KR101694982B1 - 전기화학적 바이오센서 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 효소와 반응하며 산소 분압에 의한 영향이 없고, 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되는 오스뮴 착물을 포함하는 전자전달 매개체, 상기 오스뮴 착물을 포함하는 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응시약, 및 전기화학적 바이오센서에 관한 것이다.

Description

전기화학적 바이오센서 {Electrochemical biosensor}
본 발명은 산소 분압에 의한 영향이 없고, 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되는 오스뮴 착물, 그리고 오스뮴 착물을 포함하는 전자 전달 매개체, 및 상기 전자 전달 매개체와 산화환원효소를 포함하는 전기화학적 바이오센서에 관한 것이다.
최근 의료 분야부터 환경 및 식품 분야까지 목표 분석물의 정량, 정성 분석을 위해 바이오센서의 개발에 대한 관심이 날로 증대되고 있다. 특히 효소를 이용한 바이오센서는 생물체의 기능 물질 또는 미생물 등 생물체가 특정 물질과 예민하게 반응하는 생물 감지 기능을 이용하여 시료에 함유되어 있는 화학 물질을 선택적으로 검출 계측하는 데 사용하는 화학 센서로 주로 혈당 센서와 같은 의료 계측 용도로 개발되었으며, 그 외 식품 공학이나 환경 계측 분야의 응용에서 역시 연구가 활발하게 이루어지고 있다.
당뇨 관리에 있어 혈당의 주기적인 측정은 대단히 중요하며, 이에 정확성과 정밀성을 갖춘 다양한 종류의 전기화학적 바이오센서가 널리 쓰이고 있다. 혈당을 측정하는 전기화학적 바이오센서는 작동 전극에 효소, 전자 전달 매개체 및 다양한 안정제와 분산제를 섞어서 조제한 시약을 건조시켜 제조하는데, 그 특성을 가장 크게 좌우하는 것은 사용하는 효소의 종류와 전자 전달 매개체의 특성이다.
예를 들어, 대부분의 상용화된 전기화학적 센서에 사용되는 글루코오스 산화환원효소인 FAD-GOX (flavin adenine dinucleotide-glucose oxidase)는 열에 안정하고 글루코오스만을 산화시키는 반응선택성은 탁월하지만, 혈액에 녹아 있는 산소와 반응하기 때문에 FAD-GOX 효소를 사용하여 만든 센서는 시료 혈액의 종류 (정맥혈, 동맥혈, 또는 모세혈)에 따라서 측정값이 크게 다를 수 있다.
Guibault와 Lubrano 등은 생성된 과산화수소를 전류법으로 측정하는 방법을 제안하였다. 약 +600 mV (vs. Ag/AgCl)의 산화전위가 전극에 도입되면 다음의 과정에서 전류값이 얻어지게 된다. 그러나 이러한 방법의 혈당 센서의 경우 시료 내에 존재하는 용존산소량에 대해 큰 의존성을 가지며 과산화수소의 산화전류를 측정할 때 높은 산화전위를 인가함으로써 시료 속에 있는 낮은 전위에서 산화될 수 있는 약물 및 대사물질 (아스코르브산, 요산, 아세트아미노펜, 도파민 등)이 함께 전극에서 산화되어 심각한 측정 오차가 유발된다.
혈당 센서의 산소 의존성을 극복하기 위한 방법 중 하나로서, 산소 대신 전극 표면 위에 전극 표면과 효소 활성자리 사이의 전자 전달을 용이하게 하기 위하여 전자 전달 매개체 (electron transfer mediator)를 도입하였으며, 또한 상대적으로 낮은 형식전위를 가지는 ferrocene 유도체 등과 같은 유기금속 전자 전달 매개체를 도입하여 생체 시료에 존재하는 다른 산화성 물질들 (아스코르브산, 요산, 아세트아미노펜 등)의 방해 효과를 최소화하려는 연구가 진행되었다.
채혈 혈당 센서의 개발 추이는 혈액 (정맥혈, 모세혈 등)에 따라 달라지는 산소 분압 (pO2) 차이에 따른 측정치 변화를 차단하기 위하여 혈액 내 글루코오스와의 효소 반응에서 산소가 참여하는 GOX 대신에 효소반응에 산소가 배제된 GDH 사용으로 전환되고 있으며, 전자 전달 매개체의 경우 습도에 따른 안정성이 민감한 ferricyanide를 대신 온도 및 습도에 따른 안정성이 우수한 퀴논 유도체 (Phenanthroline quinone, Quineonediimine 등)와 같은 유기화합물과 Ru complex (ruthenium hexamine 등)나 오스뮴 착물과 같은 유기금속 화합물로 대체되고 있다.
가장 보편적으로 사용되는 전자 전달 매개체로는 포타슘페리시아나이드 [K3Fe(CN)6]가 있으며, 가격이 저렴하고 반응성이 좋아서 FAD-GOX, PQQ-GDH 또는 FAD-GDH를 이용한 센서 모두에 유용하다. 그러나, 이 전자 전달 매개체를 이용한 센서는 혈액에 존재하는 요산 (uric acid)이나 겐티식산 (gentisic acid)과 같은 방해 물질에 의한 측정오차가 발생하고, 온도와 습도에 의하여 변질되기 쉽기 때문에 제조와 보관에 각별히 주의해야 하며, 장시간 보관 후 바탕전류의 변화로 낮은 농도의 글루코오스를 정확하게 검출하는데 어려움이 있다.
헥사아민루테늄클로라이드 [Ru(NH3)6Cl3]는 페리시아나이드에 비하여 산화환원 안정성이 높아 이 전자 전달 매개체를 사용한 바이오센서는 제조와 보관이 용이하고 장시간 보관에도 바탕전류의 변화가 작아 안정성이 높은 장점을 갖지만, FAD-GDH와 사용하기에는 반응성이 서로 맞지 않아 상업적으로 유용한 센서로 제작하기가 어렵다는 단점이 있다. 또한, 이들 전자 전달 매개체도 센서 스트립의 정확도가 산소 분압에 영향을 받는다는 문제점이 있다.
따라서 산소에 의하여 영향을 받지 않고, 온도와 습도에 의한 성능변화가 적으며, 장기간 보관한 후에도 성능의 변화가 적으며, 넓은 농도 범위의 측정이 가능하며, 대량생산에 적합한 산화환원반응용 시약, 보다 구체적으로 전기화학적 바이오센서용 시약을 제조하기 위한 기술의 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 산화환원효소와 반응하며 산소 분압에 의한 영향이 없고, 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되어 전기화학적 바이오센서용 전자 전달 매개체로 우수한, 오스뮴 착물과 이의 염화합물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 산화환원효소와 반응하며 산소 분압에 의한 영향이 없고, 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되어 전기화학적 바이오센서용 전자 전달 매개체로 우수한, 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물을 포함하는 전자 전달 매개체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물을 포함하는 전자 전달 매개체를 포함하는 산화환원반응용 시약 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물을 포함하는 전자 전달 매개체를 포함하는 전기화학적 바이오센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 효소와 반응하며 산소 분압에 의한 영향이 없고, 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되는 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물을, 그리고 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물을 포함하는 전자 전달 매개체, 산화환원반응시약, 및 전기화학적 바이오센서, 예컨대 혈당 센서를 제공하는 것이다.
구체적으로, 본 발명의 일예는 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 효소와 반응하며 산소 분압에 의한 영향이 없고, 기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되어 전기화학적 바이오센서용 전자 전달 매개체로 우수한, 오스뮴 착물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
일구체예는 생체시료, 예를 들면 액체 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 효소와 반응하며 산소 분압에 의한 영향이 없고, 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되는 오스뮴 착물을 포함하는 전자 전달 매개체에 과한 것이다. 상기 오스뮴 착물은 하기 화학식 1의 구조를 가진다:
Figure 112014128490597-pat00001
상기 식에서,
A는 하기 화학식 2를 가지는 화합물이며,
Figure 112014128490597-pat00002
X는 각각 독립적으로 할로겐 원소, 예를 들면 F, Cl, Br 및 I로 이루어지는 군에서 선택될 수 있으며,
m은 1 내지 3의 정수이고, n은 0 내지 4의 정수이고, m과 n의 합은 3 내지 5의 정수이다.
