CN112710702B - 一种具有特异构型的蔗糖生物传感芯片 - Google Patents

一种具有特异构型的蔗糖生物传感芯片 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有特异构型的蔗糖生物传感芯片，属于蔗糖生物监测技术领域。将合成的铜三聚氰胺络合物纳米浆料与碳浆混合，制备出铜三聚氰胺络合物‑碳混合浆料进行印刷，加快电子传输速率，可调节芯片上负载的酶量来控制检测灵敏度以及检测线性范围。采用丝网印刷技术，制备方法操作简便且可批量生产，成本低廉。所制备出的蔗糖生物传感芯片具有良好的性能，且拥有很好的重现性、适应性以及稳定性，特异性的工作电极区域可将修饰的不同的酶分隔开以避免酶污染，相对于蔗糖传统检测方法的繁琐步骤以及传统检测方法的环境污染的问题，具备高效、安全、简便、经济的优点，对于人类健康、零食制造业、发酵行业以及医药行业具有重要意义。

Description

一种具有特异构型的蔗糖生物传感芯片
技术领域
本发明涉及一种具有特异构型的蔗糖生物传感芯片的制备方法，属于蔗糖生物监测技术领域。
背景技术
蔗糖是光合作用的主要产物，广泛分布于植物体内，特别是甜菜、甘蔗和水果中含量极高。蔗糖是植物储藏、积累和运输糖分的主要形式。平时食用的白糖、红糖都是蔗糖。蔗糖由一分子葡萄糖和一分子果糖脱水缩合形成，易溶于水较难溶于乙醇，甜味仅次于果糖。人体摄入蔗糖后，经过身体转化成葡萄糖和果糖，一部分葡萄糖随着血液循环运往全身各处，生成产生能量，供给脑组织功能、人体的肌肉活动。但是过量摄入蔗糖会引起身体机能的紊乱，从而导致疾病，因此蔗糖浓度的检测至关重要。
现如今，蔗糖的检测方法只有通过酸解法将蔗糖进行水解成葡萄糖和果糖，再通过滴定法或者色谱法检测葡萄糖的浓度进而反推蔗糖的浓度，传统方法步骤过于繁琐且检测精度不高，色谱法成本高、检测周期长，不利于日常检测。同时，检测过程中需要使用到大量的化学试剂，会造成环境污染。因此，制备一种高效的低成本检测周期短的蔗糖检测元件，对于人类健康、零食制造业、发酵行业以及医药行业具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有特异构型的蔗糖生物传感芯片的制备方法，包括铜三聚氰胺络合物的合成、特异结构的基底电极的印刷以及酶的配制和固定。
本发明的技术方案为：一种具有特异构型的蔗糖生物传感芯片的制备方法，具体步骤如下：
1.制备铜三聚氰胺络合物纳米浆料：配制铜盐和三聚氰胺溶液,将铜盐溶液与三聚氰胺溶液按照摩尔比进行混合，将所得到的混合溶液在离心机中进行离心，清洗，得到铜三聚氰胺络合物纳米浆料；
2.将合成的铜三聚氰胺络合物纳米浆料与碳浆按照一定质量配比混合，制备出铜三聚氰胺络合物-碳混合浆料；
3.通过丝网印刷技术在基板上印刷出基底电极，工作电极区域整体呈V型或U型，中间岔口分隔0.5mm，面积为0.15cm2,末端重合部分区域仅用于两部分信号的结合，不用于修饰任何酶蛋白，印刷使用的浆料为步骤2制备的铜三聚氰胺络合物-碳混合浆料；参比电极区域呈Z云型，面积为0.05cm2,印刷使用的浆料为氯化银浆料；对电极区域呈半包结构，与参比电极全包工作电极区域，面积为0.25cm2,印刷使用的浆料为碳浆；连接线和连接触点印刷使用的浆料为碳浆；工作电极区域和参比电极区域的末端与连接线区域有部分重合；对电极、连接线和连接触点印刷浆料一致，无需分隔开。
4.配制蔗糖水解酶和葡萄糖氧化酶的混合溶液，向混合酶溶液中加入交联剂，混合均匀得到混合酶溶液；配制葡萄糖变旋酶溶液，向变旋酶溶液中加入交联剂，混合均匀得到变旋酶溶液，取一定蔗糖水解酶和葡萄糖氧化酶的混合溶液滴加到步骤3)中制备的基底电极的工作电极的A区域，取一定量葡萄糖变旋酶溶液滴加到步骤3)中制备的基底电极的工作电极的B区域,置于0~15℃干燥环境下静置，待酶溶液完全固化，即可得到简易的蔗糖生物传感芯片。
