JP3539021B2 - バイオセンサ - Google Patents

バイオセンサ

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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、バイオセンサに関
する。更に詳しくは、直線検量性および選択性にすぐれ
たバイオセンサに関する。
【0002】
【従来の技術】従来のグルコースバイオセンサを用いて
のグルコース濃度の測定方法では、測定試料を電極表面
に滴下もしくは注入した後一定電位を電極に与え、一定
時間後の電流値を測定するポテンシャルステップ法がと
られており、試料溶液が希釈かつ連続供給されないた
め、酵素反応に必要な溶存酸素量が不足し、検量範囲が
狭いという欠点がみられる。また、アスコルビン酸等の
他の酸化還元物質が共存する場合には、一様に電気化学
的応答が示されるため、選択性の点では全く不満足な結
果しか示していない。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、絶縁
性基板上に作用極および対極の少なくとも2電極を設
け、作用極上に酸化還元酵素を固定化せしめたバイオセ
ンサであって、直線検量性および共存する他の酸化還元
物質多孔質に対する選択性の点ですぐれたものを提供す
ることにある。
【0004】
【課題を解決するための手段】かかる本発明の目的は、
絶縁性基板上に作用極および対極の少なくとも2電極を
設け、該作用極上にアルブミン-ジアルデヒド化合物架
橋物層および (1)酸化還元酵素 - 電子伝達体混合物層 または(2) 酸化還元酵素-アルブミン-電子伝達体混合物層 を順次形成させたバイオセンサによって達成される。
【0005】
【発明の実施の形態】セラミックス、ガラス、プラスチ
ック、紙、生分解性材料(例えば、微生物生産ポリエス
テル等)などの絶縁性基板上には、作用極および対極あ
るいは作用極、対極および参照極が設けられる。作用
極、対極および参照極リードは、スクリーン印刷法、蒸
着法、スパッタリング法などによって白金、金、カーボ
ン等から形成され、参照極は参照極リード上にスクリー
ン印刷法、蒸着法、スパッタリング法などによって一旦
銀電極を形成させた後、定電流電解する方法あるいは塩
化第2鉄水溶液中に浸漬する方法、更にはスクリーン印
刷法によって塩化銀を塗布、積層させる方法などによっ
て形成される。その後、各電極の中央部分が樹脂製絶縁
膜などによって被覆される。なお、参照極を設けない2
電極構造のものとすることもできる。
【0006】かかる2電極構造または3電極構造の作用
極上へは、アルブミン-ジアルデヒド化合物架橋物層が
まず形成される。架橋物層の形成は、約5〜50μg、好ま
しくは約10〜30μgの牛血清アルブミンを1mlの蒸留水
に溶解させた水溶液にグルタルアルデヒド、ジアルデヒ
ドでん粉等のジアルデヒド化合物を最終濃度が約0.001
〜0.4重量%、好ましくは約0.1〜0.3重量%になるような
量で水溶液として添加し、このようにして調製された混
合液を作用極上に適当量(約0.1〜10μl、好ましくは約1
〜3μl)滴下した後、ジアルデヒド化合物水溶液の飽和
蒸気圧下、約2〜25℃の条件下に約0.01〜5時間、好まし
くは約0.5〜3時間程度放置し、更に約10〜45℃、好まし
くは約30〜45℃の恒温雰囲気中に約1〜60分間程度放置
し、アルブミンとジアルデヒド化合物との間の架橋反応
を完結させることにより行われる。このようなアルブミ
ン-ジアルデヒド化合物架橋物層の形成は、測定サンプ
ル中に共存する他の酸化還元物質に対する選択性を大幅
に改善させる。
【0007】アルブミン-ジアルデヒド化合物架橋物層
上には、前記(1)〜(2)の各層のいずれかが形成される。
【0008】酸化還元酵素- 電子伝達体混合物層(1)は、
グルコースオキシダーゼ(GOD)によって代表される酸化
還元酵素、例えば165800単位/gのGODの場合その約1〜50
mg、好ましくは約1〜20mgとフェリシアン化カリウム、
パラベンゾキノン等の電子伝達体、例えばフェリシアン
化カリウムにあっては約 1 100mg 、好ましくは約 40 60
mg 、パラベンゾキノンにあっては約 1 200mg 、好ましく
