JP3297341B2

JP3297341B2 - バイオセンサ

Info

Publication number: JP3297341B2
Application number: JP05811697A
Authority: JP
Inventors: 信池田; 智浩山本; 俊彦吉岡; 史朗南海; 茂樹上甲; 潤子岩田
Original assignee: Panasonic Corp; Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp; Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1996-03-12
Filing date: 1997-03-12
Publication date: 2002-07-02
Anticipated expiration: 2017-03-12
Also published as: JPH09304329A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血液、尿、および
果汁などの試料中に含まれる基質（特定化合物）を高精
度で、迅速かつ容易に定量し得るバイオセンサ、ならび
にそれを用いた基質の定量方法に関し、より詳細には、
試料中に含まれるグルコースおよびコレステロールのよ
うな基質を、それらと特異的に反応し得る酸化還元酵素
と反応させることにより、試料中の基質濃度を電気化学
的に定量し得るバイオセンサおよびそれを用いた基質の
定量方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、生体試料および食品中の特定の化
合物（基質）を、試料の希釈および撹拌などを行うこと
なく、簡易に定量し得るバイオセンサが提案されてい
る。

【０００３】特開平3-202764号公報は、絶縁性基板上に
スクリーン印刷などの方法により、電極系を形成し、こ
の電極系上に、親水性高分子、酸化還元酵素、および電
子受容体を含有する反応層と、カバーおよびスペーサを
組み合わせて試料供給路を構成する空間部とを備えたバ
イオセンサを開示している。このバイオセンサは、以下
のようにして試料中の基質濃度を定量し得る：まず、試
料液をバイオセンサの空間部上に滴下することによっ
て、試料液が毛細管現象により反応層に供給され、反応
層が溶解する。次いで、試料液中の基質と反応層内の酸
化還元酵素との間で酵素反応が進行し、反応層内の電子
受容体が還元される。酸化反応終了後、この還元された
電子受容体を電気化学的に酸化することにより、このと
き得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度が定量さ
れる。

【０００４】上記バイオセンサにおいては、しばしば電
子受容体としてフェリシアン化カリウムが用いられる。
フェリシアン化カリウムを用いるバイオセンサは、安定
性に優れており、かつ生産コストが低いので大量生産に
適している。しかし、電子受容体としてフェリシアン化
カリウムを用いるバイオセンサにおいて、フェリシアン
化イオンと酸化還元酵素との間の二次反応速度は、不安
定であるか、あるいは生産コストの高いキノン誘導体ま
たは他の金属錯体のような電子受容体を用いたバイオセ
ンサのものと比較して小さい。従って、このようなバイ
オセンサは酵素反応に時間がかかり、基質濃度を迅速に
定量することができないという問題があった。

【０００５】さらに、電子受容体としてフェリシアン化
カリウムよりも大きな二次反応速度を有するフェロセン
またはその誘導体を用いた、いくつかのバイオセンサが
知られている。

【０００６】特開平2-240555号公報は、電極面上にフェ
ロセン化合物を含有する光硬化性樹脂膜と、グルコース
オキシダーゼ含有光硬化性樹脂膜とを順次有する作用極
を備えたグルコースセンサを開示している。特開平2-99
851号公報は、電極面上にフェロセン化合物を蒸着させ
た層と、蒸着層上にグルコースオキシダーゼを固定化し
た層とを有する作用極を備えたグルコースセンサを開示
している。これらのバイオセンサにおいては、フェロセ
ン化合物として、フェロセン（すなわち、ビス（シクロ
ペンタジエニル）鉄(II)）、1,1'-ジメチルフェロセ
ン、ビニルフェロセンなどが使用される。

【０００７】特開平5-256812号公報は、作用極上にグル
コースオキシダーゼとフェロセン化合物とを担持した識
別層と、作用極付近の温度を所定温度に維持する温度維
持手段とを備えたグルコースセンサを開示している。こ
のバイオセンサにおいては、フェロセン化合物として、
フェロセンおよびその誘導体が使用される。

【０００８】しかし、これらのグルコースセンサに用い
られるフェロセン化合物はいずれも還元体で存在してい
るので、センサの使用においては、酵素反応による基質
から作用極への電子移動を達成するために、まず、電極
上でフェロセン化合物を酸化体に変換させる必要があっ
た。

【０００９】特開平6-3316号公報は、導電性電極表面上
に、水溶液中でイオン化した疎水性酸化還元物質（例え
ば、フェロセン）と親水性酵素（例えば、グルコースオ
キシダーゼ）とを修飾したグルコースセンサ（修飾電
極）を開示している。このグルコースセンサは、一旦、
フェロセンをリン酸緩衝液中で電解してフェリシニウム
イオンを含有する溶液を形成し、次いで、この溶液にグ
ルコースオキシダーゼを添加し、得られた混合溶液を導
電性電極表面に塗布または電着することにより作製され
る。

【００１０】しかし、上記修飾電極は、リン酸イオンと
フェリシニウムイオンとがイオン複合体を形成し、電極
表面を不活性化するという問題があった。さらに、この
修飾電極の作製には、フェロセンを電解する工程が必要
であり、その結果、作製時間とコストとの両方が増大す
るという問題があった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題の
解決を課題とするものであり、その目的とするところ
は、酵素反応が短時間で起こり、検出感度を低下させる
ことなく、基質濃度を迅速かつ高精度で定量し得るバイ
オセンサを提供することである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明のバイオセンサ
は、絶縁性基板と、該基板上に形成され、作用極および
対極を有する電極系と、該基板上に配置された、酸化還
元酵素および電子受容体を含有する反応層とを備え、該
電子受容体が、該反応層に含有されるフェロセン電解質
由来のフェリシニウムイオンであり、そのことにより上
記目的が達成される。

【００１３】好適な実施態様では、上記フェロセン電解
質は、フェロセン６フッ化リン酸塩およびフェロセン４
フッ化ホウ酸塩からなる群より選択される。好適な実施
態様では、上記反応層はさらに、親水性高分子および界
面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種を含
有する。

【００１４】好適な実施態様では、上記酸化還元酵素
は、グルコースオキシダーゼ；グルコースデヒドロゲナ
ーゼ；乳酸オキシダーゼ；乳酸デヒドロゲナーゼ；ウリ
カーゼ；コレステロールオキシダーゼ；コレステロール
オキシダーゼおよびコレステロールエステラーゼの組合
わせ；グルコースオキシダーゼおよびインベルターゼの
組合わせ；グルコースオキシダーゼ、インベルターゼ、
およびムタロターゼの組合わせ；ならびにフルクトース
デヒドロゲナーゼおよびインベルターゼの組合せからな
る群より選択される１種である。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明のバイオセンサは、絶縁性
基板と、該基板上に形成され、作用極および対極を有す
る電極系と、該基板上に配置された反応層とを有する。

【００１６】該電気絶縁性の基板には、ポリエチレンテ
レフタレートなどの合成樹脂板が用いられ得る。

【００１７】作用極および対極を有する電極系は、この
基板上に公知の方法を用いて設けられ得る。例えば、該
基板上にリードを形成した後、該各リードに接続されそ
して互いに絶縁するように作用極および対極が設けられ
る。上記リードおよび電極の材料としては、公知の導電
性材料が使用され得る。このような導電性材料の例とし
ては、カーボン、銀、白金、金、およびパラジウムが挙
げられる。

【００１８】反応層は、少なくとも１種の酸化還元酵素
および少なくとも１種の電子受容体を含有する。

【００１９】本発明に用いられる電子受容体は、フェロ
セン電解質由来のフェリシニウムイオンである。ここ
で、本明細書中に用いられる用語「フェロセン電解質」
とは、後述の酸化還元酵素と共に水溶液を調製した際
に、電離してフェリシニウムイオン（[(C₅H₅)₂Fe]⁺）を
生じる塩をいう。フェロセン電解質を構成するアニオン
は特に限定されない。フェロセン電解質の好ましい例と
しては、フェロセン６フッ化リン酸塩およびフェロセン
４フッ化ホウ酸塩が挙げられ、これらはAldrich Inc.よ
り市販されている。

【００２０】フェロセン電解質の濃度は、特に限定され
ないが、反応層が試料液に溶解した際に、試料液中おい
て、好ましくは１ｍＭ〜100ｍＭである。フェロセン電
解質の濃度が、１ｍＭを下回ると、測定可能な基質濃度
範囲が極めて狭くなる恐れがある。フェロセン電解質の
濃度が100ｍＭを上回ると、バイオセンサの製造コスト
が高くなり、かつ反応層が割れて応答電流値にばらつき
を生じ、さらには、保存時の信頼性が低下する恐れがあ
る。

【００２１】本発明においては、酸化還元酵素は、グル
コースセンサ、コレステロールセンサ、乳酸センサ、尿
酸センサ、およびショ糖センサのような従来のバイオセ
ンサに用いられる酵素が用いられ得る。酸化還元酵素の
例としては、グルコースオキシダーゼ(GOD)、グルコー
スデヒドロゲナーゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロ
ゲナーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシダーゼ(C
hOD)、コレステロールエステラーゼ(ChE)、インベルタ
ーゼ、ムタロターゼ、およびフルクトースデヒドロゲナ
ーゼ、ならびにそれらの組合せが挙げられる。本発明の
バイオセンサがグルコースセンサである場合、酸化還元
酵素としては、GODまたはグルコースデヒドロゲナーゼ
が用いられ得る。本発明のバイオセンサが乳酸センサで
ある場合、酸化還元酵素としては、乳酸オキシダーゼま
たは乳酸デヒドロゲナーゼが用いられ得る。本発明のバ
イオセンサが尿酸センサである場合、酸化還元酵素とし
てはウリカーゼが用いられ得る。本発明のバイオセンサ
がコレステロールセンサである場合、酸化還元酵素とし
ては、ChODまたはChODとChEとの組合せが用いられ得
る。本発明のバイオセンサがショ糖センサである場合、
酸化還元酵素としては、GODおよびインベルターゼの組
合せ；GOD、インベルターゼ、およびムタロターゼの組
合せ；またはフルクトースデヒドロゲナーゼおよびイン
ベルターゼの組合せが用いられ得る。

【００２２】本発明のバイオセンサに用いられる酸化還
元酵素の含有量は特に限定されず、必要に応じて当業者
により適切な量が選択され得る。例えば、GODを用いる
場合、その含有量は、１センサ当たり0.1ユニット〜５
ユニットが好ましい。ChODとChEとの組合せを用いる場
合、ChODの含有量は、１センサ当たり0.1ユニット〜５
ユニットが好ましく、そしてChEの含有量は、１センサ
当たり0.1ユニット〜５ユニットが好ましい。ここで、
本明細書中に用いられる用語「１ユニット」とは、１μ
molの基質を１分間で酸化させるための、定量されるべ
き酸化還元酵素の量をいう。

【００２３】反応層はさらに、好ましくは親水性高分子
および／または界面活性剤を含有する。

【００２４】親水性高分子の例としては、カルボキシメ
チルセルロース(CMC)、ヒドロキシエチルセルロース、
ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エ
チルセルロース、エチルヒドロキシセルロース、および
カルボキシメチルエチルセルロースのようなセルロース
誘導体；ポリビニルピロリドン；ポリビニルアルコー
ル；ゼラチンおよびその誘導体；アクリル酸およびその
塩；メタクリル酸およびその塩；スターチおよびその誘
導体；ならびに無水マレイン酸およびその塩が挙げられ
る。特に、CMCが好ましい。

【００２５】界面活性剤の例としては、大豆由来の精製
レシチン、オクチルチオグルコシド、コール酸ナトリウ
ム、ドデシル-β-マルトシド、デオキシコール酸ナトリ
ウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、Triton-X
（登録商標）、Lubrol PX（登録商標）、DK-エステル
（登録商標）、BIGCHAP（登録商標）、およびDeoxyCHAP
（登録商標）が挙げられる。特に、精製レシチンおよび
オクチルチオグルコシドが好ましい。

【００２６】電子受容体として上記フェリシニウムイオ
ンを使用する際、一連の酵素反応を経てフェロセンが生
成される。フェロセンは、水に対する溶解度が低いの
で、試料液中に含まれる水によって生成したフェロセン
分子が反応層上に析出する場合がある。それゆえ、反応
層に界面活性剤を含有させることにより、生成したフェ
ロセンの水に対する溶解性が向上する。

【００２７】上記親水性高分子および界面活性剤は、組
み合わせて使用され得るだけでなく、親水性高分子また
は界面活性剤のいずれか一方のみが、さらなる成分とし
て反応層に含有されていてもよい。

【００２８】本発明においては、反応層上にさらに、上
記精製レシチンでなる層が形成されていてもよい。反応
層上にレシチン層が形成された場合、反応層への試料液
の供給が容易になり得る。

【００２９】本発明のバイオセンサの製造方法の好まし
い実施態様について、図１および図２を用いて説明す
る。

【００３０】まず、絶縁性基板１上に、スクリーン印刷
により銀ペーストなどの導電性材料を印刷し、リード２
および３を形成する。次いで、樹脂バインダーを含む導
電性材料を絶縁性基板１上に印刷して作用極４を形成す
る。この作用極４はリード２と接触している。

【００３１】次いで、絶縁性基板１上に、絶縁性ペース
トを印刷して絶縁層６を形成する。絶縁層６は、作用極
４の外周部を覆っており、これにより作用極４の露出部
分の面積が一定に保たれる。図１に示されるように、絶
縁層６はリード２および３の一部も覆っている。さらに
この作用極４の外周部に、リング状の対極５が樹脂バイ
ンダーを含む導電性材料を用いて形成される。対極５
は、リード３と接触している。このようにして、作用極
４および対極５を備える電極系１３が絶縁性基板１上に
形成される。

【００３２】あるいは、本発明のバイオセンサは、上記
作用極４および対極５に加えて参照極（図示せず）を備
える三電極系を絶縁性基板１上に形成され得る。この三
電極系により、安定した応答電流が得られ、精度がさら
に安定化する。

【００３３】反応層７は、以下のようにして上記絶縁性
基板１上に配置され得る。

【００３４】親水性高分子を含有する水溶液が電極系１
３上に滴下され、そして乾燥することにより親水性高分
子層が形成される。他方、所定量の酸化還元酵素とフェ
ロセン電解質とを水に溶解させる。好ましくは、数滴の
界面活性剤がこの水溶液に添加される。次いで、得られ
た酸化還元酵素とフェロセン電解質とを含有する水溶液
が上記親水性高分子層に滴下される。その結果、親水性
高分子はこの水溶液に溶解する。次いで、溶解した親水
性高分子層を乾燥することにより、酸化還元酵素と電子
受容体とが親水性高分子層中に取り込まれた反応層７が
形成される。しかし、この取り込みにおいては、撹拌な
どのさらなる操作が行われないので、反応層７と電極系
１３との界面は、親水性高分子のみが存在する。すなわ
ち、酸化還元酵素および電子受容体が電極系１３の表面
と接触していないので、電極系１３の表面にタンパク質
が吸着して電極系１３の表面を不活性化させるような場
合が排除され得る。

【００３５】親水性高分子層が使用されない場合は、電
極系１３上に直接、酸化還元酵素およびフェロセン電解
質を含有する水溶液が滴下され、乾燥される。

【００３６】本発明のバイオセンサを繰り返し使用する
ために、酸化還元酵素およびフェロセン電解質は、例え
ば、グルタルアルデヒドとの架橋により親水性高分子層
上に固定され得るか、またはニトロセルロースまたはイ
オン交換膜のようなポリマー性材料と一緒に親水性高分
子層上に固定され得る。

【００３７】上記のようにして形成された反応層７は、
図２に示されるような電極系１３全体を覆っている。

【００３８】次いで、必要に応じて、トルエンのような
有機溶媒中の所定量の精製レシチンの溶液を反応層７上
に展開し、そして乾燥して、レシチン層８が形成され
る。最終的に、反応層７上（レシチン層８が形成された
場合はその上）に、試料供給路１２を備えるスペーサー
１０と孔１１を備えるカバー９とが順次公知の方法で配
置される。このようにして、本発明のバイオセンサが製
造される。

【００３９】試料液中に含まれる基質濃度は、本発明の
バイオセンサを用いて、例えば、以下のようにして定量
される。

【００４０】まず、基質を含有する試料液が、試料供給
路１２を介して反応層７に、あるいは直接反応層７に添
加される。この添加により反応層７が溶解する。所定時
間放置した後、対極５に対して作用極４にアノード方向
に所定の大きさのパルス電圧（例えば、＋0.5Ｖ）が印
加され、得られた応答電流値が公知の手段で測定され
る。次いで、予め既知の濃度の基質を用いて作成した基
質濃度と応答電流値との検量線を用いて、得られた応答
電流値が基質濃度に変換される。

【００４１】上記ようにして定量され得る基質の例とし
ては、グルコース、コレステロール、乳酸、尿酸、およ
びショ糖が挙げられる。

【００４２】本発明のバイオセンサを用いて、応答電流
値が得られるメカニズムを以下に説明する。

【００４３】例えば、試料液が基質としてグルコースを
含有し、そして反応層７においてGODが使用される場
合、試料液によって反応層７は溶解し、そして試料液中
のグルコースはGODによって酸化されて、グルコノラク
トンを生成する。このとき、グルコースの酸化反応から
生じた電子は、反応層７中に存在するフェリシニウムイ
オンをフェロセンに還元する。次いで、上記パルス電圧
の印加により、生成したフェロセンの酸化電流が得ら
れ、この電流の大きさが応答電流値として測定される。
得られた応答電流値は、試料液中に存在するグルコース
濃度に比例する。

【００４４】試料液が基質としてコレステロールエステ
ルとコレステロールとを含有し、そ反応層７においてCh
EおよびChODが使用される場合、試料液によって反応層
７は溶解し、試料液中のコレステロールエステルがChE
によりコレステロールに変換される。次いで、試料液中
のすべてのコレステロールは、ChODによって酸化され、
コレステノンを生成する。このとき、コレステロールの
酸化反応から生じた電子は、反応層７中に存在するフェ
リシニウムイオンをフェロセンに還元する。次いで、上
記パルス電圧の印加により、生成したフェロセンの酸化
電流が得られ、この電流の大きさが応答電流値として測
定される。得られた応答電流値は、試料液中に存在する
コレステロールエステルとコレステロールとの合計の濃
度に比例する。

【００４５】このようにして、本発明のバイオセンサを
用いて、試料液中に含まれる基質濃度が定量され得る。
さらに、電子受容体として使用されるフェリシニウムイ
オンは、従来より使用されるフェリシアン化イオンと比
較して二次反応速度が大きいので、本発明のバイオセン
サは試料中の基質濃度を迅速かつ高精度で定量し得る。

【００４６】本発明のバイオセンサは、全血、血漿、血
清、および尿のような生体試料、食品工業における材
料、果汁のような食料品などに含まれる基質の濃度を定
量するのに有用である。

【００４７】

【実施例】以下に、本発明を実施例に基づいて説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。なお、各実施例の説明に用いられる図面において、
共通する要素には同一の番号を付け、必要に応じて説明
を一部省略する。

【００４８】＜実施例１＞本発明のバイオセンサの一例
として、グルコースセンサを以下のようにして作製し
た。

【００４９】図１に示されるように、ポリエチレンテレ
フタレートでなる絶縁性基板１上に、スクリーン印刷に
より銀ペーストを印刷し、リード２および３を形成し
た。次いで、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペー
ストを絶縁性基板１上に印刷して作用極４を形成した。
この作用極４はリード２と接触していた。

【００５０】次いで、絶縁性基板１上に、絶縁性ペース
トを印刷して絶縁層６を形成した。絶縁層６は、作用極
４の外周部を覆っており、これにより作用極４の露出部
分の面積を一定に保った。さらに、樹脂バインダーを含
む導電性カーボンペーストをリード３と接触するように
絶縁性基板１上に印刷してリング状の対極５を形成し
た。

【００５１】次いで、電極系１３（作用極４および対極
５）上にGODおよびフェロセン６フッ化リン酸塩（Aldri
ch製）を含有する水溶液を添加して、乾燥させて反応層
７を形成した。レシチンのトルエン溶液を反応層７上に
滴下して、反応層７全体に展開し、乾燥して、レシチン
層８を形成した。このレシチン層８上にスペーサー１０
およびカバー９を順次接着してグルコースセンサを作製
した。

【００５２】上記のようにして作製したグルコースセン
サに、試料液として３μｌの30mg/dlグルコース水溶液
をスペーサー１０内の試料供給路１２を介して添加し
た。試料液は、カバー９内に設けられた孔１１の高さに
まで達し、そして反応層７が溶解した。次いで、添加後
60秒で、対極５を基準にして作用極４にアノード方向に
＋0.5Vのパルス電圧を印加し、５秒後の応答電流値を測
定した。

【００５３】さらに、45mg/dlおよび90mg/dlのグルコー
ス水溶液に対する応答電流値についても、測定毎に新た
なグルコースセンサを用いて、上記と同様にして応答電
流値を測定した。得られた応答電流値は、グルコース水
溶液の濃度に比例していた。

【００５４】＜実施例２＞フェロセン６フッ化リン酸塩
の代わりに、フェロセン４フッ化ホウ酸塩（Aldrich
製）を用いたこと以外は、実施例１と同様にしてグルコ
ースセンサを作製した。このグルコースセンサを用い
て、実施例１と同様の濃度を有するグルコース水溶液か
ら得られる応答電流値をそれぞれ測定した。得られた応
答電流値は、グルコース水溶液の濃度に比例していた。

【００５５】＜実施例３＞実施例１と同様にして絶縁性
基板１上に電極系１３を形成した。

【００５６】次いで、電極系１３（作用極４および対極
５）上に0.5重量％のCMCの水溶液を滴下し、そして乾燥
させてCMC層を形成した。このCMC層上にGODおよびフェ
ロセン６フッ化リン酸塩を含有する水溶液を添加して、
乾燥させて反応層７を形成した。さらに、レシチンのト
ルエン溶液を反応層７上に滴下して、反応層７全体に展
開し、乾燥して、レシチン層８を形成した。このレシチ
ン層８上にスペーサー１０およびカバー９を順次接着し
てグルコースセンサを作製した。

【００５７】上記のようにして作製したグルコースセン
サに、試料液として３μｌの30mg/dlグルコース水溶液
を、スペーサー１０内の試料供給路１２を介して添加し
た。試料液は、カバー９内に設けられた孔１１の高さに
まで達し、そして反応層７が溶解した。次いで、添加後
60秒で、対極５を基準にして作用極４にアノード方向に
＋0.5Vのパルス電圧を印加し、５秒後の応答電流値を測
定した。

【００５８】さらに、45mg/dlおよび90mg/dlのグルコー
ス水溶液に対する応答電流値についても、測定毎に新た
なグルコースセンサを用いて、上記と同様にして応答電
流値を測定した。上記で得られた応答電流値は、グルコ
ース水溶液の濃度に比例していた。

【００５９】＜実施例４＞フェロセン６フッ化リン酸塩
の代わりに、フェロセン４フッ化ホウ酸塩を用いたこと
以外は、実施例３と同様にしてグルコースセンサを作製
した。このグルコースセンサを用いて、実施例３と同様
の濃度を有するグルコース水溶液から得られる応答電流
値をそれぞれ測定した。得られた応答電流値は、グルコ
ース水溶液の濃度に比例していた。

【００６０】＜実施例５＞実施例３に記載の、GODおよ
びフェロセン６フッ化リン酸塩を含有する水溶液に、界
面活性剤として大豆由来の精製レシチン（SIGMA製）を
添加し、これをCMC層上に滴下したこと以外は、実施例
３と同様にしてグルコースセンサを作製した。このグル
コースセンサを用いて、実施例３と同様の濃度を有する
グルコース水溶液から得られる応答電流値をそれぞれ測
定した。得られた応答電流値は、グルコース水溶液の濃
度に比例していた。

【００６１】＜実施例６＞フェロセン６フッ化リン酸塩
の代わりに、フェロセン４フッ化ホウ酸塩を用い、GOD
およびフェロセン４フッ化ホウ酸塩を含有する水溶液
に、界面活性剤として大豆由来の精製レシチン（SIGMA
製）を滴下し、これをCMC層上に添加したこと以外は、
実施例３と同様にしてグルコースセンサを作製した。こ
のグルコースセンサを用いて、実施例３と同様の濃度を
有するグルコース水溶液から得られる応答電流値をそれ
ぞれ測定した。得られた応答電流値は、グルコース水溶
液の濃度に比例していた。

【００６２】＜実施例７＞実施例１と同様にして絶縁性
基板１上に電極系１３を形成した。

【００６３】次いで、電極系１３（作用極４および対極
５）上に0.5重量％のCMCを含有する水溶液を滴下し、そ
して乾燥させてCMC層を形成した。他方、ChE、ChOD、お
よびフェロセン６フッ化リン酸塩を含有する水溶液に、
界面活性剤としてオクチルチオグルコシドを滴下した。
得られた水溶液を、CMC層上に添加して、乾燥させて反
応層７を形成した。さらに、レシチンのトルエン溶液を
反応層７上に滴下して、反応層７全体に展開し、乾燥し
て、レシチン層８を形成した。このレシチン層８上にス
ペーサー１０およびカバー９を順次接着してコレステロ
ールセンサを作製した。

【００６４】上記のようにして作製したコレステロール
センサに、試料液として50mg/dlのコレステロールと150
mg/dlのコレステロールエステルを含有する標準溶液３
μｌを、スペーサー１０内の試料供給路１２を介して添
加した。試料液は、カバー９内に設けられた孔１１の高
さにまで達し、そして反応層７が溶解した。次いで、添
加後180秒で、電極系１３の対極５を基準にして作用極
４にアノード方向に＋0.5Vのパルス電圧を印加し、５秒
後、試料液中に存在するコレステロールエステルとコレ
ステロールとの合計の濃度に対応する応答電流値を測定
した。

【００６５】さらに、300mg/dlのコレステロールエステ
ルと100mg/dlのコレステロールを含有する標準溶液、な
らびに450mg/dlのコレステロールエステルと150mg/dlの
コレステロールを含有する標準溶液に対する応答電流値
についても、測定毎に新たなコレステロールセンサを用
いて、上記と同様にして応答電流値を測定した。上記で
得られた応答電流値は、試料液中に存在するコレステロ
ールエステルとコレステロールとの合計の濃度に比例し
ていた。

