CN112858419B - 一种构建光电化学传感器检测5-羟甲基胞嘧啶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于钙钛矿和黑色二氧化锆构建光电化学传感器检测5‑羟甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(5hmC)的方法。光电化学传感器包括电极，以及电极上依次修饰有钙钛矿、巯基丙酸、5hmC和黑色ZrO2。首先构建了以钙钛矿为基底的光电化学生物传感器，利用钙钛矿Bi4TaO8Cl良好的光电活性和稳定性，M.HhaI甲基转移酶催化5hmC上羟甲基与巯基的特异性反应，以及黑色ZrO2对磷酸基团的特异性识别，通过黑色ZrO2与Bi4TaO8Cl形成异质结促进光生电子转移增强光电信号，实现对5hmC的高灵敏性和高特异性检测。本发明的检测方法简便易于操作，成本低，不仅扩大了两种纳米材料的应用范围，也可实现对5hmC的检测。
Description
技术领域
本发明涉及光电化学分析技术领域，具体涉及一种基于钙钛矿和黑色二氧化锆的光电化学生物传感器的制备及其用于检测5-羟甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(5hmC)的方法。
背景技术
5hmC最早于1952年在噬菌体中被发现，但在当时并没有引起足够的重视。直到2009年，Science上报道了5hmC在哺乳动物基因组DNA中有着丰富的表达，并且5-甲基胞嘧啶(5mC)可以被TET(ten-eleven translocation)酶家族氧化为5hmC，由此关于5hmC的研究引起了人们的广泛关注。作为“第六碱基”，5hmC的功能、基因组分布及生物学功能都在深入研究。值得注意的是，5hmC水平在各种癌症中显著降低，表明5hmC在癌症发展中发挥重要作用。此外，在骨髓增生异常综合征、阿尔茨海默症、精神病患者中也发现5hmC分布异常。目前已有的研究表明，5hmC是一种新兴的疾病诊断、治疗和预后的生物标志物。因此，发展准确、可靠、灵敏的5hmC检测技术非常重要。
近年来，随着生物分子检测技术的逐渐成熟，已有越来越多的方法用来检测5hmC，包括高效色谱-质谱联用(HPLC-MS)法，薄层色谱法、毛细管电泳-质谱联用技术和单分子实时测序等。然而，上述方法要么需要专业操作人员，要么太昂贵或太耗时，因此开发简单、快捷、低成本、具有高灵敏性和高选择性的替代方法至关重要。
光电化学传感器利用光电化学的原理，可以将电化学分析和光化学分析的优点结合起来。因为光电化学检测采用独立的激发光源和信号采集系统，所以拥有较高的灵敏度。此外，和需要复杂且昂贵设备的光学技术相比，光电化学仪器更简单、便宜且更容易小型化。钙钛矿Bi4TaO8Cl具有独特的光电性能和稳定性。黑色二氧化锆是一种新型的具有可见光活性的光催化材料，由于其独特的氧空位和硼掺杂的结构，它的带隙结构得到了改善，光生电子分离效率增强。但目前尚未有基于钙钛矿Bi4TaO8Cl和黑色二氧化锆的光电化学分析方法检测5hmC的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测5hmC的光电化学生物传感器及其制备方法，实现对5hmC的简便、快速、灵敏检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种基于钙钛矿和黑色二氧化锆检测5-羟甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的光电化学生物传感器，其特征在于，包括电极，所述电极上依次修饰有钙钛矿、巯基丙酸、5hmC和黑色金属氧化物。
优选的，所述电极为ITO电极；所述钙钛矿为氨基化的钙钛矿，其化学式为：Bi4TaO8Cl-NH2。所述黑色金属氧化物为黑色ZrO2。
