CN113295747B - 生物传感器芯片在赖氨酸检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品分析、临床医学以及生物工程中赖氨酸检测装置技术领域,涉及一种简易的赖氨酸生物传感器芯片制备方法。本发明在普鲁士蓝立方体上原位生长铂纳米颗粒,通过控制水热的温度和水热时间来控制浆料的导电性和催化活性,将这种纳米材料与导电碳浆混合形成纳米复合浆料,借助丝网印刷技术,将其印刷成芯片,在芯片上滴加赖氨酸氧化酶从而得到高性能的赖氨酸生物传感芯片。本发明利用的原料低廉易得,制备方法简单方便,具有大规模工业化生产的前景,同时,本发明的生物传感芯片对于赖氨酸具有很好的检测性能。
Description
技术领域
本发明属于食品分析、临床医学以及生物工程中赖氨酸检测装置技术领域,涉及一种简易的赖氨酸生物传感器芯片制备方法。
背景技术
赖氨酸是人和动物营养的9种必需氨基酸中的第一必需氨基酸, 广泛应用于医药、食品和饲料等领域。发酵法是目前生产赖氨酸最主要的方法。赖氨酸发酵法可分为二步发酵法(又称前体添加法)和直接发酵法两种。二步发酵法是20世纪50年代初开发的,该工艺仍较复杂,现已被直接发酵法取代。直接发酵法是一种广泛采用的赖氨酸生产法。这种方法是在20世纪50年代后期开发的,70年代以来,由于育种技术的发展,选育出了一些具有多重遗传标记的突变株,使工艺日趋成熟,赖氨酸的产量也成倍增长。工业生产中最高产酸率已提高到每升发酵100-120 g,提取率达到80-90 %左右。目前,世界生产赖氨酸的企业大多采用发酵法,产品为L-型赖氨酸,生产工艺已基本成熟。目前常用的赖氨酸的检测方法为酶法,化学法和比色法。化学法和比色法操作复杂,需要前处理,没有办法得到实时的检测结果。
赖氨酸在人体代谢中有重要的作用,可以参与集体蛋白质的合成,具有参与能量代谢,促进矿物质的吸收和骨骼生长,增强免疫力等多种作用,是人体不可或缺的物质,所以实现赖氨酸在发酵过程中的实时检测有着重要意义。电化学传感器由于其操作便捷、成本较低、性能稳定、准确度高等优点被广泛应用于各个行业。生物传感器的核心是传感电极,因此开发出稳定性高、性能好的电极对于实际应用尤为重要。对于赖氨酸检测,目前还没有实时检测的研究结果,此领域尚处于技术研发空白阶段。
发明内容
本发明针对传统检测无法实现赖氨酸实时检测的问题提出一种新型的简易的赖氨酸生物传感器芯片制备方法用于发酵过程中赖氨酸浓度的检测。
本发明涉及一种简易的谷氨酸生物传感芯片的制备方法。首先合成一种具有高催化活性的传感浆料,进而借助丝网印刷技术制得传感芯片。使用这种纳米复合浆料所制备的电极芯片可以实现临床医学、食品安全、发酵产业中生物质赖氨酸的精准检测。该传感芯片合成工艺简单、成本较低,具有良好的大规模生产前景。传感芯片的合成步骤主要包括:纳米立方体普鲁士蓝反应液A,B的配制,合成,离心及烘干;Pt@PB纳米颗粒的合成,离心;基于Pt@PB的传感芯片印刷。
为了达到上述目的,本发明是采用下述的技术方案实现的:
一种赖氨酸的甘油生物传感芯片,其制备步骤包括:
1)普鲁士蓝反应液A,B的配制,合成,离心及烘干,具体包括:合成液A,B均含有Fe离子,其中A溶液为阴离子供体的酸性溶液,A溶液为K4Fe(CN)6、K3Fe(CN)6中的一种,B溶液为阳离子供体的酸性溶液,B溶液为FeCl3,FeCl2中的一种,A,B溶液中铁离子的浓度相同均为5-100 mM,溶液pH值为1-7,为保证两溶液的pH相同,向其中加入相同浓度的酸溶液,所加酸为盐酸和硫酸中的任意一种,浓度为1-100 mM。将A,B溶液以一定的速率同时滴加到烧杯或其他反应容器中,其中滴加速度均为200-900 μL·min-1,反应一段时间后,将反应液离心,离心速度为6000-10000 r·min-1,离心时间为3-30 min,离心结束后,将所得沉淀物洗涤并烘干得到普鲁士蓝立方体,烘干温度为50-80 ℃,烘干时间为5-10 h。
2)Pt溶液的配制,具体包括:取一定浓度的氯铂酸溶液,将其与醇溶液混合,其中醇溶液为乙醇溶液和乙二醇溶液中的任意一种,铂离子在氯铂酸溶液中的浓度为0.002-0.05 M。
