JPH03158750A

JPH03158750A - 酵素センサー

Info

Publication number: JPH03158750A
Application number: JP1296965A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Abe; 浩史阿部; Jiro Kawarabata; 河原畑　二郎; Toshiaki Noda; 野田　俊彬
Original assignee: Nikkiso Co Ltd
Current assignee: Nikkiso Co Ltd
Priority date: 1989-11-15
Filing date: 1989-11-15
Publication date: 1991-07-08
Anticipated expiration: 2012-05-28
Also published as: JP2615220B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、酵素センサーに関し、さらに詳しく言うと、
構造が簡単で小型化が容易であるとともに、試料溶液中
の溶存酸素濃度が低い状態であっても広い基質濃度範囲
内でより正確な基質濃度の測定が可能な酵素センサーに
関する。

［従来技術および発明が解決しようとする課８］酵素を
繰り返して使用可能な形思にしてなる固定化酵素と電極
とを組み合わせてなる酵素センサーは、たとえば医療、
食品、環境などの計測分野において実用化されるに至っ
ている。

たとえば第２図に示すように、従来のグルコースセンサ
ーは、白金陽極ａを絶縁材すを介してステンレス管Ｃと
管状の銀／塩化銀ゆ極ｄ内に収納してなる過酸化水素電
極ｅの先端を被覆した酢酸セルロース製の過酸化水素セ
ンサー安定化膜ｆと酢酸セルロース製のグルコース制限
透過Ｐ１５７ｇで固定化酵素りを挟み、さらに前記グル
コース制限透過膜ｇをポリウレタン酸のグルコース制限
透過膜ｉで被覆し、その表面をさらにポリビニルアルコ
ール製の生体適合膜ｊで被覆して形成されている。なお
、第２図中、ｋは筒状の筐体、又はリード線、ｍは接着
剤である。

そして、第２図に示すグルコースセンサーを試料溶液中
に挿入すれば、前記グルコース制限透過１’ｌ！２ｇの
存在により、試料溶液中の一部のグルコースが１ｉｉｉ
記固定化酵素りに拡散し、この固定化酵素りの触媒作用
により、グルコースの酸化反応によって生成する過酸化
水素が前記過酸化水素電極ｅ−Ｊｌで電解され、それに
よって生ずる電解電流値がグルコース濃度と比例関係に
あることを利用してグルコース濃度を測定することがで
きる。

しかしながら、このような従来のグルコースセンサーは
、グルコース濃度が７００ｍｇ／ｄｉ以上であると、グ
ルコース濃度と前記電解電流値との比例関係が消失し、
さらにグルコース濃度を上げると、電解’ｉｔ流値がグ
ルコース濃度に依存しなくなることから、グルコース濃
度を広い範囲にわたって正確に測定することができない
という欠点がある。

また、このような従来のグルコースセンサーの電解′ｉ
ｔ流値は、試料溶液中の溶存酸素濃度に依存し、たとえ
ばグルコース溶液に対する飽和溶存酸素濃度（３７℃で
６゜８６ｍｇ／ｌ）時における電解電流値に対して溶存
Ｓ素膚度０．５ｍｇ／１時における電解電流値は３０〜
７０％にまで低下してしまう、皮下組織または血液中の
溶存酸素濃度は常に一定の値を示しているわけではない
ので、前述のような従来の酵素センサーを、たとえば患
者の血糖（ｒ１測定に使用しても、正確な血糖値を測定
することは不可能である。

さらに、ＩｉＯ述のような電解電流値の試料溶液中の溶
存＃＃素濃度依存性を消失させるために、メデイエータ
−として例えばフェロセンを利用したセンサーも提案さ
れている。

しかしながら、前述のようなメデイエータ−たとえばフ
ェロセンを効果的に使用するには、たとえばカーボンブ
ラック、ポリピロールなどの導電性材料を併用する必要
があるとともに、フェロセンを固着するには特殊な技術
を必要とすることから、センサーの組み立てが困難であ
るという問題がある。しかも、このセンサーにおいても
、グルコース濃度が６００　ｒｎ　ｇ／　ｄ　Ｑ以上で
あると、グルコース濃度と電解電流値との比例関係が消
失し、さらにグルコース濃度を上げると、電解電流値が
グルコース濃度に依存しなくなることがら、グルコース
１度を広い範囲にわたって正確に測定することは不可能
である。