本发明的第二方面，提供上述光电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)对电极进行清洗得到预处理电极；
(2)将Bi4TaO8Cl-NH2修饰于步骤(1)得到的预处理电极的表面，得到Bi4TaO8Cl-NH2/电极；
(3)将巯基丙酸修饰于步骤(2)得到的Bi4TaO8Cl-NH2/电极的表面，得到巯基丙酸/Bi4TaO8Cl-NH2/电极；
(4)在M.HhaI的催化作用下，将5hmC固定到步骤(3)得到的巯基丙酸/Bi4TaO8Cl-NH2/电极的表面，得到5hmC/巯基丙酸/Bi4TaO8Cl-NH2/电极；
(5)将黑色ZrO2修饰到步骤(4)得到的5hmC/巯基丙酸/Bi4TaO8Cl-NH2/电极的表面，得到黑色ZrO2/5hmC/巯基丙酸/Bi4TaO8Cl-NH2/电极，即光电化学生物传感器。
优选的，步骤(1)中，电极的清洗方法为：将电极依次用乙醇/水-氢氧化钠的混合液、丙酮和二次水超声清洗，晾干。
优选的，步骤(2)中，Bi4TaO8Cl-NH2修饰的方法为：将Bi4TaO8Cl-NH2用去离子水制成Bi4TaO8Cl-NH2分散液，将其滴加到步骤(1)得到的预处理电极的表面，红外灯照射下干燥；所述Bi4TaO8Cl-NH2分散液的浓度为0.1-5mg/mL；
更为优选的，所述Bi4TaO8Cl-NH2由如下方法制备而成：
将Bi2O3,Ta2O5,BiOCl,NaCl和KCl粉末研磨混匀，500-800℃空气氛围下煅烧1-5h，取出煅烧后的固体，研磨并洗涤、干燥后得黄色的Bi4TaO8Cl；将Bi4TaO8Cl超声分散于乙醇和水的混合溶液中，在不断搅拌下加入APTES溶液，加热至60-90℃回流反应5-7h；反应结束冷却至室温后收集并洗涤沉淀，干燥后即得到Bi4TaO8Cl-NH2。
优选的，步骤(3)中，巯基丙酸修饰的方法为：将巯基丙酸溶液用EDC/NHS提前活化1-3h，然后滴加到步骤(2)得到的Bi4TaO8Cl-NH2/电极的表面，室温和潮湿条件下反应1.5-4h；然后清洗3-5次；
更为优选的，所述巯基丙酸溶液的浓度为2.2-7.1mM。
优选的，步骤(4)中，5hmC固定的方法为：将含有M.HhaI甲基转移酶和5hmC的混合液滴加到步骤(3)得到的巯基丙酸/Bi4TaO8Cl-NH2/电极的表面，25-45℃和潮湿条件下反应1.5-4小时；然后用清洗液清洗3-5次。
优选的，歩骤(5)中，黑色ZrO2修饰的方法为：将黑色ZrO2分散液滴加到步骤(4)得到的5hmC/巯基丙酸/Bi4TaO8Cl-NH2/电极的表面，于37℃潮湿条件下孵化0.5-4h；
优选的，所述黑色ZrO2分散液的浓度为0.1-5mg/mL；
更为优选的，所述黑色ZrO2由如下方法制备而成：
将0.5-2g ZrO2和0.01-1g硼氢化钠研磨混匀，300-700℃氮气氛围下煅烧0.5-3h，得到黑色固体，洗涤、干燥，即得黑色ZrO2。
上述光电化学生物传感器在检测5hmC的应用也是本发明的保护范围。
本发明的第三方面，提供一种利用上述光电化学生物传感器检测5hmC的方法，包括以下步骤：
将上述光电化学生物传感器作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极、Pt丝为辅助电极组成三电极系统，插入检测液中进行光电信号检测，建立光电流值与5-羟甲基胞嘧啶核苷酸浓度之间的关系，对未知样品中的5-羟甲基胞嘧啶核苷酸含量进行检测。
优选的，所述检测液为含有0.06-0.55M抗坏血酸的Tris-HCl缓冲溶液(pH为5.4-8.5)。
优选的，所用检测方法为电流-时间法，应用电位为-0.5～0.2V。
更优选的，所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.01-0.5M。
需要说明的是，上述检测方法可以用在非疾病诊断方面，可以通过检测5hmC的含量，发现相关的靶向药物，为新药物的开发提供新的方法。
本发明的有益效果：
