활성제는 산화 환원 효소 활성을 저하시키지 않는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 비이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제, 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 천연형 계면활성제 등을 적절히 선택하여 사용할 수는 있다. 이들은 단독으로 이용해도 되고 혼합물의 형태로 이용해도 된다. 바람직한 계면 활성제는 폴리옥시에틸렌 에테르이다. 보다 바람직하게는, t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올이며 상표명 Triton X-100으로 구입할 수 있다.
수용성 고분자는 산화 환원 반응용 시약 조성물의 고분자 지지체로서 효소의 안정화 및 분산을 도울 수 있다. 상기 수용성 고분자는 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리플루오로설포네이트, 하이드록시에틸 셀룰로오즈, 하이드록시프로필 셀룰로오즈, 카르복시메틸 셀룰로오즈, 셀룰로오즈 아세테이트, 폴리아미드 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 수용성 고분자는 폴리비닐피롤리돈을 포함할 수 있다.
본 발명의 바이오센서는 본 발명의 산화 환원 반응 시약용 조성물로 형성된 코팅층을 포함한다.
이하, 도 1을 참조하여, 본 발명 일 실시예에 따른 바이오센서를 설명한다.
도 1을 참조하면, 바이오센서는 하부 기판(100), 스페이서(200), 상부 기판(300)을 포함하고, 하부 기판(100)은 본 발명의 산화 환원 반응 시약용 조성물로 형성된 코팅층(도 1에서 도시되지 않음)을 포함할 수 있다.
하부 기판(100)은 적어도 하나 이상의 전극(21, 22, 23)을 상부면에 구비하고 본 발명의 시약 조성물을 상기 전극 위에 도포하여 형성되는 코팅층(도 1에서 도시되지 않음)을 포함하는 절연성 기판이다. 하부 기판(100)은 절연성 물질로 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리이미드, 아크릴 수지, 폴리에스테르, 폴리비닐클로라이드 또는 폴리카보네이트로 구성된 얇은 판이 사용될 수 있다. 하부 기판(100)은 50㎛ 내지 400㎛, 보다 바람직하게는 100㎛ 내지 300㎛의 두께를 가질 수 있다.
하부 기판(100)의 상부면에는 측정 장치(도1에서 도시되지 않음)에 접촉되는 리드선(24, 25, 26)과, 리드선에 연결되며 흡입된 시료에 흐르는 전기 신호를 검출하는 전극(21, 22, 23)이 인쇄된 전극계(20)가 형성되어 있다. 여기서 전극은 작동 전극(23), 기준 전극(22) 및 확인 전극(21)으로 구성될 수 있다. 상기 리드선(24, 25, 26)은 일반적인 스크린 프린트와 같은 방법으로 형성할 수 있다. 또한 상기 전극(21, 22, 23)은 전도성 카본 잉크(탄소 반죽)를 사용하여 스크린 프린트 방법으로 형성할 수 있다.
전극(21, 22, 23)은 전도성 고분자, 전도성 카본 잉크(탄소 반죽). 탄소, ITO입자, 금속 입자, 흑연, 백금 처리된 탄소, 은, 금, 팔라듐 또는 백금 성분 등을 이용하여 제작될 수 있다. 예를 들면, 탄소나 백금 처리된 탄소로 구성된 잉크, 또는 팔라듐을 포함하는 잉크를 사용하여 하부 기판(100)에 전극(21, 22, 23)을 인쇄할 수 있다. 또는, 금을 이용한 진공 증착에 의해 하부 기판(100)에 전극(21, 22, 23)을 형성할 수도 있다.
전극(21, 22, 23) 상호간의 절연을 위해 전극(21, 22, 23) 각각의 상부면 즉 분석 물질이 흡입되는 부분을 제외한 나머지 부분에는 절연체(절연 반죽)를 부분적으로 도포함으로써 절연층이 형성될 수 있다. 상기 절연체는 비전도성 스크린 프린팅 잉크 또는 절연용 잉크를 사용할 수 있다.
여기서, 상기와 같이 부분적으로 절연체를 인쇄하고 남은 부분 중 노출된 전극(21, 22, 23)의 상부면에 본 발명의 산환 환원 반응용 시약 조성물이 도포되어 형성된 코팅층이 형성되어 있다. 상기 시약 조성물은 전극(21, 22, 23)을 충분히 덮도록 전극 위에 도포되어 고정될 수 있다. 또한, 상기 시약 조성물의 코팅층은 전극(21, 22, 23) 모두에 형성되거나, 전극(21, 22, 23) 중 적어도 하나에 형성되거나, 작동 전극(23)에만 형성될 수도 있다.
