CN110887887A - 基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪及其制备方法和应用，属于电化学传感器技术领域。本发明包括含有酶制剂的恒温消化反应容器和表面修饰LDHs/MXene玻碳电极的电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪。制备方法为：以氧化石墨烯为载体，将α‑淀粉酶和葡萄糖淀粉酶按比例进行固定化，把固定化的酶加到恒温消化反应容器中，建立反应体系，并将LDHs/MXene和Nafion的混合溶液滴加到玻碳电极表面，得到淀粉体外快速消化检测仪。本发明具体应用于检测淀粉体外消化率。本发明所述淀粉体外消化速率检测仪制备方法简单、成本低廉、制作快速，并且检测仪检测精度高、效率高、稳定性高、抗干扰性好，可以实现对淀粉体外消化率高效检测。

Description

基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪及其制 备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪及其制备方法和应用，属于电化学传感器技术领域。

背景技术

在发展中国家和发达国家，肥胖2型糖尿病和相关慢性疾病的发生率都令人震惊地高。全世界约有19亿成年人超重或肥胖，而全世界有3.82亿人患有2型糖尿病。淀粉是主食的主要部分，也是很多加工食品的重要成分。淀粉的消化性与人体健康密切相关，其消化速度也与人体许多慢性疾病有关。研究淀粉的消化性不仅可以揭示一些与人体代谢相关的疾病，而且可以为人类的膳食营养提供指南，因此具有重要意义。近年来，电化学葡萄糖生物传感器由于其高的灵敏度、操作简便、响应快和成本低等优点而备受关注。传统的淀粉体外消化检测方法耗时长、价格昂贵且稳定性较差。相比较运用电化学的方法，所需淀粉量极低，另外运用固定化酶可以降低成本，可反复利用，表现出优异的检测限和灵敏度，可能是更为理想检测淀粉消化率方法。

石墨烯作为纳米材料中明星材料性能优良，氧化石墨烯作为石墨烯的衍生物，具有高比表面积和良好的生物相容性，且表面含有丰富的官能团，是固定化酶的理想载体，其表面的羧基、羟基、羰基和环氧基可以通过结合力较弱的非共价键或共价偶联的方式将酶固定化到氧化石墨烯上。可以提高酶的稳定性，可反复利用，极易将酶与底物分开。

纳米复合材料是理想的电极修饰材料，用于葡萄糖传感器具有优异的传感性能。其中，层状双金属氢氧化物（LDHs）是一类二维纳米阴离子粘土，具有类似于阳离子粘土的特殊物理化学性能。与其他无机材料相比，LDHs具有表面积大、离子交换容量高、插层空间和电荷密度可调、生物相容性好、热稳定性和化学稳定性高等特点，是一种理想的修饰电极纳米材料。相比传统碳材料，MXene表面丰富的官能团（-OH，-O，-F）使其具有优异的亲水性能和负电荷表面，在水溶液中更容易吸附金属离子M²⁺/M³⁺，获得具有耦合的LDHs/MXene纳米复合材料。该纳米材料表现出超高的电化学传感器灵敏度、检出限和稳定性。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪及其制备方法和应用，其选择性好、活性高、反应速度快、线性范围宽、检测限低、储存稳定性好，并且其制备方法简单、成本低，可对淀粉的体外消化进行灵敏检测，适用于大规模生产和商业应用。

本发明的技术方案，一种基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪，其包括含有酶制剂的恒温消化反应容器和表面修饰LDHs/MXene玻碳电极的电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪。

所述基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪，包括电化学工作站；还包括工作电极、辅助电极、参比电极、恒温消化反应容器、加热式磁体搅拌装置和温度传感装置；所述恒温消化反应容器下方设有加热式磁体搅拌装置，内部设有温度传感装置；所述恒温消化反应容器内包括工作电极、辅助电极和参比电极；工作电极、辅助电极和参比电极均通过导线与电化学工作站对应连接；所述温度传感装置和加热式磁体搅拌装置均由电化学工作站进行控制。

所述电化学工作站包括信号采集系统、信号处理系统和数据分析系统；所述信号采集系统采集电流信号，通过信号处理系统和数据分析系统进行相关数据分析处理，得到淀粉消化速率。

基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪的制备方法，步骤如下：

（1）固定消化酶：以氧化石墨烯为载体固定消化酶，将α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶按比例固定化，得到氧化石墨烯固定化消化酶；

