CN115165982A - 天然高分子化合物在生物传感器中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种天然高分子化合物在生物传感器中的应用，所述生物传感器包括工作电极，所述生物传感器的制备方法包括：对天然高分子化合物进行氧化处理，得到氧化天然高分子化合物；以及将所述氧化天然高分子化合物作为交联剂，用于将敏感基元固定在所述工作电极中。本发明采用所述氧化天然高分子化合物作为交联剂能够提高敏感基元的活性和稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，特别是涉及一种天然高分子化合物在生物传感器中的应用。
背景技术
生物传感器通常用于生物体内物质的测定，其应用越来越广泛。例如，生物传感器可用于体内血糖的测定。然而许多可植入的生物传感器都容易在体内受到免疫反应，并且使用寿命往往较短。此外，现有的生物传感器中的敏感基元固定工艺都会应用一些有生物毒性的交联剂，例如戊二醛、光引发剂或丙烯酸类等，不仅会影响敏感基元的活性和稳定性，残留的交联剂也会加强人体的排异反应，从而降低使用寿命，同时也不利于批量的生产安全。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够提高敏感基元活性和稳定性的天然高分子化合物在生物传感器中的应用。
本发明提供了一种天然高分子化合物在生物传感器中的应用，所述生物传感器包括工作电极，所述生物传感器的制备方法包括：
对天然高分子化合物进行氧化处理，得到氧化天然高分子化合物；以及
将所述氧化天然高分子化合物作为交联剂，用于将敏感基元固定在所述工作电极中。
在其中一些实施例中，所述天然高分子化合物包括纤维素及其衍生物、海藻酸钠、壳聚糖及其衍生物、透明质酸、魔芋甘露聚糖、淀粉及其衍生物、果胶和卡拉胶中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述氧化天然高分子化合物为双醛化天然高分子化合物。
在其中一些实施例中，对所述天然高分子化合物进行氧化处理，得到所述氧化天然高分子化合物具体包括以下步骤：
将所述天然高分子化合物溶于溶剂中，得到天然高分子化合物溶液；
将氧化剂溶于溶剂中，得到氧化性溶液；以及
将所述天然高分子化合物溶液和所述氧化性溶液混合，氧化反应后得到所述氧化天然高分子化合物。
在其中一些实施例中，所述氧化天然高分子化合物的氧化度为5％～85％。
本发明提供了一种天然高分子化合物在生物传感器中的应用，所述生物传感器包括工作电极，所述工作电极包括将氧化天然高分子化合物作为交联剂将敏感基元固定。
在其中一些实施例中，所述工作电极包括酶膜层，所述敏感基元包括葡萄糖氧化酶，所述酶膜层的制备方法包括以下步骤：
将血清蛋白、所述葡萄糖氧化酶和所述氧化天然高分子化合物于溶剂中混合，得到葡萄糖氧化酶混合溶液；以及
将所述葡萄糖氧化酶混合溶液涂覆在金属层上，交联反应后得到所述酶膜层。
在其中一些实施例中，所述应用包括以下的至少一项：
在所述葡萄糖氧化酶混合溶液中，所述葡萄糖氧化酶的浓度为0.5％～20％；
在所述葡萄糖氧化酶混合溶液中，所述氧化天然高分子化合物的浓度为0.1％～20％；
在所述葡萄糖氧化酶混合溶液中，所述血清蛋白的浓度为0.5％～20％；
所述交联反应的温度为0℃～37℃。
在其中一些实施例中，所述交联反应包括所述葡萄糖氧化酶中的伯氨基与所述氧化天然高分子化合物中的醛基发生希夫碱反应。
在其中一些实施例中，所述生物传感器为葡萄糖生物传感器，所述敏感基元包括葡萄糖氧化酶。
本发明通过对天然高分子化学物进行氧化处理，得到氧化天然高分子化合物，并采用所述氧化天然高分子化合物作为交联剂将敏感基元固定在生物传感器的工作电极中，以保证敏感基元的活性和稳定性，避免了传统化学交联剂的生物毒性，优化和提高了敏感基元化学键合的环境和过程的可控性，有利于保持敏感基元的数量和活性，提高了工作电极的生物相容性，进而提高了所述生物传感器的一致性和长期稳定性。