本発明は前記の事情に基いてなされたものである。

本発明の目的は、構造が簡単で小型化が容易であるとと
もに、試料溶液中の溶存酸素濃度が低い状態であっても
広い基質濃度範囲内でより正確な基質濃度の測定が可能
な酵素センサーを提供することにある。

［課題を解決するための手段］前記課題を解決するために２本発明者が鋭意検討を重ね
た結果、電解電流値を低くシ、試料溶液中の微量溶存酸
素とグルコースとの酸化反応により生成した過酸化水素
を、過酸化水素安定化膜を取り除くことにより、白金陽
極上で効率良く電気分解させ、それにより生成したｍＺ
を、微細孔を有する酵素固定粒子と高分子からなる膜状
物との作用により、外部に流出させることなく効率良く
酵素固定化層内に拡散させることによって試料溶液中の
溶存酸素濃度が低い状態であっても溶存酸Ｘ濃度に依存
することなく、一定の電解電流値を各グルコース濃度に
おいて得ることの可能な酵素センサーが得られることを
見い出して１本発明に到達した。

請求項１記佐の発明の構成は、金属製電極よりなる過酸
化水素電極の先端に、共有結合法により酵素全固定化し
た酵素固定粒子と高分子とからなる膜状物と、基質制限
透過膜と、生体適合膜とを設けてなることを特徴とする
酵素センサーであり、請求項２記載の発明の構成は、前記金属′！Ａ電極が、
白金よりなる陽極と、銀／塩化銀よりなる陰極とからな
る請求項１記載のＰ／Ｉ素センサーであり、請求項３記載の発明の構成は、前記酵素固定粒子が、γ
−アミノプロピルトリエトキシシランの濃度が１０〜３
０％であるトルエン溶液を用いてアミノ基を多孔性ガラ
ス粒子に導入した後、前記アミノ基と酵素中のアミノ基
との間を濃度が１〜２０％であるグルグルアルデヒド溶
液を用いて架橋することにより酵素を固定化してなる請
求項１または請求項２記載の酵素センサーであり、請求項４記載の発明の構成は、ボｊ記高分子がポリビニ
ルアルコールおよびポリウレタンおよび／または酢酸セ
ルロースでおる請求項１乃至請求項３のいずれかに記載
の酵素センサーであり、請求項５記載の発明の構成は、
前記酵素がグルコースオキシダーゼである請求項１乃至
請求項４のいずれかに記載の酵素センサーである。

［作　用］本発明の酵素センサーは、金属製電極よりなる過酸化水
素Ｓ極の先端に、共有結合法により酵素を固定化した酵
素固定粒子と高分子とからなる膜状物と、基質制限透過
膜と、生体適合膜とを設けてなり、前記過酸化水素電極
の先端を所定の試料溶液中に挿入すれば、前記２ｔｉ質
制限透過膜の存在により、試料溶液中の一部の基質が前
記膜状物中の前記酵素固定粒子に固定化されている酵素
に拡散する。この酵素の触媒作用による基質の酸化反応
によって生成する過酸化水素が過酸化水素ｔ８ｉ上で電
解され、それに伴なって電解ＭＬ流が生ずる。この電解
型ｉ偵が基質濃度と比例関係にあることを利用して基質
濃度を測定することができる。

［実施例］次に本発明の実施例を示し、本発明についてさらに具体
的に説明する。

第１図に本発明の酵素センサーの構成を示す。

第１図に示すように５本発明の酵素センサーは金属製電
極上よりなる過酸化水素Ｓ極旦を有する。金属製電極１
は、たとえば、絶縁材３を介して白金陽極４を管状の銀
／塩化銀陰極５内に収納することにより好適に形成する
ことができる。過酸化水素電極２の先端には、膜状物６
と基質制限透過膜７と生体適合ＩＩ　８とを備える。な
お、第１図中、９は筒状筐体、ｌＯはリード線、１１は
接着剤である０本実施例においては接着剤にエポキシ接
着剤を用いている。

前記絶縁材３としては、電気絶縁性の優れた樹脂を好適
に用いることができる。具体的には、塩化ビニル樹脂、
アクリル樹脂、ケイ素樹脂、エポキシ樹脂などを挙げる
ことができる。

本実施例においては、前記絶縁材に前記白金陽極を浸漬
し、熱処理を施すことによって絶縁処理を行なっており
、この絶縁処理を行なった白金陽極４をステンレス管１
２に挿通しである。

