JPH0419503B2 - - Google Patents

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JPH0419503B2
JPH0419503B2 JP61149753A JP14975386A JPH0419503B2 JP H0419503 B2 JPH0419503 B2 JP H0419503B2 JP 61149753 A JP61149753 A JP 61149753A JP 14975386 A JP14975386 A JP 14975386A JP H0419503 B2 JPH0419503 B2 JP H0419503B2
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    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/58Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving urea or urease
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/004Enzyme electrodes mediator-assisted
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 (1) 技術分野 本発明は酵素センサ、特に酵素の分子識別機能
に基づいて、ポテンシヨメトリツク応答により所
定の生体内の基質の濃度を測定する酵素電極を有
する酵素センサに関する。
(2) 先行技術およびその問題点 酵素反応を利用する酵素センサとしては、グル
コースセンサ、尿素センサなどが知られている。
その中で、グルコースセンサでは、次の酵素反応
を利用する。
グルコース+H2O+O2 酵素(グルコース・オキシダーゼ) →グルコン酸+H2O2 従来のグルコースセンサとしては、酵素センサ
を用いて生体内のO2の消費速度または生体内の
H2O2の生成速度を測定して、基質であるグルコ
ースの濃度を測定する原理のセンサが用いられて
きた。しかし、これらの測定は電流値により測定
を行うため、生体に電流を流す必要がある。
一方、グルコン酸の生成による水素イオン濃度
の変化量をPHセンサで検出し、グルコース濃度を
測定する方法があり、ガラス電極PHセンサやイオ
ン選択性FETセンサを利用したものが報告され
ている。
しかし、ガラス電極を用いる場合には、電極膜
の抵抗が非常に高いため、酵素層の被着による応
答が非常に不安定となる。また形状が大きいなど
の欠点があつた。イオン選択性FETセンサを用
いると小型化が可能ではあるが、酵素層の被着性
が問題となつている。また、大型の製造装置を必
要とするなどのため作製が容易ではない。他の酵
素センサにおいても同様の問題があつた。
発明の目的 本発明の目的は、上記先行技術の問題点を解決
した電位法(ポテンシヨメトリツク)で生体内の
基質濃度を測定する固体型の酵素電極を有する酵
素センサを提供することにある。
又、作成が容易で、酵素層の被着性が良く、耐
久性の良い、小型の酵素電極を有する酵素センサ
を提供することにある。
発明の構成 前記目的を達成するために、本発明の酵素セン
サは、次の構成から成る。
酵素の分子識別機能に基づいて所定の生体内の
基質の濃度を電位応答で測定する酵素電極を有す
る酵素センサであつて、 前記酵素電極が、グラフアイト構造の炭素を含
んで構成される導電性基体と、該導電性基体の表
面を覆い、水素イオンと反応するが酵素とは反応
及び結合しない反応基を有する酸化還元機能物質
を含み、水素イオン濃度に感応して電位を発現す
る酸化還元機能層と、該酸化還元機能層の表面を
覆い、前記生体内の基質の酸化環元反応を促して
該水素イオン濃度に変化を与える物質を生成する
酵素を含む酵素層とから成ることを特徴とする。
又、酵素の分子識別機能に基づいて所定の生体
内の基質の濃度を電位応答で測定する酵素電極を
有する酵素センサであつて、 前記酵素電極が、グラフアイト構造の炭素を含
んで構成される導電性基体と、該導電性基体の表
面を覆い、水素イオンと反応するが酵素とは反応
及び結合をしない反応基を有する酸化還元機能物
質を含み、水素イオン濃度に感応して電位を発現
する酸化還元機能層と、該酸化還元機能層の表面
を覆い、所定のイオンに感応して該水素イオン濃
度に変化を与えるイオン感応層と、該イオン感応
層の表面を覆い、前記前体内の基質の酸化還元反
応を促して前記所定のイオン濃度に変化を与える
物質を生成する酵素を含む酵素層とから成ること
を特徴とする。
本発明の好ましい態様を以下に述べる。
1 酵素はグルコースオキシダーゼであつて、グ
ルコノラクトンの生成に基づいてグルコースの
濃度を測定する。
2 酵素はウリカーゼであつて、アラトインの生
成に基づいて尿酸の濃度を測定する。
