WO2016108671A1 - 전기화학적 바이오센서 - Google Patents

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WO2016108671A1
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electrochemical biosensor
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osmium complex
oxidase
salt
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PCT/KR2015/014582
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윤인준
신재호
정연호
차근식
남학현
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주식회사 아이센스
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    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/78—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D213/79—Acids; Esters

Definitions

  • the present invention is an osmium complex which is free from oxygen partial pressure and maintains a long-term redox form stably, and an electron transfer medium comprising an osmium complex, and an electrochemical biosensor comprising the electron transfer medium and an oxidoreductase. It is about.
  • biosensors which use the enzyme, a functional material or a microorganism such as an organism of a living organism selectively search for a chemical sample using a biological detection that banung the Min
  • For the particular material output and measurement Hi is a chemical that is used to Sensors, for example, mainly developed for medical measuring applications such as blood glucose sensors, and active research in food engineering and environmental measurement.
  • the electrochemical biosensor for measuring blood sugar is prepared by applying an enzyme, an electron transfer medium, and a reagent prepared by mixing various stabilizers and dispersants to a working electrode and drying it. The type and nature of the electron transfer medium.
  • FAD-GOX flavin adenine dinucleotide ⁇ glucose oxidase
  • a glucose-acid-reducing enzyme used in most commercially available electrochemical sensors, is heat-stable and banung selectivity that only oxidizes glucose. Because of the reaction with oxygen, the sensor made using the FAD-G0X enzyme can vary greatly depending on the type of sample blood, such as venous blood, arterial blood, or capillary blood.
  • Guibault and Lubrano et al. Proposed a method for the measurement of hydrogen peroxide produced by current method.
  • an oxidation potential of about +600 mV vs. Ag / AgCl
  • the current value is obtained.
  • the blood glucose sensor of this method is highly dependent on the amount of dissolved oxygen present in the sample, and by applying a high oxidation potential when measuring the oxidation current of hydrogen peroxide, drugs and metabolites (ascorbic acid, which can be oxidized at low potentials in the sample). Uric acid, acetaminophen, dopamine, etc.) are oxidized together at the electrode causing serious measurement errors.
  • an electron transfer mediator has been introduced to facilitate the transfer of electrons between the electrode surface and the enzyme active site on the electrode surface instead of oxygen, and also has a relatively low type potential.
  • Organometallic electron transfer mediators such as ferrocene derivatives have been introduced to minimize the interfering effects of other oxidizing substances (ascorbic acid, uric acid, acetaminophen) in biological samples.
  • the most commonly used electron transport mediator is potassium ferricyanide
  • Biosensors used as nucleoamine ruthenium chloride electron transfer mediators are easy to manufacture and store, and have a high stability because they have a small change in background current even during long-term storage, but they are not suitable for use with FAD—GDH. Oh, it is difficult atda the 'disadvantages produced by commercially available sensors. In addition, these electron transport media also have a problem that the accuracy of the sense strip is affected by the oxygen partial pressure.
  • An object of the present invention is to react with oxidoreductase and have no effect by oxygen partial pressure, and the redox form is stably maintained for a long time, so it is an electron transfer medium containing an excellent osmium complex or a salt compound thereof as an electron transfer medium for an electrochemical biosensor. To provide every single object.
  • Still another object of the present invention is to provide a redox reaction reagent composition comprising an electron transport medium containing the osmium complex or a salt compound thereof.
  • the present invention also provides an electron transfer medium, an redox reagent, and an electrochemical biosensor, such as a blood glucose sensor, containing an osmium complex or a salt compound thereof.
  • one embodiment of the present invention reacts with an enzyme capable of redoxing an analyte to be included in a biological sample and is not affected by oxygen partial pressure, and maintains a stable redox form for a long time, thereby providing an electron transfer medium for an electrochemical biosensor.
  • an enzyme capable of redoxing an analyte to be included in a biological sample and is not affected by oxygen partial pressure and maintains a stable redox form for a long time, thereby providing an electron transfer medium for an electrochemical biosensor.
  • One embodiment includes an osmium complex that reacts with an enzyme capable of redoxing an analyte in a biological sample, such as a liquid biological sample, and is free from the effects of oxygen partial pressure and maintains a stable redox form for a long time. Is an electron transfer medium.
  • the osmium complex has the structure of Formula 1:
  • A is a compound having Formula 2
  • X may be each independently selected from the group consisting of halogen elements, for example F, CI, Br and I,
  • n is an integer of 0-4, and the sum of m and n is an integer of 3-5.
  • the redox reaction reagent according to the present invention more specifically, the electrochemical biosensor reagent is not affected by oxygen, has a small change in performance due to temperature and humidity, and a small change in performance even after long-term storage. have.
  • One embodiment of the present invention is a substrate having at least two or more electrodes, the formula
  • the present invention relates to an electrochemical biosensor prepared by fixing an enzyme capable of redoxing a salt compound and an analyte included in a liquid biological sample.
  • the electrode may be a working electrode and an auxiliary electrode,
  • the enzyme and the osmium complex or a salt compound thereof can be secured to the working electrode.
  • embodiments of the present invention illustrate biosensors for measuring glucose as applicable examples of electrochemical biosensors, cholester, lactate, creatinine, It is applicable to biosensors for the quantification of various substances such as hydrogen peroxide, alcohols, amino acids, and glutamate.
  • One embodiment of the present invention is a substrate having at least two electrodes
  • the present invention relates to an electrochemical semi-ion sensor prepared by immobilizing an osmium complex having 1 or an salt compound thereof and an enzyme capable of redoxing an analyte included in a liquid biological sample:
  • A is a compound having formula (2), that is, 4,4'-dicarboxy-2,2'-bipyridine (dcbpy).
  • X may be each independently selected from the group consisting of halogen elements, for example F, CI, Br and I,
  • n is an integer of 0-4, and the sum of m and n is an integer of 3-5.
  • Examples of osmium complexes according to the present invention may be compounds having the following Chemical Formulas 3, 4 and 5.
  • the osmium complex having the structure of Formula 1 according to the present invention may include a trivalent osmium complex and a divalent osmium complex, preferably an oxidized compound (trivalent Os compound).
  • a trivalent osmium complex and a divalent osmium complex preferably an oxidized compound (trivalent Os compound).
  • the osmium complex of Formula 1 is a mixture containing both an oxidized state and a reduced state compound, it is oxidized to provide a salt compound of an oxidized osmium complex or an oxidized osmium complex, or an oxidizing agent is added to the reagent composition. It can be included as.
  • the osmium complexes according to the invention may be in salt form and are more preferred because the salt compounds have high solubility.
  • the salt compound may be a salt compound of at least one alkali metal selected from the group consisting of Li salt, Na salt, K salt, Rb salt, Cs salt and Fr salt.
  • the osmium complex S having the structure of Formula 1 according to the present invention may be a salt compound thereof, and the osmium contained in the osmium complex or a salt compound thereof is preferably in a trivalent oxidation state.
  • the osmium complex salt compound of the oxidation state is prepared by treatment with an oxidizing agent, or the osmium is first treated with an oxidizing agent to prepare the osmium complex of the oxidation state
  • oxidized Osmum complexes may be prepared as salt compounds. '
  • the osmium complex is a compound having formula (2) and It may be synthesized using a compound of the formula (6).
  • Y is K, Na or NH 4
  • X is a halogen element
  • p is an integer of 1-2
  • q is an integer of 1-6.
  • the osmuffle complex according to the invention is a compound of formula 6 with 4,4'-dicarboxy ⁇ 2,2'-bipyridine (dcbpy), for example K 2 0sCl 6 or (NH 4 ) 2 [OsCl 6 ] can be synthesized using as a starting material.
  • dcbpy 4,4'-dicarboxy ⁇ 2,2'-bipyridine
  • K 2 0sCl 6 or (NH 4 ) 2 [OsCl 6 ] can be synthesized using as a starting material.
  • Reaction Formula 1 Reaction Formula 1
  • the synthesized osmium complex may be an osmium complex (trivalent Os compound) in an oxidized state obtained by performing an oxidation treatment using various oxidants.
  • the oxidizing agent used in the oxidation treatment of the present invention is not particularly limited, and specific examples thereof include NaOCl, ⁇ 2 0 2) 0 2 '0 3 , Pb0 2 ' Mn0 2 , KMn0 4 , C10 2) F 2 , Cl 2> H 2 Cr0 4) K 2 Cr 2 0 7 , N 2 0, Ag 2 0, Os0 4 , H2S2O8, pyridinium chlorochromate, 3 ⁇ 4 2,2'— may be one or more selected from the group consisting of dipyridyldisulfide.
  • the oxidation state compound may be prepared according to Scheme 2 below.
  • the salt form of the osmium complex is more preferred due to the increased solubility.
  • the procedure for preparing a salt compound of the osmium complex using NaOH is shown in Reaction Formula 3 below.
  • the salt compound of the osmium complex may be a salt compound of at least one alkali metal selected from the group consisting of Li salt, Na salt, K salt, Rb salt, Cs salt and Fr salt, but is not limited thereto. .
  • One example of the invention reacts with GDH and is not affected by oxygen partial pressure, It relates to an electron transfer medium comprising an osmium complex in which the long-term redox form is stably maintained.
  • the osmium complex according to the present invention has the structure of Chemical Formula 1, and the osmium complex is as described above.
  • the electrochemical biosensor according to the present invention may include an enzyme and an electron transfer medium capable of redoxing an analyte included in a liquid biological sample, and the electron transfer medium may be an osmium complex or a salt compound thereof as a single component. It may be included or as a main component.
  • the electron transfer medium includes an osmium complex or a salt compound thereof as a main component, and preferably does not include an osmium complex or a metal complex other than the salt compound thereof.
  • a further embodiment of the present invention relates to a reagent for redox reaction, preferably an electrochemical biosensor, comprising an electron transfer medium comprising an osmium complex and an oxidoreductase.
  • the method of manufacturing a common summing stage reduction reaction reagent for the stability promoting oxide containing a month medium is provided.
  • the redox reagent composition may be applied to an electrochemical biosensor, so in another example, a reagent for enhanced electrochemical biosensor comprising mixing a redox enzyme and an electron transfer mediator. It provides a method for producing.
  • Another example provides an electrochemical biosensor comprising a reagent composition for an electrochemical biosensor having enhanced stability.
  • the electron transport mediator In the electron transport mediator, redox drug composition and electrochemical biosensor according to the present invention, the electron transport mediator is reacted with the metabolite to be reduced by the reduced enzyme and redox reaction, and thus the reduced electrons formed
  • the transfer medium plays a role in generating a current at the surface of the electrode to which the oxidation potential is applied.
  • the osmium complex of the present invention or a salt compound thereof may be used alone, or may further include at least one second electron transfer medium. Can be.
  • Electron transfer mediator according to the present invention, the redox reagent composition and Electrochemical :
  • the osmium ' complex may be used as the osmium complex itself, or a salt compound of an osmium complex, an oxidized compound of an osmium complex, or a compound obtained by oxidizing a salt compound of an osmium complex.
  • the redox reaction reagent composition and electrochemical BaoSensor (a) redox enzyme and () osmium complex, salt compound of osmium complex, oxidation treatment compound of osmium complex, or osmium And a compound obtained by oxidizing the salt compound of the complex, and (c) an oxidizing agent.
  • (c) further comprises an oxidizing agent
  • the (b) component is not subjected to oxidation
  • 3 ⁇ 4 is an osmium complex or a salt compound thereof.
  • the oxidizing agent is not particularly limited, and specific examples NaOCl, H 2 0 2, 0 2, 0 3, Pb0 2, Mn0 2, KMn0 4, C10 2, F 2l Cl 2, H 2 Cr0 4> K 2 Cr 2 0 7 , N 2 0, Ag 2 0, Os0 4 , H 2 S 208, pyridinium chlorochromate, and 2,2'_Dipyridyldisulfide.
  • the content of the oxidizing agent added to the redox reaction reagent composition according to the present invention is not particularly limited as long as it provides an oxidation state of the osmium complex.
  • the content of the oxidizing agent according to the present invention is based on 1 mol of the osmium complex. 0.1 to 10 molar ratio.
  • the glucose detection performance can be significantly increased and there is little effect of various interferences of glucose detection. .
  • the reagent composition according to the present invention may contain 20 to 700 parts by weight of osmium complex, such as 60 to 700 parts by weight or 30 to 340 parts by weight, based on 100 parts by weight of oxidoreductase.