前記白金陽極４およびステンレス管１２および管状の銀
／塩化銀陰極５は、たとえば従来より公知の過酸化水素
電極において用いられているものと同様のものでよく、
たとえば過酸化水素電極ヱの先端の直径は約０．８ｍｍ
であり、前記白金陽極４の直径は約０．５ｍｍである。

また、前記ステンレス管１２の内径は約０．３ｍｍであ
り、外径は約０．５５ｍ　ｍである。さらに、前記管状
の銀／塩化銀陰極５の内径は約０．６　ｍｍである。

なお、第１図に示すように、絶縁材３を介して白金陽極
４をステンレス管Ｉ２および管状の銀／塩化銀陰極５内
に収納してなる金属！２電極１よりなる過酸化水Ｘ″：
４．極２は、たとえばポリプロピレン製の筒状筐体９を
有する。

本発明の酵素センサーは、前記過酸化水素電極２の先端
に膜状物６を備える。

前記膜状物６は、共有結合法により酵素を固定化した酵
素固定粒子６１と高分子６２とからなる。

前記酵素固定粒子としては、表面に多数の細孔を有する
例えば固定化酵素用ガラスの粒子、セラミックスの粒子
などを好適に用いることができる。

たとえばこれらの材質からなる前記酵素固定粒子の細孔
径は、大きすぎると粒子の表面積が小さくなるし、小さ
すぎると酵素が細孔内に入り込むことができなくなって
酵素の固定化が可能な有効表面積が著しく減少すること
から、通常５００〜８００　　の範囲内で選定すること
が好ましい。

本発明において、前記酵素固定粒子に固定させることの
できる酵素としては、たとえばグルコースオキシダーゼ
、ガラクトースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ
、ウリカーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、コレステロ
ールエステラーゼ、ホスホリパーゼ、ラクテートオキシ
ダーゼなどの種々の酵素の中から、目的に応じて適宜に
選定することができる。たとえば、前記酵素にグルコー
スを選択すれば、本発明の酵素センサーをグルコースオ
キシダーゼの定量分析に好適に使用することができる。

また、前記酵素を前記酵素固定粒子に固定化する前記共
有結合法としては、たとえば前記酵素固定粒子と濃度が
１０〜３０％、好ましくは１５〜２５％であるγ−アミ
ノプロピルトリエトキシシランのトルエン溶液とを混合
して６〜１２時間還流させ、充分に乾燥させた後、濃度
１〜２０％、好ましくは３〜１５％のグルグルアルデヒ
ド溶液で１時間反応させ、濾過した後、酵素固定粒子と
、酵素をリン酸緩衝液に溶解した酵素溶液とを、０℃で
２時間反応させることによって固定化する方法を好適に
採用することができる。なお、トルエン溶液中のγ−ア
ミノプロピルトリエトキシシランの濃度が１０５未満で
あると１本発明の目的を達成することができないことが
あり、また３０％を越えるとγ−７ミノプロビルトリエ
トキシシランがトルエンに溶解しにくくなることがある
。グルタルアルデヒド溶液中のグルタルアルデヒドの濃
度が前記１％未満であると、十分に本発明の目的を達成
することができず、また２０％を越えると濃度をそれだ
け高くするに見合った効果を得ることができないことが
ある。

前記高分子としては、ポリビニルアルコールおよびポリ
ウレタンおよび／または酢酸セルロースを好適に用いる
ことができる。

前記高分子がポリビニルアルコールだけであると、高分
子の膨潤により、結果的には前記膜状物全体の膨潤によ
り、前記白金陽極上で生成された酵素が前記膜状物内か
ら容易に系外へ拡散してしまうため、効率良く前記膜状
物内に酵素が拡散することができない、また、前記高分
子がポリウレタンおよび／または酢酸セルロースである
と、前記膜状物の緻密化により、前記膜状物内で生成し
た過酸化水素を効率良く前記白金陽極上に到達させるこ
とができず、基質濃度と電解電流値との間の比例関係が
得られにくくなる。したがって、本発明においては、ポ
リビニルアルコールおよびポリウレタンまたは酢酸セル
ロースを任意の割合で混合した高分子、またはポリビニ
ルアルコールおよびポリウレタンおよび酢酸セルロース
を任意の割合で混合した高分子を用いることが望ましい
。

