CN113549623B - 一种同时检测胰岛素与葡萄糖的适配体组合、检测传感器及其制备方法 - Google Patents

一种同时检测胰岛素与葡萄糖的适配体组合、检测传感器及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113549623B
CN113549623B CN202110607049.3A CN202110607049A CN113549623B CN 113549623 B CN113549623 B CN 113549623B CN 202110607049 A CN202110607049 A CN 202110607049A CN 113549623 B CN113549623 B CN 113549623B
Authority
CN
China
Prior art keywords
insulin
glucose
electrode
sensor
aptamer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110607049.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113549623A (zh
Inventor
李少光
李辉
朱满
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Weierbo Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Wuhan Weierbo Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Weierbo Biotechnology Co ltd filed Critical Wuhan Weierbo Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110607049.3A priority Critical patent/CN113549623B/zh
Publication of CN113549623A publication Critical patent/CN113549623A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113549623B publication Critical patent/CN113549623B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/48—Systems using polarography, i.e. measuring changes in current under a slowly-varying voltage
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/62—Insulins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biophysics (AREA)

Abstract

本发明公开了一种同时检测胰岛素与葡萄糖的适配体组合，所述适配体为核酸适配体，包括依次连接的修饰基团、能够与胰岛素和葡萄糖进行特异性结合的人工合成核苷酸序列组和电信号亚甲基蓝基团和电信号二茂铁基团，所述修饰基团为HS‑C6‑，所述能够与胰岛素和葡萄糖进行特异性结合的人工合成核苷酸序列组的序列表为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。本发明还保护上述适配体制备的检测传感器及检测传感器的制备方法。本发明可以在未稀释的全血环境中以高灵敏和高选择性同时检测葡萄糖和胰岛素，具有潜在的临床应用价值，而且采用了适配体识别，不需要任何酶或纳米材料的参与，检测过程十分便捷。