（2）含有酶制剂的恒温消化反应容器：把步骤（1）氧化石墨烯固定化消化酶加到恒温消化反应器，建立消化反应体系，温度可控，能够进行低速搅拌，从而得到含有酶制剂的恒温消化反应容器；

（3）MXene材料的制备：由MAX材料通过刻蚀、插层和超声剥离处理，得到MXene材料；

（4）LDHs/MXene的电极材料制备：将步骤（3）所得MXene材料放入水中，加入金属元素A的前驱体、金属元素B的前驱体和尿素，再加入NaOH和Na₂CO₃，搅拌，静置，清洗沉淀物，得到LDHs/MXene复合材料；

（5）基于LDHs/MXene玻碳电极的电化学葡萄糖传感器的淀粉体外消化速率检测仪的制备：配置LDHs/MXene与Nafion的混合溶液，取适量滴于玻碳电极表面，干燥，得到表面修饰LDHs/MXene玻碳电极的电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪；

（6）组装：将步骤（5）所得表面修饰LDHs/MXene玻碳电极的电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪与步骤（2）所得含有酶制剂的恒温消化反应容器进行组装，即得到基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪。

具体步骤如下：

（1）固定消化酶：

a、将氧化石墨烯悬溶在纯水中，800-5000Hz超声分散0.1-8h后，得到浓度为0.1-10mg/mL的分散均匀的氧化石墨烯悬浊液；并1000-6000r/min离心10-90min；

b、取1mL上清液至于试管，加入1-3mL、pH为6的磷酸缓冲液，并加入1-10mL的α-淀粉酶溶液和0.5-5mL的葡萄糖淀粉酶溶液，在4-60℃恒温振荡4-24h，1000-6000r/min离心，用蒸馏水洗涤，重悬，即得到氧化石墨烯固定化消化酶；

（2）含有酶制剂的恒温消化反应容器：取步骤（1）制备所得氧化石墨烯固定化消化酶按照1-2:2-8的比例溶解于醋酸钠缓冲液中，得到电化学反应液，添加入恒温消化反应容器中；恒温消化反应容器的温度设置在20-60℃，并进行缓慢磁体搅拌进行淀粉消化；

（3）MXene材料的制备：室温下，将1g Ti₃AlC₂转移到体积浓度为5%-50%的HF的PTFE衬里中，并在氮气氛下磁力搅拌2-72h；然后，将产物用超纯水洗涤并离心分离若干次，直到pH达到6；将所得混合物在水中室温50-400Hz超声处理0.1-8h，将其在过滤器上抽滤；最后在30-50℃下1-20MPa真空干燥后，得到MXene材料，即多层Ti₃C₂；

（4）LDHs/MXene的电极材料制备：首先将10mg MXene材料、0.524g Ni(NO₃)₂·6H₂O、0.349g Co(NO₃)₂·6H₂O和1g CTAB分散在含有甲醇的混合溶剂中；加入5-60g蒸馏水并将混合物在室温下磁力搅拌；随后将混合物在1-20MPa、2-18℃下水热反应1-24h；通过乙醇和去离子水1000-6000r/min多次离心后，在10-60℃、1-20MPa下真空中干燥，得到LDHs/MXene的电极材料；

（5）基于LDHs/MXene玻碳电极的电化学葡萄糖传感器的淀粉体外消化速率检测仪的制备：配置LDHs/MXene与Nafion溶液的混合水溶液，其中LDHs/MXene浓度为1-100mg/mL，Nafion溶液浓度为0.1-10mg/mL；取5-100μL所配混合水溶液滴于玻碳电极表面，常温干燥，得到基于LDHs/MXene玻碳电极的电化学葡萄糖传感器；

（6）组装：将步骤（5）所得基于LDHs/MXene玻碳电极的电化学葡萄糖传感器的电化学淀粉体外快速消化检测仪与步骤（2）所得含有酶制剂的恒温消化反应容器进行组装，即得到基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪。

步骤（4）所述含有甲醇的混合溶剂中所述混合溶剂具体包括NaOH、Na₂CO₃和尿素；甲醇：NaOH：Na₂CO₃：尿素浓度比为1:2-4:1-3:4-6。

基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪的应用，将其应用于检测淀粉体外消化率。

基于LDHs/MXene玻碳电极的电化学葡萄糖传感器作为工作电极，甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，将工作电极的检测端置于待测溶液中，通过电化学工作站检测出待测溶液中进行电化学反应时的还原电流大小，然后根据葡萄糖的浓度与还原电流变化的线性回归方程，即定性或定量地测定待测溶液中的葡萄糖浓度，进而计算出淀粉消化率。