스페이서(200)는 하부 기판(100) 상에 소정의 높이로 형성되어 하부 기판(100)과 상부 기판(300)을 접착시킬 수 있다.
스페이서(200)는 분석 물질 시료가 하부 기판(100)의 전극(21, 22, 23)까지 흡입 및 유도되도록 전극(21, 22, 23)과 대향되는 일 측면에 시료 주입부(30)를 더 구비할 수 있다. 스페이서(200)는 상부 기판(300)과 하부 기판(100)을 접착하여 형성되는 시료 주입부(30)를 통해 모세관을 형성할 수 있다. 이를 통해 분석 물질 시료가 빠르게 흡수될 수 있다. 스페이서(200)는 양면 테이프로 구성될 수 있다. 시료 주입부(30)를 통해 측정하고자 하는 시료가 모세관 현상으로 자동 주입되며, 시료 주입부(30)에 존재하던 공기는 시료의 유입으로 인해 상부 기판(300)에 형성된 공기 배출부(40)를 통해 외부로 배출될 수 있다.
상부 기판(300)은 하부 기판(100)과 마주보며 스페이서(200) 상에 구비되고, 시료 주입부(30)를 통해 분석 물질 시료와 함께 흡입되는 공기를 배출하는 공기 배출부(40)를 더 포함하는 절연성 기판(300)일 수 있다.
공기 배출부(40)는 시료의 흡입 속도를 높이기 위하여 시료 주입부(30)와 별개의 다른 층에 터널 형태로 형성될 수 있으며, 특히 공기 배출부(40)는 시료의 흡입 방향과 수직한 방향으로 형성된 반원통형의 형상인 것이 바람직할 수 있다.
시료 주입부(30)를 통해 분석 물질 시료가 주입되면, 시료 내에 포함된 분석물과 산화 환원 효소가 반응하여 분석물이 산화되고, 이에 따라 전자수용체가 환원된다. 효소 반응 종료 후 이 환원된 전자수용체를 전기화학적으로 산화하여 얻어지는 산화 전류를 상기 전극(21, 22, 23)과 연결된 리드선(24, 25, 26)에 접촉되는 측정 장치(도 1에서 도시되지 않음)를 통해 측정함으로써 시료 중에 포함된 분석 물질의 농도를 구할 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로 제시된 것이며 어떠한 의미로도 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1: 화학식 2-1의 화합물의 합성 및 측정
(1)화학식 2-1의 화합물의 합성
표면에 술폰산기를 갖는 스티렌-디비닐벤젠 비드(TRILITE MC-10H, Samyang TRILITE, 다공성 타입, 강산성 비드)를 초순수 또는 1M 농도의 HCl 용액으로 3시간 동안 세척한 후 컬럼 내에 충진시켰다. (K+)3[Fe(CN)6)]을 초순수에 용해시켜 농도 50mg/ml의 용액 50ml를 제조하고, 제조한 용액을 상기 비드가 충진된 컬럼 내에 투입하여 흘려주었다. 상기 컬럼으로부터 나온 용리액을 다시 상기 컬럼 내에 흘려주고 받는 과정을 반복하였다. 이를 통해 (K+)3[Fe(CN)6)]가 (H+)3[Fe(CN)6)]로 양이온 교환되었다.
상기 컬럼으로부터 얻은 최종 용액에서 pH 미터기를 이용하여 pH를 측정하였으며, 그 결과 pH는 1내지 2었다. 그런 다음, 1,5-비스(메틸아미노)-3-옥사펜탄 30.12mg을 투입하고 pH를 6.5 내지 7로 맞춘 다음 교반하여, 화학식 2-1을 함유하는 용액을 제조하였다.
그런 다음, 화학식 2-1을 함유하는 용액에 과량의 다이에틸 에테르를 첨가하여 화학식 2-1을 재결정시키고 다이에틸 에테르를 제거한 다음 에탄올로 용해시키고 다시 과량의 다이에틸 에테르를 첨가하는 재결정을 반복하였다. 그런 다음 필터로 여과시키고 건조시켜 화학식 2-1을 제조하였다.
(2) 전위 측정
상기 제조된 화학식 2-1 10mM, 글루코스 탈수소 효소 450 unit/mL을 사용하고, 가교제로 PEGDGE(poly(ethylene glycol)diglycidyl ether 10 mg/mL 을 사용하고 화학식 2-1, 글루코스 탈수소 효소, 가교제를 4 : 4 : 1 (v/v)의 Mixing용액으로 평가하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2는 바이오센서의 글루코스의 농도에 따른 순환전압전류 곡선 및 글루코스 산화 촉매 전류를 나타내는 그래프이다.
