JP2615220B2 - 酵素センサー - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、酵素センサーに関し、さらに詳しく言う
と、構造が簡単で小型化が容易であるとともに、試料溶
液中の溶存酸素濃度が低い状態であっても広い基質濃度
範囲内でより正確な基質濃度の測定が可能な酵素センサ
ーに関する。

［従来技術および発明が解決しようとする課題］ 酵素を繰り返して使用可能な形態にしてなる固定化酵
素と電極とを組み合わせてなる酵素センサーは、たとえ
ば医療、食品、環境などの計測分野において実用化され
るに至っている。

たとえば第２図に示すように、従来のグルコースセン
サーは、白金陽極ａを絶縁材ｂを介してステンレス管ｃ
と管状の銀／塩化銀陰極ｄ内に収納してなる過酸化水素
電極ｅの先端を被覆した酢酸セルロース製の過酸化水素
センサー安定化膜ｆと酢酸セルロース製のグルコース制
限透過膜ｇで固定化酵素ｈを挟み、さらに前記グルコー
ス制限透過膜ｇをポリウレタン製のグルコース制限透過
膜ｉで被覆し、その表面をさらにポリビニルアルコール
製の生体適合膜ｊで被覆して形成されている。なお、第
２図中、ｋは筒状の筐体、ｌはリード線、ｍは接着剤で
ある。

そして、第２図に示すグルコースセンサーを試料溶液
中に挿入すれば、前記グルコース制限透過膜ｇの存在に
より、試料溶液中の一部のグルコースが前記固定化酵素
ｈに拡散し、この固定化酵素ｈの触媒作用により、グル
コースの酸化反応によって生成する過酸化水素が前記過
酸化水素電極ｅ上で電解され、それによって生ずる電解
電流値がグルコース濃度と比例関係にあることを利用し
てグルコース濃度を測定することができる。

しかしながら、このような従来のグルコースセンサー
は、グルコース濃度が700mg/dl以上であると、グルコー
ス濃度と前記電解電流値との比例関係が消失し、さらに
グルコース濃度を上げると、電解電流値がグルコース濃
度に依存しなくなることから、グルコース濃度を広い範
囲にわたって正確に測定することができないという欠点
がある。

また、このような従来のグルコースセンサーの電解電
流値は、試料溶液中の溶存酸素濃度に依存し、たとえば
グルコース溶液に対する飽和溶存酸素濃度（37℃で6.86
mg/）時における電解電流値に対して溶存酸素濃度0.5
mg/時における電解電流値は30〜70％にまで低下して
しまう。皮下組織または血液中の溶存酸素濃度は常に一
定の値を示しているわけではないので、前述のような従
来の酵素センサーを、たとえば患者の血糖値測定に使用
しても、正確な血糖値を測定することは不可能である。

さらに、前述のような電解電流値の試料溶液中の溶存
酸素濃度依存性を消失させるために、メディエーターと
して例えばフェロセンを利用したセンサーも提案されて
いる。

しかしながら、前述のようなメディエーター、たとえ
ばフェロセンを効果的に使用するには、たとえばカーボ
ンブラック、ポリピロールなどの導電性材料を併用する
必要があるとともに、フェロセンを固着するには特殊な
技術を必要とすることから、センサーの組み立てが困難
であるという問題がある。しかも、このセンサーにおい
ても、グルコース濃度が600mg/dl以上であると、グルコ
ース濃度と電解電流値との比例関係が消失し、さらにグ
ルコース濃度を上げると、電解電流値がグルコース濃度
に依存しなくなることから、グルコース濃度を広い範囲
にわたって正確に測定することは不可能である。