(1)本发明利用钙钛矿Bi4TaO8Cl良好的光电活性，使黑色ZrO2与Bi4TaO8Cl形成异质结提高光生电子空穴转移速率，实现光电信号的扩增，提高5hmC的检测灵敏度。
(2)利用5hmC独有的、能在M.HhaI甲基转移酶催化下、5hmC上的羟甲基与巯基的共价反应，提高5hmC检测的特异性。
(3)本发明的检测方法步骤简便，实现了仪器小型化，且易于操作，成本低，仅对ITO电极表面进行简单的处理，即可实现对5hmC的检测。
(4)本发明是基于黑色ZrO2中的四价Zr与5-羟甲基胞嘧啶核苷酸上磷酸基团特异性结合作用固定信号扩增材料，具有很高的检测选择性。
附图说明
图1：本发明的5hmC检测的原理图。
图2：不同浓度的5hmC的光电化学响应曲线；曲线a-i代表的浓度分别为0.02、0.1、0.5、1、5、10、50、100、180nM的5hmC。
图3：光电流值与5hmC浓度对数值的线性拟合曲线。
图4：不同核苷酸条件下的光电化学响应变化的柱状图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明中的“室温”的范围为20-30℃。
本发明中的“潮湿条件”为湿度大于90％；优选湿度为95-99％。
本发明中所使用的清洗液的成分为：3-15mM Tris-HCl和20-60mM KCl，pH 7.4。
本发明中所使用的M.HhaI缓冲液的成分为：20-60mM Tris-HCl、5-30mM EDTA，pH6.0-8.5。
本发明中所使用的检测液为：0.01-0.5M Tris-HCl、0.06-0.55M AA，pH为5.4-8.5。
正如背景技术部分所介绍的，现有技术中5hmC的检测方法存在一定的不足，需要开发简单、快捷、低成本、具有高灵敏性和高选择性的替代方法。基于此，本发明构建了一种新颖的检测5hmC的光电化学生物传感器。
本发明的光电化学生物传感器构建和检测的原理图见图1。以ITO电极为基体电极，利用ITO电极表面的含氧基团与氨基化钙钛矿Bi4TaO8Cl-NH2之间的静电吸附力，将氨基化的钙钛矿修饰到电极表面。再利用巯基丙酸(MPA)上的羧基在EDC/NHS活化后能与钙钛矿表面的氨基发生共价结合，将巯基丙酸修饰到电极表面。然后，巯基丙酸的另一端暴露出巯基，在M.HhaI甲基转移酶的催化作用下，5hmC上羟甲基与巯基发生共价反应，将5hmC捕获到电极表面。最后，利用黑色ZrO2与5hmC上磷酸根的结合作用，将黑色ZrO2修饰到电极表面，得到制备的传感器。当黑色ZrO2修饰到电极表面后，光电流会显著增强，这主要是由于黑色ZrO2能与基底钙钛矿Bi4TaO8Cl形成异质结，促进了光生电子的迁移。而黑色ZrO2的修饰量由5hmC的浓度决定的，因此，利用5hmC的浓度与光电流值的线性关系，可实现对5hmC的检测。
在本发明的一个实施方案中，给出的光电化学生物传感器的构建过程为：
(1)氨基化钙钛矿Bi4TaO8Cl-NH2的制备：将0.3-3g Bi2O3,0.3-1g Ta2O5,0.2-1gBiOCl,0.6-5g NaCl和0.6-5g KCl粉末研磨混匀，500-800℃空气氛围下煅烧1-5h，取出煅烧后的固体，研磨后用去离子水在7000-12000rpm转速下离心洗涤、收集沉淀，于60℃真空干燥，即得黄色的钙钛矿Bi4TaO8Cl。将Bi4TaO8Cl粉末超声分散于乙醇和水的混合溶液(乙醇与水的体积比为1:1～1:6)中，在不断搅拌下加入3-5mL APTES溶液，加热至60-90℃回流反应5-7h。冷却至室温后离心收集沉淀，再将沉淀依次用无水乙醇和水在7000-12000rpm转速下离心洗涤，最后产物于60℃真空干燥后研磨收集备用。
(2)黑色ZrO2的制备：将0.5-2g ZrO2和0.01-1g硼氢化钠研磨混匀，300-700℃氮气氛围下煅烧0.5-3h，得到的黑色固体粉末用去离子水洗涤，并真空干燥，最后产品研磨收集后备用。