Description

一种同时检测胰岛素与葡萄糖的适配体组合、检测传感器及 其制备方法
技术领域
本发明涉及电化学检测技术领域，特别涉及一种同时检测胰岛素与葡萄糖的适配体组合、检测传感器及其制备方法。
背景技术
糖尿病是由不同发病机制和病因引起的体内胰岛素不足，而导致糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱，并以严重高血糖为主要临床表现的代谢性疾病。糖尿病分为两种主要形式：1型糖尿病(T1DM)，它是一种自身免疫性疾病，其诱导产生胰岛素的胰腺β细胞的破坏，导致胰岛素的绝对缺乏；②2型糖尿病(T2DM)，主要特征是胰岛素抵抗，其中外周组织不能对胰岛素刺激做出正常反应，机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。
胰岛素是葡萄糖和脂质代谢的关键调节剂，但也作为生长因子发挥作用。胰岛素与其受体的结合启动了两种主要的信号通路：即PI3K/AKT通路和MAPK通路，参见图1。胰岛素对胰岛素受体的激活导致胰岛素受体蛋白的聚集，从而启动PI3K/AKT途径，继而触发葡萄糖转运蛋白4易位和参与代谢调节的酶/蛋白的激活。不同的外周组织之间胰岛素所扮演的角色也有所不同。在肝脏中，它通过调节糖原合成和糖异生而作为葡萄糖产生的抑制剂。在肌肉和脂肪组织中，胰岛素导致葡萄糖转运蛋白4转运到质膜，这显著增加了血液对这些组织的葡萄糖吸收。此外，胰岛素诱导的PI3K/AKT途径的激活减少了脂解并增加了脂质合成，这加速了葡萄糖向甘油三酯的转化。因此，胰岛素是脂肪组织中脂肪储存的主要调节剂。胰岛素还激活促有丝分裂MAPK途径，包括RAS/RAF/MEK/ERK信号级联通路。活化的ERK磷酸化胞质蛋白质转移到细胞核，并在转录和翻译以及细胞生长的水平上刺激蛋白质生物合成。虽然PI3K/AKT途径也参与细胞生存及生长，但MAPK级联被认为是胰岛素刺激促有丝分裂的主要介质。
现在有多种分析方法可用于测定血清胰岛素水平。例如液相色谱-质谱，酶联免疫吸附测定，电化学方法和基于荧光的技术等，但是上述方法都很难做到同时对血糖和胰岛素进行检测。同时测定血糖和胰岛素在时间和样本数量上都很有价值，因为一次测定就能诊断糖尿病及其类型。但是到目前为止，同时测定血糖和胰岛素的技术寥寥无几。
据现有文献报道，Sohail等人基于碲化镉/硫化镉/硫化锌量子点和硫化镉的静态猝灭和内过滤效应，成功设计了一种双发射纳米光传感器，可用于同时测定人血清中葡萄糖和胰岛素的浓度。通过方差分析优化了所有反应参数，并建立了多项式回归模型，有效地解释了反应参数对荧光恢复的影响。设计的统计模型经观测、预测和残差图验证。该模型被证明是一个有价值的工具，可以利用一个模型来评估多个变量在其特定水平上对单个因素的影响。胰岛素和葡萄糖的线性范围分别为0.2～2nM和0.5～7mM。胰岛素和葡萄糖的检测限分别为0.018nM和0.058mM。所有相对误差％值均在5.00～4.00％范围内，相对标准偏差％值≤3.77％。在存在各种干扰物质的情况下，探针荧光强度恢复的变化小于5％，葡萄糖和胰岛素的所有回收率在90～110％的范围内。但他们的方案是基于荧光分析法的，虽然灵敏度高，检测限低，但是仪器不便于携带，无法做到实时监测。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的至少一种技术问题，提供一种同时检测胰岛素与葡萄糖的适配体组合、检测传感器及其制备方法，可以在未稀释的全血环境中以高灵敏和高选择性同时检测葡萄糖和胰岛素，具有潜在的临床应用价值，而且采用了适配体识别，不需要任何酶或纳米材料的参与，检测过程十分便捷。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种同时检测胰岛素与葡萄糖的适配体组合，所述适配体为核酸适配体，包括依次连接的修饰基团、能够与胰岛素和葡萄糖进行特异性结合的人工合成核苷酸序列组和电信号亚甲基蓝基团和电信号二茂铁基团，所述修饰基团为HS-C6-，所述能够与胰岛素和葡萄糖进行特异性结合的人工合成核苷酸序列组的序列表为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
本发明还保护由上述适配体组合制备的一种同时检测胰岛素与葡萄糖的检测传感器，所述检测传感器包括电极，所述电极外附有所述的同时检测胰岛素与葡萄糖的适配体组合。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述电极包括固定连接的钨丝和金丝，以及包裹在钨丝和金丝外的绝缘层；所述电极两端留有工作段，所述绝缘层完全包裹工作段之外的金属丝。
优选的，所述钨丝和金丝通过环氧树脂粘接。
优选的，所述绝缘层材质为聚四氟乙烯。
优选的，所述钨丝长度为6～10cm，金丝长度为1～4cm，钨丝一侧留出的工作段长度为1～2cm，金丝一侧留出的工作长度为0.3～0.8cm。
本发明还要求保护上述一种同时检测胰岛素与葡萄糖的检测传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)，制作电极；
步骤2)，清洗步骤1)制得的电极；
步骤3)，将步骤2)清洗后的电极放入权利要求1所述的适配体组合配置的溶液中反应，然后移到MCH溶液中反应，取出后制得检测传感器。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述步骤1)中，电极的制作包括以下步骤：首先用环氧树脂连接钨丝和金丝，然后将连接处用绝缘层包裹，最后将工作段外的金属丝部分用绝缘层包裹。