  • the content of the osmium complex may be appropriately adjusted according to the activity of the oxidoreductase. If the activity of the oxidoreductase contained in the reagent composition is high, the reagent composition may exhibit the desired effect even if the content of the metal-containing complex is low. The higher the oxidoreductase activity, the lower the content of the metal-containing complex can be controlled to be relatively low.
  • the reagent composition comprising the second electron transfer mediator is based on 100 parts by weight of the redox enzyme . It may contain 2 to 25 parts by weight, such as 6 to 25 parts by weight or 6 to 20 parts by weight.
  • the content of the second electron transfer mediator can be appropriately adjusted according to the activity of the oxidoreductase.
  • the reagent composition can exert the desired effect even if the content of the metal-containing complex is low. Therefore, in general, the higher the activity of the oxidoreductase, the lower the content of the tannin or its derivatives can be controlled relatively.
  • the electron transport mediator of Crab 2 is thionine, 1-methoxy PMS (1 ⁇ ).
  • Methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate 3 ⁇ amino-he "(2,3, 4, 5, 6 pentamide hydroxyamido) ⁇ 5 ⁇ phenothiazinium (3-amino ⁇ (2, 3, 4, 5,6-pentahydroxy hexanamido)-5— phenothiazinium), ..
  • the molar ratio of thionine or 1 ⁇ methoxy PMS and osmium complex may be 1: 1 to 20, more specifically 1: 1 to 10.
  • the oxidoreductase refers to an enzyme that catalyzes the redox reaction of a living body, and in the present invention, an enzyme that is reduced by reacting with a metabolite to be measured in the case of a target substance to be measured, such as a biosensor.
  • the reduced enzyme reacts with the electron transfer medium, and the metabolite is quantified by measuring a signal such as a change in ⁇ generated current.
  • the oxidoreductase usable in the present invention may be one or more selected from the group consisting of various dehydrogenases, oxidases, esterases, and the like, depending on the redox or detection target substance, Among enzymes belonging to the enzyme group, an enzyme having a target substance as a substrate may be selected and used.
  • Phase 1 oxidoreductases include : glut 5i austalsoxoenzyme : (glucose dehydrogenase), glutamate dehydrogenase, glucose oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol esterification enzyme (cholesteror esterase), lactate oxidase (lactate oxidase), ascorbyl biksan oxidase '(ascorbic acid oxidase), alcohol oxidase (alcohol oxidase), alcohol dehydrogenase (alcohol dehydrogenase), bilirubin oxidase (bilirubin oxidase), etc. It may be one or more selected from the group consisting of.
  • the oxidoreductase to be measured may include a cofactor (cofactor) that serves to store the hydrogen taken by the oxidoreductase from a target material (eg metabolites), for example, flavin adenine dinucleotide (FAD) ), Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), pyrroloquinoline quinone (Pyrroloquinoline quinone, PQQ) and the like.
  • a cofactor that serves to store the hydrogen taken by the oxidoreductase from a target material (eg metabolites), for example, flavin adenine dinucleotide (FAD) ), Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), pyrroloquinoline quinone (Pyrroloquinoline quinone, PQQ) and the like.
  • glucose dehydrogenase may be used as the oxidoreductase, and the glucose dehydrogenase is a flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase including FAD as a cofactor.
  • the oxidoreductases available may include FAD-GDH (eg, EC 1.1.99.10, etc.), NAD-GDH (eg, EC 1.1.1.47, etc.), PQQ-GDH (eg, EC1.1.5.2).
  • the reagent composition according to the present invention is a surfactant, a water-soluble polymer, the fourth One or more additives selected from the group consisting of ammonium salts, fatty acids, thickeners, and the like may be further included for the role of dispersants in dissolving reagents, pressure-sensitive adhesives in preparing reagents, stabilizers for long-term storage, and the like.
  • the surfactant may serve to distribute the reagent evenly on the electrode when the reagent is dispensed, so that the reagent is dispensed with a uniform thickness.
  • Triton X-100 as the surfactant sodium dodecyl sulfate, sodium dodecyl sulfate, perfluorooctane sulfonate, sodium stearate, sodium stearate, etc. More than one species can be used.
  • Reagent composition according to the present invention in order to properly perform the role of the reagent to be evenly spread on the electrode when the reagent is dispensed to distribute the reagent to a uniform thickness, 3 Net weights of 25 parts by weight, such as from 10 to 25 parts by weight.
  • an oxidoreductase having an activity of 700 U / mg it may contain 10 to 25 parts by weight of the surfactant based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, and if the activity of the oxidoreductase is higher than this, the content of the surfactant Can be adjusted lower than this.
  • the water-soluble polymer may serve to help stabilize and disperse the enzyme as a polymer support of the reagent composition.
  • the water-soluble polymers include polyvinyl pyrrolidone (PVP), polyvinyl alcohol (PVA), polyfluorosulfonate, hydroxyethyl cellulose (HEG), At least one selected from the group consisting of hydroxypropyl cellulose (HPC), carboxy methyl cellulose (CMC), cellulose acetate, polyamide, and the like It can be used.
  • Reagent composition according to the present invention 10 to 70 parts by weight, for example, based on 100 parts by weight of the redox enzyme in order to provide a sufficient and appropriate role to help stabilize and disperse the oxidoreductase It may be contained in an amount of 30 to 70 parts by weight.
  • an oxidoreductase having an activity of 700 U / mg it may contain 30 to 70 parts by weight of a water-soluble polymer based on 100 parts by weight of the oxidoreductase. The content of the polymer can be controlled lower than this.
  • the water-soluble polymer may have an increased average molecular weight of about 2,500 to 3,000,000, for example, about 5 000 000 to about 1,000,000 in order to effectively perform the dynamics to help stabilize and disperse the support and the enzyme.
  • the quaternary ammonium salt may serve to reduce the measurement error according to the amount of hematocrit.
  • Examples of the quaternary ammonium salts include acyltrimethylammonium and myristyltrimethylammonium.
  • the reagent composition according to the present invention may contain the quaternary ammonium salt in an amount of 20 to 130 parts by weight, such as 70 to 130 parts by weight, based on 100 parts by weight of the redox enzyme, in order to efficiently reduce the measurement error according to the red blood cell volume ratio. have.
  • an oxidoreductase having an activity of 700 U / mg it may contain 70 to 130 parts by weight of the quaternary ammonium salt based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, and if the activity of the oxidoreductase is higher than this, the quaternary ammonium salt The content of can be adjusted lower than this.
  • the fatty acid and the quaternary ammonium salt described above the role of reducing the measurement error due to the amount of hematocrit (hematocrit) as shown, and also serves to extend the linear dynamic range (linear dynamic range) of the biosensor at high concentration region .
  • the fatty acid may be one or more selected from the group consisting of fatty acids having a C4 to C20 carbon chain and fatty acid salts thereof, preferably fatty acids having an alkyl carbon chain consisting of C6 C12 or fatty acid salts thereof.
  • the fatty acids include caproic acid, heptanoic acid, caprylic acid, octanoic acid, nonanoic acid, and ⁇ l "capric acid.
  • the fatty acid in order to properly obtain the effect of reducing the measurement error according to erythrocytes and the linear dynamic range of the biosensor in the high concentration region, is 10 to '70 based on the redox enzyme 100: parts by weight It may contain as parts by weight, for example, both portions 30 to 70 wt. For example, in the case of using an oxidoreductase having an activity of 700 U / mg, it may contain 30 to 70 parts by weight of fatty acid based on 100 parts by weight of the oxidoreductase. Can be adjusted low.
  • the thickener serves to firmly attach the reagent to the electrode.
  • the thickener one or more selected from the group consisting of natrosol, diethylaminoethyl-dextran hydrochloride, and the like can be used.
  • the reagent composition according to the present invention may contain the thickener in an amount of 10 to 90 parts by weight, such as 30 to 90 parts by weight, based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, so that the reagent is firmly attached to the electrode.
  • an oxidoreductase having an activity of 700 U / mg it may contain 30 to 90 parts by weight of a thickener based on 100 parts by weight of the oxidoreductase. the content may be lower than this. adjust.
  • an electrochemical biosensor comprising the reagent composition.
  • an osmium complex having the formula (1) or a salt compound thereof It is an electrochemical biosensor manufactured by applying an enzyme capable of redoxing an analyte to be included in a body biological sample and drying it.
  • the working electrode and the auxiliary electrode are provided on one plane, and the planar electrochemical biosensor is provided, wherein the reagent composition according to the present invention is included on the working electrode.
  • the electrochemical biosensor in another embodiment, is characterized in that the working electrode and the auxiliary electrode is provided so as to face on different planes, the reagent composition according to the present invention is included on the working electrode A sensor is provided.
  • the form contains a "reagent composition according to the invention according to the biosensor is not particularly limited, may be included in a particular coating on the working electrode surface form However, it is not limited thereto.
  • the planar and face type electrochemical biosensor according to the present invention is, for example, Republic of Korea Patent Publication : No. 10-2004—0105429, Republic of Korea Patent Publication No. 10-2006- 0089464, Republic of Korea Patent Registration No. 0854389, Republic of Korea Patent Publication 10 2008- 0080841, Republic of Korea Patent Publication No. 10-2008-0084030, Republic of Korea Patent Publication No. 10-2008-0088028 It can be prepared by a method known in the art.
  • the planar electrochemical biosensor illustrated in FIG. 1 includes a top plate 11 having a working electrode and an auxiliary electrode provided on one plane, and having a vent 10 for allowing blood to permeate into the sensor from above; There is adhesive-coated on both sides and serves to bond the i and the upper panel to the lower panel, the fitting plate 9 for the blood to permeate into the electrode by capillary action deuldorok; To the working electrode and the electrode contained in this article (e.g., coating) the other reagents in the present composition are: 8;, to the working electrode and having a passage portion for defining the area of the auxiliary electrode an insulating sheet (7); work to be printed onto the lower plate electrode (2) and the auxiliary electrode (3); And a lower plate 1 on which the working electrode and the auxiliary electrode are formed.
  • the face type electrochemical biosensor shown in FIG. 2 is provided such that the working electrode and the auxiliary electrode face each other on a different plane, and includes a vent 10 for allowing blood to permeate into the sensor from above.
  • An adhesive is coated on both sides to serve to bond the upper plate and the lower plate, and an insertion plate 9 for allowing blood to penetrate into the electrode by capillary action;
  • the electron transport medium containing the osmium complex according to the present invention reacts with GDH and is not affected by the oxygen partial pressure, and is long term ;
  • the redox form is maintained stably, the redox reaction reagent, and the electrochemical biosensor applying the same, the measurement error due to the partial pressure of oxygen in the sample is minimized, there is an advantage that can be used stably for a long time.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view of a planar biosensor according to an embodiment of the present invention.
  • 2 is an exploded perspective view of a face-type biosensor according to an embodiment of the present invention.
  • 3a and 3b show the 1 H NMR spectrum results of the osmium compound prepared in Example 1.
  • 4A and 4B are graphs showing measurement results of currents according to glucose concentration changes according to Example 1;
  • Figures 5a to 5c compare the changes in the UV-visible spectrum over time in aqueous solutions of various electron transfer mediators.
  • Figure 5a relates to osmium complexes and
  • Figure 5b to ruthenium hexamine.
  • 5c relates to ferricyanide.
  • Figure 6 shows the change in characteristics over time in the storage conditions of the osmium-based glucose strip sensor, (a) the ground current and (b) the response slope.
  • FIG. 8 illustrates the change of characteristics over time in the storage condition of an osmium complex-based glucose strip sensor according to the addition of an oxidizing agent (NaOCl), and relates to (a) a ground current and (b) a guiding phase.
  • an oxidizing agent NaOCl
  • FIG. 9 shows the change of characteristics over time in osmium complex-based glucose strip sensor and storage conditions with addition of oxidant (3 ⁇ 40 2 ).
  • FIG. 10 is a graph illustrating characteristics change over time in storage conditions of an osmium complex (oxidized state) based glucose strip sensor oxidized with an oxidizing agent (3 ⁇ 40 2 ). Indicates.
  • FIG. 11 shows the change in characteristics over time in storage conditions of an oxidized oxidized (NaOCl) -based ounceium complex (oxidized state) based glucose strip sensor.
  • 13A and 13B show a change in characteristics according to a change in applied voltage of an oxidizing agent (NaOCl) ⁇ oxidized osmium complex (oxidized state) based glucose strip sensor.
  • 14A and 14B show changes in properties over time in storage conditions of an osmium complex (oxidized) based glucose strip sensor.