步骤1中所述CuSO4、CuCl2、Cu(NO3)2水溶液的浓度范围均为10-100mM，三聚氰胺溶液的浓度范围为5-50mM。
步骤1中所述铜盐溶液与三聚氰胺溶液等体积混合的摩尔比例为1:0.5-5。
步骤1中所述离心机的转速为6000-12000r/min，离心时间为1-30min。
步骤2中所述铜三聚氰胺络合物纳米浆料与碳浆按照质量比为1:1-99均匀混合。
步骤3中所述区域5的印刷基底材料可为PVC、PET、陶瓷。
步骤4中所述蔗糖水解酶和葡萄糖氧化酶的混合酶溶液中蔗糖水解酶的浓度为0.1-10u/μl，葡萄糖氧化酶的浓度为0.1-18u/μl。
步骤4中所述葡萄糖变旋酶溶液的浓度为0.1-10u/μl。
步骤4中所述酶混合溶液中的交联剂含量为0.1-0.25%，v/v。
步骤4中所述酶混合溶液中的交联剂可为戊二醛、丹宁酸、壳聚糖、聚赖氨酸以及其他一系列可用于酶固定的交联剂。
步骤4中蔗糖水解酶和葡萄糖氧化酶的混合溶液滴加到基底电极的工作电极的A区域，葡萄糖变旋酶溶液滴加到基底电极的工作电极的B区域。
步骤4中所述所取酶溶液的量为5-50μl。
该生物传感芯片适用于食品、医药分析及其生物工程中蔗糖的快速检测以及持续性检测，其灵敏度高、稳定性强、寿命高，可作为便携式蔗糖检测仪的核心部件，也可集成于现场原位的蔗糖浓度定量设备中用于实时检测。
有益效果
本发明是基于丝网印刷法的蔗糖生物传感芯片的制备方法。将合成的铜三聚氰胺络合物纳米浆料与碳浆以一定质量比进行混合，制备出铜三聚氰胺络合物-碳混合浆料来进行印刷，可以通过控制质量比来控制铜三聚氰胺络合物的量，这样能加快电子传输速率，同时也可调节芯片上负载的酶量来控制检测灵敏度以及检测线性范围。本发明采用丝网印刷技术，制备方法操作简便且可批量生产，成本较为低廉，所制备出的蔗糖生物传感芯片具有良好的性能，且拥有很好的重现性、适应性以及稳定性，特异性的工作电极区域可将修饰的不同的酶分隔开以避免酶污染，相对于蔗糖传统检测方法的繁琐步骤以及传统检测方法的环境污染的问题，具备高效、安全、简便、经济的优点，对于人类健康、零食制造业、发酵行业以及医药行业具有重要意义。
附图说明
图1为合成的铜三聚氰胺络合物电镜图。
图2为通过丝网印刷技术印刷出特异结构的基底电极的结构示意图。
各附图标记为：1-工作电极；2-参比电极；3-对电极；4-连接触点；5-印刷基底材料。
具体实施方式
实施例1
一种具有特异构型的蔗糖生物传感芯片的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)配置10mM的CuSO4溶液和5mM的三聚氰胺溶液，等体积混合，将混合溶液用离心机进行离心，离心速率为6000r/min,离心时间为30min，得到铜三聚氰胺络合物纳米浆料；
(2)将合成的铜三聚氰胺络合物纳米浆料与碳浆按质量比1:1进行混合，并使其混合均匀，制备出铜三聚氰胺络合物-碳混合浆料；
(3) 如图2所示，通过丝网印刷技术在底板材料上印刷出基底电极，区域1工作电极区域，面积为0.15cm2,印刷使用的浆料为步骤2)制备的铜三聚氰胺络合物-碳混合浆料；区域2参比电极区域，面积为0.05cm2,印刷使用的浆料为氯化银浆料；区域3对电极区域，面积为0.25cm2,印刷使用的浆料为碳浆；区域4为连接触点，印刷使用的浆料为碳浆；区域5为PVC基底材料；
(4)取蔗糖水解酶500u和葡萄糖氧化酶1500u溶于100μl缓冲溶液中，配制蔗糖水解酶和葡萄糖氧化酶的混合溶液，取葡萄糖变旋酶500u溶于100μl缓冲溶液中，配制葡萄糖氧化酶溶液，向两种酶溶液加入25%（v/v）的戊二醛交联剂1μl，混匀；