进一步，所述步骤2)中，电极的清洗包括以下步骤：以Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，依次使用0.5M的NaOH溶液，0.5M的H2SO4溶液和0.05M的H2SO4溶液，采用循环伏安法清洗。
进一步，所述步骤3)中，所述适配体组合溶液的浓度为1μM，在适配体溶液中的反应条件为室温下反应1h；所述MCH溶液的浓度为4％，在MCH溶液中的反应条件为4℃温度下反应12h。
本发明的有益效果是：本发明以亚甲基蓝(MB)和二茂铁(Fc)作为指示剂制备的电化学传感器稳定性很高，在未加入靶标物质时，在不同频率的扫描电压下的电化学信号很稳定，频率最大时，电化学信号最高；本发明的靶标物质，电信号感应良好，且随着时间的延长，几乎没有变化，频率越低灵敏度越高，稳定性越好，本发明在保证较高的灵敏度的前提下，还能够解决目前电化学生物传感器稳定性的问题；本发明对于糖尿病患者的日常检测有很大的意义，同时在医疗、临床、医学、生物学等领域也有很大的前景。
附图说明
图1是胰岛素信号通路及其功能的化学表征原理图；
图2为本发明基于核酸适配体的电化学生物传感器电极的结构示意图；
图3为本发明传感器基于SEQ ID NO.1序列，在全血溶液中加入5mM葡萄糖溶液前后本发明传感器的方波伏安响应曲线图；
图4为本发明传感器基于SEQ ID NO.1序列，在5mM葡萄糖溶液中不同频率的响应及稳定性测试图。
图5为本发明传感器基于SEQ ID NO.2序列，在全血中电信号随1μM浓度胰岛素加入前后的方波伏安曲线图。
图6为本发明传感器基于SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列组合，在全血中电信号随1μM浓度胰岛素/1mM葡萄糖和2μM浓度胰岛素/2mM葡萄糖加入后的方波伏安曲线图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明设计的一种同时检测胰岛素与葡萄糖的适配体组合，所述适配体为核酸适配体，包括依次连接的修饰基团、能够与胰岛素和葡萄糖进行特异性结合的人工合成核苷酸序列组和电信号亚甲基蓝基团和电信号二茂铁基团，所述修饰基团为HS-C6-，所述能够与胰岛素和葡萄糖进行特异性结合的人工合成核苷酸序列组的序列表为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。所述电信号亚甲基蓝基团和电信号二茂铁基团分别连接SEQ ID NO.1和SEQID NO.2的末端。
本发明的修饰基团HS-C6-中，HS为巯基基团。
具体的，本发明设计的胰岛素适配体的序列如下：5′-HS-C6-GACCGTGTGTGTTGCTCTGTAACAGTGTCCATTGTC-MB-3′。
具体的，本发明设计的葡萄糖适配体的序列如下：5′-HS-C6-AAAAGGTGGTGGGGGGGGTTGGTAGGGTGTCTTCT-Fc-3′。
目前现有技术中，除背景技术中提到的双发射纳米光传感器外，未见有同时测定人血清中葡萄糖和胰岛素的其它现有技术报道。实现快速、准确的同时测定人血清中葡萄糖和胰岛素，对于医学上具有较高的价值。能够通过一次检测，就能对糖尿病及其类型进行准确的诊断。
本发明的发明人基于此，设计了采用电化学方式实现同时快速对人血清中葡萄糖和胰岛素进行准确测定的方案。本方案通过设计特定的胰岛素与葡萄糖的适配体组合来实现对人血清中葡萄糖和胰岛素的快速、精确测定。
本发明设计了可以同时与胰岛素和葡萄糖进行特异性结合单链寡核苷酸，并以此为模板进行PCR扩增后得到大量可与胰岛素和葡萄糖特异性结合的ssDNA，以此制备核酸适配体，实现胰岛素和葡萄糖同时检测。
本发明的核心是上述同时检测胰岛素与葡萄糖的适配体组合，采用人工设计、并经过修饰的能够同时与胰岛素和葡萄糖进行特异性结合的人工合成核苷酸序列，同时采用MB和Fc作为指示剂。
本发明的检测传感器包括电极，所述电极外附有上述的同时检测胰岛素与葡萄糖的适配体组合。
在本发明较为优选的实施方式中，所述电极包括固定连接的钨丝和金丝，以及包裹在钨丝和金丝外的绝缘层；所述电极两端留有工作段，所述绝缘层完全包裹工作段之外的金属丝。
优选的，所述钨丝和金丝通过环氧树脂粘接。
优选的，所述绝缘层材质为聚四氟乙烯。
优选的，所述钨丝长度为6～10cm，金丝长度为1～4cm，钨丝一侧留出的工作段长度为1～2cm，金丝一侧留出的工作长度为0.3～0.8cm。
本发明选用钨丝和金丝制备电极，并通过特定材料进行绝缘处理。能够配合本发明的适配体，形成充分的电信号，并且对葡萄糖和胰岛素都能有稳定的高敏感性。采用特定的工作段结构设计和电极结构，能够进一步提高上述检测敏感性。
本发明的上述同时检测胰岛素与葡萄糖的检测传感器的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)，制作电极；
步骤2)，清洗步骤1)制得的电极；
步骤3)，将步骤2)清洗后的电极放入权利要求1所述的适配体配置的溶液中反应，然后移到MCH溶液中反应，取出后制得检测传感器。
本发明的核酸适配体组合，除了能够同时与胰岛素和葡萄糖进行特异性结合外，还能够通过浸润反应的方式，与电极材料结合，能够极大简化制备过程和制备难度，具有意想不到的技术效果。而本发明电极材料的选择，也考虑了这方面的因素，选择的金能较好地与核酸适配体组合反应结合。
在本发明较为优选的实施方式中，所述步骤1)中，电极的制作包括以下步骤：首先用环氧树脂连接钨丝和金丝，然后将连接处用绝缘层包裹，最后将工作段外的金属丝部分用绝缘层包裹。