본 발명에 제공되는 산화환원반응용 시약, 보다 구체적으로 전기화학적 바이오센서용 시약은 산소에 의하여 영향받지 않고, 온도와 습도에 의한 성능변화가 적으며, 장기간 보관한 후에도 성능의 변화가 적다는 장점이 있다.
본 발명의 예는 적어도 두 개 이상의 전극을 갖춘 기판에, 하기 화학식 1을 갖는 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물과 액체 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 효소를 도포 고정하여 제작한 전기화학적 바이오센서에 관한 것이다. 상기 전극의 예로는 작동전극과 보조전극일 수 있으며, 예컨대 효소와 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물은 작동전극에 고정될 수 있다.
본 발명의 구체예는 전기화학적 바이오센서의 적용 가능한 예로서 글루코오스를 측정하기 위한 바이오센서를 예시하고 있지만, 본 발명의 시약조성물에 포함되는 효소의 종류를 달리함으로써 콜레스테롤, 락테이트, 크레아티닌, 과산화수소, 알코올, 아미노산, 및 글루타메이트와 같은 다양한 물질의 정량을 위한 바이오센서에 적용할 수 있다.
오스뮴 착물(산화상태)를 기반으로 한 글루코오스 스트립 센서의 보관 조건에서 인가 전압을 0.3 V로 한 장기 안정성 실험 결과 8주 이상 바탕 전류 (0.3 μA), 감응 기울기 (45 nA/(mg/dL)) 및 산소 분압에 따른 % 오차 (4% 이내) 등을 안정적으로 유지한다. 20 mM ~ 200 mM 구간에서 교정한 결과를 바탕으로 시간 경과에 따른 70 mg/dL 글루코오스와 100 mg/dL 글루코오스의 전류값을 이용하여 % 오차를 연산한 결과 10% 이하의 유효한 결과를 나타낸다. 기존 센서의 가장 큰 문제점으로 작용한 산소 분압에 따른 영향 또한, 전체적으로 4% 이내의 산소 분압에 따른 영향을 받는 것으로 평가되었다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.
본 발명의 일예는 적어도 두 개 이상의 전극을 갖춘 기판에, 하기 화학식 1을 갖는 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물과 액체 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 효소를 고정하여 제작한 전기화학적 바이오센서에 관한 것이다:
[화학식 1]
Os(A)mXn
상기 식에서,
A는 하기 화학식 2을 가지는 화합물, 즉 4,4'-dicarboxy-2,2'-bipyridine (dcbpy)이며,
[화학식 2]
Figure 112014128490597-pat00003
X는 각각 독립적으로 할로겐 원소, 예를 들면 F, Cl, Br 및 I로 이루어지는 군에서 선택될 수 있으며,
m은 1 내지 3의 정수이고, n은 0 내지 4의 정수이고, m과 n의 합은 3 내지 5의 정수이다.
본 발명에 따른 오스뮴 착물의 예는 하기 화학식 3, 화학식 4 및 화학식 5를 갖는 화합물일 수 있다.
Figure 112014128490597-pat00004
Figure 112014128490597-pat00005
Figure 112014128490597-pat00006
본 발명에 따른 화학식 1의 구조를 갖는 오스뮴 착물은 3가 오스뮴 착물과 2가 오스뮴 착물을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 산화상태의 화합물 (3가 Os 화합물)일 수 있다. 또한, 화학식 1의 오스뮴 착물로서 산화상태와 환원상태의 화합물을 포함하는 혼합물인 경우, 산화 처리하여 산화상태의 오스뮴 착물 또는 산화상태의 오스뮴 착물의 염화합물을 제공하거나, 시약 조성물에 산화제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 오스뮴 착물은 염형태일 수 있으며, 염 화합물이 높은 용해도를 가지므로 더욱 바람직하다. 상기 염화합물은 Li염, Na염, K염, Rb염, Cs염 및 Fr염으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 알칼리금속의 염화합물일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따라 화학식 1의 구조를 갖는 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물일 수 있으며, 상기 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물에 포함된 오스뮴은 3가의 산화상태인 것이 바람직하다. 구체적으로, 오스뮴 착물 제조 후, 또는 오스뮴 착물의 염화합물을 제조한 후에, 산화제로 처리하여 산화상태의 오스뮴 착물 염화합물을 제조하거나, 먼저 오스뮴에 산화제를 처리하여 산화상태의 오스뮴 착물을 제조한 후에, 산화상태의 오스뮴 착물을 염화합물로 제조할 수도 있다.
본 발명의 일예에서, 상기 오스뮴 착물이 화학식 2를 가지는 화합물과 하기 화학식 6의 화합물을 이용하여 합성된 것일 수 있다.
[화학식 2]
Figure 112014128490597-pat00007
Figure 112014128490597-pat00008
상기 식에서,
Y는 K, Na 또는 NH4 이고, X는 할로겐 원소이며,
p는 1 내지 2의 정수이고, q는 1 내지 6의 정수이다.
구체적인 일예에서, 본 발명에 따른 오스뮴 착물은 4,4'-dicarboxy-2,2'-bipyridine (dcbpy)와 화학식 6의 화합물로서 예를 들면 K2OsCl6 또는 (NH4)2[OsCl6]을 출발물질로 사용하여 합성할 수 있다. 오스뮴 착물의 제조예로서 dcbpy와 K2OsCl6를 사용한 오스뮴 착물의 합성 과정를 반응식 1에 나타냈다.
[반응식 1]
Figure 112014128490597-pat00009

상기 합성된 오스뮴 착물을 다양한 산화제를 이용하여 산화처리를 수행하여 얻어진 산화상태의 오스뮴 착물 (3가 Os 화합물)일 수 있다. 본 발명의 산화처리에 사용되는 산화제는 특별히 한정하지 않으며, 구체적인 예는 NaOCl, H2O2, O2, O3, PbO2, MnO2, KMnO4, ClO2, F2, Cl2, H2CrO4, K2Cr2O7, N2O, Ag2O, OsO4, H2S2O8, pyridinium chlorochromate, 및 2,2'-Dipyridyldisulfide로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 본 발명의 일예에 따라 산화상태 화합물은 하기 반응식 2에 따라 제조할 수 있다.
[반응식 2]
Figure 112014128490597-pat00010

본 발명의 일예에 따라 오스뮴 착물의 염형태가 용해도 증가로 인해 더욱 바람직하다. 오스뮴 착물의 염을 제조하는 일예로서, NaOH를 이용한 오스뮴 착물의 염화합물을 제조하는 과정을 하기 반응식 3에 나타낸다. 상기 오스뮴 착물의 염화합물은 Li염, Na염, K염, Rb염, Cs염 및 Fr염으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 알칼리금속의 염화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 의도는 아니다.
[반응식 3]
Figure 112014128490597-pat00011

본 발명의 일예는 GDH와 반응하며 산소 분압에 의한 영향이 없고, 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되는 오스뮴 착물을 포함하는 전자 전달 매개체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 오스뮴 착물은 상기 화학식 1의 구조를 가지며, 오스뮴 착물에 대해서는 상술한 바와 같다.
본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서는 액체 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 효소와 전자 전달 매개체를 포함할 수 있으며, 상기 전자 전달 매개체는 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물을 단독 성분으로 포함하거나, 주성분으로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서에서, 전자 전달 매개체는 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물을 주성분으로 포함하며, 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물이외의 금속 착물을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 추가 일예는 오스뮴 착물을 포함하는 전자 전달 매개체 및 산화환원효소를 포함하는 산화환원반응용 시약, 바람직하게는 전기화학적 바이오센서용 시약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서 산화환원효소 및 전자 전달 매개체를 혼합하는 단계를 포함하는 안정성이 증진된 산화환원반응용 시약의 제조 방법이 제공된다. 구체예에서, 상기 산화환원반응용 시약 조성물은 전기화학적 바이오센서에 적용될 수 있으므로, 또 다른 예에서 산화환원효소 및 전자 전달 매개체를 혼합하는 단계를 포함하는 안정성이 증진된 전기화학적 바이오센서용 시약의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 예는 상기 안정성이 증진된 전기화학적 바이오센서용 시약 조성물을 포함하는 전기화학적 바이오센서를 제공한다.
