JPS62275683A - 固定化酵素薄膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 ［産業上の利用分野］ 本発明の物理的に性能向上した固定化酵素薄膜は化学工
業、食品工業、環境保全などの分野で特にバイオセンサ
ーとして利用される。

［従来の技術］ 酵素又は微生物を水不溶性の高分子担体中に固定化した
膜（以下、固定化酵素膜という。）は触媒作用、物質代
謝作用をもつ機能生膜としてバイオセンサー、バイオリ
アクターに利用され、化学工業、食品工業、環境保全な
どの分野で広く適用されている。

バイオセンサー川の固定化酵素１漠として次に示す性質
を備えていることが要求される。

（イ）固定化操作にともなう酵素又は微生物の失活が少
ないこと。

（ロ）寸分なｍの酵素又は微生物を膜内に保持できるこ
と。

（ハ）膜厚が十分に薄くできること。例えば、数十秒程
度の高速応答を１ｒｆるためには膜厚を２００〃ｍ以下
にすることが必要である。

（ニ）強＋ｌが大きいこと。電極装着時、使用時に破れ
ないものであること。

（ボ）均一であること。センサーに適用する膜（例えば
直径１０ｍｍの円）のうらイ１効に割ｊく部分は一般的
に直径１〜２　ｍｍ程度である。酵素又は微生物が膜中
に均一に分散していないと、装着する１食に有効に動く
酵素膜、微生物菌体の総量が変化し、したがってセンサ
ーの特性がばらつく。

（へ）粘着しないこと。特に薄い膜ではねじれたり丸ま
ったりしやずい。粘着性があるとねじれたとぎに互いに
接看して使用不可能となる。

従来上記の（イ）〜くへ）の１べてを満足するバイオセ
ンサー用固定化酵素膜は知られていない。

ｌｒ２素必るいは微生物の固定化方法は種々知られてい
るが、例えば上記（イ〉の点では包括固定化法がすぐれ
ている。包括固定化法用の担体としては、一般にはポリ
アクリルノアミドが多１１１８れ（いるが、バイオセン
サー用としては膜状に成形しやずい点及び物理強度が１
ぐれていることなどからコラーゲンが一般に使用されて
いる。そのほか、ポリビニルアルコール、ポリエチレン
グリコール等も知られでいる。

［発明が解決しようとする問題点コ Ｍ、１定化材料としてのポリビニルアルコールは薄い膜
をつくると強度が不足し、組立て時に破れたり、仮に装
着できても使用中に破損しやりいという欠点があった。

ポリビニルアルコール膜には粘着性がおるため、特に膜
を薄くするほとねじれたり変形しゃづくなりしたがって
製膜又はセンサーに装着時に粘着して使用不可能となり
やすかった。また、膜中における酵素又は微生物の分散
が均一でないため、これを使用したセンサーは特性のば
らつきが大きいという欠点もおった。

これらの問題点を解決するため、組枠の互いに重なり必
う面に粘着剤を塗イＩしてこれに固定化酵素膜をはさ／
υで取り扱い時の変形、破ＩＱ、粘着を防止する方法及
び膜中にポリエステル紗など芯を入れて補強する方法等
があった。しかじ組枠を用いる方法は手間がかかり、又
ポリエステル紗などの芯を入れる方法はその分だけ膜が
厚くなりセンサーの応答を劣化さけるなどの難点があっ
てまだ根本的解決はなされていない。

［問題点を解決するための手段］ 本発明はこのような問題点を解決した固定化酵素薄膜を
提供するものであり、ポリビニルアルコールを担体とし
て酵素又は微生物を固定化した薄膜において、微生物の
産生ずるセルロース性物質を含有往しめたことを特徴と
している。

担体として利用されるポリビニルアルコールの例として
は既知の方法（Ｋｕｎｉｈｉｒｏ　ｉｃｈｉｍｕｒａ。

“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｒ　ＷａＬｅｒ−３ｏｌ
ｕｂｌｅ　ＰｂｏｔｏｒｅｓｉｓｔＤｅｒｉｖｅｄ　ｆ
ｒｏｍ　ｐｏｌｙ　（ｖｉｎｙｌ　Ａｌｃｏｈｏｌ）　
”　。

Ｊ、Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉ　、、　２０．１４１ｔ　
〜１４１７　（１９８２）　）で合成したポリビニルア
ルコールを主鎖とした光硬化性樹脂を代表的なものとし
てめげることができる。

酵素及び微生物は測定対象物質を検出するバイオセンサ
ー用として公知のものでよい。その例を下記に示す。

固定化対象酵素　　　　　測定対象物質グルコース第４
シダービ　　　グルコースアシノ酸オキシダーゼ　　　
　Ｌ−アミノ酸ピルビン酸Δ：１．シダーＬ　　　ピル
ビン酸乳酸オキシダーＬ　　　　　　乳酸 キサンヂンオキシダーピ　　　ヒポキリ゛ンチン乳酸デ
ヒドロゲナーＬ　　　　乳酸 グルタミン酸　　　　　　　　し−グルタミンデヒドロ
ゲナーゼ アスパラギナーｔｆｆｉ　　　　　　Ｌ−アスパラギン
リパーピ　　　　　　　　　中性脂質 固定化対象徴生物　　　　測定対象物質重ｒｉｃｈｏｓ
ｐｏｒｏｎ　　ｃｕｔａｎｅｕｍ　　　　　　Ｂ　ＯＤ
Ｔ　ｒ、　　　　　ｂｌ’ａｓｓｉｃａｅ　　　エタノ
ール〃　　　　　　　酢酸 Ｅｓｃｈｅｒｉｃ旧ａｃｏｌｉ　　　　　　Ｌ−グルタ
ミン酸本発明の膜に使用されるセルロース性物質は幅ク
ロフィブリルからなっている。

このセルロース性物質はセルラーゼによって容易に分解
され、グルコースを生成する。すなわち、本セルロース
性物質の０．１％（Ｗ／Ｖ）懸濁液にセルラーゼ（ＥＣ
Ｕ、２，１．４　）　　（大野製薬製〉を０．５％（Ｗ
／Ｖ）になるように溶かし、０．１Ｍ酢酸緩衝液中で３
０℃で２４時間反応させた。その結果、本物質の一部が
分解されることが観察され、上澄液をペーパークロマト
グラフィーで展開したところセロオリゴ糖及びグルコー
スが検出された。さらに、グルコース以外の６炭糖も生
伍検出された。

すなわち、本発明のセルロース性物質はセルロース及び
セルロースを主鎖としだへテロ多糖を含むもの及びβ−
１，３，β−１，２等のグルカンを含むものである。ペ
テロ多糖の場合のセルロース以外の構成成分はマンノー
ス、フラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビ
ノース、ラムノース、グルクロン酸等の六炭糖、五炭糖
及び有殿酸等である。なお、これ等の多糖が単一物質で
ある場合もあるし、２種以上の多糖が水素結合等により
混在していてもよい。

セルロース性物質は上記のようなものであればいかなる
ものであっても使用可能である。

このようなセルロース性物質を産生ずる微生物は特に限
定されないが、アセトバクター・アセチ・サブスピーシ
ス◆キシリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉ　
５ｕｂｓｐ、　ｘｙｌｉｎｕｍ　）ＡＴＣＣ１０８２１
あるいは同バストウリアン（Ａ、ｐａＳｔｅｌＪｒｉａ
ｎ）　、同ランセンス（Ａ、　ｒａｎｃｅｎｓ）、サル
シナ・ベン］〜リクリ（Ｓａｒｃｉｎａｖｅｎｔｒｉｃ
ｕｌｉ）　、バタテリウム・キジロイデス（Ｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　ｘｙｌｏｉｄｅｓ）、シュードモナス属細菌
、アグロバタテリウム属細菌等でセルロース性物質を産
生ずるものを利用することができる。

これらの微生物を培養してセルロース性物質を生成蓄積
させる方法は細菌を培養する一般的方法に従えばよい。

すなわら、炭素源、窒素源、無敗塩類、その他必要に応
じてアミノ酸、ビタミン等のｊ′ｉ殿微■栄養素を含０
づ゛る通常の栄養培地に微生物を接種し、静置又はゆる
やかに通気撹拌を行なう。炭素源としては、グルコース
、シュクロース、マルトース、澱粉加水分解物、糖蜜等
が利用されるが、エタノール、酢酸、クエン酸等も単独
あるいは上記の糖と併用して利用することができる。窒
素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、
リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素
、ペプトン等の有機おるいは無機の窒素源が利用される
。、無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カ
ルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が利用される。有機微
量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸
さらにはこれらの栄養素を含むペプトン、カザミノ酸、
酵母エキス、大豆蛋白加水分解物等が利用され、生育に
アミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を用いる場合に
は要求される栄養素をざらに補添する必要がある。

培養条件も通常でよく、ｐｌ＋を５ないし９そして温度
を２０ないし４０’Ｃに制御しつつ１ないし３０日間培
養すれば表層にセルロース性物質がゲル状に蓄積される
。

このゲルを取り出して必要により水洗いする。

この水洗水には必要に応じて殺菌剤、前処理剤などの薬
剤を添加することができる。

セルロース性物質は力学的強度を高めるうえで一旦離解
することが好ましい。離解は機械的な剪断力を利用して
行なえばよく、例えば回転式の離解機あるいはミキサー
等で容易に離解できる。

本発明の固定化酵素薄膜を作製する方法は次の通りであ
る。酵素の固定化担体として重量濃度１〜２０％程度の
光硬化性ポリビニルアルコール水溶液又は水懸濁液を使
用する。

このような固定化担体に固定化しようとする酵素又は微
生物を添加しさらに微生物の産生するセルロース性物質
の離解物を添加しく（分混合づる。

酵素又は微生物及びセルロース性物質の添加量は乾燥重
量基準で固定化担体に対してそれぞれ１０〜１００％、
及び５〜１０％程度とする。この混合物をガラス板又は
テフロン板上に移し厚さ０．１〜１ｍｍ程度に形成しで
、風乾覆る。風乾）品磨は酵素の失活が起きないように
４°Ｃ程度で行ないかつファン等を利用して水分の蒸発
を促進させる。微生物の産生ずるセルロース性物質を添
加しない場合は、この風乾の過程で酵素が凝集する場合
が多く、これによって固定化酵素膜中の酵素の均一性が
失われる。微生物の産生ずるセルロース性物質を加える
と酵素は膜内に均一に分散したまま乾燥され、膜厚１０
〜２００）１ｍ程度の薄膜となる。この膜を水に入れた
とき膨潤することを防上するため、光を照射して光硬化
性樹脂に架橋反応を起こさせる。その後乾燥することに
よって水に浸しても膨潤せずかつ膜内の酵素のもれを起
きない固定化八！累薄膜となる。

次にセルロース性物質の添加量と膜の状態との関係を測
定した結果を示づ。

実施例１で得られたセルロース性物質を乾燥重量で０．
５％の濃度に懸濁し、やはり実施例１の光硬化性樹脂１
０重足％溶液と、セルロース性物質／光硬化性樹脂の乾
燥重量比で０％、５％、１０％、２０％になるようにそ
れぞれ混合した。各混合物１ｍｌを３．３Ｘ　３．３．
；（４の面積に展開して１日風乾したところ膜厚が５０
〜１００ハｍの乾燥物が１ｑられた。

これを１時間光照射して硬化させ、評価した。

評価は乾燥状態と、湿潤状態（イオン交換水中１時間放
置）とで膜の強さ、扱いやすさから総合的に行なった。

乾燥重量比　　　乾燥状態　　　　湿ｉＩ■状態（問題
点）　　　　（問題点） ０％　　　へ（膜と膜とが　×（破れやすいくっつき易
い）　伸縮性がある） １　５％　　　Ｑ　　　　　　　０ １０％　　　○　　　　　　　○ ２０％　　△（パリパリで　○ 破れやすい） 以上の実験結果から微生物セルロースを乾燥重量比で５
〜１０％添加することによって光硬化性樹脂膜の欠点を
改良することができることが分った。

［作用］ セルロース性物質を添加量ることによって固定化酵素薄
膜に十分な物理強度を（＝Ｊ与づるとともに粘着性のな
い膜を（ｑることかできる。また、酵素及び微生物を均
一に分散ざぜるという作用も有する。

［実施例］ 実施例１ シュクロース５（１／ｄ文、酵母エキス（旧ｆｃｏ）０
．５（Ｊ／ｄ１、硫安０．５ｃ＋／ｄｊ！　、にｔｌｚ
ＰＯ４０，３（！／ｄＪ　、　Ｍｇ５Ｏ＋・７１１ｚ０
０．０５ｇ／ｄｉ（ｐ１１５．０）の組成の培地５０１
７１Ｉ２を２００　ｄ容三角フラスコに張込み、１２０
’Ｃで２０分間蒸気殺菌した。これに酵母エキス０．５
ｇ／＋Ｊ又、ペプトン０．３（１／ｄＱ、マンニトール
２．５ｇ／ｄ又、（ｐＨ６、ｏ）の組成の試験管斜面寒
天培地Ｃ生育させた（３０°Ｃ１３日間）アｔ？１〜バ
クター、アセチ、（ナブスピーシス、キシリナムＡＴＣ
Ｃ１０８２１を１白金耳づつ接種し３０℃で培養した。

３０日俊、培養液の上層に白色のセルロース性物質を含
むゲル状の膜が形成された。この膜を分散して水洗後ミ
キサーで離解した。

５００　ｍｌの３つロフラスコに水ｉｏｏ　ｍｌ及びポ
リビニルアルコール（日本合成化学工業■製、ゴーレノ
ールＧｌ＋−１７＞　２０ＣＩを入れ、瀉溶中で９０’
Ｃに保って撹拌溶解させた。

ポリビニルアルコールが完全に溶解後４０℃まで放冷し
、暗所に移して１−メチル−４（２−（Ｐ−ポルミルフ
ェニル）エチニル）ピリジニウムメト硫酸２．９ｇを添
加し撹拌した。りん酸溶液でｐｌ＋２．０に調整後１２
時間室温にて撹拌し反応させた。

この反応液に、２ノ　のアセトンを室温下で撹拌しつつ
滴下すると、生成した光硬化性樹脂が固結してきた。こ
れを取り出しアセトン２００　ｄで洗浄後粉砕してメタ
ノール２００ｍ１で３回洗浄しアンモラア水で中和後風
乾した。このようにして１ｑた光硬化性樹脂をイΔン交
換水に濃度１０Ｗ（％になるように溶解した。

グルコースオキシタービｉｏｏ　ｍｇにｐＨ６，０のリ
ン酸緩衝液０．２ｍｌ及び上記の１０重量％光硬化性樹
脂水溶液（ｐＨ６、０）２．０　ｍｌを添加して混合し
た。この液に０．５重量％セルロース性物貿−水懸濁液
をセルロース性物質／光硬化性樹脂の乾燥重量比で５％
になるように混合し、厚さ１　ｍｍに展開した。これを
１目１虱乾し、１１１．’ｉ間光を照射しζ固定化酵素
薄膜を１ｑた。比較のために、セルロース性物質を加え
ないほかは同様にして製膜を行なった。

このようにして１ｑられた膜の物理的性質を次に示す。

平均厚ざ　破断応力　弾性率 （、ａｍ）　　　　（）ｌＰａ）　　　（ｅＰａ）本発
明品（八）　　　１０５　　　３４．０　　　１．６４
比較例品（Ｂ）　　　　９５　　　１５．３　　　０．
８０性状を次に示す。

本発明品（Ａ） ■引っ張ると比較例品に比べ弾性変形せず、又簡単に切
れない。

■酵素の分散性が良く均質である。

■粘着性なく、丸まってしまうことがなく形状は平面状
の形を保つ。

比較例品（Ｂ） ■引っ張るとゴムのように伸びて切れてしまう。

■酵素がところどころ凝集し、その部分は強度不足で固
定化担体がぬＧＪ　Ｔ穴があきやすい。

■粘着性が強い。丸まって自己接着しやプい。

次に、このＡ、Ｂの膜をそれぞれ１　ｃｍ角の大きさに
きり、隔膜式酵素電極面に密着しナイロンネットで覆っ
て酵素電極を作製した。その際Ｂの膜は丸まって自己接
着しないよう上からガラス板等で押えてＪ′３き、必要
に応じてガラス板をのぞいて膜を取り出し、所定のサイ
ズに切断した後電極面に素早く装着するなど一連の注意
深い作業を必要とした。この点Ａの膜は強度も大きく粘
着性もないので特別の注意が不ＨＣ作業性は極めて良好
であった。

このようにして作製した酵素電極の試験を行なった。電
極をフローセルに装着して温度３５℃に保持し、空気飽
和したリン緩衝液（０，１ト１．　ｐｌＩ＋３．　ｏ）
を流ｍ　２　ｍｌ／ｍｉｎで送りこの中にグルコース標
準液を３０秒間流ｆｆｉ　１　ｄ／ｍｉｎで送って酵素
電極の応答を記録させた。ざらに長時間の耐久性試験を
行なう場合は上記のグルコース標準液の注入を５分間隔
で繰返し電極の応答を調べた。グルコースを注入づると
グルコースオキシダーゼの作用によって膜中でグルコー
スは醇化され膜中のＶｆ−素が減るので電（つ４の指示
値がグルコース濃度に応じて減少した。

上記の試験の結果、酵素電極の反応特性はＡ。

Ｂいずれの膜を用いたものも大差なく、測定範囲Ｏ〜５
００　ｍｙ／ｉ７．９０％反不反応時間３０秒でおった
。

長期耐久性についても１４日間の連続試験で応答の劣化
は認められず、実用上充分な性能を示した。

この長期耐久性試験の結果から、光硬化性樹脂にセルロ
ース性物質を加えることによって固定化酵素膜からＵ素
が漏出するおそれがないものと推察される。

一方、セルロース性物質を加えない固定化酵素膜は、品
質むらがあり上述のにうに良好なものが作製できず使用
中に固定化酵素膜の不均一性と強度不足のため膜が破損
し、応答が出なくなるものｂａう　つ　ｌこ。

実施例２ グルタミン酸脱炭酸酵素活性を持つ微生物Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ８７３９の乾燥菌体１
００ｍｙを実施例１に示した方法で合成した１０重但％
光硬化性樹脂水溶液２．０ｍｊに加えた乙のに５車量％
レルロース性物質の水溶液０．７ｒｎ１を加えて混合し
た。

これをカラス板上に厚さ１　ｍｍに展開して４°Ｃで一
膠夜通風下で乾燥させた。なお、これまでの操作は暗所
で行なった。次に、この膜に蛍光灯（２０ｗ）で各面３
０分間づつ照則し光硬化性樹脂を架（ｎ化させた。この
膜を’ＩｃｍＸ１ｃｍに切り取り炭酸ガス電極に密着さ
けてグルタミン酸測定用の微生物電極を作製した。この
電極を）［１−Ｉ？ルに装着し、ピリジン−］ＩＣ１緩
衝液（ｐｌ＋４．４）を流＠　２ｍ／ｍｉｎで流通させ
同口）にｊｌＩ２ガスを５００ｍ１／ｍｉｎで吹き込ｌ
νだ。このような状ｆ、３℃フローセル中にグルタミン
酸標準液を注入づると膜中のＥ、ｃｏｌｉがグルタミン
Ｍ　ＩＢ２炭酸酵素活性をもっているのでグルタミン酸
から炭酸ガスが発生し炭酸ガス電極が試料液のグルタミ
ンｒＰｉｉ１１度に比例した応答を示した。この微生物
電極は３週間以上にわたって安定な応答を示し、実用上
十分な性能を持つことがわかった。前述と同様に固定化
微生物膜は強度大きく、均一性がおりかつ非粘着性であ
るためセンサー組立保存などの際の作業性が優れている
ことがわかった。

［発明の効果］ 本発明の固定化酵素薄膜は高強度でかつ、粘着性がない
。微生物の産生するセルロース性物質を加えない場合は
（ｑられる膜の強度が不足しかつ、酵素の分散が不均一
で酵素が凝集したところは固定化が不十分でもれがおき
やすい。また、膜が相互に粘着する。

本発明の固定化酵素″ＩＩＩ！では上記のような欠点が
一挙に解決されており、従って本発明による固定化酵素
薄膜を電極面に装着して酵素電極を作製する際、破損し
たりねじれて自己粘着するおそれもないのでその取り扱
いが容易であると同時に、耐久性がよくかつ、品質のバ
ラツキの少ない酵素電極を作製することができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ポリビニルアルコールを担体として酵素又は微生
   物を固定化した薄膜において、微生物の産生するセルロ
   ース性物質を含有せしめたことを特徴とする固定化酵素
   薄膜
2. （２）ポリビニルアルコールが光硬化性樹脂である特許
   請求の範囲第１項記載の固定化酵素薄膜