3 酵素はコレステロールオキシダーゼであつ
て、コレステロールの濃度を測定する。
4 酵素は架橋剤により架橋構造にされている。
5 酸化還元機能層はキノン−ハイドロキノン型
の酸化還元機能を有する物質のグループから選
ばれる。
6 酸化還元機能層はアミンーキノイド型の酸化
還元機能を有する物質のグループから選ばれ
る。
7 酸化還元機能層はポリ(ピロール)、ポリ
(チエニレン)の酸化還元機能を有する物質の
グループから選ばれる。
発明の具体的説明 酵素センサはバイオセンサのはしりで、トラン
スデユーサ部(信号変換部位)が電極であるた
め、酵素電極(enzyme electrode)の呼称でな
じまれている。レセプタ部(分子識別部位)は酵
素層であり、トランスデユーサ部には各種層電極
が用いられている。主な酵素センサの基本構成を
第6図に示す。酵素層で誘起される物質変化は、
O2,H2O2,H+,NH3,CO2などであり、これら
の物質はトランスデユーサ部のガス透過層などに
達し、それぞれ電気化学的に電気信号に変換され
る。
たとえば、グルコース酵素センサの場合には、
グルコースオキシダーゼ(GOD)を固定化した
酵素層がレセプタ部に用いられる。レセプタ部が
グルコースを分子識別すると、O2が減少するか、
あるいはH2O2が増大する。
グルコース+O2+H2O →グルコン酸+H2O2 すなわち酸素電極あるいは過酸化水素電極の酸
素透過層あるいは過酸化水素透過層に密着して、
GOD層が装着されれば、グルコース酵素センサ
ができる。
しかし、先行技術の欄でも述べた如く、電流値
による測定であつたり、ガラス電極の使用により
小型化に限界がある等の不都合があつた。
そこで、本実施例においては、前記グルコース
の酸化反応が次の2つの反応、 (1) (GOD)px+グルコース →グルコノラクトン(H+)+(GOD)RED (2) (GOD)Red+O2 →(GOD)px+H2O2(速い反応) に分解されることを注目して、(1)の反応における
グルコノラクトン(H+)を固体型PH電極又は固
体型電極等で測定する。
(1)と(2)をまとめると、 で示される。ここで、(GOD)pxは酸化状態のグル
コースオキシダーゼ、(GOD)Redは還元状態のグ
ルコースオキシダーゼを示している。
以下に示す3種の酵素センサを作製した。
<参考例> 参考例の酵素センサの構成模式図を第1図aに
示す。
(1) 導電性基体 ベーサル・プレーン・ピロテイツク・グラフア
イト1(直径1.0mmφ×長さ3.5mm、以下、BPG1と
称す)の底面に導電性接着剤2(アミコン社製、
C−850−6)を用いてリード線3(銅線ZUE−
CM5W、トウトク(株)社製)を接続したものの周
囲をテフロン7(タフコートエナメルR、ダイキ
ン工業(株)製)で絶縁してBPG電極1を作製した。
(2) 酵素層 作製したBPG電極1の面上に以下に示す操作
でグルコースオキシダーゼ層を約1mmの厚さに被
着した。該層の被着は、グルタルアルデヒドを架
橋剤とする架橋法によつた。この架橋構造によ
り、被検液中にグルコースオキシダーゼが溶出す
るのを防止できる。
(A液)PH0.40リン酸塩緩衝液に15重量パーゼン
トとなる牛血漿アルブミンを溶かし、
さらにその溶液5mlにグルコースオキ
シダーゼ0.5(g)を溶かす。
(B液)25パーセントグルタルアルデヒド水溶
液。
(C液)10パーセントグリシン水溶液 BPG電極1を上記A液に浸漬し、約1分間乾
燥させてから、B液に浸し、さらに1分間乾燥す
るという操作を層厚が約1mmとなるまで繰り返
し、最後にC液に1分間浸すとにより未反応のグ
ルコースオキシダーゼを取り除いてグルコースオ
キシダーゼ層4の被着を完成した。
実施例 1 本実施例の酵素センサの構成模式図を第1図b
に示す。
(1) 導電性基体 参考例と同様のBPG電極1を作製した。
(2) 酸化還元機能層 作製したBPG電極1を作用極、白金セルを対
極、銀/塩化銀電極を基準極とする3電極セルを
用いて、以下の条件で電解重合を行ない、BPG
電極表面に酸化還元機能層5を直接被着した。
<電解液組成> 2,6−ジメチルフエノール …0.5M 過塩素酸ナトリウム …0.2M アセトニトリル …溶媒 <電解重合条件> 0〜±1.5V(vs.Ag/AgCl)の間で3回電位掃
引(掃引速度50mV/sec)した後、+1.5Vで10分
間定電位電解した。重合は−20℃付近で行なつ
た。
(3) 酵素層 作製した電極の酸化還元機能層5の面上に参考
例と同様な操作でグルコースオキシダーゼ層4を
被着した。
実施例 2 本実施例の酵素センサの構成模式図を第1図c
に示す。
(1) 導電性基体 参考例と同様のBPG電極1を作製した。
(2) 酸化還元機能層 実施例1と同様な方法でBPG電極1の面上に
酸化還元機能層5を被着した。
(3) イオン感応層 作製した酸化還元機能層5の面上に、以下に示
す組成の水素イオンキヤリア層6を被着した。該
水素イオンキヤリア層6の被着は、以下に示すテ