화학식 2-1화합물 합성을 확인한 Cyclic voltammetry 결과이다. 이 때 Redox potential은 -0.001V, Oxidation potential은 0.077V, Reduction potential은 -0.078V를 확인했다. 바이오센서를 제작 후 글루코스 농도별 Cyclic voltammetry 신호를 측정하여 글루코스 농도가 0mg/dL부터 600mg/dL까지 감응하는 것을 확인했으며, 이에 따라 전류 밀도가 증가함으로써 글루코스 산화 촉매 전류는 선형으로 증가하는 것으로 나타났다. 순환전압전류법에서 산화환원반응이 일어나는 0.2V, 0.3V, 0.4V 에 대하여 글루코스의 농도에 따른 시간-전류 곡선 및 글루코스 산화 촉매 전류를 측정하여 글루코스 산화 촉매 전류가 선형적으로 증가하는 것으로 나타났다.
실시예 2: 화학식 2-3의 화합물의 합성 및 측정
실시예 1에서, 1,5-비스(메틸아미노)-3-옥사펜탄 대신에 N,N,N',N'-테트라메틸-1,4-디아미노부탄을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 화학식 2-3의 화합물을 제조하였다. 제조한 화학식 2-3의 화합물을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 전위 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 바이오센서의 글루코스의 농도에 따른 순환전압전류 곡선 및 글루코스 산화 촉매 전류를 나타내는 그래프이다.
화학식 2-3 화합물 합성을 확인한 Cyclic voltammetry 결과이다. 이 때 Redox potential은 -0.069V, Oxidation potential은 0.018 V, Reduction potential은 -0.156V를 확인했다. 본 발명의 신규 양이온 교환 물질을 포함하는 포도당 센서를 제작 후 포도당 농도별 Cyclic voltammetry 신호를 측정하여 포도당 농도가 0mg/dL부터 600mg/dL까지 감응하는 것을 확인했으며, 이에 따라 전류밀도가 증가함으로써 글루코스 산화 촉매 전류는 선형으로 증가하는 것으로 나타났다. 순환전압전류법에서 산화환원반응이 일어나는 0.2V, 0.3V, 0.4V 에 대하여 글루코스의 농도에 따른 시간-전류 곡선 및 글루코스 산화 촉매 전류를 측정하여 글루코스 산화 촉매 전류가 선형적으로 증가하는 것으로 나타났다.
실시예 3: 화학식 2-2의 화합물의 제조
실시예 1에서 1,5-비스(메틸아미노)-3-옥사펜탄 대신에 에탄올아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법을 실시하여 화학식 2-2의 화합물을 제조하였다.
실시예 4: 화학식 2-4의 화합물의 제조
실시예 1에서 1,5-비스(메틸아미노)-3-옥사펜탄 대신에 비스[2-(N,N-디메틸아미노)에틸] 에테르를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법을 실시하여 화학식 2-4의 화합물을 제조하였다.
실시예 5: 화학식 2-5의 화합물의 제조
실시예 1에서 1,5-비스(메틸아미노)-3-옥사펜탄 대신에 (2-히드록시에틸)디메틸아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법을 실시하여 화학식 2-5의 화합물을 제조하였다.
실시예 6: 화학식 2-6의 화합물의 제조
실시예 1에서 1,5-비스(메틸아미노)-3-옥사펜탄 대신에 디에틸렌트리아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법을 실시하여 화학식 2-6의 화합물을 제조하였다.
실시예 7: 화학식 2-7의 화합물의 제조
실시예 1에서 1,5-비스(메틸아미노)-3-옥사펜탄 대신에 1,1-디메틸에틸렌디아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법을 실시하여 화학식 2-7의 화합물을 제조하였다.
실시예 8: 화학식 2-8의 화합물의 제조
실시예 1에서 1,5-비스(메틸아미노)-3-옥사펜탄 대신에 에틸렌디아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법을 실시하여 화학식 2-8의 화합물을 제조하였다.
실시예 9: 화학식 2-9의 화합물의 제조
실시예 1에서 1,5-비스(메틸아미노)-3-옥사펜탄 대신에 2,2'-옥시비스(에틸아민)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법을 실시하여 화학식 2-9의 화합물을 제조하였다.