は約 100 200mgを蒸留水1mlに溶解させ、その水溶液(G
OD水溶液)約0.5〜10μl、好ましくは約0.5〜2μlを滴下
法、スピンコート法などによって滴下し、室温で乾燥さ
せて、膜厚約0.05〜10μm、好ましくは約0.1〜2μmの層
を形成させることにより行われる。酸化還元酵素として
は、GOD以外にも乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシ
ダーゼ等が用いられる。
【0009】混合物層(2)の場合も、この場合と同様の
形成方法が行われ、ただしGOD- 電子伝達体混合物水溶液
中に更に牛血清アルブミン約 1 100mg 、好ましくは約 1
20mgが添加された水溶液が用いられる。
【0010】グルコースがGODの作用により酵素の存在
下で酸化されてグルコノラクトンを生成させ、そのとき
発生するH2O2を作用極上で酸化し、その際の酸化電流
値を測定することにより、グルコース濃度を間接的に求
める方法は周知である。しかしながら、測定液が水で希
釈されない原液サンプルの場合には、酸化反応が溶存酸
素濃度に律速されるため、グルコース濃度が約100mg/dl
程度迄しか直線検量範囲を示さないが、酸化還元酵素 (-
アルブミン混合物 ) を形成させた場合には、その直線
検量範囲を0〜250mg/dlに拡大できるもののそれ以上
の濃度では直線検量性がみられなくなる。
【0011】酸化還元酵素にさらに電子伝達体(- アルブ
ミン ) を混合して用いることにより、その選択性を良好
に維持しながら、直線検量範囲を0〜1000mg/dlまたはそ
れ以上に拡大すること可能となる
【0012】電子伝達体がフェリシアン化カリウムK3Fe
(CN)6の場合、グルコース等との反応は次のように進行
する。 この際発生したフェロシアンイオンは、作用極で酸化さ
れて酸化電流を生ずる。
【0013】また、電子伝達体としてフェリシアン化カ
リウムの代わりにパラベンゾキノンを用いた場合には、
GOD存在下でのグルコースとパラベンゾキノンとの反応
でヒドロキノンが生成し、この際生成したヒドロキノン
は作用極で酸化され、酸化電流を生ずるのでその値が測
定される。
【0014】従って、原液サンプル等の溶液中濃度が有
限である酸素の代わりに、電子伝達体をGOD等と共に用
いると、酸素の共存量とは関係なく、グルコース濃度な
どを正確にかつより広範囲に測定することができる。
【0015】
【発明の効果】作用極上にグルコースオキシダーゼによ
って代表される酸化還元酵素またはそれの混合物層を形
成させるに際し、予めアルブミン-ジアルデヒド化合物
架橋物層をその下層として形成させておき、さらに酸化
還元酵素を電子伝導体 ( およびアルブミン ) との混合物層
とすることにより、直線検量性にすぐれ、しかも測定サ
ンプル中に共存する他の酸化還元物質の影響を殆んど受
けることなく、即ち良好な選択性でグルコース等の濃度
を測定することができるので、このようなバイオセンサ
は原液サンプルが測定液とされる使い捨てバイオセンサ
として、家庭内健康診断(セルフケァ)、特に血糖、尿糖
の測定による糖尿病の自己管理、糖尿病の予防および早
期発見などに効果的に用いることができ、また食品製造
工程中のグルコース管理に用いられるなど、幅広い用途
を期待することができる。
【0016】
【実施例】次に、実施例について本発明を説明する。
【0017】実施例 ポリエチレンテレフタレートフィルム(厚さ0.25mm)上
に、スクリーン印刷法によって、いずれもカーボン製の
対極、作用極および参照極リードを作用極を中心とし
て、膜厚5μmで形成させた。次いで、参照極リード上
に、銀ペーストをスクリーン印刷法によって5μmの厚さ
で印刷し、焼成して銀電極とした。これらの各電極の中
央部分を厚さ15μmのポリエステル樹脂製絶縁膜で覆っ
た後、銀電極部分を0.1M塩酸中に浸漬し、0.6mA/cm2
電流密度で20分間の定電流電解を行い、その表面を塩化
銀化して、銀/塩化銀参照極を形成させた。この定電流
電解には、ポテンショガルバノスタット(北斗電工製HA5
01)が用いられた。
【0018】このような構成の各電極の内の作用極(面
積0.16cm2)上に、牛血清アルブミン(シグマ社製品A-600
3)20μgを蒸留水1mlに溶解させた水溶液および20重量%
グルタルアルデヒド水溶液10μlから調製した混合液の