3)Pt@PB纳米颗粒的合成,具体包括:取步骤1得到的PB粉末,溶于乙二醇溶液中,将步骤2得到的溶液倒入上述溶液中,超声一段时间后,将混合溶液倒入水热釜中,一定温度下反应一段时间,反应结束后将反应釜中液体离心,洗涤。其中PB在乙二醇溶液中的质量浓度为0.12-12 mM,超声时间为10-30 min,水热温度为120-160 ℃,水热时间为3-8 h,离心速度为6000-10000 r·min-1,离心时间为3-30 min。
4)印刷浆料的合成,具体包括:取步骤3得到的纳米材料与导电碳浆以一定比例混合得到纳米印刷浆料,其中纳米材料与导电碳浆的质量比为1:1-1:100。
5)三电极的印刷,具体包括:将步骤4得到的印刷浆料与氯化银浆料,导电碳浆通过丝网印刷技术分别印刷在基板的不同位置,烘干固化,其中基板为PET,PVC,陶瓷的任意一种,固化温度为40-80 ℃,固化时间为1-5 h。
6)赖氨酸芯片的制备,具体包括:将赖氨酸氧化酶与戊二醛以一定比例混合,取一定量的混合液滴加在步骤5得到的芯片的工作电极上,一定温度下干燥一段时间,得到赖氨酸传感芯片。其中赖氨酸氧化酶浓度为200-2000 U·mL-1,戊二醛的质量百分浓度为0.1-10%,芯片上负载的赖氨酸氧化酶的浓度范围为10-100 μL·cm-2,干燥温度为0-20 ℃,干燥时间为12 h。
作为本发明的进一步改进,所述步骤1)中A溶液为阴离子供体的酸性溶液,A溶液为K4Fe(CN)6、K3Fe(CN)6中的一种,B溶液为阳离子供体的酸性溶液,B溶液为FeCl3,FeCl2中的一种,A,B溶液中铁离子的浓度相同均为5-100 mM,溶液pH值为1-7,所加酸为盐酸和硫酸中的一种,浓度为1-100 mM。
作为本发明的进一步改进,所述步骤1)中A,B溶液的滴加速度均为200-900 μL·min-1,离心速度为6000-10000 r·min-1,离心时间为3-30 min,烘干温度为50-80 ℃,烘干时间为5-10 h。
作为本发明的进一步改进,所述步骤2)中使用的醇溶液为乙醇溶液和乙二醇溶液中的一种,氯铂酸溶液中铂离子浓度为0.002-0.05 M。
作为本发明的进一步改进,所述步骤3)中乙二醇溶液中PB质量浓度为0.12-12mM,超声时间为10-30 min,水热温度为120-160 ℃,水热时间为3-8 h,离心速度为6000-10000 r·min-1,离心时间为3-30 min。
作为本发明的进一步改进,所述步骤4)中印刷浆料中的纳米材料与导电碳浆的质量比为1:1-1:100。
作为本发明的进一步改进,所述步骤5)中的基板为PET,PVC,陶瓷的一种,固化温度为40-80 ℃,固化时间为1-5 h。
作为本发明的进一步改进,所述步骤6)中赖氨酸氧化酶的浓度为200-2000 U·mL-1,戊二醛的质量百分浓度为0.1-10%,芯片上负载的赖氨酸氧化酶的浓度范围为10-100μL·cm-2,干燥温度为0-20 ℃,干燥时间为12 h。
普鲁士蓝被称为人工过氧化物酶,对于双氧水具有出色的检测能力,且金属铂对于电子有出色的传导能力,铂的生物相容性也较好。因此,本专利以普鲁士蓝和铂纳米颗粒作为电极材料,通过控制他们的纳米结构,合成有高催化性能和导电性能的纳米浆料,将其用于丝网印刷电极芯片的制备。
上述传感芯片制备工艺简单,成本较低,可以用来大规模的批量化生产,具有广阔的市场应用前景,可以实现对甘油浓度的精确检测。
与现有技术相比,本发明的优点和积极效果在于:
在普鲁士蓝立方体上原位生长铂纳米颗粒,通过控制水热的温度和水热时间来控制浆料的导电性和催化活性,将这种纳米材料与导电碳浆混合形成纳米复合浆料,借助丝网印刷技术,将其印刷成芯片,在芯片上滴加赖氨酸氧化酶从而得到高性能的赖氨酸生物传感芯片。本发明利用的原料低廉易得,制备方法简单方便,具有大规模工业化生产的前景,同时,本发明的生物传感芯片对于赖氨酸具有很好的检测性能。
附图说明
图 1 为实施例1制备的赖氨酸生物传感芯片的实物图。