トラヒドロフラン混合液に酸化還元機能層5を被
着したBPG電極1を浸漬・乾燥する操作を10回
繰り返すことにより行なつた。
<水素イオンキヤリア組成物> セバシン酸ジオクチル(DOS)
…65.2重量パーセント ポリ塩化ビニル(PVC、Po=1050)
…32.7重量パーセント トリドデシルアミンテトラキス (p−クロロフエニル) 4.0重量パーゼント ホウ酸カリウム 0.6重量パーセント (4) 酵素層 水素イオンキヤリア層6の面上に、参考例と同
様の操作で、グルコースオキシダーゼ層4を被着
した。
実施例 1 第2図に示すように、参考例及び実施例1,2
で作製した酵素センサ20を用いて基準電極(飽
和ナトリウムカロメロ電極)21との間の電位差
を測定する方法より、被検液22のグルコー濃度
のステツプ変化に対するその応答性を調べた。
尚、被検液22の温度は37℃、測定環境温度とし
て室温21℃〜23℃に設定した。
<試験方法> 被検液22のPHはリン酸塩緩衝溶液で6.2に調
整した。37℃のグルコース水溶液に、やはり37℃
の高濃度のグルコース水溶液を滴下して濃度を変
え、その時の基準電極21に対する酵素センサ2
0の電位を測定した。尚、グルコースの濃度はモ
ル濃度で、被溶液1中のグルコースのモル数で
示す。又、滴下後10分経つた安定時間の酵素セン
サの電位値を求めた。
これらの測定結果を第3図〜第5図に示す。こ
のように、グルコースの濃度の対数と、酵素セン
サの電位応答の間には、良い直線関係が見られ
た。
それらの近似式は以下のようになつた。
参考例で作製した酵素センサ E=191.9+74.8log[Glucose](M/l) (第3図より) 実施例1で作製した酵素センサ E=190.7+38.7log[Glucose](M/l) (第4図より) 実施例2で作製した酵素センサ E=176.8+27.6log[Glucose](M/l) (第5図より) 尚、本実施例ではグルコースオキシダーゼ層を
被着することにより、グルコースの濃度を測定し
たが、ウレアーゼ層により尿素濃度を、ウリカー
ゼ層により尿酸濃度を、又コレステロールオキシ
ダーゼ層によりコレステロール濃度を等、他の酵
素による酵素センサについても同様の結果が得ら
れた。又、本発明は、生体内の基質に所定の反応
を起させる酵素と、発生するイオンによるイオン
濃度の変化を測定する内部液室を有しない固体型
イオンセンサとを構成要素としており、実施例で
述べた水素イオンの測定に限らず他のイオンを測
定する固体型イオンセンサで構成されても良い。
更に、本発明の技術思想は、微生物センサ、免疫
センサ等の他のバイオセンサにも拡張できる。
発明の具体的効果 本発明により、酵素反応で生成する物質による
水素イオン濃度の変化を測定することによつて、
電位法(ポテンシヨメトリツク)で生体内の基質
濃度を測定する固体型の酵素電極を有する酵素セ
ンサを提供した。又、構造および構成が簡単なた
め作成が容易で、酵素層の被着性が良く、安定か
つ耐久性の良い、更に小型化が容易な酵素電極を
有する酵素センサを提供した。このため、カテー
テル等と併せて用いることにより、生体中での測
定が可能である。又、濃度の対数と電位値との直
線性の範囲が広く、応答が安定している酵素電極
を有する酵素センサを提供した。
【図面の簡単な説明】
第1図aは参考例の酵素センサの構成模式図、
第1図bは実施例1の酵素センサの構成模式図、
第1図cは実施例の酵素センサの構成模式図、第
2図は本実施例の酵素センサによる測定回路例
図、第3図は参考例の酵素センサによる測定結果
を示す図、第4図は実施例1の酵素センサによる
測定結果を示す図、第5図は実施例2の酵素セン
サによる測定結果を示す図、第6図は従来の酵素
センサの説明図である。 図中、1……BPG、2……導電性接着剤、3
……リード線、4……グルコースオキシダーゼ
層、5……酸化還元機能層、6……水素イオンキ
ヤリア層、7……テフロンである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 酵素の分子識別機能に基づいて所定の生体内
    の基質の濃度を電位応答で測定する酵素電極を有
    する酵素センサであつて、 前記酵素電極が、 グラフアイト構造の炭素を含んで構成される導
    電性基体と、 該導電性基体の表面を覆い、水素イオンと反応
    するが酵素とは反応及び結合をしない反応基を有
    する酸化還元機能物質を含み、水素イオン濃度に
    感応して電位を発現する酸化還元機能層と、 該酸化還元機能層の表面を覆い、前記生体内の
    基質の酸化還元反応を促して該水素イオン濃度に
    変化を与える物質を生成する酵素を含む酵素層と
    から成ることを特徴とする酵素センサ。 2 酵素はグルコースオキシダーゼであつて、グ
    ルコノラクトンの生成に基づいてグルコースの濃
    度を測定することを特徴とする特許請求の範囲第