본 발명에 따른 전자 전달 매개체, 산화환원반응용 시약 조성물 및 전기화학적 바이오센서에서, 상기 전자 전달 매개체는 대사물질과 반응하여 환원된 효소와 산화환원반응에 의해 환원되게 되며, 이렇게 형성된 환원상태의 전자 전달 매개체는 산화전위가 인가된 전극표면에서 전류를 발생시키는 역할을 수행한다. 본 발명에 따른 전자 전달 매개체, 산화환원반응용 시약 조성물 및 전기화학적 바이오센서에서, 본 발명의 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물을 단독으로 사용하거나, 제2의 전자 전달 매개체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 전자 전달 매개체, 산화환원반응용 시약 조성물 및 전기화학적 바이오센서에서, 상기 오스뮴 착물은 오스뮴 착물 그 자체로 사용하거나, 오스뮴 착물의 염화합물, 오스뮴 착물의 산화처리한 화합물, 또는 오스뮴 착물의 염화합물을 산화처리한 화합물을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체예에 따르면, 상기 산화환원반응용 시약 조성물 및 전기화학적 바이오센서에서, (a)산화환원효소 및 (b)오스뮴 착물, 오스뮴 착물의 염화합물, 오스뮴 착물의 산화처리 화합물, 또는 오스뮴 착물의 염화합물을 산화처리한 화합물, 및 (c)산화제를 포함할 수 있다. 상기 (c)산화제를 추가로 포함하는 경우, 상기 (b)성분은 산화처리하지 않는 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물이다. 상기 산화제는 특별히 한정하지 않으며, 구체적인 예는 NaOCl, H2O2, O2, O3, PbO2, MnO2, KMnO4, ClO2, F2, Cl2, H2CrO4, K2Cr2O7, N2O, Ag2O, OsO4, H2S2O8, pyridinium chlorochromate, 및 2,2'-Dipyridyldisulfide로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 산화환원반응용 시약 조성물에 첨가되는 산화제의 함량은 오스뮴 착물의 산화상태를 제공하는 한 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 본 발명에 따른 산화제의 함량은 오스뮴 착물 1몰을 기준으로 0.1 내지 10 몰비일 수 있다.
본 발명의 구체예에 따르면 상기 전자 전달 매개체로서 오스뮴 착물과 제2의 전자 전달 매개체를 함께 사용함으로써 글루코오스 검출 성능을 현저히 증가시키고 글루코오스 검출에 있어서의 여러 방해물질에 영향이 거의 없도록 할 수 있다.
본 발명에 따른 시약 조성물은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 오스뮴 착물 20 내지 700 중량부, 예컨대 60 내지 700 중량부 또는 30 내지 340 중량부를 함유할 수 있다. 상기 오스뮴 착물의 함량은 산화환원효소의 활성도에 따라서 적절히 조절할 수 있으며, 시약 조성물 내에 함유된 산화환원효소의 활성도가 높으면 금속함유 착물의 함량이 낮아도 시약 조성물이 목적하는 효과를 발휘할 수 있으므로, 일반적으로 산화환원효소의 활성도가 높을수록 금속함유 착물의 함량은 상대적으로 낮게 조절할 수 있다.
본 발명의 시약 조성물에서 전자 전달 매개체로서 기존의 루테늄 착물과 달리 오스뮴 착물 단독으로 사용하더라도 전자 전달 매개체로서 기능을 충분히 달성할 수 있다, 본 발명에서 추가적으로 금속착물 이외의 제2의 전자 전달 매개체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 오스뮴 착물과 제2의 전자전달 매개체의 혼합물을 사용하는 경우, 제2의 전자 전달 매개체를 포함하는 시약 조성물은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 제2의 전자 전달 매개체를 2 내지 25 중량부, 예컨대 6 내지 25 중량부 또는 6 내지 20 중량부를 함유할 수 있다. 상기 제2의 전자 전달 매개체의 함량은 산화환원효소의 활성도에 따라서 적절히 조절할 수 있으며, 시약 조성물 내에 함유된 산화환원효소의 활성도가 높으면 금속함유 착물의 함량이 낮아도 시약 조성물이 목적하는 효과를 발휘할 수 있으므로, 일반적으로 산화환원효소의 활성도가 높을수록 티오닌 또는 이의 유도체의 함량은 상대적으로 낮게 조절할 수 있다.
상기 제2의 전자 전달 매개체는 티오닌 (thionine), 1-메톡시 PMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate), 3-아미노-7-(2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥산아미도)-5-페노티아지늄 (3-amino-7-(2,3,4,5,6-pentahydroxy hexanamido)-5-phenothiazinium), 1-메톡시-5-메틸페나지늄 (1-Methoxy-5-methylphenazinium), 아주르 C (Azure C), 아주르 A (Azure A), 메틸렌블루 (Methylene Blue), 톨루이딘블루 (Toluidine Blue), 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
전자 전달 매개체로서 오스뮴 착물과 티오닌 또는 이의 유도체의 혼합물, 및/또는 오스뮴 착물을 1-메톡시 PMS 또는 이의 유도체와 혼합물을 사용하는 경우, 티오닌 또는 1-메톡시 PMS와 오스뮴 착물의 몰비(티오닌 또는 1-메톡시 PMS의 몰: 오스뮴 착물의 몰)가 1:1 내지 20, 보다 구체적으로 1:1 내지 10일 수 있다.
산화환원효소는 생체의 산화환원반응을 촉매하는 효소를 총칭하는 것으로, 본 발명에서는 측정하고자 하는 대상물질, 예컨대 바이오센서의 경우에는 측정하고자 하는 대사물질과 반응하여 환원되는 효소를 의미한다. 이와 같이 환원된 효소는 전자 전달 매개체와 반응하며, 이 때 발생한 전류변화 등의 신호를 측정하여 대사물질을 정량하게 된다. 본 발명에 사용 가능한 산화환원효소는 각종 탈수소효소 (dehydrogenase), 산화효소 (oxidase), 에스테르화효소 (esterase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으며, 산화환원 또는 검출 대상 물질에 따라서, 상기 효소 군에 속하는 효소들 중에서 상기 대상 물질을 기질로 하는 효소를 선택하여 사용할 수 있다.
보다 구체적으로 상기 산화환원효소는 글루코오스탈수소효소 (glucose dehydrogenase), 글루탐산탈수소효소 (glutamate dehydrogenase), 글루코오스산화효소 (glucose oxidase), 콜레스테롤산화효소 (cholesterol oxidase), 콜레스테롤에스테르화효소 (cholesterol esterase), 락테이트산화효소 (lactate oxidase), 아스코빅산산화효소 (ascorbic acid oxidase), 알코올산화효소 (alcohol oxidase), 알코올탈수소효소 (alcohol dehydrogenase), 빌리루빈산화효소 (bilirubin oxidase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
한편, 상기 산화환원효소는 측정하고자 하는 대상물질 (예컨대, 대사물질)로부터 산화환원효소가 뺏어온 수소를 보관하는 역할을 하는 보조인자 (cofactor)를 함께 포함할 수 있는데, 예컨대, 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드 (flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 피롤로퀴놀린 퀴논 (Pyrroloquinoline quinone, PQQ) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
예컨대, 혈중 글루코오스 농도를 측정하고자 하는 경우, 상기 산화환원효소로서 글루코오스 탈수소효소 (glucose dehydrogenase, GDH)를 사용할 수 있으며, 상기 글루코오스 탈수소효소는 보조인자로서 FAD를 포함하는 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코오스탈수소효소 (flavin adenine dinucleotide- glucose dehydrogenase, FAD-GDH), 및/또는 보조인자로서 FAD-GDH를 포함하는 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드-글루코오스탈수소효소 (nicotinamide adenine dinucleotide- glucose dehydrogenase)일 수 있다.