图2为纳米复合材料的电镜图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点,下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但是,本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施,因此,本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
下述各实施例中,首先配制一定浓度的A,B合成液,配制一定浓度的氯铂酸的醇溶液,通过微速合成的方法,在普鲁士蓝纳米立方体上原位生长铂纳米颗粒,将合成的纳米复合材料进行离心等处理,之后与导电碳浆混合得到可供印刷的浆料,接着通过丝网印刷技术将浆料印刷成芯片,最后在芯片上负载赖氨酸氧化酶得到赖氨酸生物传感芯片。
实施例1
本实施例提供一种简易的赖氨酸生物传感器芯片制备方法,包括如下步骤:
1)配制5 mM的K4Fe(CN)6和FeCl3盐酸水溶液,分别取出100 mL溶液在注射器中,将两根注射器固定在注射泵上,合成温度为40 ℃,注射速度为200 μL·min-1,注射完成后,将混合液进行离心,离心速度为6000 r·min-1,离心时间为30 min。将离心完得到的下层沉淀物质置于烘箱中烘干,烘干温度为50 ℃,烘干时间为10 h。
2)取5 mL浓度为2mM的氯铂酸溶液,溶于30 mL乙二醇与水的混合溶液中,其中乙二醇与水体积比为2:1,配制成0.12 g·L-1氯铂酸的乙二醇溶液。
3)取0.03 g PB溶于30 mL乙二醇溶液中,将氯铂酸的乙二醇溶液倒入PB溶液中,超声15 min,之后将混合溶液置于水热釜中,120 ℃下水热反应8 h。将水热反应完成后的溶液离心,离心速度为6000 r·min-1,离心时间为30 min,离心,洗涤,得到Pt@PB纳米复合材料。
4)取0.5 g的Pt@PB纳米复合材料与5 g导电碳浆混合得到工作电极浆料,将浆料置于60 ℃下烘至粘度为120 dpa·S。
5)取5.5 g工作电极浆料、5 g氯化银浆料、10 g碳浆印刷在PET基板的不同位置上。其中导电碳浆印刷到基板上形成对电极和连接体,氯化银浆料印刷在基板上称为参比电极。Pt@PB与导电碳浆的混合浆料印刷在基板上成为工作电极。如图1,中间小圆点是工作电极,右边那个弧形区域是对电极,左边带有一定角度的是参比电极(各电极的形状是通过丝网板的形状直接印刷得到)。制得三电极体系的芯片。
6)使用PBS溶液作为溶剂,配制0.2 U·μL-1的赖氨酸氧化酶溶液,加入戊二醛,使得酶溶液中戊二醛的质量分数为0.1 %,取2 μL配置好的酶溶液均匀的负载在工作电极区域,在4 ℃下干燥12 h,得到赖氨酸生物传感芯片。
7)赖氨酸生物传感芯片实物图如附图1。
通过计时安培电流测试可知:该方法制得的甘油生物传感器芯片对于甘油的检测灵敏度较高为27. 08µA•mM-1•cm-2,检测极限为12 µM。试验后,将该芯片于4 ℃下置于pH为7的缓冲液中一周,其响应信号基本不变;一个月后,其响应信号为初始信号的94 %;三个月后,其响应信号为初始信号的86 %,这表明该芯片的稳定性很好。
实施例2使用仪器及试剂来源相同,未特殊说明之处,下述实施例与实施例1操作步骤相同。
实施例2
一种简易的赖氨酸生物传感器芯片,包括如下:
1)配制10 mM的K3Fe(CN)6和FeCl2硫酸水溶液,分别取出100 mL溶液在注射器中,将两根注射器固定在注射泵上,合成温度为40 ℃,注射速度为400 μL·min-1,将混合液进行离心,离心速度为8000 r·min-1,离心时间为15 min。将离心完的物质置于烘箱中,烘干温度为80 ℃,烘干时间为5 h。
2)取5 mL浓度为0.05M的氯铂酸溶液,溶于30 mL乙醇与水的混合溶液中,其中乙二醇与水体积比为2:1,配制成2.9 g·L-1氯铂酸的乙二醇溶液。
3)取0.3 g PB溶于30 mL乙醇溶液中,将氯铂酸的乙醇溶液倒入PB溶液中,超声30min,之后将混合溶液置于水热釜中,140 ℃下水热6 h。将反应后的溶液离心,离心速度为8000 r·min-1,离心时间为15 min。
4)取1 g的Pt@PB纳米复合材料与15 g导电碳浆混合得到工作电极浆料,将浆料置于40 ℃下烘至粘度为120 dpa·S。