前記膜状物は、たとえば次のようにして製造することが
できる。

すなわち、前記高分子がポリビニルアルコールおよびポ
リウレタンで形成される場合には、グリセリンを溶媒と
した高分子濃度３〜８％、好ましくは５〜７％のポリビ
ニルアルコール溶液８重量部に対してジメチルホルムア
ミドおよびテトラヒドロフランを溶媒とした高分子濃度
５〜１５％、好ましくは６〜８％のポリウレタン溶液２
重量部を加えて混合し、この混合高分子溶液１０重量部
に対して６重量部の前記酵素固定粒子を加えて混合し、
その適量を前記過酸化水素電極の先端に付着させた後、
乾燥させれば、前記膜状物を得ることができる。

たとえばこのようにして得られる前記膜状物の膜厚は通
常１００〜１．Ｇｏｏ　ＪＬｍ、好ましくは４００〜８
００鉢ｍである。

前記基質制限透過膜としては、たとえばポリウレタン、
酢酸セルロース等からなる高分子膜を挙げることができ
る。

前記基質制限透過膜は、たとえば次のようにして製造す
ることができる。

すなわち、前記基質制限透過膜がポリウレタン膜からな
るものである場合には、ポリウレタンを、たとえばジメ
チルホルムアミドおよびテトラヒドロフランの混合溶媒
に溶かし、得られた高分子溶液に前記膜状物を固着した
前記過酸化水素電極の先端を浸漬し、真空乾燥を行なえ
ば、前記基質制限透過膜を得ることができる。

前記基質制限透過膜を作製するに際して使用に供される
前記高分子溶液の高分子濃度は、前記高分子溶液がポリ
ウレタンとジメチルホルムアミドとテトラヒドロフラン
との混合溶媒からなるものである場合には通常５〜１５
％、好ましくは８〜１０％である。また、前記基質Ｍ１
限透過膜の膜厚は通常５〜５０延ｍ、好ましくは２０〜
４０７１ｍである。

前記生体適合膜は、たとえばポリビニルアルコール、フ
ィブロインなどの生体適合性を有する高分子を用いて形
成することができる。

このような高分子を用いた前記生体適合膜は、たとえば
次のようにして製造することができる。

すなわち、前記生体適合膜がポリビニルアルコールを用
いてなるものである場合には、ポリビニルアルコールを
、たとえばグリセリンに溶かし、得られた溶液に前記膜
状物および前記基質ル１限透過膜を固着した前記過酸化
水素電極の先端を浸漬し、真空乾燥を行なえば、前記生
体適合膜を得ることができる。

たとえばこのようにして得られる前記生体適合膜の高分
子濃度は通常３〜８％、好ましくは５〜７％である。

また、前記生体適合膜の膜厚は５〜５０μｍ、好ましく
は２０〜４０μｍである。

本発明の酵素センサーは以上のようにして前記過酸化水
素電極の先端に、前記膜状物、前記基質制限透過膜およ
び前記生体適合膜を固着した後、５０〜６０℃で熱処理
することにより形成することができる。

そして、本発明においては、前記酵素固定粒子がグルコ
ースオキシダーゼを固定した多孔性ガラス粒子であり、
前記高分子がポリビニルアルコールおよびポリウレタン
および／または酢酸セルロースであり、前記基質制限透
過膜がポリウレタン膜であり、かつ前記生体適合膜がポ
リビニルアルコール膜であることが好ましい、未発明の
酵素センサーがこのような構成であると、たとえば血糖
値を正確に測定することの可能なグルコースセンサーと
することができる。

次に１本発明の酵素センサーの実験例を示す。

（実験例１）前記＃素固定粒子と、５％ポリビニルアルコールおよび
７．５％ポリウレタンからなる前記膜状物と、　１０％
ポリウレタンからなる前記基質制限透過Ｍと、５％ポリ
ビニルアルコールからなる前記生体適合膜とを、前記過
酸化水素電極に固着した後、温度５０℃にて３０分間熱
処理してなる酵素センサーを用いて１種々のグルコース
濃度における電解電流値を測定した。

その結果、第３図に示すようにグルコース濃度１．００
０鵬ｇ／ｄｉまで、グルコース濃度と電解電流値との間
の比例関係を得ることができた。

（実験例２）前記実験例１で使用した酵素センサーを用いてグｊｌｚ
Ｄ−ス濃度５００　ｍｇ／ｄｌおよびり、０００＋ｓｇ
／ｄｉの試料溶液中に窒素ガスな吹き込むことにより、
試料溶液中の溶存酸素濃度を調節して電解電流値の溶存
酸素濃度依存性を調べた。