  • 15a and 15b show the osmium complex (oxidized) based glucose strip sensor ⁇ over time in storage conditions . % Error change by concentration.
  • FIG. 16 shows the degree of disturbance according to the oxygen partial pressure for each glucose concentration over time in the storage condition of the osmium complex (oxidized state) based glucose strip sensor.
  • Os (dcbpy) 2 Cl 2 (osmium complex) was synthesized using 4'-dicarboxy-2,2'-bipyridine (dcbpy) and ⁇ K 2 0sCl 6 as starting materials.
  • Cyclic voltammetry was performed to verify the electrochemical properties of osmium complexes.
  • the working electrode is a carbon electrode
  • the auxiliary electrode is platinum
  • a reference electrode is Ag / AgCl .
  • (sat.KC1) electrodes were used and measured with varying glucose concentration on 10 mg / mL FAD-glucose dehydrogenase (FAD-GDH), 30 mmol of osmium complex and 0.1 M PBS (pH 7.4) mixed solution.
  • the scan rate was measured in the range of -0.2 V to 0.3 V at 10 mV / sec.
  • the measurement result graph is shown in FIG.
  • the synthesized osmium complex has a low solubility in water as an organometallic compound because dcbpy, a bypyridin structure having a carboxyl (COOH) group, is coordinated with a ligand as osmium (Os).
  • the solubility was increased by converting one COOH functional group of the osmium complex into a salt form substituted with ⁇ COO—Na + .
  • the equivalence ratio was determined by titration to convert to the salt form, and the proper equivalence ratio was found to be 1: 3.
  • the osmium complex sodium salt substituted with a 1: 3 equivalent ratio using NaOH was used.
  • Example 3 Oxidation of Osmium Complexes
  • UV-visible spectrum changes over time in aqueous solution were compared with ruthenium hexamine and ferricyanide, which are currently used as electron transfer mediators of glucose strip sensors.
  • the working electrode is carbon
  • the reference electrode is Ag / AgCl-based large -area sensor.
  • the osmium complex 30 mM, FAD-GDH 10 mg / mL, 0.1 M PBS (pH 7.4) as surfactant and back electrolyte.
  • Os-based glucose strip sensors were used to measure electrochemical properties (such as sensitivity, stability, effects of oxygen partial pressure), CareSens N (Ru + GOX), CareSens Pro (Fe + GDH), and VetMate (Ru + GDH). + Thionin) to compare with three glucose strip sensors. Response . The characteristics were measured at an applied voltage of 0.2 V using a multi-channel biosensor system.
  • the osmotic properties of osmium-based glucose strip sensors over time under normal storage conditions were investigated.
  • the 30 mM Os-based strips and CareSens N, CareSens Pro and VetMate 3 capsules were stored in a storage room with a temperature of 23 ° C and a relative humidity of 20% or less.
  • the partial pressure of oxygen was measured at low (90 mg / dL), medium (200 mg / dL), and high (400 mg / dL) concentrations of glucose at saturation (160 mmHg) and low partial pressure (40 mmHg) with deoxygenation. Then, the% error was calculated according to the oxygen partial pressure difference by the following equation.
  • the sensitization characteristics were 0.2 applied voltage using multi-channel biosensor system.
  • the working electrode uses carbon
  • the reference electrode is a Ag / AgCl face-to-face sensor
  • the osmium complex is 20 mM, 30 mM and FAD—GDH 10 mg / mL, respectively, and 0.1 M PBS (pH 4)
  • Two basic compositions using two compositions containing the same amount of H 2 O 2 as the osmium complex, and a composition with 30% increase in GDH in the 30 mM Os composition containing H 2 O 2 Os-based glucose strip sensors with five compositions were measured and their electrochemical properties (such as sensitivity, stability, and effects of oxygen partial pressure) were measured and compared with CareSens N and CareSens Pro two glucose strip sensors.
  • the Os-based strip to which 3 ⁇ 40 2 was added showed a similar background current of about 0.2 ⁇ and more than 20 nA / (mg / dL) decay compared to the NaOCl-added strip.
  • the working electrode is carbon
  • the reference electrode is a Ag / AgCl face-type sensor
  • the osmium complex is 20 mM, 30 mM and 10 mg / mL FAD-GDH, respectively, 0.1 M PBS (pH 7.4) as a surfactant and a base electrolyte.
  • the sensitization characteristics were measured at an applied voltage of 0.2 V using a multi-channel biosensor system.
  • Os (ox) complex-based strips oxidized with H 2 0 2 were found to have a background current of about 0.2 ⁇ similar to that of Os-based strips containing 3 ⁇ 40 2 . case was investigated by the background current is higher than the Os (ox) complex-based strips with the same conditions, sensitized Crawl group also 3 ⁇ 40 2 a as compared with the strip Os (ox) oxidizing a 3 ⁇ 40 2 was added to complex and Os (ox) salt It was shown that there was a slight increase in all four base compositions (FIG. 10). I.
  • Os (ox) complex-based strip sensor oxidized with NaOCl The carbon electrode was used as the working electrode, and the reference electrode was a Ag / AgCl filled face sensor.
  • the osmium complexes were 20 mM, 30 mM and 10 mg of FAD-GDH, respectively.
  • the characteristics were measured at an applied voltage of 0.2 V using a multi-channel biosensor system.
  • the change in characteristics over time was investigated while storing at storage conditions.
  • Os (ox) complex-based strips oxidized with NaQCl showed the best electrochemical sensitization characteristics of Os-based strips studied so far, including low background current, response slope, stability over time and reduced effects of oxygen partial pressure. (FIG. 11, FIG. 12).
  • Os (ox) complex strip sensor In order to investigate the sensitization characteristics of Os (ox) complex strip sensor according to applied voltage, a face-type sensor made of carbon and Ag / AgCl was used as the working electrode and GDH was used as the os (ox) complex 30 mM and FA.
  • An os (ox) complex-based glucose strip sensor was prepared using 10 mg / mL, surfactant, and 0.1 M PBS (pH 7.4) as a base electrolyte. The sensitization characteristics were measured at 0.05 V intervals in the applied voltage range of 0.1 V to 0.4 V using a multi-channel biosensor system with easy change of applied voltage.
  • the multi-channel biosensor system was used for measurement and 0.3 V was applied.
  • the Os (ox) complex-based strip sensor oxidized with NaOCl was found to maintain stable background current and kinetic slope for more than 8 weeks under storage conditions.
  • the% Error was calculated using the current values of 70 mg / dL glucose and 100 mg / dL glucose over time. .
  • the strip sensor of the oxidized Os (ox) complex and FAD -GDH enzyme oxidized with NaOCl was stable for more than 8 weeks at room temperature and maintained the effects of changes in background current, kinetic slope and oxygen partial pressure.

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Abstract

본 발명은 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 효소와 반응하며 산소 분압에 의한 영향이 없고, 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되는 오스뮴 착물을 포함하는 전자전달 매개체, 상기 오스뮴 착물을 포함하는 전기화학적 바이 오센서용 산화환원반응시약, 및 전기화학적 바이오센서에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
전기화학적 바이오센서
【기술분야】
본 발명은 산소 분압에 의한 영향이 없고， 장기간 산화 환원 형태가 안정 적으로 유지되는 오스뮴 착물， 그리고 오스뮴 착물을 포함하는 전자 전달 매개체， 및 상기 전자 전달 매개체와 산화환원효소를 포함하는 전기화학적 바이오센서에 관한 것이다.
【배경기술】
최근 의료 분야부터 환경 및 식품 분야까지 목표 분석물의 정량 및 정성 분석을 위해 바이오센서의 개발에 대한 관심이 증대되고 있다. 특히 효소를 이용 한 바이오센서는， 생물체의 기능성 물질 또는 미생물 등 생물체가 특정 물질과 예 민하게 반웅하는 생물 감지 기능을 이용하여 시료 내 화학 물질을 선택적으로 검 출 및 계측히 "는 데 사용하는 화학 센서， 예를 들면 주로 혈당 센서와 같은 의료 계측 용도로 개발되었으며, 그 외 식품 공학이나 환경 계측 분야에서도 활발한 연 구가 이루어지고 있다.
혈당의 주기적인 측정은 당뇨 관리에 있어 대단히 중요하며， 이에 정확성 과 정밀성을 갖춘다양한 종류의 전기화학적 바이오센서가 널라쓰이고 있다. 혈 당을 측정하는 전기화학적 바이오센서는 효소， 전자 전달 매개체 및 다양한 안정 제와 분산제를 섞어서 조제한 시약을 작동 전극에 도포하여 건조시켜 제조하는데， 상기 바이오센서의 특성을 가장 크게 좌우하는 것은 사용하는 효소의 종류와 전 자 전달 매개체의 특성이다.
예를 들어， 대부분의 상용화된 전기화학적 센서에 사용되는 글루코오스 산 화환원효소인 FAD-GOX (flavin adenine dinucleotideᅳ glucose oxidase)는 열에 안정하고 글루코오스만을 산화시키는 반웅 선택성은 탁월하지만， 혈액에 녹아 있 는 산소와 반웅하기 때문에， FAD-G0X 효소를 사용하여 만든 센서는 정맥혈， 동 맥혈, 또는 모세혈과 같은 시료 혈액의 종류에 따라서 측정값이 크게 다를 수 있 다.
Guibault와 Lubrano 등은 생성된 과산화수소를 전류법으로 측정하는 방법 을 제안하였다. 약 +600 mV (vs. Ag/AgCl)의 산화전위가 전극에 도입되면 다음 과정에서 전류값이 얻어지게 된다. 그러나 이러한 방법의 혈당 센서는 시료 내에 존재하는 용존 산소량에 크게 의존하여 과산화수소의 산화전류를 측정할 때 높은 산화전위를 가함으로써, 시료 내 낮은 전위에서 산화될 수 있는 약물 및 대사물 질 (아스코르브산， 요산， 아세트아미노펜， 도파민 등)이 전극에서 함께 산화되어 심각한 측정 오차를 유발한다.
혈당 센서의 산소 의존성을 극복하기 위한 방법 중 하나로서 , 산소 대신 전극 표면 위에 전극 표면과 효소 활성자리 사이의 전자 전달을 용이하도록 전자 전달 매개체 (electron transfer mediator)를 도입하였으며， 또한 상대적으로 낮은 형식전위를 가지는 ferrocene 유도체 등과 같은 유기금속 전자 전달 매개체를 도 입하여 생체 시료에 존재하는 다른 산화성 물질들 (아스코르브산， 요산, 아세트아 미노펜 등)의 방해 효과를 최소화하려는 연구가 진행되었다.
혈당 센서의 개발 추이는， 효소 측면에서 채혈된 혈액의 종류 (정맥혈， 모 세혈 등)에 따라 달라지는 산소 분압 (p02) 차이에. .따른 측정치 변화를 차단하기 위하여, 혈액 내 글루코오스와 효소 반응에서 산소가 참여하는 GOX 대신에 효소 반응에 산소가 배제된 GDH의 사용으로 전환되고 있다. 또한, 전자 전달 매개체의 경우 습도에 대한 안정성이 민감한 ferricyanide를 대신 하여 온도 및 습도에 대 한 안정성이 우수한 퀴논 유도체 (Phenanthroline quinone, Quineonediimine 등) 와 같은 유기 화합물과 Ru complex (ruthenium hexamine 등)나 오스뮴 착물과 같은 유기금속 화합물로 대체되고 있다.
가장 보편적으로 사용되는 전자 전달 매개체로는 포타슘페리시아나이드
[K3Fe(CN)6]가 있으며, 가격이 저렴하고 반응성이 좋아 FADᅳ GOX, PQQ-GDH 또는 FA으 GDH를 이용한 센서 모두에 유용하다. 그러나， 상기 전자 전달 매개체 를 이용한 센서는 혈액에 존재하는 요산 (uric acid)이나 겐티식산 (gentisic acid) 곽 같은 방해 물질에 의한 측정 오차가 발생하고， 온도와 습도에 의하여 쉽게 변 질되기 때문에 제조와 보관에 각별한 주의가 필요하며， 장시간 보관 후 바탕전류 의 변화로 인해， 낮은 농도의 글루코오스를 정확하게 검출하는데 어려움이 있다. ' 핵사아민루테늄클로라이드 [Ru(NH3)6Cl3]는 페리시아나이드에 비하여 산 화환원 안정성이 높다. 핵사아민루테늄클로라이드 전자 전달 매개체로 사용한 바 이오센서는 제조와 보관이 용이하고 장시간 보관 시에도 바탕전류의 변화가 작아 안정성이 높은 장점을 갖지만， FAD— GDH와 사용하기에는 반웅성이 서로 맞지 않 아 상업적으로 유용한 센서로 제작하기가 어렵다는'단점이 았다. 또한， 이들 전자 전달 매개체도 센세 스트립의 정확도가 산소 분압에 영향을 받는다는 문제점이 있다.