5)取10 g工作电极浆料、10 g氯化银浆料、15 g碳浆印刷在PVC基板的不同位置上。其中导电碳浆印刷到基板上形成对电极和连接体,氯化银浆料印刷在基板上称为参比电极。Pt@PB与导电碳浆的混合浆料印刷在基板上成为工作电极。如图1,中间小圆点是工作电极,右边那个弧形区域是对电极,左边带有一定角度的是参比电极(各电极的形状是通过丝网板的形状直接印刷得到)。制得三电极体系的芯片。
6)使用PBS溶液作为溶剂,配制0.4 U·μL-1的赖氨酸氧化酶溶液,加入戊二醛,使得酶溶液中戊二醛的质量分数为0.5 %,取5 μL配置好的酶溶液均匀的负载在工作电极区域上,在4 ℃下干燥12 h,得到赖氨酸生物传感芯片。
7)赖氨酸生物传感芯片实物图如附图1。
通过计时安培电流测试可知:该方法制得的甘油生物传感器芯片对于甘油的检测灵敏度较高为32.11 µA•mM-1•cm-2,检测极限为15 µM。试验后,将该芯片于4 ℃下置于pH为7的缓冲液中一周,其响应信号基本不变;一个月后,其响应信号为初始信号的96 %;三个月后,其响应信号为初始信号的88 %,这表明该芯片的稳定性很好。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非是对本发明作其它形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域,但是凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型,仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (1)
1.生物传感器芯片在赖氨酸检测中的应用,其特征在于,所述生物传感器芯片制备步骤如下:
步骤1:PB粉末制备
将A溶液和B溶液同时滴加至容器中,反应后离心、洗涤并烘干,得到PB粉末;
其中,A溶液为阴离子供体的酸性溶液,B溶液为阳离子供体的酸性溶液,A溶液和B溶液中均含有Fe离子,且Fe离子浓度与pH值均相同;
步骤2:Pt溶液的配制
将氯铂酸溶液与醇溶液混合得到含有铂离子的醇溶液;
步骤3:Pt@PB纳米颗粒的合成
将步骤1得到的PB粉末溶于乙二醇和水的混合溶液中,得到PB溶液,将步骤2得到的Pt溶液倒入PB溶液中,超声后倒入水热釜中反应,反应结束后离心,洗涤,得到Pt@PB纳米颗粒;
步骤4:印刷浆料的合成
将Pt@PB纳米颗粒与导电碳浆混合得到纳米印刷浆料;
步骤5:三电极的印刷
将导电碳浆印刷到基板上形成对电极和连接体;氯化银浆料印刷在基板上得到参比电极;步骤4得到的纳米印刷浆料印刷在基板上得到工作电极;烘干固化,得到电极芯片;
步骤6:赖氨酸芯片的制备
将赖氨酸氧化酶与戊二醛混合,滴加在步骤5得到的芯片的工作电极上,干燥,得到赖氨酸传感芯片;
步骤1所述的A溶液Fe离子供体为K4Fe(CN)6或K3Fe(CN)6,B溶液Fe离子供体为FeCl3或FeCl2;A溶液和B溶液中含有相同浓度的盐酸或硫酸水溶液;铁离子浓度均为5 -100 mM,pH均为1-7,滴加速率均为200-900 μL·min-1,离心速度为6000-10000 r·min-1;
步骤2所述的醇溶液为乙二醇或乙醇溶液,氯铂酸溶液中Pt离子浓度为0.002-0.05M;
步骤3所述的混合溶 液中PB粉末的质量浓度为0.1-10 g·L-1;超声时间为10-30 min,水热反应温度为120-160 ℃,水热反应时间为3-8 h,离心速度为6000-10000 r·min-1;
步骤4中Pt@PB纳米颗粒与导电碳浆的质量比为1:1-100;
步骤5所述的基板材料为PET、PVC、陶瓷中的任意一种,固化温度为40 -80 ℃,固化时间为1-5 h;
步骤6中所述赖氨酸氧化酶的浓度为200-2000 U·mL-1,戊二醛的质量分数为0.1-10%,芯片上负载的赖氨酸氧化酶的量为10-100μL·cm-2,干燥温度为0-20 ℃,干燥时间为12h。
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