(3)氨基化钙钛矿Bi4TaO8Cl-NH2分散液的制备：称取1-20mg氨基化钙钛矿Bi4TaO8Cl-NH2，加入到3-10mL去离子水中，超声分散1-3小时。
(4)黑色ZrO2分散液的制备：称取1-20mg黑色ZrO2，加入到1-10mL去离子水中，超声分散1-3小时。
(5)ITO电极预处理：将ITO导电玻璃切割成5×1cm2的小片，先用丙酮超声清洗30-60分钟，然后用NaOH(摩尔浓度为0.01-1M)的乙醇/水(乙醇与水的体积比为1:1～1:3)混合溶液超声清洗30-60分钟，最后再用二次水清洗30-60分钟，并在室温下晾干，待用。
(6)氨基化钙钛矿Bi4TaO8Cl-NH2的固定：将25-60μL氨基化钙钛矿Bi4TaO8Cl-NH2分散液滴加到预处理的ITO电极表面，红外灯照射烤干。制备的电极标记为Bi4TaO8Cl/ITO。
(7)巯基丙酸(MPA)的固定：提前将巯基丙酸溶液(1-5mM)用EDC/NHS溶液活化1-2小时,将16-55μL活化后的巯基丙酸溶液滴加到Bi4TaO8Cl/ITO电极表面，置于25-40℃和潮湿条件下反应0.5-3小时。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。制备的电极标记为MPA/Bi4TaO8Cl/ITO。
EDC/NHS溶液的配制方法为：
第一步，配制EDC溶液。称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)粉末，溶于二次水中，配成80-150mM的EDC溶液。
第二步，配制NHS溶液。称取N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)粉末，溶于二次水中，配成25-50mM的NHS溶液。
第三步，配制EDC/NHS溶液。取等体积量的EDC溶液和NHS溶液混合均匀，即得EDC/NHS溶液。以上溶液均现配现用。
EDC/NHS溶液活化巯基丙酸的方法为：
取等体积量的巯基丙酸溶液和EDC/NHS溶液，混合均匀并密封，之后放置在37℃的恒温箱中振荡反应1-2h，即完成活化。
(8)5hmC的修饰：将10-50μL含有M.HhaI甲基转移酶(50-200unit/mL)和不同浓度5hmC的混合液滴加到MPA/Bi4TaO8Cl/ITO电极表面，25-45℃和潮湿条件下反应1.5-4小时。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。制备的电极标记为5hmC/MPA/Bi4TaO8Cl/ITO。
(9)黑色ZrO2固定：将20-62μL的黑色ZrO2分散液滴加到5hmC/MPA/Bi4TaO8Cl/ITO电极表面，25-55℃和潮湿条件下反应0.5-3.5小时。然后，将电极用清洗液清洗3-5次。制备的电极标记为ZrO2/5hmC/MPA/Bi4TaO8Cl/ITO。
上述光电化学生物传感器的构建过程中，各步骤相辅相成，顺序是严格限定的，每一步都为下一步的固定修饰服务，缺少上一步，可能会导致后面的修饰失败。
在本发明的另一个实施方案中，给出了采用上述光电化学生物传感器检测5hmC的过程为：
(1)以不同浓度5hmC制备的ZrO2/5hmC/MPA/Bi4TaO8Cl/ITO电极作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极、Pt丝为辅助电极组成三电极系统进行光电化学信号检测，光源为可见光，应用电位为-0.5～0.2V，在检测液(0.01-0.5M Tris-HCl、0.06-0.55M AA，pH为5.4-8.5)中记录光电流。
(2)建立电流与5-羟甲基胞嘧啶核苷酸浓度之间的关系，利用该关系式对待测样品中的5hmC的含量进行检测。
随着5hmC浓度的增加，电极表面固定的黑色ZrO2数量也随之增加，导致光电流信号增加。根据5hmC浓度与电流的线性关系，可实现对5hmC的检测。