(5)取5μl蔗糖水解酶和葡萄糖氧化酶的混合溶液滴加到基底电极的工作电极的A区域，取5μl葡萄糖变旋酶溶液滴加到基底电极的工作电极的B区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥。
通过计时安培电流测试可知：此例所得的传感芯片对蔗糖的检测灵敏度较高为82μA·mM-1·cm-2，检测极限低为0.1μM。实验后，将丝网印刷电极于4℃下置于pH为7.0的PBS缓冲溶液中一周，其响应信号基本不变；一个月后，其响应信号为初始信号的97％；三个月后，其响应信号仍为初始信号的94％，表明该制备方法可较好地制备蔗糖生物传感芯片。
实施例2
一种具有特异构型的蔗糖生物传感芯片的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)配置20mM的CuSO4溶液和40mM的三聚氰胺溶液，等体积混合，将混合溶液用离心机进行离心，离心速率为8000r/min,离心时间为15min，得到铜三聚氰胺络合物纳米浆料；
(2)将合成的铜三聚氰胺络合物纳米浆料与碳浆按质量比1:9进行混合，并使其混合均匀，制备出铜三聚氰胺络合物-碳混合浆料；
(3) 如图2所示，通过丝网印刷技术在底板材料上印刷出基底电极，区域1工作电极区域，面积为0.15cm2,印刷使用的浆料为步骤2)制备的铜三聚氰胺络合物-碳混合浆料；区域2参比电极区域，面积为0.05cm2,印刷使用的浆料为氯化银浆料；区域3对电极区域，面积为0.25cm2,印刷使用的浆料为碳浆；区域4为连接触点，印刷使用的浆料为碳浆；区域5为PET基底材料；
(4)取蔗糖水解酶120u和葡萄糖氧化酶560u溶于100μl缓冲溶液中，配制蔗糖水解酶和葡萄糖氧化酶的混合溶液，取葡萄糖变旋酶100u溶于100μl缓冲溶液中，配制葡萄糖氧化酶溶液，向两种酶溶液加入25%（v/v）的戊二醛交联剂2μl，混匀；
(5)取20μl蔗糖水解酶和葡萄糖氧化酶的混合溶液滴加到基底电极的工作电极的A区域，取20μl葡萄糖变旋酶溶液滴加到基底电极的工作电极的B区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥。
通过计时安培电流测试可知：此例所得的传感芯片对蔗糖的检测灵敏度较高为67μA·mM-1·cm-2，检测极限低为0.1μM。实验后，将丝网印刷电极于4℃下置于pH为7.0的PBS缓冲溶液中一周，其响应信号基本不变；一个月后，其响应信号为初始信号的99％；三个月后，其响应信号仍为初始信号的96％，表明该制备方法可较好地制备蔗糖生物传感芯片。
实施例3
一种具有特异构型的蔗糖生物传感芯片的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)配置10mM的CuSO4溶液和50mM的三聚氰胺溶液，等体积混合，将混合溶液用离心机进行离心，离心速率为12000r/min,离心时间为5min，得到铜三聚氰胺络合物纳米浆料；
(2)将合成的铜三聚氰胺络合物纳米浆料与碳浆按质量比1:49进行混合，并使其混合均匀，制备出铜三聚氰胺络合物-碳混合浆料；
(3) 如图2所示，通过丝网印刷技术在底板材料上印刷出基底电极，区域1工作电极区域，面积为0.15cm2,印刷使用的浆料为步骤2)制备的铜三聚氰胺络合物-碳混合浆料；区域2参比电极区域，面积为0.05cm2,印刷使用的浆料为氯化银浆料；区域3对电极区域，面积为0.25cm2,印刷使用的浆料为碳浆；区域4为连接触点，印刷使用的浆料为碳浆；区域5为PVC基底材料；
(4)取蔗糖水解酶80u和葡萄糖氧化酶360u溶于100μl缓冲溶液中，配制蔗糖水解酶和葡萄糖氧化酶的混合溶液，取葡萄糖变旋酶80u溶于100μl缓冲溶液中，配制葡萄糖氧化酶溶液，向两种酶溶液加入25%（v/v）的戊二醛交联剂2.5μl，混匀；