附图说明
图1为本发明提供的生物传感器中的柔性电极的平面示意图。
图2为本发明提供的柔性电极中的工作电极的截面示意图。
图3为由本发明实施例1中的工作电极制备得到的葡萄糖生物传感器的灵敏度测试结果图。
图4为由本发明实施例1中的工作电极制备得到的葡萄糖生物传感器的稳定性测试结果图。
图5为本发明实施例1～3以及对比例1制备的工作电极的细胞毒性测试结果图。
图标：100-柔性电极；10-柔性基底；20-工作电极；201-金属层；202-酶膜层；203-保护层；30-参比电极；40-对电极。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供一种天然高分子化合物在生物传感器中的应用，所述生物传感器的制备方法包括：对天然高分子化合物进行氧化处理，得到氧化天然高分子化合物。
其中，对所述天然高分子化合物进行氧化处理，得到所述氧化天然高分子化合物具体包括以下步骤：
步骤S11，将所述天然高分子化合物溶于溶剂中，得到天然高分子化合物溶液。
在一实施例中，所述天然高分子化合物包括纤维素及其衍生物、海藻酸钠、壳聚糖及其衍生物、透明质酸、魔芋甘露聚糖、淀粉及其衍生物、果胶和卡拉胶中的至少一种。在本实施例中，所述溶剂为水。在另一实施例中，所述溶剂还可以为乙醇等有机溶剂，或酸性、碱性溶剂。
步骤S12，将氧化剂溶于溶剂中，得到氧化性溶液。
在一实施例中，所述氧化剂可为高碘酸钠。具体地，将高碘酸钠溶于水中，得的高碘酸钠水溶液。即在本实施例中，所述溶剂为水。
步骤S13，将所述天然高分子化合物溶液和所述氧化性溶液混合，氧化反应后得到所述氧化天然高分子化合物。
在一实施例中，所述氧化天然高分子化合物可为双醛化天然高分子化合物。具体地，所述氧化剂(如高碘酸钠)将所述天然高分子化合物中的糖环氧化，以得到两个醛基。
其中，通过控制所述氧化剂和所述天然高分子化合物之间的比例可以得到不同氧化度的氧化天然高分子化合物。在一实施例中，所述氧化天然高分子化合物的氧化度为5％～85％。
请参阅图1，在一实施例中，所述生物传感器包括柔性电极100。在一实施例中，所述柔性电极100包括柔性基底10以及位于所述柔性基底10同一表面上的工作电极20、参比电极30和对电极40。
在一实施例中，可在所述柔性基底10上通过微纳加工的方式覆盖金属层，并将所述金属层图案化，以形成所述工作电极20、所述参比电极30和所述对电极40的三电极体系。
其中，所述微纳加工是指光刻、显影、磁控溅射、湿法刻蚀、等离子清洗以及激光切割等一系列基于半导体工艺的技术。
在一实施例中，所述柔性基底10的厚度可为10～300μm。在一实施例中，所述柔性基底10的材质包括聚酰亚胺以及聚对苯二甲酸乙二醇酯中的至少一种。
请参阅图2，在一实施例中，所述工作电极20包括依次层叠设置的金属层201、酶膜层202以及保护层203。其中，所述金属层201位于所述柔性基底10和所述保护层203之间。
在一实施例中，所述金属层201包括依次层叠设置的第一金属部(图未示)、第二金属部(图未示)和第三金属部(图未示)。在一实施例中，所述第一金属部的材质包括铬、钛或镍铬合金，所述第二金属部的材质包括金、铜或银，所述第三金属部的材质包括铂、铂铱合金或铂碳混合物。其中，所述第二金属部具有较好的导电性，所述第三金属部对过氧化氢具有催化作用。
所述生物传感器的制备方法还包括：将所述氧化天然高分子化合物作为交联剂，用于将敏感基元固定在所述酶膜层202中。在一实施例中，所述敏感基元包括葡萄糖氧化酶。
现以所述敏感基元为葡萄糖氧化酶为例进行说明。其中，所述酶膜层202的制备方法包括以下步骤：
步骤S21，将血清蛋白、所述葡萄糖氧化酶和所述氧化天然高分子化合物于溶剂中混合，得到葡萄糖氧化酶混合溶液。