구체예에서, 상기 사용 가능한 산화환원효소는 FAD-GDH (예컨대, EC 1.1.99.10 등), NAD-GDH (예컨대, EC 1.1.1.47 등), PQQ-GDH (예컨대, EC1.1.5.2 등), 글루탐산탈수소효소 (예컨대, EC 1.4.1.2 등), 글루코오스산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.4 등), 콜레스테롤산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.6 등), 콜레스테롤에스테르화효소 (예컨대, EC 3.1.1.13 등), 락테이트산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.2 등), 아스코빅산산화효소 (예컨대, EC 1.10.3.3 등), 알코올산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.13 등), 알코올탈수소효소 (예컨대, EC 1.1.1.1 등), 빌리루빈산화효소 (예컨대, EC 1.3.3.5 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 시약 조성물은 계면활성제, 수용성 고분자, 4차 암모늄염, 지방산, 점증제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 시약 용해시의 분산제, 시약 제조시의 점착제, 장기 보관의 안정제 등의 역할을 위하여 추가로 포함할 수 있다.
상기 계면활성제는 시약을 분주할 때 시약이 전극위에서 골고루 퍼져서 시약이 균일한 두께로 분주되게 하는 역할을 하는 것일 수 있다. 상기 계면활성제로 트리톤 X-100 (Triton X-100), 소듐도데실설페이트 (sodium dodecyl sulfate), 퍼플루오로옥탄설포네이트 (perfluorooctane sulfonate), 소듐스테아레이트 (sodium stearate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 시약을 분주할 때 시약이 전극위에서 골고루 퍼져서 시약이 균일한 두께로 분주되게 하는 역할을 적절하게 수행하도록 하기 위하여, 상기 계면활성제를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 3 내지 25 중량부, 예컨대 10 내지 25 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 계면활성제 10 내지 25 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 계면활성제의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.
상기 수용성 고분자는 시약 조성물의 고분자 지지체로서 효소의 안정화 및 분산 (dispersing)을 돕는 역할을 수행하는 것일 수 있다. 상기 수용성 고분자로는 폴리비닐피롤리돈 (polyvinyl pyrrolidone; PVP), 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol; PVA), 폴리플루오로설포네이트 (perfluoro sulfonate), 하이드록시에틸 셀룰로오즈 (hydroxyethyl cellulose; HEC), 하이드록시프로필 셀룰로오즈(hydroxypropyl cellulose; HPC), 카르복시메틸 셀룰로오즈 (carboxy methyl cellulose; CMC), 셀룰로오즈 아세테이트 (cellulose acetate), 폴리아미드 (polyamide) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 산화환원효소의 안정화 및 분산 (dispersing)을 돕는 역할을 충분하고 적절하게 발휘하도록 하기 위하여, 상기 수용성 고분자를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 70 중량부, 예컨대 30 내지 70 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 수용성 고분자 30 내지 70 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 수용성 고분자의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.
상기 수용성 고분자는 지지체 및 효소의 안정화 및 분산 (dispersing)을 돕는 역학을 효과적으로 수행하기 위하여 중량평균분자량이 2,500 내지 3,000,000 정도, 예컨대, 5,000 내지 1,000,000 정도일 수 있다.
상기 4차 암모늄염은 적혈구용적률 (hematocrit)의 양에 따른 측정오차를 감소시키는 역할을 하는 것일 수 있다. 상기 4차 암모늄염으로는 에실트리메틸 암모늄 (ecyltrimethylammonium), 마이리스틸트리메틸암모늄 (myristyltrimethylammonium), 세틸트리메틸 암모늄 (cetyltrimethylammonium), 옥타데실트리메틸 암모늄 (octadecyltrimethylammonium), 테트라헥실 암모늄 (tetrahexylammonium) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은 적혈구용적률에 따른 측정오차를 효율적으로 감소시키기 위하여, 상기 4차 암모늄염을 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 20 내지 130 중량부, 예컨대 70 내지 130 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 4차 암모늄염 70 내지 130 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 4차 암모늄염의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.
상기 지방산은 상술한 4차 암모늄염과 같이 적혈구용적률 (hematocrit)의 양에 따른 측정오차를 감소시키는 역할을 하며, 또한 고농도 영역에서 바이오센서의 선형 동적 영역 (linear dynamic range)을 확대시키는 역할을 한다. 상기 지방산으로는 C4~C20의 탄소사슬을 갖는 지방산 및 그의 지방산염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있고, 바람직하게는 C6~C12로 이루어진 알킬탄소사슬을 갖는 지방산 또는 그의 지방산염을 사용할 수 있다. 상기 지방산으로는 카프로산 (caproic acid), 헵타노산 (heptanic acid), 카프릴산 (caprylic acid), 옥타논산 (octanoic acid), 노나노산 (nonanoic acid), 카프르산 (capric acid), 운데카노산 (undecanoic acid), 라우르산 (lauric acid), 트리데카노산 (tridecanoic acid), 미리스티산 (myristic acid), 펜타데카노산 (pentadecanoic acid), 팔미트산 (palmitic acid), 헵타데카노산 (heptadecanoic acid), 스테아르산 (stearic acid), 노나데카노산 (nonadecanoic acid), 아라키드산 (arachidonic acid), 상기 지방산의 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 적혈구용적률에 따른 측정오차 감소 및 고농도 영역에서 바이오센서의 선형 동적 영역 확대 효과를 적절하게 얻기 위하여, 상기 지방산을 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 70 중량부, 예컨대 30 내지 70 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 지방산 30 내지 70 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 지방산의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.
상기 점증제는 시약을 전극에 견고하게 부착하도록 하는 역할을 한다. 상기 점증제로는 나트로졸, 디에틸아미노에틸-덱스트란 하이드로클로라이드 (DEAE-Dextran hydrochloride) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 시약이 전극에 견고하게 부착되도록 하기 위하여, 상기 점증제를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 90 중량부, 예컨대 30 내지 90 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 점증제 30 내지 90 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 점증제의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 시약 조성물이 포함된 전기화학적 바이오센서를 제공한다. 일 구현예에서, 적어도 두 개 이상의 전극을 갖춘 기판에, 하기 화학식 1을 갖는 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물과 액체 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 효소를 도포한 후 건조하여 제작한 전기화학적 바이오센서이다. 예를 들면, 전기화학적 바이오센서에 있어서 작동전극 및 보조전극이 한 평면상에 구비되고, 상기 작동전극 위에 본 발명에 따른 시약 조성물이 포함된 것을 특징으로 하는 평면형 전기화학적 바이오센서가 제공된다.
또 다른 구현예에서, 전기화학적 바이오센서에 있어서, 작동전극 및 보조전극이 서로 다른 평면상에서 대면하도록 구비되고, 상기 작동전극 위에 본 발명에 따른 시약 조성물이 포함된 것을 특징으로 하는 대면형 전기화학적 바이오센서가 제공된다.
상기 바이오센서에 있어서 본 발명에 따른 시약 조성물이 포함된 형태는 특별한 제한이 없으며, 구체적으로 작동전극 표면에 코팅된 형태로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 평면형 및 대면형 전기화학적 바이오센서는, 예컨대 대한민국 특허공개 제10-2004-0105429호, 대한민국 특허공개 제10-2006-0089464호, 대한민국 특허등록 제0854389호, 대한민국 특허공개 제10-2008-0080841호, 대한민국 특허공개 제10-2008-0084030호, 대한민국 특허공개 제10-2008-0088028호 등에 공지된 방법을 통해 제조할 수 있다.
이하, 상기 평면형 및 대면형 전기화학적 바이오센서의 구조를 도 1 및 도 2를 참조하여 예시한다.