2.5μlを滴下し、グルタルアルデヒド水溶液の飽和蒸気
下、4℃の条件下に2時間放置した後、40℃で30分間の架
橋処理が行われた。
【0019】このようにして形成された作用極上のアル
ブミン-グルタルアルデヒド架橋物層の上に、次のよう
な各層の形成が行われた。 A層:GOD(165800単位/g;以下同じものを使用)10mgを
蒸留水1mlに溶解させて調製した水溶液1.5μlを滴下
し、室温で乾燥させて形成 B層:GOD 10mgおよび牛血清アルブミン10mgを蒸留水1
mlに溶解させて調製した水溶液1.5μlを滴下し、室温で
乾燥させて形成 C層:GOD 10mgおよびフェリシアン化カリウム48mgを蒸
留水1mlに溶解させて調製した水溶液1.5μlを滴下し、
室温で乾燥させて形成 D層:GOD 10mgおよびパラベンゾキノン160mgを蒸留水
1mlに溶解させて調製した水溶液1.5μlを滴下し、室温
で乾燥させて形成 E層:GOD 10mg、牛血清アルブミン10mgおよびフェリシ
アン化カリウム48mgを蒸留水1mlに溶解させて調製した
水溶液1.5μlを滴下し、室温で乾燥させて形成 F層:GOD 10mg、牛血清アルブミン10mgおよびパラベン
ゾキノン160mgを蒸留水1mlに溶解させて調製した水溶
液1.5μlを滴下し、室温で乾燥させて形成
【0020】アルブミン-グルタルアルデヒド架橋物層
上にA〜F層を形成させたグルコースバイオセンサに、
所定濃度のグルコース水溶液40μlを滴下して5秒間反応
を進行させた後、0.6Vの電圧を印加し、印加20秒後の電
流値を測定した。測定には、ポテンショガルバノスタッ
ト(HA501)およびファンクションジェネレータ(北斗電工
製HB-104)が用いられた。
【0021】測定は、参照極を形成させたもの(3電極
構造)および形成させないもの(2電極構造)のそれぞれ
について行われ、次の表に示されるような出力結果(単
位:μA)を得た。これらの結果から、グルコース水溶液
濃度0〜250mg/dl(A〜B層形成)または0〜1000mg/dl(C
〜F層形成)の範囲での直線検量性が得られることが分
かる。なお、各センサは、1サンプル測定毎に使い捨て
とした。また、グルコース濃度100mg/dlでの各センサ間
の再現性(n=10)を示す変動係数および選択性[グルコー
ス水溶液濃度100mg/dlの出力を100としたときの同濃度
のアスコルビン酸水溶液(40μlをセンサに滴下)の出力]
についても、それらの値が併記されている。
【0022】
【図面の簡単な説明】
【図1】A層を形成させたグルコースバイオセンサにお
けるグルコース水溶液濃度と出力との関係を示す検量線
グラフである。
【図2】B層を形成させたグルコースバイオセンサにお
けるグルコース水溶液濃度と出力との関係を示す検量線
グラフである。
【図3】C層を形成させたグルコースバイオセンサにお
けるグルコース水溶液濃度と出力との関係を示す検量線
グラフである。
【図4】D層を形成させたグルコースバイオセンサにお
けるグルコース水溶液濃度と出力との関係を示す検量線
グラフである。
【図5】E層を形成させたグルコースバイオセンサにお
けるグルコース水溶液濃度と出力との関係を示す検量線
グラフである。
【図6】F層を形成させたグルコースバイオセンサにお
けるグルコース水溶液濃度と出力との関係を示す検量線
グラフである。
【図7】(B層)を形成させたグルコースバイオセンサに
おけるグルコース水溶液濃度と出力との関係を示す検量
線グラフである。

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 絶縁性基板上に作用極および対極の少な
    くとも2電極を設け、該作用極上にアルブミン - ジアル
    デヒド化合物架橋物層および酸化還元酵素 - 電子伝達体
    混合物層を順次形成せしめてなるバイオセンサ。
  2. 【請求項2】 絶縁性基板上に作用極および対極の少な
    くとも2電極を設け、該作用極上にアルブミン - ジアル
    デヒド化合物架橋物層および酸化還元酵素 - アルブミン -
    電子伝達体混合物層を順次形成せしめてなるバイオセン
    サ。
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