具体地，将不同比例的所述血清蛋白和所述葡萄糖氧化酶配制成一定浓度的水溶液，然后将所述氧化天然高分子化合物配置成一定浓度的水溶液，将两者混合后得到所述葡萄糖氧化酶混合溶液。即在本实施例中，所述溶剂为水。
在一实施例中，在所述葡萄糖氧化酶混合溶液中，所述血清蛋白的浓度为0.5％～20％，所述葡萄糖氧化酶的浓度为0.5％～20％，所述氧化天然高分子化合物的浓度为0.1％～20％。
步骤S22，将所述葡萄糖氧化酶混合溶液涂覆在所述金属层上，交联反应后得到所述酶膜层202。
具体地，将混合得到的所述葡萄糖氧化酶混合溶液立即涂敷在所述金属层上，在一定温度下交联一定时间，使所述葡萄糖氧化酶中的伯氨基与所述氧化天然高分子化合物中的醛基发生希夫碱反应，以形成稳定的所述酶膜层202。可以理解，在不同温度下交联所需要的交联时间也不同。
在一实施例中，所述葡萄糖氧化酶混合溶液在所述金属层上进行交联反应的温度为0℃～37℃。
在一实施例中，所述保护层203的材质包括聚氨酯、聚乙二醇、醋酸纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮以及聚乙烯中的至少一种。
其中，所述保护层203可采用浸涂法制备。具体地，将所述保护层的材质(即聚氨酯、聚乙二醇、醋酸纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮以及聚乙烯中的至少一种)溶于溶剂中，得到保护层溶液，再将所述酶膜层202放入在所述保护层溶液中，取出后干燥，即得到所述保护层。
在一实施例中，所述保护层的溶剂包括四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、环己烷以及丙酮中的至少一种。
在一实施例中，在所述保护层溶液中，所述保护层的材质(即聚氨酯、聚乙二醇、醋酸纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮以及聚乙烯中的至少一种)的浓度为0.5％～10％。
在一实施例中，所述生物传感器可为葡萄糖生物传感器，所述敏感基元包括葡萄糖氧化酶。
本发明通过对天然高分子化学物进行氧化处理，得到氧化天然高分子化合物，并采用所述氧化天然高分子化合物作为交联剂将敏感基元(如葡萄糖氧化酶)固定在生物传感器的工作电极20中，以保证敏感基元的活性和稳定性，避免了传统化学交联剂的生物毒性，优化和提高了敏感基元化学键合的环境和过程的可控性，有利于保持敏感基元的数量和活性，提高了工作电极20的生物相容性，进而提高了所述生物传感器的一致性和长期稳定性。
以下通过具体实施例和对比例对本发明作进一步说明。
实施例1
第一步，将3g海藻酸钠溶于150ml蒸馏水中，得到海藻酸钠水溶液。
第二步，将2g高碘酸钠溶于50ml蒸馏水中，得到高碘酸钠水溶液。
第三步，将高碘酸钠水溶液滴加在海藻酸钠水溶液中，并在室温下避光反应24h，然后加入5ml乙二醇搅拌1h以终止反应，再通过透析纯化，并在烘箱中干燥后得到氧化海藻酸钠。
第四步，将氧化海藻酸钠溶解在蒸馏水中，配制成浓度为3％的氧化海藻酸钠水溶液，并向其中加入葡萄糖氧化酶，使其浓度为30mg/ml，再向其中加入牛血清蛋白，使其浓度为20mg/ml，搅拌溶解后得到预交联的葡萄糖氧化酶混合溶液。
第五步，将上述预交联的葡萄糖氧化酶混合溶液涂敷在金属层上，并在4℃冰箱交联24h，再用蒸馏水清洗未交联的所述葡萄糖氧化酶，以得到酶膜层。
第六步，将酶膜层放入在浓度为5％的聚氨酯溶液中，取出后经室温干燥，形成一层保护层，从而得到工作电极。
实施例2
第一步，将5g羧甲基纤维素溶于500ml蒸馏水中，得到羧甲基纤维素水溶液。
第二步，将4.5g高碘酸钠溶于50ml蒸馏水中，得到高碘酸钠水溶液。
第三步，将高碘酸钠水溶液滴加在羧甲基纤维素水溶液中，并在4℃下避光反应24h，然后加入5ml乙二醇搅拌1h以终止反应，再通过过滤，并在烘箱中干燥后得到氧化羧甲基纤维素。