所述葡萄糖浓度与还原电流变化的线性回归方程为：I（A）=1.4302×10^-7+0.1544C（mol/L）；上式中，I为葡萄糖检测时的电流变化值，单位为A；C为待测溶液中葡萄糖的浓度值，单位为mol/L；所述葡萄糖的线性检测范围为0.025~3.6mmol/L，当信噪比为3时，检出限为0.047μmol/L；

最终根据检测出的葡萄糖含量计算出消化的淀粉量，与初始加入的淀粉进行比值计算，计算出淀粉的消化率。

本发明的有益效果：本发明的基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪及其制备，成本低廉、制作简单、稳定性好，适合规模化生产。用固定化酶技术可以使消化酶反复利用且提高稳定性，用LDHs/MXene修饰电极，可以改善电极和待测溶液间电子的转移速度，能够快速获得稳定的响应电流，大大提高了传感器的稳定性、重复性和传感器结构的可靠性，提高了现有淀粉消化率的检测水平。

附图说明

图1为本发明基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪装置图。

图2实施例2电流信号相应曲线。

图3为传统的淀粉体外消化曲线。

图4为本发明淀粉体外消化曲线。

附图标记说明：1、工作电极；2、辅助电极；3、参比电极；4、恒温消化反应容器；5、加热式磁体搅拌装置；6、温度传感装置；7、电化学工作站。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

实施例1 基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪及其制备

（1）固定消化酶：

a、将氧化石墨烯悬溶在纯水中，3000Hz超声分散3h后，得到分散均匀的氧化石墨烯悬浊液；并在4000r/min条件下离心30min；

b、取1mL上清液至于试管，加入3mL pH为6的磷酸缓冲液，并加入1mL的α-淀粉酶溶液和0.5mL的葡萄糖淀粉酶溶液，在37℃恒温振荡4h，4000r/min离心，用蒸馏水洗涤，重悬，即得到氧化石墨烯固定化消化酶；

（2）含有酶制剂的恒温消化反应容器：将氧化石墨烯固定化消化酶按照1:3的比例溶解于醋酸钠缓冲液中，得到电化学反应液，添加入恒温消化反应容器中；温度设置在37℃，并进行缓慢磁体搅拌进行淀粉消化；

（3）MXene的制备：将1g Ti₃AlC₂转移到包含10mL HF的PTFE衬里中，并在氮气氛下磁力搅拌18h。然后，将产物用超纯水洗涤并离心分离几次，直到pH达到6。随后将混合物超声处理3h后，将其在过滤器上抽滤。最后在50℃下真空干燥后，得到多层MXene。

（4）LDHs/MXene的制备：MXene/NiCo-LDH纳米复合材料是通过简单的水热法生产的。首先将10mg e-MXene，0.524g Ni(NO₃)₂·6H₂O，0.349g Co(NO₃)₂·6H₂O和1g CTAB分散含有60mL甲醇和12mL混合溶剂中。加50mL超纯水，并将混合物在室温下磁力搅拌。随后，将混合物在18℃水热反应24h。最后，通过乙醇和去离子水多次离心后，最终产品（MXene/NiCo-LDH）在60℃的真空中干燥，得到LDHs/MXene材料。

如图1所示，为基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪装置图，其中1为工作电极，2为辅助电极，3为参比电极，4为恒温消化反应容器。其中还包括恒温搅拌装置，5为加热式磁体搅拌装置，6为温度传感装置，这样可实现模拟人体恒温消化反应。

具体包括电化学工作站7；还包括工作电极1、辅助电极2、参比电极3、恒温消化反应容器4、加热式磁体搅拌装置5和温度传感装置6；所述恒温消化反应容器4下方设有加热式磁体搅拌装置5，内部设有温度传感装置6；所述恒温消化反应容器4内包括工作电极1、辅助电极2和参比电极3；工作电极1、辅助电极2和参比电极3均通过导线与电化学工作站7对应连接；所述温度传感装置6和加热式磁体搅拌装置5均由电化学工作站7进行控制。

实施例2 基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪应用，检测过程如下：

将实施例1制备所得基于LDHs/MXene玻碳电极的电化学葡萄糖传感器作为工作电极1，甘汞电极作为参比电极3，铂电极作为辅助电极2，建立三电极系统，将三电极系统与电化学工作站7连接，对待测溶液中的淀粉消化分解得到的葡萄糖浓度进行检测。