(5)取20μl蔗糖水解酶和葡萄糖氧化酶的混合溶液滴加到基底电极的工作电极的A区域，取20μl葡萄糖变旋酶溶液滴加到基底电极的工作电极的B区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥。
通过计时安培电流测试可知：此例所得的传感芯片对蔗糖的检测灵敏度较高为55μA·mM-1·cm-2，检测极限低为0.3μM。实验后，将丝网印刷电极于4℃下置于pH为7.0的PBS缓冲溶液中一周，其响应信号基本不变；一个月后，其响应信号为初始信号的95％；三个月后，其响应信号仍为初始信号的93％，表明该制备方法可较好地制备蔗糖生物传感芯片。
实施例4
一种具有特异构型的蔗糖生物传感芯片的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)配置100mM的CuSO4溶液和50mM的三聚氰胺溶液，等体积混合，将混合溶液用离心机进行离心，离心速率为8000r/min,离心时间为15min，得到铜三聚氰胺络合物纳米浆料；
(2)将合成的铜三聚氰胺络合物纳米浆料与碳浆按质量比1:99进行混合，并使其混合均匀，制备出铜三聚氰胺络合物-碳混合浆料；
(3) 如图2所示，通过丝网印刷技术在底板材料上印刷出基底电极，区域1工作电极区域，面积为0.15cm2,印刷使用的浆料为步骤2)制备的铜三聚氰胺络合物-碳混合浆料；区域2参比电极区域，面积为0.05cm2,印刷使用的浆料为氯化银浆料；区域3对电极区域，面积为0.25cm2,印刷使用的浆料为碳浆；区域4为连接触点，印刷使用的浆料为碳浆；区域5为氧化锆基底材料；
(4)取蔗糖水解酶30u和葡萄糖氧化酶90u溶于100μl缓冲溶液中，配制蔗糖水解酶和葡萄糖氧化酶的混合溶液，取葡萄糖变旋酶30u溶于100μl缓冲溶液中，配制葡萄糖氧化酶溶液，向两种酶溶液加入15%（v/v）的戊二醛交联剂1.5μl，混匀；
(5)取50μl蔗糖水解酶和葡萄糖氧化酶的混合溶液滴加到基底电极的工作电极的A区域，取50μl葡萄糖变旋酶溶液滴加到基底电极的工作电极的B区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥。
通过计时安培电流测试可知：此例所得的传感芯片对蔗糖的检测灵敏度较高为65μA·mM-1·cm-2，检测极限低为0.2μM。实验后，将丝网印刷电极于4℃下置于pH为7.0的PBS缓冲溶液中一周，其响应信号基本不变；一个月后，其响应信号为初始信号的97％；三个月后，其响应信号仍为初始信号的95％，表明该制备方法可较好地制备蔗糖生物传感芯片。
实施例5
一种具有特异构型的蔗糖生物传感芯片的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)配置80mM的CuSO4溶液和20mM的三聚氰胺溶液，等体积混合，将混合溶液用离心机进行离心，离心速率为12000r/min,离心时间为10min，得到铜三聚氰胺络合物纳米浆料；
(2)将合成的铜三聚氰胺络合物纳米浆料与碳浆按质量比1:49进行混合，并使其混合均匀，制备出铜三聚氰胺络合物-碳混合浆料；
(3)如图2所示，通过丝网印刷技术在底板材料上印刷出基底电极，区域1工作电极区域，面积为0.15cm2,印刷使用的浆料为步骤2)制备的铜三聚氰胺络合物-碳混合浆料；区域2参比电极区域，面积为0.05cm2,印刷使用的浆料为氯化银浆料；区域3对电极区域，面积为0.25cm2,印刷使用的浆料为碳浆；区域4为连接触点，印刷使用的浆料为碳浆；区域5为氧化铝基底材料；