따라서 산소에 의하여 영향을 받지 않고， 은도와 습도에 의한 성능변화가 적으며， 장기간 보관한 후에도 성능의 변화가 적으며， 넓은 농도 범위의 측정이 가능하며, 대량생산에 적합한 산화환원반응용 시약， 보다 구체적으로 전기화학적 바이오센서용 시약을 제조하기 위한 기술의 개발이 요구되고 있다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 산화환원효소와 반응하며 산소 분압에 의한 영향이 없 고， 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되어 전기화학적 바이오센서용 전자 전달 매개체로 우수한， 오스뮴 착물과 이의 염화합물 및 이의 제조방법을 제공하 는 것이다.
본 발명의 목적은 산화환원효소와 반웅하며 산소 분압에 의한 영향이 없 고, 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되어 전기화학적 바이오센서용 전자 전달 매개체로 우수한 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물을 포함하는 전자 전달 매 개체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물을 포함 하는 전자 전달 매개체를 포함하는 산화환원반응용 시약 조성물을 제공하는 것이 다.
본 발명의 또 다른 목적은 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물을 포함하는 전자 전달 매개체를 포함하는 전기화학적 바이오센서를 제공하는 것이다. 【기술적 해결방법】
본 발명의 목적은 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있 는 효소와 반웅하며 산소 분압에 의한 영향이 없고， 장기간 산화 환원 형태가 안 정적으로 유지되는 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물을， 그리고 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물을 포함하는 전자 전달 매개체， 산화환원반응시약, 및 전기화학적 바이오센서， 예컨대 혈당 센서를 제공하는 것이다. 구체적으로 본 발명의 일예는 생체시료에 포함된 분석 대상 물질을 산화 환원시킬 수 있는 효소와 반웅하며 산소 분압에 의한 영향이 없고， 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되어 전기화학적 바이오센서용 전자 전달 매개체로 우수한， 오스뮴 착물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
일구체예는 생체시료, 예를 들면 액체 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 효소와 반웅하며 산소 분압에 의한 영향이 없고， 장기간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되는 오스뮴 착물을 포함하는 전자 전달 매개체에 과한 것이다. 상기 오스뮴 착물은 하기 화학식 1의 구조를 가진다:
[화학식 1 ]
Os (A)mXn 상기 식에서，
A는 하기 화학식 2를 가지는 화합물이며，
[화학식 2]
Figure imgf000006_0001
X는 각각 독립적으로 할로겐 원소， 예를 들면 F, CI, Br 및 I로 이루어지는 군에서 선택될 수 있으며,
m은 1 내지 3의 정수이고， n은 0 내지 4의 정수이고， m과 n의 합은 3 내지 5의 정수이다.
본 발명에 따른 산화환원반웅용 시약， 보다 구체적으로 전기화학적 바이오센서용 시약은 산소에 의하여 영향받지 않고, 온도와 습도에 의한 성능변화가 적으며, 장기간 보관한 후에도 성능의 변화가 적다는 장점이 있다. 본 발명의 일예는 적어도 두 개 이상의 전극올 갖춘 기판에, 하기 화학식
1을 갖는 오스뮴 착물 또는 . 이의 염화합물과 액체 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 효소를 고정하여 제작한 전기화학적 바이오센서에 관한 것이다. 상기 전극의 예로는 작동전극과 보조전극일 수 있으며， 예컨대 효소와 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물은 '작동전극에 고정될 수 있다. 본 발명의 구체예는 전기화학적 바이오센서의 적용 가능한 예로서 글루코오스를 측정하기 위한 바이오센서를 예시하고 있지만, 본 발명의 시약 조성물에 포함되는 효소의 종류를 달리함으로써 콜레스테를, 락테이트， 크레아티닌， 과산화수소， 알코올， 아미노산， 및 글루타메이트와 같은 다양한 물질의 정량을 위한 바이오센서에 적용할 수 있다.
오스뮴 착물 (산화상태 )를 기반으로 한 글루코오스 스트립 센서의 보관 조건에서 인가 전압을 0.3 V로 한 장기 안정성 실험 결과 8주 이상 바탕 전류 (0.3 μΑ), 감응 기울기 (45 nA/(mg/dD ) 및 산소 분압에 따른 % 오차 (4% 이내) 등을 안정적으로 유지한다. 20 mM ~ 200 mM 구간에서 교정한 결과를 바탕으로 시간 경과에 따른 70 mg/dL 글루코오스와 100 mg/dL 글루코오스의 전류값을 이용하여 & 오차를 연산한 결과 10% 이;하의 유효한 결과를 나타낸다. 기존 센서의 가장 큰 문제점으로 작용한 산소 분압에 따른 영향 또한, 전체적으로 4% 이내의 산소 분압에 따른 영향을 받는 것으로 평가되었다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.
본 발명의 일예는 적어도 두 개 이상의 전극을 갖춘 기판에， 하기 화학식
1을 갖는 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물과 액체 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 효소를 고정하여 제작한 전기화학적 반이오센서에 관한 것이다:
[화학식 1 ]
Os(A)mXn
상기 식에서 .，
A는 하기 화학식 2을 가지는 화합물， 즉 4,4'-dicarboxy- 2,2'-bipyridine (dcbpy).이며，
[화학식 2 ]
Figure imgf000007_0001
X는 각각 독립적으로 할로겐 원소， 예를 들면 F, CI, Br 및 I로 이루어지는 군에서 선택될 수 있으며,
m은 1 내지 3의, 정수이고, n은 0 내지 4의 정수이고， m과 n의 합은 3 내지 5의 정수이다.
본 발명에 따른 오스뮴 착물의 예는 하기 화학식 3， 화학식 4 및 화학식 5를 갖는 화합물일 수 있다.
[화학식 3]
Figure imgf000008_0001
Os(dcbpy)CI4
[화학삭 4]
Figure imgf000008_0002
Os(dcbpy)CI, [화학식 5 ]
Figure imgf000009_0001
Os(dcbpy)3 본 발명에 따른 화학식 1의 구조를 갖는 오스뮴 착물은 3가 오스뮴 착물과 2가 오스뮴 착물을 포함할 수 있으며， 바람직하게는 산화상태의 화합물 (3가 Os 화합물)일 수, 있다. 또한, 화학식 1의 오스뮴 착물로서 산화상태와 환원상태의 화합물을 모두 포함하는 흔합물인 경우, 산화처리하여 산화상태의 오스뮴 착물 또는 산화상태의 오스뮴 착물의 염화합물을 제공하거나， 시약 조성물에 산화제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 오스뮴 착물은 염형태일 수 있으며, 염 화합물이 높은 용해도를 가지므로 더욱 바람작하다. 상기 염화합물은 Li염， Na염， K염, Rb염， Cs염 및 Fr염으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 알칼리금속의 염화합물일 수 있다.
따라서， 본 발명에 따른 화학식 1의 구조를 갖는 오스뮴 착물 S는 이의 염화합물일 수 있으며， 상기 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물에 포함된 오스뮴은 3가의 산화상태인 것이 바람직하다. 구체적으로， 오스뮴 착물 제조 후， 또는 오스뮴 착물의 염화합물을 제조한 후에， 산화제로 처리하여 산화상태의 오스뮴 착물 염화합물을 제조하거나， 먼저 오스뮴에 산화제를 처리하여 산화상태의 오스뮴 착물을 제조한 후에, 산화상태의 오스뭄 착물을 염화합물로 제조할 수도 있다. '
본 발명의 일예에서, 상기 오스뮴 착물이 화학식 2를 가지는 화합물과 하기 화학식 6의 화합물을 이용하여 합성된 것일 수 있다.
[화학식 2]
Figure imgf000010_0001
[화학식 6]
YpOsXq 상기 식에서 ,
Y는 K, Na 또는 NH4이고， X는 할로겐 원소이며，
p는 1 내지 2의 정수이고， q는 1 내지 6의 정수이다.
'구체적인 일예에서， 본 발명쎄 따른 오스뭄 착물은 4,4'-dicarboxyᅳ 2，2'- bipyridine (dcbpy)와 화학식 6의 화합물로서 예를 들면 K20sCl6 또는 (NH4)2[OsCl6]을 출발물질로 사용하여 합성할 수 있다. 오스뮴 착물의 제조예로서 dcbpy와 K20sCl6를 사용한 오스뮴 착물의 합성 과정를 반웅식 1에 나타냈다.
[반웅식 1 ]
Figure imgf000010_0002
상기 합성된 오스뮴 착물을 다양한 산화제를 이용하여 산화처리를 수행하여 얻어진 산화상태의 오스뮴 착물 (3가 Os 화합물)일 수 있다. 본 발명의 산화처리에 사용되는 산화제는 특별히 한정하지 않으며， 구체적인 예는 NaOCl, Η202 ) 02' 03， Pb02' Mn02, KMn04, C102) F2, Cl2 > H2Cr04) K2Cr207, N20, Ag20, Os04, H2S2O8, pyridinium chlorochromate, ¾ 2,2'— Dipyridyldisulfide로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 본 발명의' 일예에 따라 산화상태 화합물은 하기 반응식 2에 따라 제조할 수 있다.
[반응식 2]
Figure imgf000011_0001
Os(dc pfy)2CI2≡ Os(H m) Os(dcbpy .Cl2≡ Os(lll)
본 발명의 일예에 따라 오스뮴 착물의 염형태가 용해도 증가로 인해 더욱 바람직하다. 오스뮴 착물의 염을 제조하는 일예로서， NaOH를 이용한 오스뮴 착물의 염화합물을 제조하는 과정올 하기 반웅식 3에 나타낸다. 상기 오스뮴 착물의 염화합물은 Li염， Na염， K염， Rb염， Cs염 및 Fr염으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 알칼리금속의 염화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 의도는 아니다. .
[반웅식 3]
Figure imgf000011_0002
Os(dcbpy)2Cl2 Os{dcbpy)2C!2 sodium salt
발명의 일예는 GDH와 반응하며 산소 분압에 의한 영향이 없고， 장가간 산화 환원 형태가 안정적으로 유지되는 오스뮴 착물을 포함하는 전자 전달 매개체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 오스뮴 착물은 상기 화학식 1의 구조를 가지며, 오스뮴 착물에 대해서는 상술한 바와 같다.
본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서는 액체 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 효소와 전자 전달 매개체를 포함할 수 있으며, 상기 전자 전달 매개체는 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물을 단독 성분으로 포함하거나， 주성분으로 포함할 수 있다. 또한， 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서에서， 전자 전달 매개체는 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물을 주성분으로 포함하며， 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물이외의 금속 착물을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 추가 일예는 오스뮴 착물을 포함하는 전자 전달 매개체 및 산화환원효소를 포함하는 산화환원반응용 시약, 바람직하게는 전기화학적 바이오센서용 시약 조성물에 관한 것이다.
, 또 다른 측면에서 산화환원효소 및 전자 전:달 매개체를 흔합하는 단계를 포함하는 안정성이 증진된 산화환원반응용 시약의 제조 방법이 제공된다. 구체예에서， 상기 산화환원반응용 시약 조성물은 전기화학적 바이오센서에 적용될 수 있으므로， 또 다른 예ᅳ에서 산화환원효소 및 전자 전달 매개체를 흔합하는 단계를 포함하는 안정성이 증진된 전기화학적 바이오센서용 시약의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 예는 상기 안정성이 증진된 전기화학적 바이오센서용 시약 조성물을 포함하는 전기화학적 바이오센서를 제공한다.
본 발명에 따른 전자 전달 매개체， 산화환원반응용 사약 조성물 및 전기화학적 바이오센서에서, 상기 전자 전달 매개체는 대사물질과 반웅하여 환원된 효소와 산화환원반웅에 의해 환원되게 되며， 이렇게 형성된 환원상태의 전자 전달 매개체는 산화전위가 인가된 전극표면에서 전류를 발생시키는 역할을 수행한다. 본 발명에 따른 전자 전달 매개체ᅳ 산화환원반응용 시약 조성물 및 전기화학적 바이오센서에서, 본 발명의 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물을 단독으로 사용하거나， 제 2의 전자 전달 매개체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 전자 전달 매개체, 산화환원반응용 시약 조성물 및 전기화학적 : 바이오센서에서, 상기 오스뮴 '착물은 오스뮴 착물 그 자체로 사용하거나, 오스뮴 착물의 염화합물， 오스뮴 착물의 산화처리한 화합물， 또는 오스뮴 착물의 염화합물을 산화처리한 화합물을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체예에 따르면， 상기 산화환원반웅용 시약 조성물 및 전기화학적 바아오센서에서， (a)산화환원효소 및 ( )오스뮴 착물， 오스뮴 착물의 염화합물, 오스뮴 착물의 산화처리 화합물, 또는 오스뮴 착물의 염화합물을 산화처리한 화합물， 및 (c)산화제를 포함할 수 있다. 상기 (c)산화제를 추가로 포함하는 경우， 상기 (b)성분은 산화처리하지 ¾는 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물이다. 상기 산화제는 특별히 한정하지 않으며， 구체적인 예는 NaOCl, H202, 02， 03， Pb02, Mn02, KMn04, C102, F2l Cl2, H2Cr04> K2Cr207, N20, Ag20, Os04, H2S208, pyridinium chlorochromate, 및 2,2'_Dipyridyldisulfide로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 산화환원반웅용 시약 조성물에 첨가되는 산화제의 함량은 오스뮴 착물의 산화상태를 제공하는 한 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면， 본 발명에 따른 산화제의 함량은 오스뮴 착물 1몰을 기준으로 0.1 내지 10 몰비일 수 있다.
본 발명의 구체예에 따르면 상기 전자 전달 매개체로서 오스뮴 착물과 추가로 제 2의 전자 전달 매개체를 함께 사용함으로써 글루코오스 검출 성능을 현저히 증가시키고 글루코오스 검출의 여러 방해물질에 의한 .영향이 거의 없도록 할 수 있다.
본 발명에 따른 시약 조성물은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 오스뮴 착물 20 내지 700 중량부, 예컨대 60 내지 700 중량부 또는 30 내지 340 중량부를 함유할 수 있다. 상기 오스뮴 착물의 함량은 산화환원효소의 활성도에 따라서 적절히 조절될 수 있으며， 시약 조성물 내에 함유된 산화환원효소의 활성도가 높으면 금속함유 착물의 함량이 낮아도 시약 조성물이 목적하는 효과를 발휘할 수 있으므로， 일반적으로 산화환원효소의 활성도가 높을수톡 금속함유 착물의 함량은 상대적으로 낮게 조절할 수 있다.
본 발명의 시약 조성물에서 전자 전달 매개체로서 기존의 루테늄 착물과 달리 오스뮴 착물 단독으로 사용하더라도 전자 전달 매개체로서 기능을 층분히 달성할 수 있다， 본 발명에서 추가적으로 금속착물 이외의 제 2의 전자 전달 매개체를 포함할 수 있다. 예를 들면， 오스뮴 착물과 제 2의 전자전달 매개체의 흔합물을 사용하는 경우， 제 2의 전자 전달 매개체를 포함하는 시약 조성물은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 제 2의 전자 전달 매개체를. 2 내지 25 중량부， 예컨대 6 내지 25 중량부 또는 6 내지 20 중량부를 함유할 수 있다. 상기 제 2의 전자 전달 매개체의 함량은 산화환원효소의 활성도에 따라서 적절히 조절할 수 있으며, 시약 조성물 내에 함유된 산화환원효소의 활성도가 높으면 금속함유 착물의 함량이 낮아도 시약 조성물이 목적하는 효과를 발휘할 수 있으므로， 일반적으로 산화환원효소의 활성도가 높을수록 타오닌 또는 이의 유도체의 함량은 상대적으로 낮게 조절할 수 있다.
상기 게 2의 전자 전달 매개체는 티오닌 (thionine), 1 -메특시 PMS ( 1ᅳ
Methoxy- 5 -methylphenazinium methylsulfate), 3一아미노―그 " (2,3, 4, 5, 6一 펜탄하이드록시핵산아미도)ᅳ 5ᅳ페노티아지늄 ( 3 - aminoᅳ그 ( 2， 3， 4,5,6 - pentahydroxy hexanamido ) - 5— phenothiazinium ) , .. 1一메록시— 5一메틸페나지늄 ( 1 -Methoxy- 5 -methylphenazinium) , 아주르 C (Azure C) , 아주르 A (Azure A), 메틸렌블루 (Methylene Blue), 를루이딘블루 (Toluidine Blue), 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
전자 전달 매개체로서 오스뮴 착물과 티오닌 또는 이의 유도체의 흔합물， 및 /또는 오스뮴 착물을 1 -메톡시 PMS 또는 이의 유도체와 흔합물올 사용하는 경우, 티오닌 또는 1ᅳ메록시 PMS와 오스뮴 착물의 몰비 (티오닌 또는 1ᅳ메특시 PMS의 몰: 오스뮴 착물의 몰)가 1 : 1 내지 20, 보다 구체적으로 1 : 1 내지 10일 수 있다.
산화환원효소는 생체의 산화환원반웅을 촉매하는 효소를 총칭하는 것으로, 본 발명에서는 측정하고자 하는 대상물질， 예컨대 바이오센서의 경우에는 측정하고자 하는 대사물질과 반웅하여 환원되는 효소를 의미한다. 이와 같이 환원된 효소는 전자 전달 매개체와 반웅하며， 이 때^ 발생힌ᅳ 전류변화 등의 신호를 측정하여 대사물질을 정량하게 된다. 본 발명에 사용 가능한 산화환원효소는 각종 탈수소효소 (dehydrogenase ) , 산화효소 (oxidase), 에스테르화효소 (esterase ) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으며， 산화환원 또는 검출 대상 물질에 따라서， 상기 효소 군에 속하는 효소들 중에서 상기 대상 물질을 기질로 하는 효소를 선택하여 사^할 수 있다. : :보다 구체적으로 상 1 산화환원효소는 글루 5i오스탈쑤소효소 : (glucose dehydrogenase) , 글루탐산탈수소효소 (glutamate dehydrogenase ) , 글루코오스산화효소 (glucose oxidase) , 콜레스테롤산화효소 (cholesterol oxidase) , 콜레스테롤에스테르화효소 (cholesteror esterase) , 락테이트산화효소 (lactate oxidase) , 아스코빅산산화효소 ' (ascorbic acid oxidase ) , 알코올산화효소 (alcohol oxidase) , 알코올탈수소효소 (alcohol dehydrogenase) , 빌리루빈산화효소 (bilirubin oxidase ) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
한편， 상기 산화환원효소는 측정하고자 . 하는 대상물질 (예컨대, 대사물질)로부터 산화환원효소가 뺏어온 수소를 보관하는 역할을 하는 보조인자 (cofactor)를 함께 포함할 수 있는데， 예컨대, 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드 (flavin adenine dinucleotide, FAD ) , 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 피를로퀴놀린 쥐논 (Pyrroloquinoline quinone, PQQ) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
예컨대， 혈증 글루코오스 농도를 측정하고자 하는 경우， 상기 산화환원효소로서 글루코오스 탈수소효소 (glucose dehydrogenase, GDH)를 사용할 수 있으며， 상기 글루코오스 탈수소효소는 보조인자로서 FAD를 포함하는 플라빈아데닌디뉴클레오티드 -글루코오스 탈수소효소 (flavin adenine dinucleotide- glucose dehydrogenase, FAD-GDH) , 및 /또는 보조인자로서 FAD- GDH를 포함하는 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드—글루코오스 탈수소효소 (nicotinamide adenine dinucleotide— glucose dehydrogenase)일 수 있다.
구체예에^ I， 상기 사용 가능한 산화환원효소는 FAD-GDH (예컨대， EC 1.1.99.10 등)， NAD-GDH (예컨대， EC 1.1.1.47 등)， PQQ-GDH (예컨대, EC1.1.5.2 등)， 글루탐산탈수소효소 (예컨대， EC 1.4.1.2 등)， 글투코오스산화효소 (예컨대， EC 1.1.3.4 등)， 콜레스테를산화효소 (예컨대， EC 1.1.3.6 등) , 콜레스테를에스테르화효소 (예컨대， EC 3.1.1.13 등), 락테이트산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.2 등)， 아스코빅산산화효소 (예컨대, EC 1.10.3.3 등), 알코올산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.13 등)， 알코을탈수소효소 (예컨대， EC 1.1.1.1 등) , 빌리루빈산화효소 (예컨대; EC 1.3.3.5 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
한편， 본 발명에 따른 시약 조성물은 계면활성제, 수용성 고분자， 4차 암모늄염, 지방산， 점증제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 시약 용해시의 분산제， 시약 제조시의 점착제， 장기 보관의 안정제 등의 역할을 위하여 추가로 포함할 수 있다.
상기 계면활성제는 시약을 분주할 때 시약이 전극위에서 골고루 퍼져서 시약이 균일한 두께로 분주되게 하는 역할을 는 것일 수 있다. 상기 계면활성제로 트리톤 X- 100 (Triton X- 100 ), 소듐도데실설페이트 (sodium dodecyl sulfate ), 퍼플루오로옥탄설포네이트 (perfluorooctane sulfonate ), 소듐스테아레이트 (sodium stearate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은， 시약을 분주할 때 시약이 전극위에서 골고루 퍼져서 시약이 균일한 두께로 분주되게 하는 역할을 적절하게 수행하도록 하기 위하여， 상기 계면활성제를 산화환원효소 100 증량부를 기준으로 3 넷지 25 중량부, 예컨대 10 내지 25 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 계면활성제 10 내지 25 중량부를 함유할 수 있으며， 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면， 계면활성제의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.
상기 수용성 고분자는 시약 조성물의 고분자 지지체로서 효소의 안정화 및 분산 (dispersing)을 돕는 역할을 수행하는 것일 수 있다. 상기 수용성 고분자로는 폴리비닐피를리돈 (polyvinyl pyrrolidone; PVP)， 폴리비닐알코을 (polyvinyl alcohol; PVA), 폴리플루오로설포네이트 (perfluoro sulfonate ), 하이드록시에틸 셀를로오즈 (hydroxyethyl cellulose; HEG), 하이드록시프로필 셀롤로오즈 (hydroxypropyl cellulose; HPC) , 카르복시메틸 셀를로오즈 (carboxy methyl cellulose; CMC) , 셀를로오즈 아세테이트 (cellulose acetate) , 폴리아미드 (polyamide) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 '있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은， 산화환원효소의 안정화 및 분산 (dispersing)을 돕는 역할을 층분하고 적절하게 발휘하도록 하기 위하여， 상기 수용성 고분자를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 70 중량부， 예컨대 30 내지 70 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대， 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 수용성 고분자 30 내지 70 중량부를 함유할 수 있으며， 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면， 수용성 고분자의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.
상기 수용성 고분자는 지지체 및 효소의 안정화 및 분산 (dispersing)을 돕는 역학을 효과적으로 수행하기 위하여 증량평균분자량이 2,500 내지 3,000,000 정도， 예컨대， 5ᅳ 000 내지 1 ,000,000 정도일 수 있다.
상기 4차 암모늄염은 적혈구용적률 (hematocrit)의 양에 따른 측정오차를 감소시키는 역할을 하는 것일 수 있다. 상기 4차 암모늄염으로는 에실트리메틸 암모늄 (ecyltrimethylammonium) , 마이리스틸트리메틸암모늄
(myristyltrimethylammonium) , 세틸트리메틸 암모늄 (cetyltrimethylammonium) , 옥타데실트리메틸 암모늄 (octadecyltrimethylammonium) , 테트라핵실 암모늄 (tetrahexylammonium) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은 적혈구용적률에 따른 측정오차를 효율적으로 감소시키기 위하여, 상기 4차 암모늄염을 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 20 내지 130 중량부, 예컨대 70 내지 130 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대， 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 4차 암모늄염 70 내지 130 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 4차 암모늄염의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.
상기 지방산은 상술한 4차 암모늄염과 :같이 적혈구 용적률 (hematocrit)의 양에 따른 측정오차를 감소시키는 역할을 하며， 또한 고농도 영역에서 바이오센서의 선형 동적 영역 (linear dynamic range)을 확대시키는 역할을 한다. 상기 지방산으로는 C4~C20의 탄소사슬을 갖는 지방산 및 그의 지방산염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있고, 바람직하게는 C6 C12로 이루어진 알킬탄소사슬을 갖는 지방산 또는 그의 지방산염을 사용할 수 있다ᅳ 상기 지방산으로는 카프로산 (caproic acid) , 헵타노산 (heptanic acid) , 카프릴산 (caprylic acid) , 옥타논산 (octanoic acid) , 노나노산 (nonanoic acid), ^l"프르산 (capric acid), 운더】 ^l"노산 (undecanoic acid), 라우르산 (lauric acid), 트리데카노산 (tridecanoic acid) , 미리스티산 (myristic acid) , 펜타데카노산 (pentadecanoic acid) , 팔미트산 (palmitic acid), 헵타데카노산 (heptadecanoic acid) , 스테아르산 (stearic acid) , 노나데카노산 (nonadecanoic acid) , .아라키드산 (arachidonic acid) , 상기 지방산의 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은， 적혈구용쩍볼에 따른 측정오차 감소 및 고농도 영역에서 바이오센서의 선형 동적 영역 확대 효과를 적절하게 얻기 위하여, 상기 지방산을 산화환원효소 100: 중량부를 기준으로 10 내지 ' 70 중량부， 예컨대 30 내지 70 중량부의'양으로 함유할 수 있다. 예컨대， 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를기준으로 지방산 30 내지 70 중량부를 함유할 수 있으며， 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면， 지방산의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.
상기 점증제는 시약을 전극에 견고하게 부착하도록 하는 역할을 한다. 상기 점증제로는 나트로졸， 디에틸아미노에틸—덱스트란 하이드로클로라이드 (DEAE-Dextran hydrochloride) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 시약이 전극에 견고하게 부착되도록 하기 위하여， 상기 점증제를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 90 중량부， 예컨대 30 내지 90 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대， 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 점증제 30 내지 90 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 ¾성도가 이보다 높아지면， 점증제의 함량을 이보다..낮게 조절할 수 있다.
또한， 본 발명은 상기 시약 조성물이 포함된 전기화학적 바이오센서를 제공한다. 일 구현예에서, 적어도 두 개 이상의 전극올 갖춘 기판에, 하기 화학식 1을 갖는 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물^ 액.체 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 효소를 도포한 후 건조하여 제작한 전기화학적 바이오센서이다. 예를 들면， 전기화학적 바이오센서에 있어서 작동전극 및 보조전극이 한 평면상에 구비되고， 상기 작동전극 위에 본 발명에 따른 시약 조성물이 포함된 것을 특징으로 하는 평면형 전기화학적 바이오센서가 제공된다.
또 다른 구현예에서, 전기화학적 바이오센서에 있어서， 작동전극 및 보조전극이 서로 다른 평면상에서 대면하도록 구비되고, 상기 작동전극 위에 본 발명에 따른 시약 조성물이 포함된 것올 특징으로 하는 대면형 전기화학적 바이오센서가 제공된다.
상기 바이오센서에 있어서 본 발명에 따른'시약 조성물이 포함된 형태는 특별한 제한이 없으며， 구체적으로 작동전극 표면에 코팅된 형태로 포함될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 평면형 및 대면형 전기화학적 바이오센서는， 예컨대 대한민국 특허공개 : 제 10-2004— 0105429호， 대한민국 특허공개 제 10-2006- 0089464호, 대한민국 특허등록 제 0854389호， 대한민국 특허공개 제 10 2008- 0080841호， 대한민국 특허공개 게 10-2008-0084030호， 대한민국 특허공개 제 10-2008-0088028호 등에 공지된 방법을 통해 제조할 수 있다.
이하， 상기 평면형 및 대면형 전기화학적 바이오센서의 구조를 도 1 및 도 2를 참조하여 예시한다.
먼저， 도 1에 나타낸 평면형 전기화학적 바이오센서는 작동전극과 보조전극이 한 평면상에 구비되는 것으로， 위에서부터， 혈액이 센서 안으로 스며들도록 하기 위한 통기부 (10)를 구비한 상판 (11); 양면에 접착제가 코팅되어 있어 ᅵ 상기 상판과 하기 하판을 접착하는 역할을 하며, 혈액이 모세작용으로 전극쪽으로 스며들도록 하기 위한 끼움판 (9); 하기 작동전극과 본조전극에 포함 (예컨대， 코팅 )되는 본 발명에 른 시약 조성물:. (8)； ,하기 작동전극과 보조전극의 면적을 규정하기 위한 통로부가 구비된 절연판 (7)； 하기 하판 상에 프린트되는 작동전극 (2)과 보조전극 (3); 및 상기 작동전극 및 보조전극이 형성되는 하판 (1)이 순차적으로 적층된 구조를 갖는다.
도 2에 나타낸 대면형 전기화학적 바이오센서는 작동전극과 보조전극이 서로 다른 평면상에 대면하도록 구비되는 것으로, 위에서부터， 혈액이 센서 안으로 스며들도록 하기 위한 통기부 (10)를 구비하며， 하기 보조전극이 프린트되는 상판 (11); 상기 상판에 프린트되는 보조전극 (3); 양면에 접착제가 코팅되어 있어 상기 상판과 하기 하판을 접착하는 역할을 하고， 혈액이 모세작용으로 전극쪽으로 스며들도록 하기 위한 끼움판 (9); 하기 작동전극에 포함 (예컨대, 코팅)되는 본 발명에 따른 시약 조성:물 (8)； 하기 작동전극과 상기 보조전극의 면적을 규정하기 위한 통로부가 구비된 ;절연판 (7); 상기 보조전극과 하기 보조전극의 리드를 연결하는 회로연결접지 (5); 하기 하판 상에 프린트되는 작동전극 (2)， 보조전극의 리드 (4) 및 혈액이 들어오는 속도를 측정하기 위한 유동감지전극 (6); 및 상기 작동전극， 보조전극의 리드 및 유동감지전극이 형성되는 하판 (1)이 순차적으로 적층되는 구조를 갖는다. 【발명꾀 효과】
본 발명에 따른 오스뮴 착물을 함유하는 전자 전달 매개체는 GDH와 반웅하며 산소 분압에 의한 영향이 없고， 장기간 ;산화 환원 형태가 안정적으로 유지되는 장점이 있어， 이를 적용한 산화환원반응시약， 및 전기화학적 바이오센서는 시료 내 산소 분압에 따른 측정오차가 최소화되며， 장기간 안정적으로 사용 가능한 장점이 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 평면형 바이오센서의 분해사시도이다. 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 대면형 바이오센서의 분해사시도이다. 도 3a 및 도 3b은 실시예 1에서 제조한 오스뮴 화합물의 1H NMR 스펙트럼 결과를 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 실시예 1에 따라 글루코오스 농도 변화에 따른 전류의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5a 내지 도 5c는 다양한 전자전달 매개체의 수용액 상에서의 시간 경과에 따른 UV—가시광선 스펙트럼의 변화를 비교한 것으로세 도 5a는 오스뮴 착물에 관한 것이고, 도 5b는 루테늄 핵사아민 (ruthenium hexamine)에 관한 것이고， 도 5c는 페리시아나이드 (ferricyanide)에 관한 것이다.
. 도 6은 오스뮴 기반 글루코오스 스트립 센서의 보관 조건에서 시간 경과에 따른 특성 변화를 나타내는 것으로서， (a) 바탕 전류 및 (b) 감응 기울기를 나타낸다.
도 7은 오스뮴 기반의 글루코오스 스트립 센서의 글루코오스 농도별 산소 분압에 른 방해 정도를 비교한 결과이다.
도 8은 산화제 (NaOCl) 첨가에 따른 오스뮴 착물 기반 글루코오스 스트립 센서의 보관 조건에서 시간 경과에 따른 특성 변화를 나타내는 것으로서， (a) 바탕 전류, (b) 감웅 기을기에 관한 것이다.
도 9는 산화제 (¾02) 첨가에 따른 오스뮴 착물 기반 글루코오스 스트립 센서와보관 조건에서의 시간 경과에 따른 특성 변화를 나타낸다.
도 10는 산화제 (¾02)로 산화 처리한 오스뮴 착물 (산화상태) 기반 글루코오스 스트립 센서의 보관 조건에서의 시간 경과에 따른 특성 변화를 나타낸다.
도 11은 산화제 (NaOCl)로 산화 처리한 온스뮴 착물 (산화상태) 기반 글루코오스 스트립 센서의 보관 조건에서의 시간 경과에 따른 특성 변화를 나타낸다.
도 12는 산화제 (NaOCl)로 산화 처리한 오스뮴 착물 (산화상태) 기반 글루코오스 스트립 센서의 글루코오스 농도별 산소 분압에 따른 방해 정도 비교한 것이다.
도 13a 및 도 13b은 산화제 (NaOCl)≤ 산화 처리한 오스뮴 착물 (산화상태) 기반 글루코오스 스트립 센서의 인가 전압에 변화에 따른 특성 변화를 나타낸다.
도 14a 및 도 14b는 오스뮴 착물 (산화상태) 기반 글루코오스 스트립 센서의 보관 조건에서의 시간 경과에 따른 특성 변화를 나타낸다.
도 15a 및 도 15b는 오스뮴 착물 (산화상태) 기반 글루코오스 스트립 센서욍 보관 조건에서의 시간 경과에 따른. 농도별 % 오차 (Error) 변화를 나타낸다.
도 16은 오스뮴 착물 (산화상태) 기반 글루코오스 스트립 센서의 보관 조건에서의 시간 경과에 따른 글루코오스 농도별 산소 분압에 따른 방해 정도를 나타낸다. 【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하， 본 발명올 하기의 실시 예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단， 하기의 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기의 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 오스뮴 착물 제조
1 - 1. 오스뮴 착물의 합성
4)4'-dicarboxy-2,2'-bipyridine (dcbpy)와 ᅳ K20sCl6를 출발 물질로 Os(dcbpy)2Cl2 (오스뮴 착물)를 합성하고자 하였다.
K20sCl6 0.481 g ( 1 mM)과 dcbpy 0.488 g ( 2 mM)을 500 mL three -neck round— bottem flask에 넣고, dimethylformamide (DMF) 40 mL 첨가하여 1시간 동안 교반하며 녹인 후 N2 분위기 reflux 하에서 oil bath로 180 °C를 유지하면서 2시간 동안 반응을 진행하였다. 반웅이 완결된 용액을 rotary evaporator를 이용하여 용매를 제거한 후 생성물을 증류수로 세척하면서 감압 여과하였고， 여과된 생성물은 증류수， methyl alcohol, ethyl ether 순으로 세척하였다. 이렇게 얻어진 생성물을 50 °C에서 12시간 이상 건조시켜 60% 정도의 Os(dcbpy)2Cl2
(오스뮴 착물)을 수득하였다.
1 -2. 분광학적 특성 분석
dcbpy와 K20sCl6를 사용한 합성된 Os(dcbpy)2Cl2 (오스뮴 착물)의 성공적 합성 유무를 판단하기 위하여 1H NMR (400 MHz, DMS으 d6)을 측정하였다. Dcbpy (a)와 오스뮴 착물 (b)의 1H NMR spectrum를 도 2에 나타냈다.
도 3에서 보는 바와 같이 dcbpy ligand가 중심 금속인 Os에 배위되면서 aromatic ring에 치환되어 있는 -COOH의 H peak (도 3 (b )의 1 )의 . band width가 중심 급속 Os에 배위되기 전 -COOH의 H peak (도 3 (a)의:：' 1 )보다 현저히 넓어 진 것을 확인할 수 있었다. 일반적으로.유기 화:합물이 금속에 배위될 경우 peak의 band width가 넓어지는 경향이 있는...것으, ¾ 알려져 있으며， 이러한 1H N.MR spectrum 결과를 통해 성공적으로 반웅이 진행된 것을 확인할 수 있었다. 1 - 3. 전기화학적 특성 분석
오스뮴 착물의 전기화학적 특성을 검증하기 위하여 cyclic voltammetry를 진행하였다.. 작동 전극은 탄소 전극， 보조 전극은 백금 및 기준 전극으로 Ag/AgCl . (sat. KC1) 전극을 사용하였고， FAD-glucose dehydrogenase (FAD- GDH) 10 mg/mL, 오스뮴 착물 30 mmol 및 0.1 M PBS (pH 7.4) 흔합 용액 상에서 글루코오스 농도를 변화하면서 측정하였다. -0.2 V ~ 0.3 V 구간에서 scan rate 10 mV/sec.로 측정하였다. 측정결과 그래프를 도 3에 나타냈다.