在本发明较为优选的实施方式中，所述步骤2)中，电极的清洗包括以下步骤：以Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，依次使用0.5M的NaOH溶液，0.5M的H2SO4溶液和0.05M的H2SO4溶液，采用循环伏安法清洗。
在本发明较为优选的实施方式中，所述步骤3)中，所述适配体溶液的浓度为1μM，在适配体溶液中的反应条件为室温下反应1h；所述MCH溶液的浓度为4％，在MCH溶液中的反应条件为4℃温度下反应12h。
实施例1
同时测定葡萄糖的传感器，其制备过程如下：
步骤1)，制作电极，首先用环氧树脂连接钨丝和金丝，然后将连接处用绝缘层包裹，最后将工作段外的金属丝部分用绝缘层包裹，所述钨丝长度为6cm，金丝长度为4cm，钨丝一侧留出的工作段长度为2cm，金丝一侧留出的工作长度为0.8cm，绝缘层材料选择聚四氟乙烯。
步骤2)，清洗电极，以Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，依次使用0.5M的NaOH溶液，0.5M的H2SO4溶液和0.05M的H2SO4溶液，采用循环伏安法清洗。
步骤3)，制备传感器，将清洗后的电极放入浓度为1μM的葡萄糖适配体溶液中，室温下反应1h；然后移入浓度为4％的MCH溶液中，4℃温度下反应12h，制得传感器。
实施例2
测定胰岛素的传感器，其制备过程如下：
步骤1)，制作电极，首先用环氧树脂连接钨丝和金丝，然后将连接处用绝缘层包裹，最后将工作段外的金属丝部分用绝缘层包裹，所述钨丝长度为10cm，金丝长度为1cm，钨丝一侧留出的工作段长度为1cm，金丝一侧留出的工作长度为0.3cm，绝缘层材料选择聚四氟乙烯。
步骤2)，清洗电极，以Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，依次使用0.5M的NaOH溶液，0.5M的H2SO4溶液和0.05M的H2SO4溶液，采用循环伏安法清洗。
步骤3)，制备传感器，将清洗后的电极放入浓度为1μM的胰岛素适配体溶液中，室温下反应1h；然后移入浓度为4％的MCH溶液中，4℃温度下反应12h，制得传感器。
实施例3
同时测定胰岛素和葡萄糖的传感器，其制备过程如下：
步骤1)，制作电极，首先用环氧树脂连接钨丝和金丝，然后将连接处用绝缘层包裹，最后将工作段外的金属丝部分用绝缘层包裹，所述钨丝长度为8cm，金丝长度为1.5cm，钨丝一侧留出的工作段长度为1.5cm，金丝一侧留出的工作长度为0.5cm，绝缘层材料选择聚四氟乙烯。
步骤2)，清洗电极，以Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，依次使用0.5M的NaOH溶液，0.5M的H2SO4溶液和0.05M的H2SO4溶液，采用循环伏安法清洗。
步骤3)，制备传感器，将清洗后的电极放入浓度为1μM的葡萄糖和胰岛素适配体溶液中，室温下反应1h；然后移入浓度为4％的MCH溶液中，4℃温度下反应12h，制得传感器。
实施例4
同时测定胰岛素和葡萄糖的传感器，其制备过程如下：
步骤1)，制作电极，首先用环氧树脂连接钨丝和金丝，然后将连接处用绝缘层包裹，最后将工作段外的金属丝部分用绝缘层包裹，绝缘层材料选择聚四氟乙烯。
步骤2)，清洗电极，采用循环伏安法清洗电极。
步骤3)，制备传感器，将清洗后的电极放入适配体溶液中，室温下反应；然后移入MCH溶液中，4℃温度下反应，制得传感器。
将本发明实施例1-3的传感器进行相关测试，以确定本发明是否能够实现同时对胰岛素与葡萄糖的快速检测。
将实施例1的传感器放置在全血中使用方波伏安法测试其对葡萄糖的响应情况，具体结果见图3和图4。
从图3中可以看出，基于SEQ ID NO.1序列制备的传感器，在加入葡萄糖溶液(第37次测试)前或后信号分别都重合性较好，说明电极信号稳定，加入葡萄糖溶液后，信号迅速变化，与加入前对比有明显的电流差。
从图4中可以看到，基于SEQ ID NO.1序列制备的传感器，5Hz为信号增益，800Hz为信号减小。当使用两个信号的差值作为输出信号时，加葡萄糖前后信号增益可达约130％，这对于检测来说是非常容易观测到的结果。
将实施例2的传感器放置在全血中使用方波伏安法测试其对胰岛素的响应情况，具体结果见图5。
从图5可以看出，基于SEQ ID NO.2序列制备的传感器，在加入1M浓度的胰岛素靶标前后，该传感器在0.22V处的电化学信号位移至0.24V，电流产生100A的衰减，电信号变化率为40％。
将实施例3的传感器放置在全血中使用方波伏安法测试其对胰岛素和葡萄糖的响应情况，具体结果见图6。
从图6可以看出，基于SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列制备的传感器，在加入1M浓度胰岛素/1mM葡萄糖和2M浓度胰岛素/2mM葡萄糖以后，该传感器在0.22V处的电化学信号产生50和100纳安的电流变化，在-0.26V处的信号则产出20和40纳安的电流变化，实现对于葡萄糖和胰岛素的同时检测。
由上述检测数据可知，本发明的适配体组合，以及由本发明适配体组合制备的检测传感器，电化学信号很稳定，电信号感应良好，频率越低灵敏度越高，稳定性越好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> 一种同时检测胰岛素与葡萄糖的适配体组合、检测传感器及其制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaccgtgtgt gttgctctgt aacagtgtcc attgtc 36
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaaggtggt ggggggggtt ggtagggtgt cttct 35