    1項記載の酵素センサ。 3 酵素はウリカーゼであつて、アラントインの
    生成に基づいて尿酸の濃度を測定することを特徴
    とする特許請求の範囲第1項記載の酵素センサ。 4 酵素はコレステロールオキシダーゼであつ
    て、コレステロールの濃度を測定することを特徴
    とする特許請求の範囲第1項記載の酵素センサ。 5 酵素は架橋剤より架橋構造にされていること
    を特徴とする特許請求の範囲第1項記載の酵素セ
    ンサ。 6 酸化還元機能層はキノン−ハイドロキノン型
    の酸化還元機能を有する物質のグループから選ば
    れることを特徴とする特許請求の範囲第1項記載
    の酵素センサ。 7 酸化還元機能層はアミン−キノイド型の酸化
    還元機能を有する物質のグループから選ばれるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の酵素
    センサ。 8 酸化還元機能層はポリ(ピロール)、ポリ
    (チエニレン)の酸化還元機能を有する物質のグ
    ループから選ばれることを特徴とする特許請求の
    範囲第1項記載の酵素センサ。 9 酵素の分子識別機能に基づいて所定の生体内
    の基質の濃度を電位応答で測定する酵素電極を有
    する酵素センサであつて、 前記酵素電極が、 グラフアイト構造の炭素を含んで構成される導
    電性基体と、 該導電性基体の表面を覆い、水素イオンと反応
    するが酵素とは反応及び結合をしない反応基を有
    する酸化還元機能物質を含み、水素イオン濃度に
    感応して電位を発現する酸化還元機能層と、 該酸化還元機能層の表面を覆い、所定のイオン
    に感応して該水素イオン濃度に変化を与えるイオ
    ン感応層と、 該イオン感応層の表面を覆い、前記生体内の基
    質の酸化還元反応を促して前記所定のイオン濃度
    に変化を与える物質を生成する酵素を含む酵素層
    とから成ることを特徴とする酵素センサ。 10 酵素はグルコースオキシダーゼであつて、
    グルコノラクトンの生成に基づいてグルコースの
    濃度を測定することを特徴とする特許請求の範囲
    第9項記載の酵素センサ。 11 酵素はウリカーゼであつて、アラントイン
    の生成に基づいて尿酸の濃度を測定することを特
    徴とする特許請求の範囲第9項記載の酵素セン
    サ。 12 酵素はコレステロールオキシダーゼであつ
    て、コレステロールの濃度を測定することを特徴
    とする特許請求の範囲第9項記載の酵素センサ。 13 酵素は架橋剤により架橋構造にされている
    ことを特徴とする特許請求の範囲第9項記載の酵
    素センサ。 14 酸化還元機能層はキノンーハイドロキノン
    型の酸化還元機能を有する物質のグループから選
    ばれることを特徴とする特許請求の範囲第9項記
    載の酵素センサ。 15 酸化還元機能層はアミンーキノイド型の酸
    化還元機能を有する物質のグループから選ばれる
    ことを特徴とする特許請求の範囲第9項記載の酵
    素センサ。 16 酸化還元機能層はポリ(ピロール)、ポリ
    (チエニレン)の酸化元機能を有する物質のグル
    ープから選ばれることを特徴とする特許請求の範
    囲第9項記載の酵素センサ。
JP61149753A 1986-06-27 1986-06-27 酵素センサ Granted JPS636451A (ja)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
JP61149753A JPS636451A (ja) 1986-06-27 1986-06-27 酵素センサ
KR1019870006187A KR890004367B1 (ko) 1986-06-27 1987-06-18 효소센서
US07/065,908 US4927516A (en) 1986-06-27 1987-06-24 Enzyme sensor
DK328487A DK328487A (da) 1986-06-27 1987-06-26 Enzymsensor til potentiometrisk eller amperometrisk maaling af substratkoncentrationer
EP19870401487 EP0251915A3 (en) 1986-06-27 1987-06-26 Enzyme sensor

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JPS636451A JPS636451A (ja) 1988-01-12
JPH0419503B2 true JPH0419503B2 (ja) 1992-03-30

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