도 4에 보는 바와 같이 90 mg/dL 내지 540 mg/dL 글루코오스 농도 구간에서 77.1 nA/( mg/dL)의 감웅 기울기와 비교적 우수한 직선성을 나타내었다. 도 3와 도 4의 분광학적 및 전기화학적 결과를 바탕으로 오스뮴 착물이 성공적으로 합성된 것을 확인 할 수 있었다. 실시예 2: 오스뮴 착물의 염화합물 제조
합성된 오스뮴 착물의 구조는 카르복시 (COOH) 작용기를 가지는 bypyridin 구조인 dcbpy가 리간드로 중심 금속인 오스뮴 (Os)에 배위되어 유기금속 화합물로서 물에 대한 용해도가 낮다. 오스뮴 착물의 一 COOH 작용기를 ᅳ COO— Na+로 치환시킨 염 형태로 변환시켜 용해도를 증가시키고자 하였다. 먼저, 염 형태로 변환시키기 위해 적정을 통하여 당량비를 구하였으며, 적정한 당량비는 1:3로 나타났다. 이후 실시예에서는 NaOH를 사용하여 1:3 당량비로 치환시킨 오스뮴 착물 소디움염을 사용하였다. 실시예 3: 오스뮴착물의 산화 처리
합성한 오스뮴 착물 0.75 g (1 mM)를 500 mL one-neck round-bottem flask에 넣고， 증류수 100 mL에 잘 녹인 후 산화제 (NaOCl/H202) 0.037 g/0.034 g (1 mM)을 첨가한 후 상온에서 교반하며 2시간 동안 반웅을 진행하였다. 반웅이 완결된 용액을 rotary evaporator를 이용하여 용매를 제거한 후 생성물을 에틸에테르로 세척하면서 감압 여과하였고， 여과된 생성물은 50 °C에서 12시간 이상 건조시켜 90% 정도의 오스뮴 착물 (산화상태， Os(ox) complex)를 수득하였다. 실시예 4: 오스뮴착물의 안정성 평가
오스뮴 착물의 유기금속 화합물로서의 안정성을 확인하기 위하여 수용액 상태에서 시간 경과에 따른 UV— Visible spectrum 변화를 현재 시판 중인 글루코오스 스트립 센서의 전자 전달 매개체로 사용되고 있는 ruthenium hexamine, ferricyanide와 비교하였다.
구체적으로， 오스뮴 착물， ruthenium hexamine, ferricyanide 각각 1 mg을 0.1 M PBS ( H 7.4) 1 mL에 녹인 수용액의 UV-Vis spectrum을 측정한 후 상온에서 밀폐 보관하며 11일 간 실험을 진행하였다. 실험결과를 도 5a 내지 도 5c에 나타냈다.
도 5b에서 보는 바와 같이 ruthenium hexamine (도 5b)의 경우 시간 경과에 따른 UV-Visible spectrum 변화가 발견되지 않는 것으로 나타나, 산화 상태인 Ru(III)가 매우 안정적인 것으로 나타났다. 실시예 1에서 합성한 오스뮴 착물 (도 5a)와 경우에는 400 nm 520 mm의 흡수 peak의 흡광도가 시간 경과에 따라 감소하여 초기 산화 상태인 Os(III)와 환원 상태인 Os(II) 흔재하다가 시간 경과에 따라 산화 상태인 Os(III)로 변화하는 것으로 나타났으며， 이는 상온 수용액 조건에서 산화 상태인 Os(III)가 환원 상태인 Os(II) 보다 안정함을 의미한다. 페리시아나이드 (Ferricyanide )는 시간 경과에 따라 300 nm와 420 mm의 흡수 peak의 흡광도는 감소하고， 260 nm의 흡수 피크의 흡광도는 증가하여 산화 상태인 Fe(III)가 시간 경과에 따라 환원 상태인 Fe(II)로 변화하는 것으로 나타났으며， 이러한 결과는 환원 상태인 Fe(II)가 환원 상태인 Fe(III) 보다 안정하다는 것을 증명하는 결과이다. 실시예 5: 바이오센서의 제조
5ᅳ 1.바이오센서 제조 .
작동 전극은 탄소, 기준 전극은 Ag/AgCl 재질의 대면형ᅵ 센서를 산용하 ¾고, 오스뮴 착물 30 mM, FAD -GDH 10 mg/mL, 계면활성제 및 바탕 전해질로 0.1 M PBS (pH 7.4)를 사용한 Os 기반 글루코오스 스트립 센서를 제작하여 전기화학적 특성 (감웅성， 안정성， 산소 분압에 따른 영향 등)을 측정하였고， CareSens N (Ru + GOX), CareSens Pro (Fe + GDH) 및 VetMate (Ru + GDH + Thionin) 3가지 글루코오스 스트립 센서와 비교하고자 하였다. 감응.특성은 multi— channel biosensor system을 사용하여 인가 전압 0.2 V에서 측정하였다.
5 -2. 보관 조건에서의 시간 경과에 따른 특성 변화
오스뮴 기반 글루코오스 스트립 센서의 일반적인 보관 조건에서의 시간 경과에 따른 특성 (바탕 전류, 감응 기울기)을 조사하였다. 30 mM Os 기반 스트립과 CareSens N, CareSens Pro 및 VetMate 3가지 스^립을 온도 23 °C , 상대습도 20% 이하의 보관함에 보관하면서 시간 경과에 따른 특성 변화를 조사하였다.
3가지 스트립의 경우 바탕 전류 및 감웅 기울기를 유지하는 반면， Os 기반 스트립의 경우 일반적인 보관 조건에서도 시간 경과에 따른 바탕 전류가 3.2 μΑ에서 2.5 μΑ정도로 변화하는 것으로 나타났다 (도 6 ). 이 결과는 실시예 4에서 관측된 오스뮴 착물의 상온 수용액 조건에서의 UVᅳ Visible spectrum 결과와도 일치한다.
5-3. 산소 분압에 따른 영향 비교
GOX 기반 글루코오스 스트립 센서의 가장 큰 문제점인 산소 분압 (p02) 차이로 인해 발생되는 모세혈과 정맥혈 간의 측정치 차이를 제거하기 위하여 산소 분압에 대한 영향이 없는 GDH로 대체하고자 하는 연구가 진행되고 있으나， 특정 전자 전달 매개체의 경우 전자 전달 매개체가 산소 분압에 영향을 받는 것으로 알려져 적용이 제한되고 있는 실정이다.
이러한 산소 분압에 따른 영향을 30 mM Os 기반 트립과 CareSens N, CareSens Pro 및 VetMate 3가지 스트립을 대상으로 조사하였다.
산소 분압은 포화상태 ( 160 mmHg)와 탈산소 과정을 적용한 저분압상태 (40 mmHg)의 저 (90 mg/dL) , 중 (200 mg/dL) , 고 (400 mg/dL)농도 포도당을 측정 후 다음과 같은 연산식으로 산소 분압 차이에 따른 % 오차를 계산하였다.
【수학식 1】
% E難 r = !40 innlttg~ ^m^g
Uo mmHg
Ru 기반 2가지 스트립 (CareSens N, VetMate )들은 산소 분압에 따른 영향이 8% 내외로 나타난 반면， 30 mM Os 기반 스트립의 경우 3% 이하로 나타났다 (도 7 ) . 실시예 6: 산화제 첨가및 산화처리 오스뮴착물 기반스트립 센서의 특성 평가
6 - 1. 산화제를 첨가한 오스뮴 착물 기반 스트립 센서의 특성 변화
선행 연구를 바탕으로 Os 기반 스트립 센서 제작 시 산화제를 첨가하여 산화제 첨가에 따른 바탕 전류와 시간 경과에 따른 바탕 전류 변화를 측정 비교하였다. 가. NaOCl을 첨가한 오스뮴 착물 기반 스트립 센서의 특성 변화 작동 전극은 탄소ᅳ 기준 전극은 Ag/AgCl 재질의 대면형 센서를 사용하였고， 오스뮴 착물 각각 20 mM, 30 mM과 FAI3-GDH 10 mg/mL, 계면활성제 및 바탕 전해질로 0.1 M PBS (pH 7.4 )를 사용한 2가지 기본 조성과 기본 조성에 각각 오스뮴 착물과 동일한 함량의 NaOCl을 첨가한 2가지 조성의 Os 기반 글루코오스 스트립 센서를 제작하여 전기화학적 특성 (감웅성， 안정성， 산소 분압에 따른 영향 등)을 측정하였고, CareSens N과 CareSens Pro 2가지 글루코오스 스트립 센서와 비교하였다.
2
4
감웅 특성은 multi-channel biosensor system을 사용하여 인가 전압 0.2
V에서 측정하였다.
4가지 조성의 Os 기반 스트립과 CareSens N ， CareSens Pro 2가지 스트립은 온도 23 °C , 상대습도 20% 이하의 일반적인 보관 조건에서 보관하면서 시간 경과에 따른 특성 변화를 조사하였다. '
NaOCl를 첨가한 Os 기반 스트립의 경우 첨가하지 않은 기존 스트립과 비교하여 2 μΑ 내외의 높은 바탕 전류에서 0.2 μΑ 내외로 감소하였으며， 보관 조건에서 시간 경과에 따라 비교적 안정적인 바탕 전류를 유지하는 것으로 나타났다 (도 8 ) . 나. Η202를 첨가한 오스뮴 착물 기반 스트립 센서의 특성 변화
작동 전극은 탄소， 기준 전극은 Ag/AgCl 재질의 대면형 센서를 사용하였고， 오스뮴 착물 각각 20 mM, 30 mM과 FAD— GDH 10 mg/mL, 계면활성제 및 바탕 전해질로 0.1 M PBS (pH 그 4 )를 사용한 2가지 기본 조성, 기본 조성에 각각 오스뮴 착물과 동일한 함량의 H202을 첨가한 2가지 조성 및 H202를 첨가한 30 mM Os 조성에 GDH의 함량을 2배 증가시킨 조성 등 총 5가지 조성의 Os 기반 글루코오스 스트립 센서를 제작하여 전기화학적 특성 (감웅성， 안정성， 산소 분압에 따른 영향 등)을 측정하였고， CareSens N과 CareSens Pro 2가지 글루코오스 스트립 센서와 비교하고자 하였다.
감응 특성은 multi-channel biosensor system을 사용하여 인가 전압 0.2 V에서 측정하였다. 6가지 조성의 Os 기반 스트립과 CareSens N, CareSens Pro 2가지 스트립은 은도 23 V, 상대습도 20% 이하의 일반적인 보관 조건에서 보관하면서 시간 경과에 따른 특성 변화를 조사하였다.
도 9에 도시한 바와 같이， ¾02를 첨가한 Os 기반 스트립의 경우 NaOCl 첨가 스트립과 비교하여 0.2 μΑ 내외의 유사한 바탕 전류와 20 nA/(mg/dL) 이상의 감웅 기을기를 나타내었다.
6-2. 산화 처리한 Os(ox) complex 기반 스트립 센서의 특성 변화 가. (½로 산화 처리한 오스뮴 착물 (산화상태) (Os(ox) complex) 기반 스트립 센서의 특성 변화
작동 전극은 탄소， 기준 전극은 Ag/AgCl 재질의 대면형 센서를 사용하였고， 오스뮴 착물 각각 20 mM, 30 mM과 FAD-GDH 10 mg/mL, 계면활성제 및 바탕 전해질로 0.1 M PBS (pH 7.4)를 사용한 2가지 기본 조성, H202로 산화 처리한 Os(ox) complex를 첨가한 2가지 조성 및 H202로 산화 처리한 오스뮴 착물 (산화상태) 염화합물 (Os(ox) salt)를 첨가한 2가지 조성 동 총 6가지 조성의 Os 기반 글루코오스 스트립 센서를 제작학여 전기화학적 특성 (감응성， 안정성， 산소 분압에 따른 영향 등)을 측정하였고, CareSens N과 CareSens Pro 2가지 글루코오스 스트립 센서와 비교하였다.
감웅 특성은 multi-channel biosensor system을 사용하여 인가 전압 0.2 V에서 측정하였다.
6가지 조성의 Os 기반 스트립과 CareSens N, CareSens Pro 2가지 스트립은 온도 23 °C, 상대습도 20% 이하의 일반적인 보관 조건에서 보관하면서 시간 경과에 따른 특성 변화를 조사하였다.