Claims (10)

1.一种同时检测胰岛素与葡萄糖的适配体组合，其特征在于，所述适配体为核酸适配体，包括依次连接的修饰基团、能够与胰岛素和葡萄糖进行特异性结合的人工合成核苷酸序列组和电信号亚甲基蓝基团和电信号二茂铁基团，所述修饰基团为
Figure QLYQS_1
，所述能够与胰岛素和葡萄糖进行特异性结合的人工合成核苷酸序列组的序列表为SEQ ID NO.1和SEQID NO.2；所述电信号亚甲基蓝基团和电信号二茂铁基团分别连接SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2的末端。
2.一种同时检测胰岛素与葡萄糖的检测传感器，其特征在于，所述检测传感器包括电极，所述电极外附有如权利要求1所述的同时检测胰岛素与葡萄糖的适配体组合。
3.根据权利要求2所述的一种同时检测胰岛素与葡萄糖的检测传感器，其特征在于，所述电极包括固定连接的钨丝和金丝，以及包裹在钨丝和金丝外的绝缘层；所述电极两端留有工作段，所述绝缘层完全包裹工作段之外的金属丝。
4.根据权利要求3所述的一种同时检测胰岛素与葡萄糖的检测传感器，其特征在于，所述钨丝和金丝通过环氧树脂粘接。
5.根据权利要求3所述的一种同时检测胰岛素与葡萄糖的检测传感器，其特征在于，所述绝缘层材质为聚四氟乙烯。
6.根据权利要求3所述的一种同时检测胰岛素与葡萄糖的检测传感器，其特征在于，所述钨丝长度为6～10cm，金丝长度为1～4cm，钨丝一侧留出的工作段长度为1～2cm，金丝一侧留出的工作长度为0.3～0.8cm。
7.权利要求2～6任一项所述的一种同时检测胰岛素与葡萄糖的检测传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)，制作电极；
步骤2)，清洗步骤1)制得的电极；
步骤3)，将步骤2)清洗后的电极放入权利要求1所述的适配体组合配置的溶液中反应，然后移到MCH溶液中反应，取出后制得检测传感器。
8.根据权利要求7所述的一种同时检测胰岛素与葡萄糖的检测传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，电极的制作包括以下步骤：首先用环氧树脂连接钨丝和金丝，然后将连接处用绝缘层包裹，最后将工作段外的金属丝部分用绝缘层包裹。
9.根据权利要求7所述的一种同时检测胰岛素与葡萄糖的检测传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，电极的清洗包括以下步骤：以Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，依次使用0.5M的NaOH溶液，0.5M的H2SO4溶液和0.05M的H2SO4溶液，采用循环伏安法清洗。
10.根据权利要求7所述的一种同时检测胰岛素与葡萄糖的检测传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述适配体组合溶液的浓度为1μM，在适配体溶液中的反应条件为室温下反应1h；所述MCH溶液的浓度为4％，在MCH溶液中的反应条件为4℃温度下反应12h。
CN202110607049.3A 2021-05-31 2021-05-31 一种同时检测胰岛素与葡萄糖的适配体组合、检测传感器及其制备方法 Active CN113549623B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110607049.3A CN113549623B (zh) 2021-05-31 2021-05-31 一种同时检测胰岛素与葡萄糖的适配体组合、检测传感器及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110607049.3A CN113549623B (zh) 2021-05-31 2021-05-31 一种同时检测胰岛素与葡萄糖的适配体组合、检测传感器及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113549623A CN113549623A (zh) 2021-10-26
CN113549623B true CN113549623B (zh) 2023-07-11