その結果、第４図に示すように、各グルコース濃度にお
ける試料溶液の電解電流値は０．２ｍｇ／文まで飽和溶
存酸素濃度時の電解電流値と変わらず一定であった。

（比較実験例１）５％酢酸セルロースからなる過酸化水漏センサー安定化
膜と固定化酵素と５％酢酸セルロースおよび６％ポリウ
レタンからなるグルコース制限透過膜と５％ポリビニル
アルコールからなる生体適合膜とを、過酸化水素電極に
固着した後、温度５０℃にて３０分間熱処理してなると
ともに、第２図に示すような形状のグルコースセンサー
ヲ用いて前記実験例工と同様の試験を行なった。

その結果、ｔＪＳ５図に示すように、グルコース濃度５
００信ｇ／ｄｉまでグルコース濃度と電解電流値との間
の比例関係が得られた。

（比較実験例２）前記比較実験例１で使用しセンサーを用いて前記実験例
２と同様の試験をグルコース濃度５００ｍｇ／ｄ文の試
料溶液について行なった。

その結果、第６図に示すように、溶存酸素濃度０．９ｍ
ｇ１ｆＬ付近から電解電流値の低下が認められた。

［発明の効果］本発明によると、（１）　　金属製電極からなる過酸化水素電極の先端に
、酵素固定粒子および高分子からなる膜状物と基質制限
透過膜と生体適合膜とを設けてなるので、構造が簡単で
小型化が容易であり、（２）シかも、多孔性の酵素固定
粒子を用いているので、より多くの酵素の固定化が可能
であるとともに、酵素固定粒子と高分子とを混合してい
るので、電極上で生成した酸素を系外に流出させること
なく効率良く酵素固定化層内に拡散することが可能であ
るので、試料溶液中の溶存酸素濃度が低い状思であって
も電解１ｔｏｔ値が低下することがなくて安定した電解
電流値を広い基質濃度範囲内で１！）ることができる。

という利点を有する工業的に有用な酵素センサーを提供
することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の酵素センサーの一例を示す説明図、第
２図は従来の酵素センサーの一例を示す説明図、第３図
は実験例１において用いた酵素センサーについてのグル
コース濃度と電解室Ｒ（ｔｉとの関係を示すグラフ、第
４図は実験例２において用いた酵素センサーについての
溶存酸素濃度と電解電流値との関係を示すグラフ、第５
図は比較実ａ例ｉにおいて用いた酵素センサーについて
のグルコース濃度と電解電流値との関係を示すグラフ、
第６図は比較実験例２において用いた酵素センサーにつ
いての溶存酸素濃度と電解′ｒｒＬ流値との関係を示す
グラフである。第１図１・−・金属製電極、２−中−過酸化水素電極、６・・
・膜状物、６１◆・拳酵素固定粒子、６２・・・高分子
、７・・・基質ｚｉ’ｉ透過膜、８・・・生体適合膜。第３図グンしコース、Ｊカ（（ｍｇ／ｄｕ）第４図熔存市交素濃度（ｍｇ／Ｊり第５図第６図０．２０．４０．６０．８１．０り）レコース禮度（ｒｎｇ／ｄ交）溶存酸禾鷹反（ｍｇ／Ｊ２）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）金属製電極よりなる過酸化水素電極の先端に、共
有結合法により酵素を固定化した酵素固定粒子と高分子
とからなる膜状物と、基質制限透過膜と、生体適合膜と
を設けてなることを特徴とする酵素センサー。
（２）前記金属製電極が、白金よりなる陽極と、銀／塩
化銀よりなる陰極とからなる請求項１記載の酵素センサ
ー。
（３）前記酵素固定粒子が、γ−アミノプロピルトリエ
トキシシランの濃度が１０〜３０％であるトルエン溶液
を用いてアミノ基を多孔性ガラス粒子に導入した後、前
記アミノ基と酵素中のアミノ基との間を濃度が１〜２０
％であるグルタルアルデヒド溶液を用いて架橋すること
により酵素を固定化してなる請求項１または請求項２記
載の酵素センサー。
（４）前記高分子がポリビニルアルコールおよびポリウ
レタンおよび／または酢酸セルロースである請求項１乃
至請求項３のいずれかに記載の酵素センサー。
（５）前記酵素がグルコースオキシダーゼである請求項
１乃至請求項４のいずれかに記載の酵素センサー。