H202로 산화 처리한 Os(ox) complex 기반 스트립의 경우 기존의 ¾02를 첨가한 Os 기반 스트립과 유사한 0.2 μΑ 내외의 바탕 전류를 갖는 것으로 나타났으나, Os(ox) salt 기반 스트립의 경우 동일 조건의 Os(ox) complex 기반 스트립 보다 바탕 전류가 높은 것으로 조사되었고， 감응 기을기 또한 ¾02를 첨가한 스트립과 비교하여 ¾02로 산화 처리한 Os(ox) complex 및 Os(ox) salt 기반 4가지 조성 모두에서 다소 증가하는 것으로 니:타났다 (도 10). 나. NaOCl로 산화 처리한 Os(ox) complex 기반 스트립 센서의 특성 변화 작동 전극은 탄소， 기준 전극은 Ag/AgCl 채질의 대면형 센서를 사용하였고， 오스뮴 착물 각각 20 mM, 3O mM과 FAD-GDH 10 mg/mL, 계면활성제 및 바탕 전해질로 0.1 M PBS (pH 7.4 )를 사용한 2가지 기본 조성， NaOCl로 산화 처리한 Os(ox) complex를 첨가한 2가지 조성， NaOCl로 산화 처리한 Os(ox) salt를 첨가한 1가지 조성과 Os(ox) salt에 다른 종류의 전자 전달 매개체를 추가한 조성 등 총 6가지 조성의 Os 기반 글루코오스 스트립 센서를 제작하여 전기화학적 특성 (감응성， 안정성， 산소 분압에 따른 영향 등)올 측정하였고， CareSens N과 CareSens Pro 2가지 글루코오스 스트립 센서와 비교하였다.
감웅.특성은 multi-channel biosensor system을 사용하여 인가 전압 0.2 V에서 측정하였다.
6가지 조성의 Os 기반 스트립과 CareSens N, CareSens Pro 2가지 스트립은 온도 23 °C , 상대습도 20% 이하의 일반적인. 보관 조건에서 보관하면서 시간 경과에 따른 특성 변화를 조사하였다.
NaQCl로 산화 처리한 Os(ox) complex 기반 스트립이 낮은 바탕 전류， 감응 기울기， 시간 경과에 따른 안정성 및 산소 분압에 따른 영향 감소 등 지금까지 연구된 Os 기반 스트립 중 가장 우수한 전기화학적 감웅 특성을 나타내었다 (도 11 , 도 12 ).
Os(ox) complex 스트립 센서의 .인가 전압에 따른 감웅 특성을 조사하기 위하여 작동 전극은 탄소， 기준 전극은 Ag/AgCl 재질의 대면형 센서를 사용하였고, Os(ox) complex 30 mM과 FA으 GDH 10 mg/mL, 계면활성제 및 바탕 전해질로 0.1 M PBS (pH 7.4)를 사용한 조성의 Os(ox) complex 기반 글루코오스 스트립 센서를 제작하여 인가 전압에 따른 감응 특성 조사하였다. 감웅 특성은 인가 전압 변화가 용이한 multi- channel biosensor system을 사용하여 인가 전압 0.1 V ~ 0.4 V 구간에서 0.05 V 간격으로 측정하였다.
도 13에 인가 전압에 따른 바탕 전류 및 감응 기울기 변화를 나타내었다. 바탕전류의 경우 0.2 V부터 0.35 V가지 완만히 증가하다가 0.35 V 이후 급격히 증가하는 하는 것으로 나타났으며， 감웅 기울기는 0.3 V까지 급격히 증가한 후 0.3 V 이후 완만히 증가하는 것으로 나타났다. 0.3 V로 인가 전압을 0.1 V 상승시킬 경우 바탕 전류는 0.05 μΑ 상승하는 반면， 감응 기울기는 45 nA/(mg/dL )로 2배 정도 향상되는 것으로 나타났다.
실시예 7: NaOCl로 산화처리한 Os(ox) complex 기반 스트립 센서의 장기 안정성
NaOCl로 산화 처리한 Os (ox) complex 기반 스트립 센서의 보관 조건에서의 시간 경과에 따른 바탕 전류， 감웅 기울기 및 산소 분압에 따른 영향 변화를 조사하였다.
측정은 multi-channel biosensor system을 사용하였으며, 인가 전압은 0.3 V를 인가하였다.
도 14에 나타난 바와 같이 NaOCl로 산화 처리한 Os(ox) complex 기반 스트립 센서가 보관 조건에서 8주 이상 안정적인 바탕 전류와 감웅 기울기를 유지하는 것으로 나타났으며， 1일 측정 결과를 이용하여 20 mM - 200 mM 구간에서 교정한 결과로 시간 경과에 따른 70 mg/dL 포도당과 100 mg/dL 포도당의 전류값을 이용하여 % Error를 연산한 결과 도 15에 보는 바와 같이 전체적으로 10% 이하의 유효한 결과를 나타냈다.
산소 분압에 따른 영향 또한， 전체적으로 4% 이내의 영향을 받는 것으로 조사되었다 (도 16 ) .
NaOCl로 산화 처리한 Os (ox) complex와 FAD -GDH 효소의 기반 스트립 센서는 상온 보관 조건에서 8주 이상 안정적으로 바탕 전류， 감웅 기울기 및 산소 분압에 따른 영향 변화 등을 유지하였다.
[부호의 설명]
1 : 기판
.2： 작동전극
3： 보조전극
4 : 보조전극의 리드
5 : 회로연결접지
6 : 유동감지전극
7 : 절연판
8: 산화환원시약 조성물
-kl^, :01
^몽^ :6
Z8SM0/ST0ZaM/X3d Ϊ.980Ϊ/9Ϊ0Ζ OAV

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
전극 기판과，
상기 전극 기판상에'고정된， 하기 화학식 1을 갖는 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물과 액체 생체시료에 포함된 분석대상물질을 산화환원시킬 수 있는 효소 를 포함하는， 전기화학적 바이오센서:
[화학식 1 ]
Os(A)mXn
상기 식에서,
A는 하기 화학식 2을 가지는 화합물이며，
[화학식 2 ]
Figure imgf000031_0001
X는 할로겐 원소이며,
m은 1 내지 3의 정수이고， n은 0 내지 4의 정수이고， m과 n의 합은 3 내 지 5의 정수이다.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 염화합물은 Li염， Na염, K염， Rb염， Cs염 및 Fr염 으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 알칼리금속의 염화합물인 전기화학적 바이오센서.
【청구항 3】
제 1 항에 있어서, 상기 오스뮴 착물이 3가 오스뮴 착물을 포함하는 것인 전기화학적 바이오센서.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서， 상기 오스뮴 착물은 3가 오스뮴 착물과 2가 오스뮴 착 물을 포함하는 전기화학적 바이오센서.
【청구항 5】 제 1 항에 있어서, 상기 오스뮴 착물이， 화학식 2의 화합물과 하기 화학식 6의 화합물을 이용하여 합성된 것인 전기화학적 바이오센서:
. [화학식 6]
YpOsXq
상기 식에서 ,
Y는 K, Na 또는 NH4이고， X는 할로겐 원소이며,
p는 1 내지 2의 정수이고, q는 1 내지 6의 정수이다.
【청구항 6】
제 1 항에 있어서, 산화제를 추가로 포함하는 것인 전기화학적 바이오센서. 【청구항 7】
제 1 항에 있어서, 상기 산화제는ᅳ 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물 1몰을 기준으로 0.1 내지 10몰비로 포함되는 것인 전기화학적 바이오센서.
청구항 8】,.
제 6 항에 있어서， 상기 산화제는 NaOCl, Η2θ2ᅳ ᄋ2， 03, Pb02, Mn02, KMn04, C102, F2, Cl2, H2Cr04> K2Cr207, N20, Ag20, Os04, H2S208, 피리딘 클로로 크로메이트 (pyridinium chlorochromate) 및 2,2'-디피리딜디설파이드 (2，2'- Dipyridyldisulfide)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 전기화학적 바이오센 서.
【청구항 9】
제 1 항에 있어서， 전자 전달 매개체로서 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물 이외의 금속 착물을 포함하지 않는 것인 전기화학적 바이오센서.
【청구항 10】 .
제 1 항에 있어서， 상기 오스뮴 착물 또는 이의 염화합물은 효소 100 중 량부를 기준으로 20 내지 700 중량부로 포함되는 것인 전기화학적 바이오센서. 【청구항 11】
제 1 항에 있어서， 게 2의 전자전달 매개체를 추가로 포함하며， 상기 제 2의 전자전달 매개체는 티오닌 (thionine), 1-메특시 PMS (l-Methoxy-5- methylphenazinium methylsulfate), 3—아미노-그 (2，3，4，5，6-펜타하이드톡시핵산 아미도 )-5_페노티아지늄 ( 3 - amino - 7- (2,3,4,5,6 -pentahydroxy hexanamido ) - 5 -phenothiazinium ) , 1,—메톡시—5—데틸페：나지늄 (1— Methoxy一 5-methylphenazinium), 아주르 C (Azure C), 아주르 A (Azure A), 메틸렌블루 (Methylene Blue), 를루이딘블루 (Toluidine Blue); 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인， 전기화학적 바이오센서.
【청구항 12】
제 11 항에 있어서， 상기 효소는 탈수소효소 (dehydrogenase), 산화효소 (oxidase), 및 에스테르화효소 (esterase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소; 또는 탈수소효소， 산화효소， 및 에스테르화효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소와 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드 (flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 및 피롤로퀴놀린 퀴논 (Pyrroloquinoline quinone, PQQ)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조인자를 포함하는 것인, 전기화 학적 바이오센서.
【청구항 13】
제 12 항에 있어서， 상기 탈수소효소 (dehydrogenase), 산화효소
(oxidase), 및 에스테르화효소 (esterase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소는, 글루코오스탈수소효소 (glucose dehydrogenase), 글루탐산탈수소 효소 (glutamate dehydrogenase), 글루코오스산화효소 (glucose oxidase), 콜레스 테롤산화효소 (cholesterol oxidase), 콜레스테를에스테르화효소 (cholesterol esterase), 락테이트산화효소 (lactate oxidase), 아스코빅산산화효소 (ascorbic acid oxidase), 알코을산화효소 (alcohol oxidase), 알코을탈수소효소 (alcohol dehydrogenase), 및 빌리루빈산화효소 (bilirubin oxidase)로 이루어진 군에서 선 택된 1종 이상의 것인, 전기화학적 바이오센서.
【청구항 14】
제 12 항에 있어서， 상기 효소는 플라빈아데닌디뉴클레오티드ᅳ글루코오스 탈수소효소 (flavin adenine dinucleotide -glucose dehydrogenase, FAD— GDH), 및 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드-글루코오스탈수소효소 (nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것 인， 전기화학적 바이오센서.
【청구항 15】 제 1 항에 있어서, 계면활성제， 수용성 고분자， 4차 암모늄염， 지방산, 및 점증제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 추가로 포함하는ᅳ 전기화 학적 바이오센서.
【청구항 16】
제 15 항에 있어서，
상기 계면활성제는 트리톤 X- 100 (Triton X- 100 ) , 소듐도데실설페이트 (sodium dodecyl sulfate) , 퍼플루오로옥탄설포네이트 (perfluorooctane sulfonate) 및 소듐스테아레이트 (sodium stearate)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것이고;
상기 수용성 고분자는 폴리비닐피롤리돈 (polyvinyl pyrrolidone; PVP) , 폴 리비닐알코올 (polyvinyl alcohol; PVA) , 폴리플루오로설포네이트 (perfluoro sulfonate ), 하이드록시에틸 샐를로오즈 (hydroxyethyl cellulose,; HEC), 하이드록 시프로필 셀를로오즈 (hydroxypropyl cellulose; HPC) , 키르복시메틸 셀를로오즈 (carboxy methyl cellulose; CMC) , 셀를로오즈 아세테이트 (cellulose acetate), 및 폴리아미드 (polyamide)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것이고;
상기 4차 암모늄염은 에실트리메틸 암모늄 (ecyltrimethylammonium) , 마 이리스틸트리메틸암모늄 (myristyltrimethylammonium) , 세틸트리메틸 암모늄 (cetyltrimethylammonium) , 옥타데실트리메틸 암모늄
(octadecyltrimethylammonium), 및 테트라핵실 암모늄 (tetrahexylammonkim)으 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것이고;
상기 지방산은 C4~C20의 탄소사술을 갖는 지방산 및 그의 지방산염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것이고;
상기 점증제는 나트로졸 및 디에틸아미노에¾ᅳ덱스트란 하이드로클로라이 드 (DEAE— Dextran hydrochloride)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인， 전기화학적 바이오센서.
【청구항 17】
게 16 항에 있어서， 상기 생체시료는 혈액인 전기화학적 바이오센서.
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