JPH01153952A

JPH01153952A - 酵素センサ

Info

Publication number: JPH01153952A
Application number: JP62312291A
Authority: JP
Inventors: Hideichiro Yamaguchi; 秀一郎山口; Naoto Uchida; 直人内田; Norihiko Ushizawa; 牛沢　典彦; Takeshi Shimomura; 猛下村; Noboru Koyama; 昇小山
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1987-12-11
Filing date: 1987-12-11
Publication date: 1989-06-16

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野コ本発明は酵素センサ、詳しくはアンペロメトリック応答
で生体基質の濃度を測定する酵素センサに関するもので
ある。

［従来の技術］従来、グルコースセンサ、尿素センサなどの酵素センサ
が知られている。これら従来の酵素センサにおいては、
酵素反応によって生ずる過酸化水素を白金電極で酸化す
るときに流れる電流変化を測定する。ところが、白金は
貴金属であり高価である。このため、安価な電極材料、
例えばグラファイト電極などで白金の機能を代替できる
ものはないかと研究が行われてきているが、今だに十分
なものは得られていなかった。

［発明が解決しようとする問題点］本発明の目的は、上記従来技術の問題点を解決し、過酸
化水素に関与する酵素反応を利用して基質濃度を検知す
る固体型の安価な酵素センサを１是供することにある。

［問題点を解決するための手段及び作用］この問題点を
解決するための一手段として、本発明の酵素センサは、
導電性基体と、該導電性基体表面を被覆する過酸化水素
の酸化および／または還元触媒機能を有する酸化還元触
媒機能層層と、該酸化還元触媒機能層を被覆し、酵素反
応により過酸化水素を発生あるいは消費する酵素固定化
膜とを備える。

［実施例］以下添付図面に従って、本発明の一実施例を説明する。

本実施例の酵素センサは、導電性基体を該基体表面を被
覆し過酸化水素の酸化触媒機能を有する酸化還元触媒機
能層、そして、さらに、過酸化水素の発生あるいは消費
する酵素膜を被覆して構成の固体型電極を用い基質濃度
変化をアンペロメトリックに測定する。

導電性基体としては、導電性炭素材料、酸化イリジウム
、半導体材料、金属酸化物、貴金属。

金属などであって、飽和カロメル電極に対する電位が＋
１．０ボルトの場合に、溶解または腐食を受けないもの
が使用される。

酸化還元触媒機能層の酸化還元電位は、ｐＨ１，０で飽
和塩化ナトリウムカロメル電極（ＳＳＣＥ）に対する電
位が＋０．５ボルト以上のものが良く、好ましくはビフ
ェノール系の電解酸化重合体が使用される。

酵素固定化膜に含まれる酵素は酸化酵素が好ましく、特
にグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼなどが好ましい
。

〈実施例１〉本実施例で作製した酵素センサの構造（断面図）を第１
図に模式的に示した。以下にその作製方法を述べる。

（１）カーボンファイバ電極の作製カーボンファイバ１　（ベスファイトＨＴ＾７Ｗ−ｔｏ
ｏｏ　：東邦レーヨン社製）の１０００本（１本の直径
６μｍ）の束を長さ３ｃｍに切断し、一方の端に導電性
接着剤２　（Ｃ−８５０−６：アミコン社製）を用いて
リード線３を接続した。その周囲を、エポキシ系接着剤
４及びテフロンチューブ５で絶縁した後固定した。次に
、電極面を研磨（＃１０００研磨紙）して、カーボンフ
ァイバ１の断面のみが電極面となるようにした。この場
合の電極面積は、２．８３６ｘｌＯ−’ｃｍ２となる。

（２）ポリビフェノール膜被覆（１）で作製したカーボンファイバ電極を作用極、市販
の飽和塩化ナトリウムカロメル電極（以下ＳＳにＥと略
す）を基準電極、白金巻線を対極とする３電極セルを用
い、以下の組成の電解液中で電解酸化重合を行った。