Family

ID=78101941

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110607049.3A Active CN113549623B (zh) 2021-05-31 2021-05-31 一种同时检测胰岛素与葡萄糖的适配体组合、检测传感器及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113549623B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114609215A (zh) * 2022-03-22 2022-06-10 汪开继 同时检测葡萄糖和胰岛素的便携式装置及制备、检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106501203A (zh) * 2016-10-09 2017-03-15 中南大学 一种基于核酸适体的人胰岛素检测方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104081208A (zh) * 2012-02-10 2014-10-01 美艾利尔瑞士公司 用于确定胰岛素抗性的化验和方法
CN103940872B (zh) * 2014-04-30 2016-02-03 青岛大学 同时检测两种急性白血病标志物电化学传感器的制备方法及应用
EP3330379B1 (en) * 2015-07-27 2021-10-27 Posco Aptamer against insulin receptor and pharmaceutical composition containing the same
EP3515303B1 (en) * 2016-09-25 2023-03-08 The Regents of The University of California Drift correction method for dual-reporter electrochemical sensors
CN106841340B (zh) * 2017-03-14 2019-06-14 浙江省农业科学院 同时检测水胺硫磷和啶虫脒的电化学传感器及其方法体系
CN110687179B (zh) * 2019-09-27 2021-11-23 江苏大学 一种同时检测黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a的电化学方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106501203A (zh) * 2016-10-09 2017-03-15 中南大学 一种基于核酸适体的人胰岛素检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113549623A (zh) 2021-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Weltin et al. Polymer-based, flexible glutamate and lactate microsensors for in vivo applications
Singh et al. Biomedical perspective of electrochemical nanobiosensor
Fu et al. Recent advances in the construction of biofuel cells based self‐powered electrochemical biosensors: A review
Ronkainen et al. Electrochemical biosensors
Flynn et al. Biomolecular sensors for advanced physiological monitoring
EP2929337B1 (en) Cap including device with biosensor and holder
EP2546653B1 (en) Electrode for Measuring Glycoprotein and Preparation Method Thereof
CN110243891A (zh) 一种检测癌细胞的免标记均相电化学生物传感方法
Lian et al. Insulin quantification towards early diagnosis of prediabetes/diabetes
CN113549623B (zh) 一种同时检测胰岛素与葡萄糖的适配体组合、检测传感器及其制备方法
Koukouviti et al. 3D printed enzymatic microchip for multiplexed electrochemical biosensing
CN112816533A (zh) 一种铜纳米簇作为电化学信号探针的β-淀粉样蛋白寡聚体传感器
Marinesco Micro-and nano-electrodes for neurotransmitter monitoring
US20070105232A1 (en) Voltammetric detection of metabolites in physiological fluids
Vasilescu et al. Electrochemical impedance spectroscopy investigations focused on food allergens
CN108732222A (zh) 一种同时快速检测血液中糖化血红蛋白和糖化血清蛋白的方法
Budai Electrochemical responses of carbon fiber microelectrodes to dopamine in vitro and in vivo
CN113552198B (zh) 一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器及其制备方法
Xie et al. Detection of Key Proteins in Obstetric Preeclampsia by Nanocomposites Using Gold Nanoparticles/DNA/Methylene Blue
US20210131996A1 (en) Biomarker sensor apparatus and method of measuring biomarker in blood
JP5247043B2 (ja) 試料中のチオレドキシン類の濃度に関する情報取得装置、ストレス度情報取得装置及びストレス度判定方法
CN111426849A (zh) 一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法
CN1417577A (zh) 一种能同时检测多种生物指标的传感器
Kalachar et al. Electrochemical determination of uric acid in reptilian excreta and human urine using gold modified pencil graphite electrode.
Schultz et al. Introduction to chemical and biological sensors

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant