JP3598637B2 - バイオセンサの製造法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バイオセンサの製造法に関する。更に詳しくは、作用極上に酸化還元酵素および電子受容体の混合物層を形成せしめたバイオセンサの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
絶縁性基板上に少なくとも作用極および対極の２電極を設け、この作用極上に酸化還元酵素、電子受容体およびＣＭＣ等の親水性高分子からなる酵素反応層を設けたバイオセンサが知られている（特開平３−２０２７６４号公報）。しかるに、このような構成のバイオセンサにあっては、測定液のｐＨ変化に対するバラツキが大きいという問題がみられた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、作用極上に酸化還元酵素および電子受容体を含む酵素反応層を設けたバイオセンサであって、測定液のｐＨ変化に対するバラツキの小さいものの製造法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
かかる本発明の目的は、少なくとも作用極および対極の２電極が設けられた絶縁性基板の作用極上に、酸化還元酵素、電子受容体およびアルブミンの３成分を緩衝液に溶解させた溶液として滴下し、それを乾燥させてこれらの混合物層を形成せしめたバイオセンサを製造することによって達成される。
【０００５】
【発明の実施の形態】
セラミックス、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料（例えば、微生物生産ポリエステル等）などの絶縁性基板上には、作用極および対極あるいは作用極、対極および参照極が設けられる。作用極、対極および参照極リードは、スクリーン印刷法、蒸着法、スパッタリング法などによって白金、金、カーボン等から形成され、参照極は参照極リード上にスクリーン印刷法、蒸着法、スパッタリング法などによって一旦銀電極を形成させた後、定電流電解する方法あるいは塩化第２鉄水溶液中に浸漬する方法、更にはスクリーン印刷法によって塩化銀を塗布、積層させる方法などによって形成される。その後、各電極の中央部分が樹脂製絶縁膜などによって被覆される。なお、参照極を設けない２電極構造のものとすることもできる。
【０００６】
そして、作用極上には酸化還元酵素および酸化還元酵素、電子受容体およびアルブミンの３成分の混合物層の形成が行われる。酸化還元酵素としてはグルコースオキシダーゼ(GOD)、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ等が、また電子受容体としてはフェリシアン化カリウム、パラベンゾキノン等が一般に用いられる。
【０００７】
グルコースがＧＯＤの作用により酵素の存在下で酸化されてグルコノラクトンを生成させ、そのとき発生するＨ_２Ｏ_２を作用極上で酸化し、その際の酸化電流値を測定することにより、グルコース濃度を間接的に求める方法は周知である。しかしながら、測定液が水で希釈されない原液サンプルの場合には、酸化反応が溶存酸素濃度に律速されるため、グルコース濃度が約１００ｍｇ／ｄｌ程度迄しか直線検量範囲を示さない。
【０００８】
そこで、溶液中濃度が有限である酸素の代わりに、電子受容体（メディエータ）がＧＯＤ等と共に用いられる。メディエータがフェリシアン化カリウムＫ_３Ｆｅ（ＣＮ）_６の場合、この反応は次のように進行する。

この際発生したフェロシアンイオンは、作用極で酸化されて酸化電流を生ずる。

【０００９】
また、メディエータとしてフェリシアン化カリウムの代わりにパラベンゾキノンを用いた場合には、ＧＯＤ存在下でのグルコースとパラベンゾキノンとの反応でヒドロキノンが生成し、この際生成したヒドロキノンは作用極で酸化され、酸化電流を生ずるのでその値が測定される。

【００１０】
作用極上への混合物層の形成は、酸化還元酵素、電子受容体およびアルブミンの３成分を緩衝液に溶解させ、その溶液を作用極上に滴下し、それを乾燥させることによって行われる。緩衝液としては、KH₂PO₄、K₂HPO₄、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、マレイン酸、ピロリン酸、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン等を主成分とするものが好んで用いられる。
【００１１】
これらの緩衝液を用いての混合物層の形成は、緩衝液１ｍｌ当りＧＯＤ約１〜５０ｍｇ、好ましくは約１〜２０ｍｇ（１６５８００単位の場合）、パラベンゾキノン約１〜２００ｍｇ、好ましくは約１００〜２００ｍｇまたはフェリシアン化カリウム約１〜１００ｍｇ、好ましくは約４０〜６０ｍｇおよび牛血清アルブミン約１〜１００ｍｇ、好ましくは約１〜２０ｍｇを溶解させた溶液約０．５〜１０μｌ、好ましくは約０．５〜３μｌを滴下法、スピンコート法などによって作用極上に滴下することによって行われ、そこに約０．０５〜１０μｍ、好ましくは約０．１〜２μｍの膜厚の混合物層を室温条件下で形成させる。
【００１２】
グルコース濃度の測定は、このようにして作製されたグルコースバイオセンサに所定濃度のグルコース水溶液を滴下して約１〜６０秒間程度反応させた後、そこに約０．０５〜０．８Ｖ、好ましくは約０．５〜０．７Ｖの電圧を印加し、例えば印加２０秒後の電流値を測定することによって行われる。測定には、ポテンショガルバノスタットおよびファンクションジェネレータが用いられる。
【００１３】
【発明の効果】
作用極上にグルコースオキシダーゼによって代表される酸化還元酵素および電子受容体の混合物層を形成させたバイオセンサは、溶存酸素に律速されることなく、広い検量範囲(0〜1000mg/dlまたはそれ以上)でグルコース水溶液などの濃度をそれのpHに左右されることなく測定することができ、混合物層に更にアルブミンを添加した場合には、出力のバラツキをより少なくすることができる。
【００１４】
このような混合物層を形成させる際、緩衝液の溶液として作用極上に滴下すると、乾燥後も緩衝液主成分が混合物と共に作用極上に残留することになるため、被測定液中に再び溶解してそこに緩衝作用を与える。
【００１５】
酵素を用いる反応では、その反応速度が溶液のｐＨによって大きく影響されるのが一般的であり、酵素反応に基づくバイオセンサにあっても、被測定液のｐＨが変化するとグルコースオキシダーゼ等の酵素の反応速度も変化し、その結果として出力の変動がみられるようになるが、上記の如き被測定液のｐＨへの緩衝作用は、出力を安定化させるという好ましい結果を与える。
【００１６】
本発明に係るバイオセンサは、原液サンプルが測定液とされる使い捨てバイオセンサとして、例えば食品製造工程中のグルコース管理に用いられ、あるいは家庭内健康診断（セルフケァ）、特に血糖、尿糖の測定による糖尿病の自己管理、糖尿病の予防および早期発見などに効果的に用いることができるなど、幅広い用途を期待することができる。
【００１７】
【実施例】
次に、実施例について本発明を説明する。
【００１８】
実施例、比較例
ポリエチレンテレフタレートフィルム(厚さ0.25mm)上に、スクリーン印刷法によって、いずれもカーボン製の対極、作用極および参照極リードを作用極を中心として、膜厚5μmで形成させた。次いで、参照極リード上に、銀ペーストをスクリーン印刷法によって5μmの厚さで印刷し、焼成して銀電極とした。これらの各電極の中央部分を厚さ15μmのポリエステル樹脂製絶縁膜で覆った後、銀電極部分を0.1M塩酸中に浸漬し、0.6mA/cm²の電流密度で20分間の定電流電解を行い、その表面を塩化銀化して、銀/塩化銀参照極を形成させた。この定電流電解には、ポテンショガルバノスタット(北斗電工製HA501)が用いられた。
【００１９】
このような構成の各電極の内の作用極上（面積０．１６ｃｍ^２）に、グルコースオキシダーゼ（１６５８００単位）１０ｍｇ、フェリシアン化カリウム４８ｍｇおよび牛血清アルブミン１０ｍｇをリン酸緩衝液（ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ １５．６ｇおよびＫＣｌ ３．７ｇを水に溶解させて調製した１Ｌの水溶液のｐＨを、１Ｎ ＮａＯＨで７．０に調整したもの）１ｍｌに溶解させて調製した溶液１．５μｌを滴下して室温条件下で乾燥させ、グルコースバイオセンサを作製した。
【００２０】
このようにして作製されたグルコースバイオセンサに、１００ｍｇ／ｄｌ濃度でｐＨが４．０、７．０または９．０の各種グルコース水溶液４０μｌを滴下して５秒間反応を進行させた後、０．６Ｖの電圧を印加し、印加２０秒後の電流値を測定した。測定には、ポテンショガルバノスタット（ＨＡ５０１）およびファンクションジェネレータ（北斗電工製ＨＢ−１０４）が用いられた。
【００２１】
測定は、参照極を形成させたもの(３電極構造)および形成させないもの(２電極構造)のそれぞれについて行われ、各センサは１サンプル測定毎に使い捨てとし、次の表に示されるような出力結果(単位：μA)を得た。この結果から、測定出力は被測定液のpHによって殆んど左右されないことが判る。なお、緩衝液の代わりに水を用いた場合に得られた測定結果が、比較例として表に併記されている。

Claims (2)

1. 少なくとも作用極および対極の２電極が設けられた絶縁性基板の作用極上に、酸化還元酵素、電子受容体およびアルブミンを緩衝液に溶解させた溶液として滴下し、それを乾燥させてこれらの混合物層を形成させることを特徴とするバイオセンサの製造法。
2. 請求項１記載の方法で製造されたバイオセンサ。