采用计时电流法（i-t）测定葡萄糖浓度，工作电压为0.6V，测量池中加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液作为空白溶液，加入淀粉样品，检测出淀粉消化过程中产生的葡萄糖的电流响应值，结果如图2所示，随着葡萄糖浓度的增加，电流急剧增大，说明传感器具有良好的电催化、传质和电子传递性能。由图2计算出相应电流（I）与葡萄糖浓度（C）之间的关系曲线，得到在线性检测范围为0.025~3.6mmol/L，其线性回归方程为：I（A）=1.4302×10^-7+0.1544C（mol/L）。当信噪比为3时，检出限为0.047μmol/L。最终，根据检测出的葡萄糖含量计算出消化的淀粉量，与初始加入的淀粉进行比值计算，计算出淀粉的消化率。

实施例3

为验证本发明提供的检测仪对葡萄糖具有良好的选择性和检测淀粉的痕量高效性，采用传统方法和采用本发明所述方法进行淀粉体外消化实验进行对比。

传统方法：称取淀粉样品500-1500mg，称取α-淀粉酶2.89g加入25.7mL去离子水中，量取1mL淀粉葡萄糖苷酶加入2mL去离子水中离心混合后制取酶溶液，并向每个样品中加入5mL酶液在37℃下孵育24h，每隔一段时间（0，10，20，40，60，90，120，300，360，1440min）取出检测葡萄糖含量。具体结果如图3所示。

本发明方法：采用本发明所述检测仪进行电化学检测。称取1-10mg淀粉样品加入恒温消化反应容器里面，加入5g已经固定化酶的氧化石墨烯和10mL醋酸钠缓冲液（0.5M，pH6）可以发现，在15min左右的时候，检测仪已经检测到淀粉达到消化终点。淀粉体外快速消化检测仪得到淀粉的消化曲线如图4所示。

对比图3-4可知，基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪可以达到痕量检测，检测所需样本量低，同时所需要的酶用量比传统方法大大降低，可以证明电化学方法可以减少淀粉消化率检测成本。在消化时间方面，本发明所述电化学检测方法仅在一个小时左右就可以完成消化速率的检测，节约时间，做到高效检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪，其特征在于：其包括含有酶制剂的恒温消化反应容器和表面修饰LDHs/MXene玻碳电极的电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪。

2.根据权利要求1所述基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪，包括电化学工作站（7）；其特征在于：还包括工作电极（1）、辅助电极（2）、参比电极（3）、恒温消化反应容器（4）、加热式磁体搅拌装置（5）和温度传感装置（6）；所述恒温消化反应容器（4）下方设有加热式磁体搅拌装置（5），内部设有温度传感装置（6）；所述恒温消化反应容器（4）内包括工作电极（1）、辅助电极（2）和参比电极（3）；工作电极（1）、辅助电极（2）和参比电极（3）均通过导线与电化学工作站（7）对应连接；所述温度传感装置（6）和加热式磁体搅拌装置（5）均由电化学工作站（7）进行控制。

3.根据权利要求2所述基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪，其特征在于：所述电化学工作站（7）包括信号采集系统、信号处理系统和数据分析系统；所述信号采集系统采集电流信号，通过信号处理系统和数据分析系统进行相关数据分析处理，得到淀粉消化速率。

4.权利要求1所述基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪的制备方法，其特征在于步骤如下：

（1）固定消化酶：以氧化石墨烯为载体固定消化酶，将α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶按比例固定化，得到氧化石墨烯固定化消化酶；

（2）含有酶制剂的恒温消化反应容器：把步骤（1）氧化石墨烯固定化消化酶加到恒温消化反应容器，建立消化反应体系，温度可控，能够进行低速搅拌，从而得到含有酶制剂的恒温消化反应容器；

（3）MXene材料的制备：由MAX材料通过刻蚀、插层和超声剥离处理，得到MXene材料；

（4）LDHs/MXene的电极材料制备：将步骤（3）所得MXene材料放入水中，加入金属元素A的前驱体、金属元素B的前驱体和尿素，再加入NaOH和Na₂CO₃，搅拌，静置，清洗沉淀物，得到LDHs/MXene复合材料；

（5）基于LDHs/MXene玻碳电极的电化学葡萄糖传感器的淀粉体外消化速率检测仪的制备：配置LDHs/MXene与Nafion的混合溶液，取适量滴于玻碳电极表面，干燥，得到表面修饰LDHs/MXene玻碳电极的电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪；