采用本发明的光电化学生物传感器对5hmC的检测范围为0.02-180nM，检测限为1.93pM。
本发明将黑色ZrO2与Bi4TaO8Cl形成异质结增强光电信号，这是一种利用纳米材料进行传感器信号扩增的方式，其优势在于：第一，黑色ZrO2与Bi4TaO8Cl形成异质结放大光电信号是一种光电增强型(signal-on)信号放大方式，这种“signal-on”型的方式可以进一步证实光电信号的放大的确与黑色ZrO2在电极上的固定有关，避免了其它因素的干扰；第二，黑色ZrO2作为一种新兴的纳米材料不仅能增强基底材料的光电活性，而且由于黑色ZrO2自身含有的四价锆能与目标检测物上的磷酸基团直接结合，可以省去目标检测物与信号扩增物质之间的连接步骤，使得传感器的构建更为方便快捷；第三，与生物扩增方式相比，黑色ZrO2与Bi4TaO8Cl形成异质结放大光电信号，这种扩增方式不需要设计昂贵的DNA链，而且黑色ZrO2与Bi4TaO8Cl的合成方法较为简单，成本大大降低；第四，在钙钛矿材料的应用中涉及到生物传感器的应用偏少，而且能与Bi4TaO8Cl形成异质结并增强光电信号的纳米材料并不多，利用黑色ZrO2与Bi4TaO8Cl形成异质结的方式，扩大了钙钛矿材料的应用范围。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：氨基化钙钛矿Bi4TaO8Cl-NH2的制备
称取1.7g Bi2O3,0.5g Ta2O5,0.6g BiOCl,1.4g NaCl和1.8g KCl粉末研磨混匀，700℃空气氛围下煅烧5h，取出煅烧后的固体，研磨后用去离子水在10000rpm转速下离心洗涤、收集沉淀，于60℃真空干燥，即得黄色的钙钛矿Bi4TaO8Cl。将Bi4TaO8Cl粉末超声分散于乙醇和水的混合溶液(乙醇：水为1：1)中，在不断搅拌下加入3mL APTES溶液，加热至70℃回流反应7h。冷却至室温后离心收集沉淀，再将沉淀依次用无水乙醇和水在10000rpm转速下离心洗涤，最后产物于60℃真空干燥后研磨收集。
实施例2：黑色的ZrO2的制备
将白色1g ZrO2和0.5g硼氢化钠研磨30min混匀，在650℃氮气氛围下煅烧3h，得到黑色固体粉末，用去离子水洗涤、最后产品真空干燥后研磨收集。
实施例3：氨基化钙钛矿Bi4TaO8Cl-NH2分散液的制备
称取12mg氨基化钙钛矿Bi4TaO8Cl-NH2，加入到6mL去离子水中，超声分散2小时。
实施例4：黑色ZrO2分散液的制备
称取10mg黑色ZrO2，加入到5mL去离子水中，超声分散2小时。
实施例5：ITO电极预处理
将ITO导电玻璃切割成5×1cm2的小片，先用丙酮超声清洗45分钟，然后用NaOH(摩尔浓度为0.01M)的乙醇/水混合溶液超声清洗45分钟，最后再用二次水清洗45分钟，并在室温下晾干，待用。
实施例6：氨基化钙钛矿Bi4TaO8Cl-NH2的固定
将40μL氨基化钙钛矿Bi4TaO8Cl-NH2分散液滴加到预处理的ITO电极表面，红外灯照射烤干。制备的电极标记为Bi4TaO8Cl/ITO。
实施例7：巯基丙酸(MPA)的固定
EDC/NHS溶液的配制：
称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)粉末，溶于二次水中，配成100mM的EDC溶液。称取N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)粉末，溶于二次水中，配成25mM的NHS溶液。取等体积量的EDC溶液和NHS溶液混合均匀，即得EDC/NHS溶液。
EDC/NHS溶液活化巯基丙酸：
取等体积量的巯基丙酸溶液(5mM)和EDC/NHS溶液混合均匀并封口，之后放置在37℃的恒温箱中振荡反应2h，得到活化后的巯基丙酸溶液。取40μL活化后的巯基丙酸溶液滴加到Bi4TaO8Cl/ITO电极表面，置于37℃和潮湿条件下反应2小时。然后，将电极用清洗液清洗3次。制备的电极标记为MPA/Bi4TaO8Cl/ITO。