電解液組成　４．４−ビフェノール　・・・５０ｍ　ｍ
ｏｌ／１過塩素酸ナトリウム・・・０．２ｍｏｌ／１ア
セトニトリル　　・・・溶媒電位を＋１．４　Ｖ（対５ＳＣＥ）　＜７）定電位とし
、１０分間電解を行ってビフェノールの電解重合膜６を
カーボンファイバ電極の表面に６０μｍの厚さで被着し
た。この膜厚は、１００人〜１５０μｍが好ましく、特
に好ましくは２０〜１００μｍである。１５０μｍを超
えると剥離が生じたり応答速度が遅くなり、１００Å以
下では感応が悪く安定しない。

（３）酵素固定化膜被覆酵素固定化膜７の被覆は、グルタルアルデヒドを架橋剤
とする架橋法によった。以下に、その手順を簡単に述べ
る。

０５ｍ　ｍｏｌ／ｌのｐＨ７，４リン酸塩緩衝液に、１
５ｗｔ％の生血製アルブミンを溶解し、該液に１２０ｍ
ｇ／ｍｌとなるグルコースオキシダーゼを溶かす。

■当該溶液中に上記電極を浸し、ゆっくりひき上げる。

■約１分間風乾した後、該電極を２５％グルタルアルデ
ヒド水溶液中に下し、ゆっくり引き上げる。

■約３分間後２０％グリシン水溶液で洗浄し、酵素膜固
定７の被着を完成した（膜厚１００μｍ）。

膜厚は１００人〜１５０μｍが好ましく、特に好ましく
は、２０〜１００μｍである。１５０μｍを超えると応
答速度が遅くしかも剥離が生じやすく、１００Å以下で
は酸素の失活が速くなる。

以上、（１）（２）（３）の工程により、本実施例の酵
素センサを完成した。

〈実施例２〉電極素材として直径１　ｍｍのグラファイトカーボン丸
棒（ＥＧ−５１、日本カーボン社製）を用い、実施例１
と同様の構造を有する酵素センサを作製した。作製方法
は、カーボンファイバ１０００本の代わりにカーボン丸
棒を用いる以外は実施例１に準する。

〈実施例３〉電極素材として、０　、　５　ｍｍＸ　０　、　５　ｍ
ｍのベーサルプレーンピロリティックグラファイト（Ｂ
ＰＧと略す）を用い、実施例１と同様の構造の酵素セン
サを作製した。作製方法は、カボンファイバ１０００本
の代りに、ＢＰＧを用いる以外は実施例１と同様である
。

く実験例１〉実施例１で作製した酵素センサのグルコース濃度に対す
る応答を測定した。以下に、その測定方法を述べる。第
３図に回路の模式図を示した。

第３図で、１１は酵素センサ、１３は被検溶液、１２は
５ＳＣＥ、１４は電流計、１５は＋１．ＯＶの直流電源
であり、５ＳＣＥＩ　２→＋１．ＯＶの直流電源１５→
電流計１４＝酵素センサ１１を直列につないだ測定回路
を組み立てる。

被検液には、濃度既知のグルコースを含む５ｍｍｏｌ／
旦のｐＨ６，２０リン酸塩緩衝液を用いた。５ＳＣＨに
対して、酵素センサの電位を＋１０Ｖに保ち、被検疫中
のグルコース濃度を変えた時、センサに流れる電流値を
電流計によって測定した。

その結果を表１にまとめ、第４図にプロットした（図中
Ｏ印）。ただし、検出した電流値を電極面積で割った値
（電流密度）で示した。

−以下余白− 第４図からもわかるように、グルコース濃度が増加する
につれて、電流密度もほぼ直線的に増大している。従っ
て、予め検、量線を引いておくことにより、未知の溶液
中のグルコース濃度を、該酵素センサに流れる電流密度
から求めることができる。第４図には、比較例としてカ
ーボンファイバ電極を直接酵素膜で被覆したものの応答
も・印で示した。

〈実験例２，３．＞実施例２．３で作製した酵素センサを用いて、実験例１
と同根の測定を行ったところ、各々表２９表３に示す結
果が得られ、それらを第５図、第６図にプロット（図中
○印）した。この結果、実施例２．３で作製した電極も
酵素センサとして働くことが見いだされた。