실시예 10: 화학식 2-10의 화합물의 제조
실시예 1에서 1,5-비스(메틸아미노)-3-옥사펜탄 대신에 테트라메틸에틸렌디아민을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법을 실시하여 화학식 2-10의 화합물을 제조하였다.
본 명세서에서 보여지지 않았지만, 화학식 2-2, 화학식 2-4 내지 화학식 2-10의 화합물은 본 발명의 효과를 구현할 수 있다.
비교예 1: (K
+
)
3
[Fe(CN)
6
)]으로 측정
실시예 1에서 화학식 2-1 화합물 대신에 (K+)3[Fe(CN)6)]을 동일 함량으로 사용하여 제조된 조성물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4는 바이오센서의 글루코스의 농도에 따른 순환전압전류 곡선 및 글루코스 산화 촉매 전류를 나타내는 그래프이다.
(K+)3[Fe(CN)6)]화합물 합성을 확인한 Cyclic voltammetry 결과이다. 이 때 Redox potential은 -0.089V, Oxidation potential은 -0.012 V, Reduction potential은 -0.166V를 확인했다. 본 발명의 신규 양이온 교환 물질을 포함하는 포도당 센서를 제작 후 포도당 농도별 Cyclic voltammetry 신호를 측정하여 포도당 농도가 0mg/dL부터 600mg/dL까지 감응하는 것을 확인했으며, 이에 따라 전류밀도가 증가함으로써 글루코스 산화 촉매 전류는 선형으로 증가하는 것으로 나타났다. 순환전압전류법에서 산화환원반응이 일어나는 0.3V, 0.4V 에 대하여 글루코스의 농도에 따른 시간-전류 곡선 및 글루코스 산화 촉매 전류를 측정하여 글루코스 산화 촉매 전류가 선형적으로 증가하는 것으로 나타났다.
도 2, 도 3, 도 4에서 보여지는 바와 같이, (K+)3[Fe(CN)6)]은 신규 양이온 전자 전달 매개체인 본 발명의 화합물에 비해 낮은 전위인 0.2V에서 포도당 농도에 따른 산화 촉매 전류의 선형적 증가가 나타나지 않는다는 면에서 좋지 않았다.
비교예 2: [(CH
3
)
4
N
+
]
3
[Fe(CN)
6
)]으로 측정
실시예 1에서 화학식 2-1 화합물 대신에 [(CH3)4N+]3[Fe(CN)6)]을 동일 함량으로 사용하여 제조된 조성물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 바이오센서의 글루코스의 농도에 따른 순환전압전류 곡선 및 글루코스 산화 촉매 전류를 나타내는 그래프이다. [(CH3)4N+]3[Fe(CN)6)] 합성을 확인한 Cyclic voltammetry 결과이다. 이 때 Redox potential은 -0.113V, Oxidation potential은0.064V, Reduction potential은 -0.290V를 확인했다. 본 발명의 신규 양이온 교환 물질을 포함하는 포도당 센서를 제작 후 포도당 농도별 Cyclic voltammetry 신호를 측정하여 포도당 농도가 0mg/d부터 600mg/dL까지 감응하는 것을 확인했으며, 이에 따라 전류 밀도가 증가함으로써 글루코스 산화 촉매 전류는 선형으로 증가하는 것으로 나타났다. 순환전압전류법에서 산화환원반응이 일어나는 0.3V, 0.4V 에 대하여 글루코스의 농도에 따른 시간-전류 곡선 및 글루코스 산화 촉매 전류를 측정하여 글루코스 산화 촉매전류가 선형적으로 증가하는 것으로 나타났다.
도 2, 도 3, 도 5에서 보여지는 바와 같이, [(CH3)4N+]3[Fe(CN)6)]은 실시예 1, 실시예 2인 본 발명의 신규 양이온 전자 전달 매개체에 비해 용해도가 낮으며 특히 낮은 전위인 0.2V에서 포도당 농도에 따른 산화 촉매 전류의 선형적 증가가 나타나지 않는다는 면에서 좋지 않았다.
실험예 1: 간섭 물질에 의한 영향 평가
실시예 1, 실시예 2에서 제조된 물질 각각 10mM, 글루코스 탈수소 효소 450unit/mL, 가교제로 PEGDGE(poly(ethylene glycol)diglycidyl ether) 10mg/mL을 사용하여 부피비 4 : 4 : 1로 제조한 혼합 용액으로 전극 제작한 뒤 각 인체에 존재하는 평균적인 양의 간섭 물질을 측정하는 방법으로 간섭 물질에 의한 영향을 평가하였다. 간섭 물질로서 아스코빅산, 요산, 도파민 각각에 대해 평가하였다.
그 결과를 각각 도 6(실시예 1), 도 7(실시예 2)에 나타내었다. 도 6, 도 7은 PBS 환경과 비교하였을 때 간섭 물질에 대한 신호 값의 차이가 크지 않아 0.2 V, 0.3 V에서 세 가지 간섭 물질에 대한 간섭 효과를 받지 않으며 글루코스 5.5mM농도에서 산화 촉매 전류를 검출할 수 있다는 효과가 있었다.
실험예 2: O
2
에 의한 영향 평가
실시예 1, 실시예 2에서 제조된 물질에 대해 각각 실험예 1과 동일한 방법으로 전극을 제작한 뒤 N2와 O2 가스를 이용하여 포화시킨 글루코스 용액을 사용하여 측정하는 방법으로 O2에 의한 영향을 평가하였다.
그 결과를 각각 도 8(실시예 1), 도 9(실시예 2)에 나타내었다. 도 8, 도 9에서 보여지는 바와 같이, 본 발명의 화합물은 GDH에 감응하며 산소에 대한 영향이 전혀 없음을 알 수 있다.
실험예 3: 경시 변화에 따른 평가
실시예 2, 비교예 2에서 제조된 물질에 대해 각각150mM 농도로 하여 15μL씩 일회용 플라스틱 UV 큐벳에 분주한다. 그 후 제습제가 담긴 통에 담아 밀봉하여 25℃ 데시게이터에서 약 2시간 건조한다. 각 일차에 맞게 데시게이터에서 제습제 통을 꺼내어 각각 40℃, 50℃로 설정된 오븐에서 가속화 실험을 진행하는 방법으로 경시 변화에 의한 영향을 평가하였다. 7일 동안 방치하기 전의 흡광도(A1) 및 7일 동안 방치한 후의 흡광도(A2)를 측정하고, 흡광도 변화율 [(A2-A1)/A1] x 100으로 계산하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
| 7일째의 흡광도 변화율 | ||
| @40℃ | @50℃ | |
| 실시예 2 | -1.14% | 2.82% |
| 비교예 2 | -4.49% | 2.76% |
상기 표 1에서 나타난 바와 같이, 비교예 2의 화합물은 40℃, 50℃에서 각각 7일 동안 방치하였을 때 흡광도 변화율이 각각 4.49%, 2.76%인데 비하여, 실시예 2의 화합물은 각각 1.14%, 2.82%로서 비교예 2의 화합물 대비 경시 변화에 따른 안정성이 우수하였다. 따라서, 본 발명의 화합물은 장기간 보관 한 후에도 산화 환원 반응의 성능 변화가 적어 분석물의 분석 신뢰성을 높일 수 있음을 확인할 수 있다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
Claims (9)
- 산화 환원 효소 및 페리시아나이드 염을 포함하고,
상기 페리시아나이드 염은 하기 화학식 2-1 내지 화학식 2-10 중 1종 이상을 포함하는 것인, 산화 환원 반응용 시약 조성물:
[화학식 2-1]
[화학식 2-2]
[화학식 2-3]
[화학식 2-4]
[화학식 2-5]
[화학식 2-6]
[화학식 2-7]
[화학식 2-8]
[화학식 2-9]
[화학식 2-10]
.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 산화 환원 효소는 글루코스 탈수소효소(GDH)를 포함하는 것인, 산화 환원 반응용 시약 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 산화 환원 반응용 시약 조성물은 가교제, 계면 활성제, 수용성 고분자, 완충제, 습윤제, 지방산, 4차 암모늄염, 효소 안정제 중 적어도 1종을 더 포함하는 것인, 산화 환원 반응용 시약 조성물.
- 제1항, 제5항, 제6항 중 어느 한 항의 산화 환원 반응용 시약 조성물로 형성된 코팅층을 포함하는 바이오센서.
- 제7항에 있어서, 상기 바이오센서는 순차적으로 적층된, 하부 기판, 스페이서 및 상부 기판을 포함하고, 상기 하부 기판은 상기 산화 환원 반응 시약용 조성물로 형성된 코팅층을 포함하는 것인, 바이오센서.
- 제7항에 있어서, 상기 바이오센서는 기판, 상기 기판의 상부면에 구비된 적어도 하나 이상의 전극을 포함하고, 상기 전극의 상부면에 형성된 상기 산화 환원 반응 시약용 조성물로 형성된 코팅층을 포함하는 것인, 바이오센서.
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