먼저, 도 1에 나타낸 평면형 전기화학적 바이오센서는 작동전극과 보조전극이 한 평면상에 구비되는 것으로, 위에서부터, 혈액이 센서 안으로 스며들도록 하기 위한 통기부 (10)를 구비한 상판 (11); 양면에 접착제가 코팅되어 있어 상기 상판과 하기 하판을 접착하는 역할을 하며, 혈액이 모세작용으로 전극쪽으로 스며들도록 하기 위한 끼움판 (9); 하기 작동전극과 보조전극에 포함 (예컨대, 코팅)되는 본 발명에 따른 시약 조성물 (8); 하기 작동전극과 보조전극의 면적을 규정하기 위한 통로부가 구비된 절연판 (7); 하기 하판 상에 프린트되는 작동전극 (2)과 보조전극 (3); 및 상기 작동전극 및 보조전극이 형성되는 하판 (1)이 순차적으로 적층된 구조를 갖는다.
도 2에 나타낸 대면형 전기화학적 바이오센서는 작동전극과 보조전극이 서로 다른 평면상에 대면하도록 구비되는 것으로, 위에서부터, 혈액이 센서 안으로 스며들도록 하기 위한 통기부 (10)를 구비하며, 하기 보조전극이 프린트되는 상판 (11); 상기 상판에 프린트되는 보조전극 (3); 양면에 접착제가 코팅되어 있어 상기 상판과 하기 하판을 접착하는 역할을 하고, 혈액이 모세작용으로 전극쪽으로 스며들도록 하기 위한 끼움판 (9); 하기 작동전극에 포함 (예컨대, 코팅)되는 본 발명에 따른 시약 조성물 (8); 하기 작동전극과 상기 보조전극의 면적을 규정하기 위한 통로부가 구비된 절연판 (7); 상기 보조전극과 하기 보조전극의 리드를 연결하는 회로연결접지 (5); 하기 하판 상에 프린트되는 작동전극 (2), 보조전극의 리드 (4) 및 혈액이 들어오는 속도를 측정하기 위한 유동감지전극 (6); 및 상기 작동전극, 보조전극의 리드 및 유동감지전극이 형성되는 하판 (1)이 순차적으로 적층되는 구조를 갖는다.
본 발명에 따른 오스뮴 착물을 함유하는 전자 전달 매개체는 GDH와 반응하며 산소 분압에 의한 영향이 없고, 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되는 장점이 있어, 이를 적용한 산화환원반응시약, 및 전기화학적 바이오센서는 시료 내 산소 분압에 따른 측정오차가 최소화되며, 장기간 안정적으로 사용 가능한 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 평면형 바이오센서의 분해사시도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 대면형 바이오센서의 분해사시도이다.
도 3은 실시예 1에서 제조한 오스뮴 화합물의 1H NMR 스펙트럼 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 1에 따라 글루코오스 농도 변화에 따른 전류의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5a 내지 도 5c는 다양한 전자전달 매개체의 수용액 상에서의 시간 경과에 따른 UV-가시광선 스펙트럼의 변화를 비교한 것으로서, 도 5a는 오스뮴 착물에 관한 것이고, 도 5b는 루테늄 헥사아민 (ruthenium hexamine)에 관한 것이고, 도 5c는 페리시아나이드 (ferricyanide)에 관한 것이다.
도 6은 오스뮴 기반 글루코오스 스트립 센서의 보관 조건에서 시간 경과에 따른 특성 변화를 나타내는 것으로서, (a) 바탕 전류 및 (b) 감응 기울기를 나타낸다.
도 7은 오스뮴 기반의 글루코오스 스트립 센서의 글루코오스 농도별 산소 분압에 따른 방해 정도를 비교한 결과이다.
도 8은 산화제 (NaOCl) 첨가에 따른 오스뮴 착물 기반 글루코오스 스트립 센서의 보관 조건에서 시간 경과에 따른 특성 변화를 나타내는 것으로서, (a) 바탕 전류, (b) 감응 기울기에 관한 것이다.
도 9는 산화제 (H2O2) 첨가에 따른 오스뮴 착물 기반 글루코오스 스트립 센서의 보관 조건에서의 시간 경과에 따른 특성 변화를 나타낸다.
도 10는 산화제 (H2O2)로 산화 처리한 오스뮴 착물 (산화상태) 기반 글루코오스 스트립 센서의 보관 조건에서의 시간 경과에 따른 특성 변화를 나타낸다.
도 11은 산화제 (NaOCl)로 산화 처리한 오스뮴 착물 (산화상태) 기반 글루코오스 스트립 센서의 보관 조건에서의 시간 경과에 따른 특성 변화를 나타낸다.
도 12는 산화제 (NaOCl)로 산화 처리한 오스뮴 착물 (산화상태) 기반 글루코오스 스트립 센서의 글루코오스 농도별 산소 분압에 따른 방해 정도 비교한 것이다.
도 13은 산화제 (NaOCl)로 산화 처리한 오스뮴 착물 (산화상태) 기반 글루코오스 스트립 센서의 인가 전압에 변화에 따른 특성 변화를 나타낸다.
도 14는 오스뮴 착물 (산화상태) 기반 글루코오스 스트립 센서의 보관 조건에서의 시간 경과에 따른 특성 변화를 나타낸다.
도 15는 오스뮴 착물 (산화상태) 기반 글루코오스 스트립 센서의 보관 조건에서의 시간 경과에 따른 농도별 % 오차 (Error) 변화를 나타낸다.
도 16은 오스뮴 착물 (산화상태) 기반 글루코오스 스트립 센서의 보관 조건에서의 시간 경과에 따른 글루코오스 농도별 산소 분압에 따른 방해 정도를 나타낸다.
이하, 본 발명을 하기의 실시 예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 오스뮴 착물 제조
1-1. 오스뮴 착물의 합성
4,4'-dicarboxy-2,2'-bipyridine (dcbpy)와 K2OsCl6를 출발 물질로 Os(dcbpy)2Cl2 (오스뮴 착물)를 합성하고자 하였다.
K2OsCl6 0.481 g (1 mM)과 dcbpy 0.488 g (2 mM)을 500 mL three-neck round-bottem flask에 넣고, dimethylformamide (DMF) 40 mL 첨가하여 1시간 동안 교반하며 녹인 후 N2 분위기 reflux 하에서 oil bath로 180 ℃를 유지하면서 2시간 동안 반응을 진행하였다. 반응이 완결된 용액을 rotary evaporator를 이용하여 용매를 제거한 후 생성물을 증류수로 세척하면서 감압 여과하였고, 여과된 생성물은 증류수, methyl alcohol, ethyl ether 순으로 세척하였다. 이렇게 얻어진 생성물을 50 ?에서 12시간 이상 건조시켜 60% 정도의 Os(dcbpy)2Cl2 (오스뮴 착물)을 수득하였다.
1-2. 분광학적 특성 분석
dcbpy와 K2OsCl6를 사용한 합성된 Os(dcbpy)2Cl2 (오스뮴 착물)의 성공적 합성 유무를 판단하기 위하여 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)을 측정하였다. Dcbpy (a)와 오스뮴 착물 (b)의 1H NMR spectrum를 도 2에 나타냈다.
도 3에서 보는 바와 같이 dcbpy ligand가 중심 금속인 Os에 배위되면서 aromatic ring에 치환되어 있는 -COOH의 H peak (도 3 (b)의 1)의 band width가 중심 금속 Os에 배위되기 전 -COOH의 H peak (도 3 (a)의 1)보다 현저히 넓어 진 것을 확인할 수 있었다. 일반적으로 유기 화합물이 금속에 배위될 경우 peak의 band width가 넓어지는 경향이 있는 것으로 알려져 있으며, 이러한 1H NMR spectrum 결과를 통해 성공적으로 반응이 진행된 것을 확인할 수 있었다.
1-3. 전기화학적 특성 분석
오스뮴 착물의 전기화학적 특성을 검증하기 위하여 cyclic voltammetry를 진행하였다. 작동 전극은 탄소 전극, 보조 전극은 백금 및 기준 전극으로 Ag/AgCl (sat. KCl) 전극을 사용하였고, FAD-glucose dehydrogenase (FAD-GDH) 10 mg/mL, 오스뮴 착물 30 mmol 및 0.1 M PBS (pH 7.4) 혼합 용액 상에서 글루코오스 농도를 변화하면서 측정하였다. -0.2 V ~ 0.3 V 구간에서 scan rate 10 mV/sec.로 측정하였다. 측정결과 그래프를 도 3에 나타냈다.