第四步，将氧化羧甲基纤维素溶解在蒸馏水中，配制成浓度为5％的氧化羧甲基纤维素水溶液，并向其中加入葡萄糖氧化酶，使其浓度为20mg/ml，再向其中加入牛血清蛋白，使其浓度为15mg/ml，搅拌溶解后得到预交联的葡萄糖氧化酶混合溶液。
第五步，将上述预交联的葡萄糖氧化酶混合溶液涂敷在金属层上，并在4℃冰箱交联12h，再用蒸馏水清洗未交联的所述葡萄糖氧化酶，以得到酶膜层。
第六步，将酶膜层放入在浓度为5％的聚氨酯溶液中，取出后经室温干燥，形成一层保护层，从而得到工作电极。
实施例3
第一步，将1g果胶溶于100ml蒸馏水中，得到果胶水溶液。
第二步，将1g高碘酸钠溶于50ml蒸馏水中，得到高碘酸钠水溶液。
第三步，将高碘酸钠水溶液滴加在果胶水溶液中，并在4℃下避光反应12h，然后加入5ml乙二醇搅拌1h以终止反应，再通过过滤，并在烘箱中干燥后得到氧化果胶。
第四步，将氧化果胶溶解在蒸馏水中，配制成浓度为1％的氧化果胶水溶液，并向其中加入葡萄糖氧化酶，使其浓度为10mg/ml，再向其中加入牛血清蛋白，使其浓度为8mg/ml，搅拌溶解后得到预交联的葡萄糖氧化酶混合溶液。
第五步，将上述预交联的葡萄糖氧化酶混合溶液涂敷在金属层上，并在4℃冰箱交联12h，再用蒸馏水清洗未交联的所述葡萄糖氧化酶，以得到酶膜层。
第六步，将酶膜层放入在浓度为5％的聚氨酯溶液中，取出后经室温干燥，形成一层保护层，从而得到工作电极。
对比例1
第一步，将葡萄糖氧化酶和牛血清蛋白溶解于PBS缓冲溶液中，然后向其中添加2.5％的戊二醛溶液，得到预交联的葡萄糖氧化酶混合溶液。
第二步，将上述预交联的葡萄糖氧化酶混合溶液涂敷在金属层上，并在4℃冰箱交联24h，再用蒸馏水清洗未交联的所述葡萄糖氧化酶，以得到酶膜层。
第三步，将酶膜层放入在浓度为5％的聚氨酯溶液中，取出后经室温干燥，形成一层保护层，从而得到工作电极。
将实施例1～3以及对比例1中制备得到的工作电极分别用于制备葡萄糖生物传感器。其中，葡萄糖生物传感器的制备方法如下：
第一步，选取厚度为120μm的PET作为柔性基底，并将该柔性基底贴附在玻璃或硅片支撑衬底上，清洗该柔性基底后用氮气枪将该柔性基底吹干。
第二步，将聚二甲基硅氧烷(PDMS)旋涂到支撑衬底上，并加热固化。
第三步，将清洗好的PI用贴膜机和涂有PDMS的支撑衬底吸附。
第四步，采用磁控溅射仪在PET柔性基底上溅射一层粘接层Cr，再溅射导电层Au，然后旋涂一层光刻胶，接着采用曝光机进行图案化过程，最后进行显影反应。对导电层Au进行湿法刻蚀，然后用大量水清洗干净并用氮气吹干。然后进行粘接层Cr刻蚀，直到非图案区域完全裸露出PI颜色(红棕色)，用大量水清洗干净并用氮气吹干。最后将光刻胶剥离，并检查导线是否导通。
第五步，对PET柔性基底进行聚对二甲苯沉积，然后旋涂光刻胶，显影进行图案化，再进行等离子处理，以对显影部分的聚对二甲苯沉积进行清洗，最后将光刻胶剥离，并检查引线区域是否绝缘。
第六步，制备工作电极和对电极：先在PET柔性基底上旋涂一层光刻胶，接着采用曝光机进行图案化过程，最后进行显影反应，水洗后用氮气吹干。采用磁控溅射仪在PET柔性基底上溅射一层粘接层Cr，再溅射导电层Pt，并在丙酮浸泡超声，直到WE、CE图案完全抬离干净，再分别用干净的丙酮、酒精、水冲洗干净并用氮气枪吹干，用万用表测试WE、CE与相对应的PAD的导通性，不同导线的绝缘性。
第七步，制备参比电极制备：电镀银层，采用脉冲电流源装置进行恒电流方式电镀。氯化处理：先用氩气等离子处理5分钟，然后用氯化铁溶液处理，最后用水冲洗干净并用氮气吹干。
(一)对由实施例1中的工作电极制备得到的葡萄糖生物传感器进行灵敏度测试。具体地，由实施例1中的工作电极制备5批葡萄糖生物传感器，并对这5批传感器在0～30mM的浓度下进行灵敏度测试。
请参阅图3，测试结果表明，由实施例1中的工作电极制备得到的5批葡萄糖生物传感器在0～30mM浓度的范围内均能实现线性，且5批葡萄糖生物传感器的差异性在5％以下。