实施例8：5hmC的修饰
将等体积的M.HhaI甲基转移酶溶液(由M.HhaI缓冲液配制而成，浓度为100unit/mL)和不同浓度的5hmC(0.02、0.1、0.5、1、5、10、50、100、180nM)溶液混合，取40μL混合液滴加到MPA/Bi4TaO8Cl/ITO电极表面，37℃和潮湿条件下反应2小时。然后，将电极用清洗液清洗3次。制备的电极标记为5hmC/MPA/Bi4TaO8Cl/ITO。
实施例9：黑色ZrO2固定
将40μL黑色ZrO2分散液滴加到5hmC/MPA/Bi4TaO8Cl/ITO电极表面，37℃和潮湿条件下反应2小时。然后，将电极用清洗液清洗3次。制备的电极标记为ZrO2/5hmC/MPA/Bi4TaO8Cl/ITO。
实施例10：光电化学检测
以电化学工作站为信号采集仪器，500W氙灯为可见光光源(加装滤除紫外光的滤波片)，ZrO2/5hmC/MPA/Bi4TaO8Cl/ITO电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，含有0.1M AA的0.1M Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液为检测液，以-0.2V电压为工作电压，采用i-t技术进行待测物的检测研究。建立光电流与5hmC浓度之间的关系，线性范围为0.02-180nM，校正曲线为I(nA)＝215.95logc(nM)+1142.61(R＝0.9972)，检出限为1.93pM(图2和图3)。
实施例11：检测选择性实验
为了研究构建的传感器的特异性，选择6种脱氧核糖核苷酸作为对比试剂：三磷酸腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dTTP)、三磷酸鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(dGTP)、三磷酸胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(dCTP)、5-甲基胞嘧啶脱氧核糖三磷酸(5m-dCTP)、5-醛基胞嘧啶脱氧核糖三磷酸(5f-dCTP)。并对不同对比试剂参与构建传感器的光电流变化值(ΔI＝I1-I2，I1是MPA/Bi4TaO8Cl/ITO的电流值，I2是MPA/Bi4TaO8Cl/ITO经过不同核苷酸处理后的电极继续经黑色ZrO2处理后的电极的光电流值，对比试剂和5hmC的浓度均为10nM)进行了对比。结果表明，对比试剂参与构建传感器的电流变化值明显低于5hmC，表明构建的传感器具有很好的特异性(图4)。
实施例12：稳定性实验
采用相同的方法制备10支ZrO2/5hmC/MPA/Bi4TaO8Cl/ITO电极(5hmC浓度为10nM)，在相同检测液中检测光电流值。得到10个光电流值的相对标准偏差为3.87％，说明该方法有很好的重现性。将ZrO2/5hmC/MPA/Bi4TaO8Cl/ITO传感器在4℃下存放2周，在检测液中检测光电化学信号，得到的光电流响应为原始响应的92.89％，说明该方法有很好的稳定性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种基于钙钛矿和黑色二氧化锆检测5-羟甲基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的光电化学生物传感器，其特征在于，包括电极，所述电极上依次修饰有钙钛矿、巯基丙酸、5hmC和黑色金属氧化物；所述黑色金属氧化物为黑色ZrO2；所述电极为ITO电极；所述钙钛矿为氨基化的钙钛矿，其化学式为：Bi4TaO8Cl-NH2。
2.权利要求1所述的光电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对电极进行清洗得到预处理电极；