도 4에 보는 바와 같이 90 mg/dL ~ 540 mg/dL 글루코오스 농도 구간에서 77.1 nA/(mg/dL)의 감응 기울기와 비교적 우수한 직선성을 나타내었다.
도 3와 도 4의 분광학적 및 전기화학적 결과를 바탕으로 오스뮴 착물이 성공적으로 합성된 것을 확인 할 수 있었다.
실시예 2: 오스뮴 착물의 염화합물 제조
합성된 오스뮴 착물의 구조는 카르복시 (–COOH) 작용기를 가지는 bypyridin 구조인 dcbpy가 리간드로 중심 금속인 오스뮴 (Os)에 배위되어 유기금속 화합물로서 물에 대한 용해도가 낮다. 오스뮴 착물의 -COOH 작용기를 -COO-Na+로 치환시킨 염 형태로 변환시켜 용해도를 증가시키고자 하였다. 먼저, 염 형태로 변환시키기 위해 적정을 통하여 당량비를 구하였으며, 적정한 당량비는 1:3로 나타났다. 이후 실시예에서는 NaOH를 사용하여 1:3 당량비로 치환시킨 오스뮴 착물 소디움염을 사용하였다.
실시예 3: 오스뮴 착물의 산화 처리
합성한 오스뮴 착물 0.75 g (1 mM)를 500 mL one-neck round-bottem flask에 넣고, 증류수 100 mL에 잘 녹인 후 산화제 (NaOCl/H2O2) 0.037 g/0.034 g (1 mM)을 첨가한 후 상온에서 교반하며 2시간 동안 반응을 진행하였다. 반응이 완결된 용액을 rotary evaporator를 이용하여 용매를 제거한 후 생성물을 에틸에테르로 세척하면서 감압 여과하였고, 여과된 생성물은 50 ℃에서 12시간 이상 건조시켜 90% 정도의 오스뮴 착물 (산화상태, Os(ox) complex)를 수득하였다.
실시예 4: 오스뮴 착물의 안정성 평가
오스뮴 착물의 유기금속 화합물로서의 안정성을 확인하기 위하여 수용액 상태에서 시간 경과에 따른 UV-Visible spectrum 변화를 현재 시판 중인 글루코오스 스트립 센서의 전자 전달 매개체로 사용되고 있는 ruthenium hexamine, ferricyanide와 비교하였다.
구체적으로, 오스뮴 착물, ruthenium hexamine, ferricyanide 각각 1 mg을 0.1 M PBS (pH 7.4) 1 mL에 녹인 수용액의 UV-Vis spectrum을 측정한 후 상온에서 밀폐 보관하며 11일 간 실험을 진행하였다. 실험결과를 도 5a 내지 도 5c에 나타냈다.
도 5b에서 보는 바와 같이, ruthenium hexamine (도 5b)의 경우 시간 경과에 따른 UV-Visible spectrum 변화가 발견되지 않는 것으로 나타나, 산화 상태인 Ru(III)가 매우 안정적인 것으로 나타났다. 실시예 1에서 합성한 오스뮴 착물 (도 5a)의 경우에는 400 nm와 520 mm의 흡수 peak의 흡광도가 시간 경과에 따라 감소하여 초기 산화 상태인 Os(III)와 환원 상태인 Os(II) 혼재하다가 시간 경과에 따라 산화 상태인 Os(III)로 변화하는 것으로 나타났으며, 이는 상온 수용액 조건에서 산화 상태인 Os(III)가 환원 상태인 Os(II) 보다 안정함을 의미한다. 페리시아나이드 (Ferricyanide)는 시간 경과에 따라 300 nm와 420 mm의 흡수 peak의 흡광도는 감소하고, 260 nm의 흡수 피크의 흡광도는 증가하여 산화 상태인 Fe(III)가 시간 경과에 따라 환원 상태인 Fe(II)로 변화하는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 환원 상태인 Fe(II)가 환원 상태인 Fe(III) 보다 안정하다는 것을 증명하는 결과이다.
실시예 5: 바이오센서의 제조
5-1.바이오센서 제조
작동 전극은 탄소, 기준 전극은 Ag/AgCl 재질의 대면형 센서를 사용하였고, 오스뮴 착물 30 mM, FAD-GDH 10 mg/mL, 계면활성제 및 바탕 전해질로 0.1 M PBS (pH 7.4)를 사용한 Os 기반 글루코오스 스트립 센서를 제작하여 전기화학적 특성 (감응성, 안정성, 산소 분압에 따른 영향 등)을 측정하였고, CareSens N (Ru + GOX), CareSens Pro (Fe + GDH) 및 VetMate (Ru + GDH + Thionin) 3가지 글루코오스 스트립 센서와 비교하고자 하였다. 감응 특성은 multi-channel biosensor system을 사용하여 인가 전압 0.2 V에서 측정하였다.
5-2. 보관 조건에서의 시간 경과에 따른 특성 변화
오스뮴 기반 글루코오스 스트립 센서의 일반적인 보관 조건에서의 시간 경과에 따른 특성 (바탕 전류, 감응 기울기)을 조사하였다. 30 mM Os 기반 스트립과 CareSens N , CareSens Pro 및 VetMate 3가지 스트립을 온도 23 ℃, 상대습도 20% 이하의 보관함에 보관하면서 시간 경과에 따른 특성 변화를 조사하였다.
3가지 스트립의 경우 바탕 전류 및 감응 기울기를 유지하는 반면, Os 기반 스트립의 경우 일반적인 보관 조건에서도 시간 경과에 따른 바탕 전류가 3.2 μA에서 2.5 μA정도로 변화하는 것으로 나타났다 (도 6). 이 결과는 실시예 4에서 관측된 오스뮴 착물의 상온 수용액 조건에서의 UV-Visible spectrum 결과와도 일치한다.
5-3. 산소 분압에 따른 영향 비교
GOX 기반 글루코오스 스트립 센서의 가장 큰 문제점인 산소 분압 (pO2) 차이로 인해 발생되는 모세혈과 정맥혈 간의 측정치 차이를 제거하기 위하여 산소 분압에 대한 영향이 없는 GDH로 대체하고자 하는 연구가 진행되고 있으나, 특정 전자 전달 매개체의 경우 전자 전달 매개체가 산소 분압에 영향을 받는 것으로 알려져 적용이 제한되고 있는 실정이다.
이러한 산소 분압에 따른 영향을 30 mM Os 기반 스트립과 CareSens N, CareSens Pro 및 VetMate 3가지 스트립을 대상으로 조사하였다.
산소 분압은 포화상태 (160 mmHg)와 탈산소 과정을 적용한 저분압상태 (40 mmHg)의 저 (90 mg/dL), 중 (200 mg/dL), 고 (400 mg/dL)농도 포도당을 측정 후 다음과 같은 연산식으로 산소 분압 차이에 따른 % 오차를 계산하였다.
Figure 112014128490597-pat00012
Ru 기반 2가지 스트립 (CareSens N, VetMate)들은 산소 분압에 따른 영향이 8% 내외로 나타난 반면, 30 mM Os 기반 스트립의 경우 3% 이하로 나타났다 (도 7).
실시예 6: 산화제 첨가 및 산화 처리 오스뮴 착물 기반 스트립 센서의 특성 평가
6-1. 산화제를 첨가한 오스뮴 착물 기반 스트립 센서의 특성 변화
선행 연구를 바탕으로 Os 기반 스트립 센서 제작 시 산화제를 첨가하여 산화제 첨가에 따른 바탕 전류와 시간 경과에 따른 바탕 전류 변화를 측정 비교하였다.