【００６６】＜実施例８＞反応層７にChEが含まれない
こと以外は、実施例７と同様にしてコレステロールセン
サを作製し、実施例７と同様のコレステロールエステル
およびコレステロールを含有する標準溶液から得られる
応答電流値をそれぞれ測定した。得られた応答電流値
は、標準溶液中に予め存在したコレステロールの濃度に
比例していた。

【００６７】＜実施例９＞フェロセン６フッ化リン酸塩
の代わりに、フェロセン４フッ化ホウ酸塩を用いたこと
以外は、実施例７と同様にしてコレステロールセンサを
作製した。このコレステロールセンサを用いて、実施例
７と同様の濃度のコレステロールエステルおよびコレス
テロールを含有する標準溶液から得られる応答電流値を
それぞれ測定した。得られた応答電流値は、試料液中に
存在するコレステロールエステルとコレステロールとの
合計の濃度に比例していた。

【００６８】＜実施例１０＞反応層７にChEが含まれ
ず、そしてフェロセン６フッ化リン酸塩の代わりにフェ
ロセン４フッ化ホウ酸塩を用いたこと以外は、実施例７
と同様にしてコレステロールセンサを作製し、実施例７
と同様のコレステロールエステルおよびコレステロール
を含有する標準溶液から得られる応答電流値をそれぞれ
測定した。得られた応答電流値は、標準溶液中に予め存
在したコレステロールの濃度に比例していた。

【００６９】

【発明の効果】本発明によれば、酵素反応が短時間で起
こり、検出感度を低下させることなく、基質濃度を迅速
かつ高精度で定量し得る。本発明のバイオセンサはま
た、低コストで製造され得、そしてイオン複合体の形成
により電極表面を不活性化させることがない。本発明の
バイオセンサは、全血、血漿、血清、および尿のような
生体試料、食品工業における材料、果汁のような食料品
などに含まれる基質（例えば、グルコース、コレステロ
ール、乳酸、尿酸、およびショ糖）の濃度を定量するの
に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一例を示す、反応層を取り除いたバイ
オセンサの分解斜視図である。

【図２】本発明の一例を示す、絶縁性基板上に反応層を
配置したバイオセンサの概略断面図である。

【符号の説明】

１絶縁性基板２、３リード４作用極５対極６絶縁層７反応層８レシチン層９カバー１０スペーサー１１孔１２試料供給路１３電極系

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者南海史朗大阪府門真市大字門真1006番地松下電器産業株式会社内 (72)発明者上甲茂樹大阪府門真市大字門真1006番地松下電器産業株式会社内 (72)発明者岩田潤子大阪府門真市大字門真1006番地松下電器産業株式会社内 (56)参考文献特開平５−256812（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 27/327 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】絶縁性基板と、該基板上に形成され、作
用極および対極を有する電極系と、該基板上に配置され
た、酸化還元酵素および電子受容体を含有する反応層と
を備えるバイオセンサであって、該電子受容体が、該反応層に含有されるフェロセン電解
質由来のフェリシニウムイオンである、バイオセンサ。
【請求項２】前記フェロセン電解質が、フェロセン６
フッ化リン酸塩およびフェロセン４フッ化ホウ酸塩から
なる群より選択される、請求項１に記載のバイオセン
サ。
【請求項３】前記反応層がさらに、親水性高分子およ
び界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種
を含有する、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項４】前記酸化還元酵素が、グルコースオキシ
ダーゼ；グルコースデヒドロゲナーゼ；乳酸オキシダー
ゼ；乳酸デヒドロゲナーゼ；ウリカーゼ；コレステロー
ルオキシダーゼ；コレステロールオキシダーゼおよびコ
レステロールエステラーゼの組合わせ；グルコースオキ
シダーゼおよびインベルターゼの組合わせ；グルコース
オキシダーゼ、インベルターゼ、およびムタロターゼの
組合わせ；ならびにフルクトースデヒドロゲナーゼおよ
びインベルターゼの組合せからなる群より選択される１
種である、請求項１に記載のバイオセンサ。