本発明は前記の事情に基いてなされたものである。

本発明の目的は、構造が簡単で小型化が容易であると
ともに、試料溶液中の溶存酸素濃度が低い状態であって
も広い基質濃度範囲内でより正確な基質濃度の測定が可
能な酵素センサーを提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 前記課題を解決するために、本発明者が鋭意検討を重
ねた結果、電解電流値を低くし、試料溶液中の微量溶存
酸素とグルコースとの酸化反応により生成した過酸化水
素を、過酸化水素安定化膜を取り除くことにより、白金
陽極上で効率良く電気分解させ、それにより生成した酸
素を、微細孔を有する酵素固定粒子と有機溶媒に高分子
としてポリビニルアルコール並びにポリウレタン及び／
又は酢酸セルロースを溶解した混合高分子溶液との混合
物を乾燥して得られる膜状物の作用により、外部に流出
させることなく効率良く酵素固定化層内に拡散させるこ
とによって試料溶液中の溶存酸素濃度が低い状態であっ
ても溶存酸素濃度に依存することなく、一定の電解電流
値を各グルコース濃度において得ることの可能な酵素セ
ンサーが得られることを見い出して、本発明に到達し
た。

請求項１記載の発明の構成は、金属製電極よりなる過
酸化水素電極の先端に、共有結合法により酵素を固定化
した酵素固定粒子と有機溶媒に高分子としてポリビニル
アルコール並びにポリウレタン及び／又は酢酸セルロー
スを溶解した混合高分子溶液との混合物を乾燥して得ら
れる膜状物と、基質制限透過膜と、生体適合膜とを設け
てなることを特徴とする酵素センサーであり、 請求項２記載の発明の構成は、前記金属製電極が、白
金よりなる陽極と、銀／塩化銀よりなる陰極とからなる
請求項１記載の酵素センサーであり、 請求項３記載の発明の構成は、前記酵素固定粒子が、
γ−アミノプロピルトリエトキシシランの濃度が10〜30
％であるトルエン溶液を用いてアミノ基を多孔性ガラス
粒子に導入した後、前記アミノ基と酵素中のアミノ基と
の間を濃度が１〜20％であるグルタルアルデヒド溶液を
用いて架橋することにより酵素を固定化してなる請求項
１または請求項２記載の酵素センサーであり、請求項４
記載の発明の構成は、前記酵素がグルコースオキシダー
ゼである請求項１乃至請求項３のいずれかに記載の酵素
センサーである。

［作 用］ 本発明の酵素センサーは、金属製電極よりなる過酸化
水素電極の先端に、共有結合法により酵素を固定化した
酵素固定粒子と有機溶媒に高分子としてポリビニルアル
コール並びにポリウレタン及び／又は酢酸セルロースを
溶解した混合高分子溶液との混合物を乾燥して得られる
膜状物と、基質制限透過膜と、生体適合膜とを設けてな
り、前記過酸化水素電極の先端を所定の試料溶液中に挿
入すれば、前記基質制限透過膜の存在により、試料溶液
中の一部の基質が前記膜状物中の前記酵素固定粒子に固
定化されている酵素に拡散する。この酵素の触媒作用に
よる基質の酸化反応によって生成する過酸化水素が過酸
化水素電極上で電解され、それに伴なって電解電流が生
ずる。この電解電流値が基質濃度と比例関係にあること
を利用して基質濃度を測定することができる。

［実施例］ 次に本発明の実施例を示し、本発明についてさらに具
体的に説明する。

第１図に本発明の酵素センサーの構成を示す。

第１図に示すように、本発明の酵素センサーは金属製
電極１よりなる過酸化水素電極２を有する。金属製電極
１は、たとえば、絶縁材３を介して白金陽極４を管状の
銀／塩化銀陰極５内に収納することにより好適に形成す
ることができる。過酸化水素電極２の先端には、膜状物
６と基質制限透過膜７と生体適合膜８とを備える。な
お、第１図中、９は筒状筐体、10はリード線、11は接着
剤である。本実施例においては接着剤にエポキシ接着剤
を用いている。

前記絶縁材３としては、電気絶縁性の優れた樹脂を好
適に用いることができる。具体的には、塩化ビニル樹
脂、アクリル樹脂、ケイ素樹脂、エポキシ樹脂などを挙
げることができる。

本実施例においては、前記絶縁材に前記白金陽極を浸
漬し、熱処理を施すことによって絶縁処理を行なってお
り、この絶縁処理を行なった白金陽極４をステンレス管
12に挿通してある。

前記白金陽極４およびステンレス管12および管状の銀
／塩化銀陰極５は、たとえば従来より公知の過酸化水素
電極において用いられているものと同様のものでよく、
たとえば過酸化水素電極２の先端の直径は約0.8mmであ
り、前記白金陽極４の直径は約0.5mmである。また、前
記ステンレス管12の内径は約0.3mmであり、外径は約0.5
5mmである。さら、前記管状の銀／塩化銀陰極５の内径
は約0.6mmである。