가. NaOCl 을 첨가한 오스뮴 착물 기반 스트립 센서의 특성 변화
작동 전극은 탄소, 기준 전극은 Ag/AgCl 재질의 대면형 센서를 사용하였고, 오스뮴 착물 각각 20 mM, 30 mM과 FAD-GDH 10 mg/mL, 계면활성제 및 바탕 전해질로 0.1 M PBS (pH 7.4)를 사용한 2가지 기본 조성과 기본 조성에 각각 오스뮴 착물과 동일한 함량의 NaOCl을 첨가한 2가지 조성의 Os 기반 글루코오스 스트립 센서를 제작하여 전기화학적 특성 (감응성, 안정성, 산소 분압에 따른 영향 등)을 측정하였고, CareSens N과 CareSens Pro 2가지 글루코오스 스트립 센서와 비교하였다.
감응 특성은 multi-channel biosensor system을 사용하여 인가 전압 0.2 V에서 측정하였다.
4가지 조성의 Os 기반 스트립과 CareSens N , CareSens Pro 2가지 스트립은 온도 23 ℃, 상대습도 20% 이하의 일반적인 보관 조건에서 보관하면서 시간 경과에 따른 특성 변화를 조사하였다.
NaOCl를 첨가한 Os 기반 스트립의 경우 첨가하지 않은 기존 스트립과 비교하여 2 μA 내외의 높은 바탕 전류에서 0.2 μA 내외로 감소하였으며, 보관 조건에서 시간 경과에 따라 비교적 안정적인 바탕 전류를 유지하는 것으로 나타났다 (도 8).
나. H 2 O 2 를 첨가한 오스뮴 착물 기반 스트립 센서의 특성 변화
작동 전극은 탄소, 기준 전극은 Ag/AgCl 재질의 대면형 센서를 사용하였고, 오스뮴 착물 각각 20 mM, 30 mM과 FAD-GDH 10 mg/mL, 계면활성제 및 바탕 전해질로 0.1 M PBS (pH 7.4)를 사용한 2가지 기본 조성, 기본 조성에 각각 오스뮴 착물과 동일한 함량의 H2O2을 첨가한 2가지 조성 및 H2O2를 첨가한 30 mM Os 조성에 GDH의 함량을 2배 증가시킨 조성 등 총 5가지 조성의 Os 기반 글루코오스 스트립 센서를 제작하여 전기화학적 특성 (감응성, 안정성, 산소 분압에 따른 영향 등)을 측정하였고, CareSens N과 CareSens Pro 2가지 글루코오스 스트립 센서와 비교하고자 하였다.
감응 특성은 multi-channel biosensor system을 사용하여 인가 전압 0.2 V에서 측정하였다.
6가지 조성의 Os 기반 스트립과 CareSens N, CareSens Pro 2가지 스트립은 온도 23 ℃, 상대습도 20% 이하의 일반적인 보관 조건에서 보관하면서 시간 경과에 따른 특성 변화를 조사하였다.
도 9에 도시한 바와 같이 H2O2를 첨가한 Os 기반 스트립의 경우 NaOCl 첨가 스트립과 비교하여 0.2 μA 내외의 유사한 바탕 전류와 20 nA/(mg/dL) 이상의 감응 기울기를 나타내었다.
6-2. 산화 처리한 Os ( ox ) complex 기반 스트립 센서의 특성 변화
가. H 2 O 2 로 산화 처리한 오스뮴 착물 (산화상태) ( Os ( ox ) complex ) 기반 스트립 센서의 특성 변화
작동 전극은 탄소, 기준 전극은 Ag/AgCl 재질의 대면형 센서를 사용하였고, 오스뮴 착물 각각 20 mM, 30 mM과 FAD-GDH 10 mg/mL, 계면활성제 및 바탕 전해질로 0.1 M PBS (pH 7.4)를 사용한 2가지 기본 조성, H2O2로 산화 처리한 Os(ox) complex를 첨가한 2가지 조성 및 H2O2로 산화 처리한 오스뮴 착물 (산화상태) 염화합물 (Os(ox) salt)를 첨가한 2가지 조성 등 총 6가지 조성의 Os 기반 글루코오스 스트립 센서를 제작하여 전기화학적 특성 (감응성, 안정성, 산소 분압에 따른 영향 등)을 측정하였고, CareSens N과 CareSens Pro 2가지 글루코오스 스트립 센서와 비교하였다.
감응 특성은 multi-channel biosensor system을 사용하여 인가 전압 0.2 V에서 측정하였다.
6가지 조성의 Os 기반 스트립과 CareSens N, CareSens Pro 2가지 스트립은 온도 23 ℃, 상대습도 20% 이하의 일반적인 보관 조건에서 보관하면서 시간 경과에 따른 특성 변화를 조사하였다.
H2O2로 산화 처리한 Os(ox) complex 기반 스트립의 경우 기존의 H2O2를 첨가한 Os 기반 스트립과 유사한 0.2 μA 내외의 바탕 전류를 갖는 것으로 나타났으나, Os(ox) salt 기반 스트립의 경우 동일 조건의 Os(ox) complex 기반 스트립 보다 바탕 전류가 높은 것으로 조사되었고, 감응 기울기 또한 H2O2를 첨가한 스트립과 비교하여 H2O2로 산화 처리한 Os(ox) complex 및 Os(ox) salt 기반 4가지 조성 모두에서 다소 증가하는 것으로 나타났다 (도 10).
나. NaOCl 로 산화 처리한 Os ( ox ) complex 기반 스트립 센서의 특성 변화
작동 전극은 탄소, 기준 전극은 Ag/AgCl 재질의 대면형 센서를 사용하였고, 오스뮴 착물 각각 20 mM, 30 mM과 FAD-GDH 10 mg/mL, 계면활성제 및 바탕 전해질로 0.1 M PBS (pH 7.4)를 사용한 2가지 기본 조성, NaOCl로 산화 처리한 Os(ox) complex를 첨가한 2가지 조성, NaOCl로 산화 처리한 Os(ox) salt를 첨가한 1가지 조성과 Os(ox) salt에 다른 종류의 전자 전달 매개체를 추가한 조성 등 총 6가지 조성의 Os 기반 글루코오스 스트립 센서를 제작하여 전기화학적 특성 (감응성, 안정성, 산소 분압에 따른 영향 등)을 측정하였고, CareSens N과 CareSens Pro 2가지 글루코오스 스트립 센서와 비교하였다.
감응 특성은 multi-channel biosensor system을 사용하여 인가 전압 0.2 V에서 측정하였다.
6가지 조성의 Os 기반 스트립과 CareSens N, CareSens Pro 2가지 스트립은 온도 23 ℃, 상대습도 20% 이하의 일반적인 보관 조건에서 보관하면서 시간 경과에 따른 특성 변화를 조사하였다.
NaOCl로 산화 처리한 Os(ox) complex 기반 스트립이 낮은 바탕 전류, 감응 기울기, 시간 경과에 따른 안정성 및 산소 분압에 따른 영향 감소 등 지금까지 연구된 Os 기반 스트립 중 가장 우수한 전기화학적 감응 특성을 나타내었다 (도 11, 도 12).
Os(ox) complex 스트립 센서의 인가 전압에 따른 감응 특성을 조사하기 위하여 작동 전극은 탄소, 기준 전극은 Ag/AgCl 재질의 대면형 센서를 사용하였고, Os(ox) complex 30 mM과 FAD-GDH 10 mg/mL, 계면활성제 및 바탕 전해질로 0.1 M PBS (pH 7.4)를 사용한 조성의 Os(ox) complex 기반 글루코오스 스트립 센서를 제작하여 인가 전압에 따른 감응 특성 조사하였다.
감응 특성은 인가 전압 변화가 용이한 multi-channel biosensor system을 사용하여 인가 전압 0.1 V ~ 0.4 V 구간에서 0.05 V 간격으로 측정하였다.
도 13에 인가 전압에 따른 바탕 전류 및 감응 기울기 변화를 나타내었다. 바탕전류의 경우 0.2 V부터 0.35 V가지 완만히 증가하다가 0.35 V 이후 급격히 증가하는 하는 것으로 나타났으며, 감응 기울기는 0.3 V까지 급격히 증가한 후 0.3 V 이후 완만히 증가하는 것으로 나타났다. 0.3 V로 인가 전압을 0.1 V 상승시킬 경우 바탕 전류는 0.05 μA 상승하는 반면, 감응 기울기는 45 nA/(mg/dL)로 2배 정도 향상되는 것으로 나타났다.