〈実施例４〉電極素材として酸化イリジウムを用いた酵素センナを作
製した。該センサの構造を第２図に模式的に示した。そ
の作製方法を以下に述べる。

（１）酸化イリジウム電極の作製２＋ｎｍｘｌＯｍｍで厚さ０．５ｍｍのサファイア板８
上に、酸化イリジウム膜９（数１０００人）をスパッタ
蒸着する。該酸化イリジウム膜９の端に、導電性接着剤
２　（ＳＥ５０°１東シリコーン社製）によりリード線
３を接続し、周囲をシリコーン１０で絶縁して電極面積
０．０１ｃｍ２となるようにした。

（２）実施例１と同様の方法で、該酸化イリジウム膜９
の表面をビフェノール電解重合膜６で被覆した。

（３）実施例１と同様に、ビフェノール電解重合膜６の
表面に、酵素（グルコースオキシダーゼ）膜７を被着し
、酵素センサを完成した。

く実験例４〉実施例４で作製した酵素センサのグルコース濃度に対す
る応答を、実験例１と同様の測定を行った結果を表４及
びそのプロットを第７図に示す（図中Ｏ印）。

一以下余白一この結果、グルコース濃度変化に対して応答しているこ
とが見い出された。尚、第７図中・印は酸化イリジウム
に直接酵素膜を被覆した電極の応答、ム印は酸化イリジ
ウムにポリ（４，４’　−ビフェノール）膜で被覆した
電極の応答であり、どちらもグルコース濃度変化にほと
んど応答していないことが明らかである。

尚、本実施例では酵素センサとしてグルコースセンサを
代表させたが、ウレアーゼを使用した尿素センサ等の他
の酵素センサにも本発明が適用されることは明らかであ
る。

［発明の効果］本発明により、過酸化水素に関与する酵素反応を利用し
て基質濃度を検知する固体型の安価な酵素センサを提供
できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で作製した酵素センサの模式図、第２図は実施例４で作製した酵素センサの模式図、第３図は実験例１〜４で使用した測定回路を示す図、第４図は実施例１で作製した酵素センサのグルコース濃
度に対する応答を示す図、第５図は実施例２で作製した
酵素センサのグルコース濃度に対する応答を示す図、第
６図は実施例３で作製した酵素センサのグルコース濃度
に対する応答を示す図、第７図は実施例４で作製した酵
素センサのグルコース濃度に対する応答を示す図である
。図中、１・・・カーボンファイバ、２・・・導電性接着
剤、３・・・リード線、４・・・エポキシ接着剤、５・
・・テフロンチューブ、６・・・ビフェノール電解重合
膜、７・・・酵素膜、８・・・サファイア板、９・・・
酸化イリジウム、１０・・・シリコン絶縁材、１１・・
・酵素センサ、１２・・・飽和塩化ナトリウムカロメル
電極、１３・・・被検液、１４・・・直流電流計、１５
・・・１、Ｏｖ直流電源である。第１図　　　　　第２図第３図第４図（Ｑ／ｕｃｏｓｅｌ（ｍｇ／ｄＱ）第５図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）導電性基体と、該導電性基体表面を被覆する過酸
化水素の酸化および／または還元触媒機能を有する酸化
還元触媒機能層層と、該酸化還元触媒機能層を被覆し、
酵素反応により過酸化水素を発生あるいは消費する酵素
固定化膜とを備えることを特徴とする酵素センサ。
（２）導電性基体は、導電性炭素材料、酸化イリジウム
、半導体材料、金属酸化物、貴金属、金属などであつて
、飽和塩化ナトリウムカロメル電極に対する電位が＋１
．０ボルトの場合に、溶解または腐食を受けないことを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の酵素センサ。
（３）酸化還元触媒機能層の酸化還元電位は、ｐＨ１．
０で飽和カロメル電極に対する電位が＋０．５ボルト以
上であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
酵素センサ。
（４）酸化還元触媒機能層は、ビフエノール系の電解酸
化重合体であることを特徴とする特許請求の範囲第１項
記載の酵素センサ。
（５）酵素固定化膜に含まれる酵素は、酸化酵素である
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の酵素セン
サ。
（６）酵素固定化膜に含まれる酵素は、グルコースオキ
シダーゼまたはウレアーゼであることを特徴とする特許
請求の範囲第１項記載の酵素センサ。