（2）将Bi4TaO8Cl-NH2修饰于步骤（1）得到的预处理电极的表面，得到Bi4TaO8Cl-NH2/电极；
（3）将巯基丙酸修饰于步骤（2）得到的Bi4TaO8Cl-NH2/电极的表面，得到巯基丙酸/Bi4TaO8Cl-NH2/电极；
（4）在M. HhaI甲基转移酶的催化作用下，将5hmC固定到步骤（3）得到的巯基丙酸/Bi4TaO8Cl-NH2/电极的表面，得到5hmC/巯基丙酸/Bi4TaO8Cl-NH2/电极；
（5）将黑色ZrO2修饰到步骤（4）得到的5hmC/巯基丙酸/Bi4TaO8Cl-NH2/电极的表面，得到黑色ZrO2/5hmC/巯基丙酸/Bi4TaO8Cl-NH2/电极，即光电化学生物传感器。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，Bi4TaO8Cl-NH2修饰的方法为：将Bi4TaO8Cl-NH2用去离子水制成Bi4TaO8Cl-NH2分散液，将其滴加到步骤（1）得到的预处理电极的表面，红外灯照射下干燥；所述Bi4TaO8Cl-NH2分散液的浓度为0.1-5mg/mL；
所述Bi4TaO8Cl-NH2由如下方法制备而成：
将Bi2O3, Ta2O5, BiOCl, NaCl和KCl粉末研磨混匀，500-800℃空气氛围下煅烧1-5 h，取出煅烧后的固体，研磨并洗涤、干燥后得黄色的Bi4TaO8Cl；将Bi4TaO8Cl超声分散于乙醇和水的混合溶液中，在不断搅拌下加入APTES 溶液，加热至 60-90℃回流反应 5-7 h；反应结束冷却至室温后收集并洗涤沉淀，干燥后即得到Bi4TaO8Cl-NH2。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，巯基丙酸修饰的方法为：将巯基丙酸溶液用EDC/NHS提前活化1-3h，然后滴加到步骤（2）得到的Bi4TaO8Cl-NH2/电极的表面，室温和潮湿条件下反应1.5-4h；然后清洗3-5次；
所述巯基丙酸溶液的浓度为2.2-7.1mM。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，5hmC固定的方法为：将含有M. HhaI甲基转移酶和5hmC的混合液滴加到步骤（3）得到的巯基丙酸/Bi4TaO8Cl-NH2/电极的表面，25-45℃和潮湿条件下反应1.5-4小时；然后清洗3-5次。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，歩骤（5）中，黑色ZrO2修饰的方法为：将黑色ZrO2分散液滴加到步骤（4）得到的5hmC/巯基丙酸/Bi4TaO8Cl-NH2/电极的表面，于37℃潮湿条件下孵化0.5-4h；
所述黑色ZrO2分散液的浓度为0.1-5mg/mL；
所述黑色ZrO2由如下方法制备而成：
将0.5-2g ZrO2和0.01-1g硼氢化钠研磨混匀，300-700℃氮气氛围下煅烧0.5-3 h，得到黑色固体，洗涤、干燥，即得黑色ZrO2。
7.权利要求1所述的光电化学生物传感器在检测5hmC中应用。
8.利用权利要求1所述的光电化学生物传感器检测5hmC的方法，其特征在于，所述方法为：
以权利要求1所述的光电化学生物传感器作为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极、铂丝为辅助电极，组成三电极系统，将其插入检测液中进行光电信号检测，建立光电信号值与5hmC浓度之间的线性关系；利用该线性关系对待测样品中5hmC的含量进行检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述光电信号检测的方法为电流-时间法；所述检测液为包含抗坏血酸的Tris-HCl缓冲溶液。
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