(4)取蔗糖水解酶800u和葡萄糖氧化酶1800u溶于100μl缓冲溶液中，配制蔗糖水解酶和葡萄糖氧化酶的混合溶液，取葡萄糖变旋酶1000u溶于100μl缓冲溶液中，配制葡萄糖氧化酶溶液，向两种酶溶液加入25%（v/v）的戊二醛交联剂1μl，混匀；
(5)取15μl蔗糖水解酶和葡萄糖氧化酶的混合溶液滴加到基底电极的工作电极的A区域，取15μl葡萄糖变旋酶溶液滴加到基底电极的工作电极的B区域，静置2h，待酶溶液完全固化，进行冷冻干燥。
通过计时安培电流测试可知：此例所得的传感芯片对蔗糖的检测灵敏度较高为45μA·mM-1·cm-2，检测极限低为0.5μM。实验后，将丝网印刷电极于4℃下置于pH为7.0的PBS缓冲溶液中一周，其响应信号基本不变；一个月后，其响应信号为初始信号的98％；三个月后，其响应信号仍为初始信号的94％，表明该制备方法可较好地制备蔗糖生物传感芯片。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (8)

1.一种具有特异构型的蔗糖生物传感芯片的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)制备铜三聚氰胺络合物纳米浆料：配制铜盐溶液和三聚氰胺溶液，混合离心，清洗，得到铜三聚氰胺络合物纳米浆料；
2)将铜三聚氰胺络合物纳米浆料与碳浆混合，制备出铜三聚氰胺络合物-碳混合浆料；
3）通过丝网印刷技术在底板上印刷出基底电极，在基底电极上印刷铜三聚氰胺络合物-碳混合浆料得到工作电极，工作电极包括A区域和B区域；印刷氯化银浆料得到参比电极；印刷碳浆得到对电极、连接触点和连接线；
4) 配制蔗糖水解酶和葡萄糖氧化酶的混合溶液，加入交联剂，混合均匀得到混合酶溶液；配制葡萄糖变旋酶溶液，加入交联剂，混合均匀得到变旋酶溶液；取混合酶溶液滴加工作电极的A区域，取变旋酶溶液滴加工作电极的B区域， 0-15℃静置，至酶溶液完全固化，得到蔗糖生物传感芯片。
2.根据权利要求1所述的具有特异构型的蔗糖生物传感芯片的制备方法，其特征在于，步骤3中）A区域和B区域之间间隔0.5mm，末端重合，工作电极区域面积为0.15cm2，参比电极区域面积为0.05cm2，对电极区域面积为0.25cm2。
3.根据权利要求1所述的具有特异构型的蔗糖生物传感芯片的制备方法，其特征在于，步骤1）中铜盐溶液为CuSO4、CuCl2、Cu(NO3)2任意一种的水溶液，浓度为10-100mM，三聚氰胺溶液的溶剂为水或者乙醇，浓度为5-50mM，步骤1)中等体积混合铜盐溶液与三聚氰胺溶液的溶质摩尔比例为1:0.5-5；步骤1)中离心机的转速为6000-12000r/min，离心时间为1-30min。
4.根据权利要求1所述的具有特异构型的蔗糖生物传感芯片的制备方法，其特征在于，步骤2)中铜三聚氰胺络合物纳米浆料与碳浆质量比为1:1-99。
5.根据权利要求1所述的具有特异构型的蔗糖生物传感芯片的制备方法，其特征在于，步骤3)中工作电极区域为V型或U型；基底材料为PVC、PET、陶瓷中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的具有特异构型的蔗糖生物传感芯片的制备方法，其特征在于，步骤4)中混合酶溶液中蔗糖水解酶的浓度为0.1-10u/μl，葡萄糖氧化酶的浓度为0.1-18u/μl；葡萄糖变旋酶溶液的浓度为0.1-10u/μl。
7.根据权利要求1所述的具有特异构型的蔗糖生物传感芯片的制备方法，其特征在于，步骤4)中混合酶溶液或葡萄糖变旋酶溶液中的交联剂为戊二醛、丹宁酸、壳聚糖、聚赖氨酸中的任意一种，交联剂含量为0.1-0.25%，v/v。
8.根据权利要求1所述具有特异构型的蔗糖生物传感芯片的制备方法，其特征在于，步骤4)中酶溶液的用量为5-50μl。
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