(二)对由实施例1中的工作电极制备得到的葡萄糖生物传感器进行长期稳定性测试。
请参阅图4，测试结果表明由实施例1中的工作电极制备得到的葡萄糖生物传感器在30天内灵敏度变化在10％以下。这表明本发明制备的葡萄糖生物传感器具有长期的稳定性。
(三)分别对实施例1～3以及对比例1中制备得到的工作电极进行细胞毒性测试。
工作电极细胞毒性测试方法为：分别将实施例1～3以及对比例1中制备得到的工作电极浸泡在PBS中进行浸提，以得到浸提液，并将所得的浸提液进行细胞毒性试验。
请参阅图5，测试结果表明细胞在实施例1～3制备得到的工作电极的浸提液中存活率较高，但细胞在对比例1制备得到的工作电极的浸提液中的存活率较低。这说明氧化天然高分子化合物的毒性低于戊二醛，从而说明本发明采用氧化天然高分子化合物作为交联剂明显优于现有技术采用戊二醛作为交联剂。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种天然高分子化合物在生物传感器中的应用，所述生物传感器包括工作电极，所述生物传感器的制备方法包括：
对天然高分子化合物进行氧化处理，得到氧化天然高分子化合物；以及
将所述氧化天然高分子化合物作为交联剂，用于将敏感基元固定在所述工作电极中。
2.如权利要求1所述的天然高分子化合物在生物传感器中的应用，其特征在于，所述天然高分子化合物包括纤维素及其衍生物、海藻酸钠、壳聚糖及其衍生物、透明质酸、魔芋甘露聚糖、淀粉及其衍生物、果胶和卡拉胶中的至少一种。
3.如权利要求1所述的天然高分子化合物在生物传感器中的应用，其特征在于，所述氧化天然高分子化合物为双醛化天然高分子化合物。
4.如权利要求1所述的天然高分子化合物在生物传感器中的应用，其特征在于，对所述天然高分子化合物进行氧化处理，得到所述氧化天然高分子化合物具体包括以下步骤：
将所述天然高分子化合物溶于溶剂中，得到天然高分子化合物溶液；
将氧化剂溶于溶剂中，得到氧化性溶液；以及
将所述天然高分子化合物溶液和所述氧化性溶液混合，氧化反应后得到所述氧化天然高分子化合物。
5.如权利要求1所述的天然高分子化合物在生物传感器中的应用，其特征在于，所述氧化天然高分子化合物的氧化度为5％～85％。
6.一种天然高分子化合物在生物传感器中的应用，所述生物传感器包括工作电极，其特征在于，所述工作电极包括将氧化天然高分子化合物作为交联剂将敏感基元固定。
7.如权利要求6所述的天然高分子化合物在生物传感器中的应用，其特征在于，所述工作电极包括酶膜层，所述敏感基元包括葡萄糖氧化酶，所述酶膜层的制备方法包括以下步骤：
将血清蛋白、所述葡萄糖氧化酶和所述氧化天然高分子化合物于溶剂中混合，得到葡萄糖氧化酶混合溶液；以及
将所述葡萄糖氧化酶混合溶液涂覆在金属层上，交联反应后得到所述酶膜层。
8.如权利要求7所述的天然高分子化合物在生物传感器中的应用，其特征在于，包括以下的至少一项：
在所述葡萄糖氧化酶混合溶液中，所述葡萄糖氧化酶的浓度为0.5％～20％；
在所述葡萄糖氧化酶混合溶液中，所述氧化天然高分子化合物的浓度为0.1％～20％；
在所述葡萄糖氧化酶混合溶液中，所述血清蛋白的浓度为0.5％～20％；
所述交联反应的温度为0℃～37℃。
9.如权利要求7所述的天然高分子化合物在生物传感器中的应用，其特征在于，所述交联反应包括所述葡萄糖氧化酶中的伯氨基与所述氧化天然高分子化合物中的醛基发生希夫碱反应。
10.如权利要求1至9中任一项所述的天然高分子化合物在生物传感器中的应用，其特征在于，所述生物传感器为葡萄糖生物传感器，所述敏感基元包括葡萄糖氧化酶。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| WO2023246661A1 (zh) | 2023-12-28 |
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