なお、第１図に示すように、絶縁材３を介して白金陽
極４をステンレス管12および管状の銀／塩化銀陰極５内
に収納してなる金属製電極１よりなる過酸化水素電極２
は、たとえばポリプロピレン製の筒状筐体９を有する。

本発明の酸素センサーは、前記過酸化水素電極２の先
端に膜状物６を備える。

前記膜状物６は、共有結合法により酵素を固定化した
酵素固定粒子61と高分子62とからなる。

前記酵素固定粒子としては、表面に多数の細孔を有す
る例えば固定化酵素用ガラスの粒子、セラミックスの粒
子などを好適に用いることができる。

たとえばこれらの材質からなる前記酵素固定粒子の細
孔径は、大きすぎると粒子の表面積が小さくなるし、小
さすぎると酵素が細孔内に入り込むことができなくなっ
て酵素の固定化が可能な有効表面積が著しく減少するこ
とから、通常500〜800の範囲内で選定することが好まし
い。

本発明において、前記酵素固定粒子に固定させること
のできる酵素としては、たとえばグルコースオキシダー
ゼ、ガラクトースオキシダーゼ、アルコールオキシダー
ゼ、ウリカーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、コレステ
ロールエステラーゼ、ホスホリパーゼ、ラクテートオキ
シダーゼなどの種々の酵素の中から、目的に応じて適宜
に選定することができる。たとえば、前記酵素にグルコ
ースを選択すれば、本発明の酵素センサーをグルコース
オキシダーゼの定量分析に好適に使用することができ
る。

また、前記酵素を前記酵素固定粒子に固定化する前記
共有結合法としては、たとえば前記酵素固定粒子と濃度
が10〜30％、好ましくは15〜25％であるγ−アミノプロ
ピルトリエトキシシランのトルエン溶液とを混合して６
〜12時間還流させ、充分に乾燥させた後、濃度１〜20
％、好ましくは３〜15％のグルタルアルデヒド溶液で１
時間反応させ、濾過した後、酵素固定粒子と、酵素をリ
ン酸緩衝液に溶解した酵素溶液とを、０℃で２時間反応
させることによって固定化する方法を好適に採用するこ
とができる。なお、トルエン溶液中のγ−アミノプロピ
ルエトキシシランの濃度が10％未満であると、本発明の
目的を達成することができないことがあり、また30％を
越えるとγ−アミノプロピルトリエトキシシランがトル
エンに溶解しにくくなることがある。グルタルアルデヒ
ド溶液中グルタルアルデヒドの濃度が前記１％未満であ
ると、十分に本発明の目的を達成することができず、ま
た20％を越えると濃度をそれだけ高くするに見合った効
果を得ることができないことがある。

前記高分子としては、ポリビニルアルコール並びにポ
リウレタンおよび／または酢酸セルロースを好適に用い
ることができる。

前記高分子がポリビニルアルコールだけであると、高
分子の膨潤により、結果的には前記膜状物全体の膨潤に
より、前記白金陽極上で生成された酵素が前記膜状物内
から容易に系外へ拡散してしまうため、効率良く前記膜
状物内に酵素が拡散することができない。また、前記高
分子がポリウレタンおよび／または酢酸セルロースであ
ると、前記膜状物の緻密化により、前記膜状物内で生成
した過酸化水素を効率良く前記白金陽極上に到達させる
ことができず、基質濃度と電解電流値との間の比例関係
が得られにくくなる。したがって、本発明においては、
ポリビニルアルコール並びにポリウレタンまたは酢酸セ
ルロースを任意の割合で混合した高分子、またはポリビ
ニルアルコール並びにポリウレタンおよび酢酸セルロー
スを任意の割合で混合した高分子を用いる。