（6）组装：将步骤（5）所得表面修饰LDHs/MXene玻碳电极的电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪与步骤（2）所得含有酶制剂的恒温消化反应容器进行组装，即得到基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪。

5.根据权利要求4所述基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）固定消化酶：

a、将氧化石墨烯悬溶在纯水中，800-5000Hz超声分散0.1-8h后，得到浓度为0.1-10mg/mL的分散均匀的氧化石墨烯悬浊液；并1000-6000r/min离心10-90min；

b、取1mL上清液至于试管，加入1-3mL、pH为6的磷酸缓冲液，并加入1-10mL的α-淀粉酶溶液和0.5-5mL的葡萄糖淀粉酶溶液，在4-60℃恒温振荡4-24h，1000-6000r/min离心，用蒸馏水洗涤，重悬，即得到氧化石墨烯固定化消化酶；

（2）含有酶制剂的恒温消化反应容器：取步骤（1）制备所得氧化石墨烯固定化消化酶按照1-2:2-8的比例溶解于醋酸钠缓冲液中，得到电化学反应液，添加入恒温消化反应容器中；恒温消化反应容器的温度设置在20-60℃，并进行缓慢磁体搅拌进行淀粉消化；

（3）MXene材料的制备：室温下，将1g Ti₃AlC₂转移到体积浓度为5%-50%的HF的PTFE衬里中，并在氮气氛下磁力搅拌2-72h；然后，将产物用超纯水洗涤并离心分离若干次，直到pH达到6；将所得混合物在水中室温50-400Hz超声处理0.1-8h，将其在过滤器上抽滤；最后在30-50℃下1-20MPa真空干燥后，得到MXene材料，即多层Ti₃C₂；

（4）LDHs/MXene的电极材料制备：首先将10mg MXene材料、0.524g Ni(NO₃)₂·6H₂O、0.349g Co(NO₃)₂·6H₂O和1g CTAB分散在含有甲醇的混合溶剂中；加入5-60mL蒸馏水并将混合物在室温下磁力搅拌；随后将混合物在1-20MPa、2-18℃下水热反应1-24h；通过乙醇和去离子水1000-6000r/min多次离心后，在10-60℃、1-20MPa下真空中干燥，得到LDHs/MXene的电极材料；

（5）基于LDHs/MXene玻碳电极的电化学葡萄糖传感器的淀粉体外消化速率检测仪的制备：配置LDHs/MXene与Nafion溶液的混合水溶液，其中LDHs/MXene浓度为1-100mg/mL，Nafion溶液浓度为0.1-10mg/mL；取5-100μL所配混合水溶液滴于玻碳电极表面，常温干燥，得到基于LDHs/MXene玻碳电极的电化学葡萄糖传感器；

（6）组装：将步骤（5）所得基于LDHs/MXene玻碳电极的电化学葡萄糖传感器的电化学淀粉体外快速消化检测仪与步骤（2）所得含有酶制剂的恒温消化反应容器进行组装，即得到基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪。

6.根据权利要求5所述基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述含有甲醇的混合溶剂中所述混合溶剂具体包括NaOH、Na₂CO₃和尿素；甲醇：NaOH：Na₂CO₃：尿素摩尔浓度比为1:2-4:1-3:4-6。

7.基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪的应用，其特征在于：将其应用于检测淀粉体外消化率。

8.根据权利要求7所述基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪的应用，其特征在于：基于LDHs/MXene玻碳电极的电化学葡萄糖传感器作为工作电极，甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，将工作电极的检测端置于待测溶液中，通过电化学工作站检测出待测溶液中进行电化学反应时的还原电流大小，然后根据葡萄糖的浓度与还原电流变化的线性回归方程，即定性或定量地测定待测溶液中的葡萄糖浓度，进而计算出淀粉消化率。

9.根据权利要求8所述基于电化学葡萄糖传感器的淀粉体外快速消化检测仪的应用，其特征在于所述葡萄糖浓度与还原电流变化的线性回归方程为：I=1.4302×10^-7+0.1544C；上式中，I为葡萄糖检测时的电流变化值，单位为A；C为待测溶液中葡萄糖的浓度值，单位为mol/L；所述葡萄糖的线性检测范围为0.025~3.6mmol/L，当信噪比为3时，检出限为0.047μmol/L；

最终根据检测出的葡萄糖含量计算出消化的淀粉量，与初始加入的淀粉进行比值计算，计算出淀粉的消化率。

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