실시예 7: NaOCl 로 산화처리한 Os ( ox ) complex 기반 스트립 센서의 장기 안정성
NaOCl로 산화 처리한 Os(ox) complex 기반 스트립 센서의 보관 조건에서의 시간 경과에 따른 바탕 전류, 감응 기울기 및 산소 분압에 따른 영향 변화를 조사하였다.
측정은 multi channel biosensor system을 사용하였으며, 인가 전압은 0.3 V를 인가하였다.
도 14에 나타난 바와 같이 NaOCl로 산화 처리한 Os(ox) complex 기반 스트립 센서가 보관 조건에서 8주 이상 안정적인 바탕 전류와 감응 기울기를 유지하는 것으로 나타났으며, 1일 측정 결과를 이용하여 20 mM ~ 200 mM 구간에서 교정한 결과로 시간 경과에 따른 70 mg/dL 포도당과 100 mg/dL 포도당의 전류값을 이용하여 % Error를 연산한 결과 도 15에 보는 바와 같이 전체적으로 10% 이하의 유효한 결과를 나타냈다.
산소 분압에 따른 영향 또한, 전체적으로 4% 이내의 영향을 받는 것으로 조사되었다 (도 16).
NaOCl로 산화 처리한 Os(ox) complex와 FAD-GDH 효소의 기반 스트립 센서는 상온 보관 조건에서 8주 이상 안정적으로 바탕 전류, 감응 기울기 및 산소 분압에 따른 영향 변화 등을 유지하였다.
1: 기판
2: 작동전극
3: 보조전극
4: 보조전극의 리드
5: 회로연결접지
6: 유동감지전극
7: 절연판
8: 산화환원시약 조성물
9: 끼움판
10: 통기부
11: 상판

Claims (17)

  1. 적어도 두 개 이상의 전극을 갖춘 기판에, 전자전달 매개체로서 하기 화학식 1을 갖는 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물과 액체 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 효소를 도포 고정하여 제작한 전기화학적 바이오센서:
    [화학식 1]
    Os(A)mXn
    상기 식에서,
    A는 하기 화학식 2을 가지는 화합물이며,
    [화학식 2]
    Figure 112016081982964-pat00013

    X는 할로겐 원소이며,
    m은 1 내지 3의 정수이고, n은 0 내지 4의 정수이고, m과 n의 합은 3 내지 5의 정수이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 염화합물은 Li염, Na염, K염, Rb염, Cs염 및 Fr염으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 알칼리금속의 염화합물인 전기화학적 바이오센서.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 오스뮴 착물이 3가 오스뮴 착물을 포함하는 것인 전기화학적 바이오센서.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 오스뮴 착물은 3가 오스뮴 착물과 2가 오스뮴 착물을 포함하는 전기화학적 바이오센서.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 오스뮴 착물이, 화학식 2의 화합물과 하기 화학식 6의 화합물을 이용하여 합성된 것인 전기화학적 바이오센서:
    [화학식 6]
    YpOsXq
    상기 식에서,
    Y는 K, Na 또는 NH4 이고, X는 할로겐 원소이며,
    p는 1 내지 2의 정수이고, q는 1 내지 6의 정수이다.
  6. 제 1 항에 있어서, 산화제를 추가로 포함하는 것인 전기화학적 바이오센서.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 산화제는, 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물 1몰을 기준으로 0.1 내지 10몰비로 포함되는 것인 전기화학적 바이오센서.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 산화제는 NaOCl, H2O2, O2, O3, PbO2, MnO2, KMnO4, ClO2, F2, Cl2, H2CrO4, K2Cr2O7, N2O, Ag2O, OsO4, H2S2O8, 피리딘 클로로크로메이트 (pyridinium chlorochromate) 및 2,2'-디피리딜디설파이드 (2,2'-Dipyridyldisulfide)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 전기화학적 바이오센서.
  9. 제 1 항에 있어서, 전자 전달 매개체로서 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물이외의 금속 착물을 포함하지 않는 것인 전기화학적 바이오센서.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물은 효소 100 중량부를 기준으로 20 내지 700 중량부로 포함되는 것인 전기화학적 바이오센서.
  11. 제 1 항에 있어서, 제2의 전자전달 매개체를 추가로 포함하며, 상기 제2의 전자전달 매개체는 티오닌 (thionine), 1-메톡시 PMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate), 3-아미노-7-(2,3,4,5,6-펜타하이드록시헥산아미도)-5-페노티아지늄 (3-amino-7-(2,3,4,5,6-pentahydroxy hexanamido)-5-phenothiazinium), 1-메톡시-5-메틸페나지늄 (1-Methoxy-5-methylphenazinium), 아주르 C (Azure C), 아주르 A (Azure A), 메틸렌블루 (Methylene Blue), 톨루이딘블루 (Toluidine Blue), 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 전기화학적 바이오센서.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 효소는
    탈수소효소 (dehydrogenase), 산화효소 (oxidase), 및 에스테르화효소 (esterase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소; 또는
    탈수소효소, 산화효소, 및 에스테르화효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소와 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드 (flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 및 피롤로퀴놀린 퀴논 (Pyrroloquinoline quinone, PQQ)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조인자를 포함하는 것인, 전기화학적 바이오센서.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 탈수소효소 (dehydrogenase), 산화효소 (oxidase), 및 에스테르화효소 (esterase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소는 글루코오스탈수소효소 (glucose dehydrogenase), 글루탐산탈수소효소 (glutamate dehydrogenase), 글루코오스산화효소 (glucose oxidase), 콜레스테롤산화효소 (cholesterol oxidase), 콜레스테롤에스테르화효소 (cholesterol esterase), 락테이트산화효소 (lactate oxidase), 아스코빅산산화효소 (ascorbic acid oxidase), 알코올산화효소 (alcohol oxidase), 알코올탈수소효소 (alcohol dehydrogenase), 및 빌리루빈산화효소 (bilirubin oxidase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인, 전기화학적 바이오센서.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 효소는 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코오스탈수소효소 (flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH), 및 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드-글루코오스탈수소효소 (nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인, 전기화학적 바이오센서.
  15. 제 1 항에 있어서, 계면활성제, 수용성 고분자, 4차 암모늄염, 지방산, 및 점증제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 추가로 포함하는, 전기화학적 바이오센서.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 계면활성제는 트리톤 X-100 (Triton X-100), 소듐도데실설페이트 (sodium dodecyl sulfate), 퍼플루오로옥탄설포네이트 (perfluorooctane sulfonate), 및 소듐스테아레이트 (sodium stearate)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것이고;
    상기 수용성 고분자는 폴리비닐피롤리돈 (polyvinyl pyrrolidone; PVP), 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol; PVA), 폴리플루오로설포네이트 (perfluoro sulfonate), 하이드록시에틸 셀룰로오즈 (hydroxyethyl cellulose; HEC), 하이드록시프로필 셀룰로오즈 (hydroxypropyl cellulose; HPC), 카르복시메틸 셀룰로오즈 (carboxy methyl cellulose; CMC), 셀룰로오즈 아세테이트 (cellulose acetate), 및 폴리아미드 (polyamide)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것이고;
    상기 4차 암모늄염은 에실트리메틸 암모늄 (ecyltrimethylammonium), 마이리스틸트리메틸암모늄 (myristyltrimethylammonium), 세틸트리메틸 암모늄 (cetyltrimethylammonium), 옥타데실트리메틸 암모늄 (octadecyltrimethylammonium), 및 테트라헥실 암모늄 (tetrahexylammonium)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것이고;
    상기 지방산은 C4~C20의 탄소사슬을 갖는 지방산 및 그의 지방산염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것이고;
    상기 점증제는 나트로졸 및 디에틸아미노에틸-덱스트란 하이드로클로라이드 (DEAE-Dextran hydrochloride)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인, 전기화학적 바이오센서.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 생체시료는 혈액인 전기화학적 바이오센서.
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