前記膜状物は、たとえば次のようにして製造すること
ができる。

すなわち、前記高分子がポリビニルアルコールおよび
ポリウレタンで形成される場合には、グリセリンを溶媒
とした高分子濃度３〜８％、好ましくは５〜７％のポリ
ビニルアルコール溶液８重量部に対してジメチルホルム
アミドおよびテトラヒドロフランを溶媒とした高分子濃
度５〜15％、好ましくは６〜８％のポリウレタン溶液２
重量部を加えて混合し、この混合高分子溶液10重量部に
対して６重量部の前記酵素固定粒子を加えて混合し、そ
の適量を前記過酸化水素電極の先端に付着させた後、乾
燥させれば、前記膜状物を得ることができる。

たとえばこのようにして得られる前記膜状物の膜厚は
通常100〜1,000μｍ、好ましくは400〜800μｍである。

前記基質制限透過膜としては、たとえばポリウレタ
ン、酢酸セルロース等からなる高分子膜を挙げることが
できる。

前記基質制限透過膜は、たとえば次のようにして製造
することができる。

すなわち、前記基質制限透過膜がポリウレタン膜から
なるものである場合には、ポリウレタンを、たとえばジ
メチルホルムアミドおよびテトラヒドロフランの混合溶
媒に溶かし、得られた高分子溶液に前記膜状物を固着し
た前記過酸化水素電極の先端を浸漬し、真空乾燥を行な
えば、前記基質制限透過膜を得ることができる。

前記基質制限透過膜を作製するに際して使用に供され
る前記高分子溶液の高分子濃度は、前記高分子溶液がポ
リウレタンとジメチルホルムアミドとテトラヒドロフラ
ンとの混合溶媒からなるものである場合には通常５〜15
％、好ましくは８〜10％である。また、前記基質制限透
過膜の膜厚は通常５〜50μｍ、好ましくは20〜40μｍで
ある。前記生体適合膜は、たとえばポリビニルアルコー
ル、フィブロインなどの生体適合性を有する高分子を用
いて形成することができる。

このような高分子を用いた前記生体適合膜は、たとえ
ば次ようにして製造することができる。

すなわち、前記生体適合膜がポリビニルアルコールを
用いてなるものである場合には、ポリビニルアルコール
を、たとえばグリセリンに溶かし、得られた溶液に前記
膜状物および前記基質制限透過膜を固着した前記過酸化
水素電極の先端を浸漬し、真空乾燥を行なえば、前記生
体適合膜を得ることができる。

たとえばこのようにして得られる前記生体適合膜の高
分子濃度は通常３〜８％、好ましくは５〜７％である。

また、前記生体適合膜の膜厚は５〜50μｍ、好ましく
は20〜40μｍである。

本発明の酵素センサーは以上のようにして前記過酸化
水素電極の先端に、前記膜状物、前記基質制限透過膜お
よび前記生体適合膜を固着した後、50〜60℃で熱処理す
ることにより形成することができる。

そして、本発明においては、前記酵素固定粒子がグル
コースオキシダーゼを固定した多孔性ガラス粒子であ
り、前記高分子がポリビニルアルコール並びにポリウレ
タンおよび／または酢酸セルロースであり、前記基質制
限透過膜がポリウレタン膜であり、かつ前記生体適合膜
がポリビニルアルコール膜であることが好ましい。本発
明の酵素センサーがこのような構成であると、たとえば
血糖値を正確に測定することの可能なグルコースセンサ
ーとすることができる。

次に、本発明の酵素センサーの実験例を示す。

（実験例１） 前記酵素固定粒子と、５％ポリビニルアルコールおよ
び7.5％ポリウレタンからなる前記膜状物と、10％ポリ
ウレタンからなる前記基質制限透過膜と、５％ポリビニ
ルアルコールからなる前記生体適合膜とを、前記過酸化
水素電極に固着した後、温度50℃にて30分間熱処理して
なる酵素センサーを用いて、種々のグルコース濃度にお
ける電解電流値を測定した。

その結果、第３図に示すようにグルコース濃度1,000m
g/dlまで、グルコース濃度と電解電流値との間の比例関
係を得ることができた。

（実施例２） 前記実施例１で使用した酵素センサーを用いてグルコ
ース濃度500mg/dlおよび1,000mg/dlの試料溶液中に窒素
ガスを吹き込むことにより、試料溶液中の溶存酸素濃度
を調節して電解電流値の溶存酸素濃度依存性を調べた。

その結果、第４図に示すように、各グルコース濃度に
おける試料溶液電解電流値は0.2mg/まで飽和溶存酸素
濃度時の電解電流値と変わらず一定であった。

（比較実験例１） ５％酢酸セルロースからなる過酸化水素センサー安定
化膜と固定化酸素と５％酢酸セルロースおよび６％ポリ
ウレタンからなるグルコース制限透過膜と５％ポリビニ
ルアルコールからなる生体適合膜とを、過酸化水素電極
に固着した後、温度50℃にて30分間熱処理してなるとと
もに、第２図に示すような形状のグルコースセンサーを
用いて前記実験例１と同様の試験を行なった。

その結果、第５図に示すように、グルコース濃度500m
g/dlまでグルコース濃度と電解電流値との間の比例関係
が得られた。

（比較実験例２） 前記比較実験例１で使用しセンサーを用いて前記実験
例２と同様の試験をグルコース濃度500mg/dlの試料溶液
について行なった。

その結果、第６図に示すように、溶存酸素濃度0.9mg/
付近から電解電流値の低下が認められた。

［発明の効果］ 本発明によると、 （１） 金属製電極からなる過酸化水素電極の先端に、
酸素固定粒子と有機溶媒に高分子としてポリビニルアル
コール並びにポリウレタン及び／又は酢酸セルロースを
溶解した混合高分子溶液との混合物を乾燥して得られる
膜状物と基質制限透過膜と生体適合膜とを設けてなるの
で、構造が簡単で小型化が容易であり、 （２） しかも、多孔性の酵素固定粒子を用いているの
で、より多くの酵素の固定化が可能であるとともに、酵
素固定粒子とポリビニルアルコール並びにポリウレタン
及び／又は酢酸セルロースとを混合しているので、電極
上で生成した酸素を系外に流出させることなく効率良く
酵素固定化層内に拡散することが可能であるので、試料
溶液中の溶存酸素濃度が低い状態であっても電解電流値
が低下することがなくて安定した電解電流値を広い基質
濃度範囲内で得ることができる、 という利点を有する工業的に有用な酵素センサーを提供
することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の酵素センサーの一例を示す説明図、第
２図は従来の酵素センサーの一例を示す説明図、第３図
は実験例１において用いた酵素センサーについてのグル
コース濃度と電解電流値との関係を示すグラフ、第４図
は実験例２において用いた酵素センサーについての溶存
酸素濃度と電解電流値との関係を示すグラフ、第５図は
比較実験例１において用いた酵素センサーについてのグ
ルコース濃度と電解電流値との関係を示すグラフ、第６
図は比較実験例２において用いた酵素センサーについて
の溶存酸素濃度と電解電流値との関係を示すグラフであ
る。１ ……金属製電極、２……過酸化水素電極、６……膜状
物、61……酵素固定粒子、62……高分子、７……基質制
限透過膜、８……生体適合膜。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−156555（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−85853（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−261341（ＪＰ，Ａ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】金属製電極よりなる過酸化水素電極の先端
   に、共有結合法により酵素を固定化した酵素固定粒子と
   有機溶媒に高分子としてポリビニルアルコール並びにポ
   リウレタン及び／又は酢酸セルロースを溶解した混合高
   分子溶液との混合物を乾燥して得られる膜状物と、基質
   制限透過膜と、生体適合膜とを設けてなることを特徴と
   する酵素センサー。
2. 【請求項２】前記金属製電極が、白金よりなる陽極と、
   銀／塩化銀よりなる陰極とからなる請求項１記載の酵素
   センサー。
3. 【請求項３】前記酵素固定粒子が、γ−アミノプロピル
   トリエトキシシランの濃度が10〜30％であるトルエン溶
   液を用いてアミノ基を多孔性ガラス粒子に導入した後、
   前記アミノ基と酵素中のアミノ基との間を濃度が１〜20
   ％であるグルタルアルデヒド溶液を用いて架橋すること
   により酵素を固定化してなる請求項１または請求項２記
   載の酵素センサー。
4. 【請求項４】前記酵素がグルコースオキシダーゼである
   請求項１乃至請求項３のいずれかに記載の酵素センサ
   ー。