JP2000009679A

JP2000009679A - グルコースセンサおよびグルコースの定量法

Info

Publication number: JP2000009679A
Application number: JP10182629A
Authority: JP
Inventors: Yoshiko Miyamoto; 佳子宮本; Makoto Ikeda; 信池田; Toshihiko Yoshioka; 俊彦吉岡; Shiro Nankai; 史朗南海
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1998-06-29
Filing date: 1998-06-29
Publication date: 2000-01-14

Abstract

(57)【要約】【課題】血液試料中に存在する赤血球がセンサの応答
に及ぼす影響を削減して、グルコースを高精度に定量で
きるグルコースセンサを提供する。【解決手段】電気絶縁性の基板、前記基板上に形成さ
れた少なくとも作用極と対極を有する電極系、および前
記電極系上に配置された反応層を具備し、前記反応層
に、少なくとも酵素とグルコーストランスポーターがグ
ルコースに及ぼす作用を抑制する物質とを含有させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血液試料中のグル
コースについて、迅速かつ高精度な定量を簡便に実施す
ることができるバイオセンサに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、試料中の特性成分について、試料
液の希釈や攪拌などを行うことなく簡易に定量しうる方
式として、次のようなバイオセンサが知られている（特
開平３−２０２７６４号公報）。このバイオセンサは、
電気絶縁性の基板上にスクリーン印刷などの方法で作用
極および対極からなる電極系を形成し、さらに各電極の
露出表面積を一定にする電気絶縁層を形成した後に、前
記電極上に親水性高分子と酸化還元酵素と電子受容体を
含む酵素反応層を形成したものである。

【０００３】このようにして作製したバイオセンサの酵
素反応層上に、基質を含む試料液を滴下すると、酵素反
応層が溶解し、基質と酵素が反応して基質が酸化され、
これに伴い電子受容体が還元される。酵素反応終了後、
この還元された電子受容体を電気化学的に酸化し、この
とき得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を求め
ることができる。このようなバイオセンサは、測定対象
物を基質とする酵素を選択することによって、様々な物
質に対する測定が原理的には可能である。例えば、基質
をグルコースとする酵素を用いると、グルコースセンサ
を構成することができる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記のような構成のグ
ルコースセンサの場合、血液試料中の基質濃度が同じで
あっても、その血液試料中に含まれる成分が異なると、
センサの応答特性に差が生じるという問題があった。特
に、血液中に含まれる血球の量がセンサの応答特性に影
響を及ぼしていた。この問題を解決するため、反応層上
に濾過層を設けて、センサ応答特性に影響を及ぼす成分
をトラップする方法が考えられた。しかし、この構成で
は、センサ内に添加された試料液が濾過層を通過するの
に時間を要するため、測定を迅速におこなえないという
新たな問題が生じた。

【０００５】また、試料液を一定の希釈液を用いて希釈
し、試料液に含まれる成分の性状の差を緩和する方法が
検討されたが、この方法は、使い勝手から考慮すると必
ずしも得策とはいえなかった。本発明は、上記課題に鑑
み、血液試料液中に含まれる血球がセンサの応答に及ぼ
す影響を削減して、優れた応答特性を有するバイオセン
サを提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明によるグルコース
センサは、電気絶縁性の基板、前記基板上に形成された
少なくとも作用極と対極を有する電極系、および前記電
極系上に配置された反応層を具備し、前記反応層が、少
なくとも酵素とグルコーストランスポーターがグルコー
スに及ぼす作用を抑制する物質とを含有することを特徴
とする。

【０００７】血液試料液中の赤血球の存在が、グルコー
スセンサの応答特性に悪影響を与える原因の一つとし
て、測定対象物となるグルコースと赤血球との間に働く
相互作用が考えられる。赤血球は、ヘモグロビンタンパ
ク質や酵素タンパク質および脂質等と、これらを内部に
含包する赤血球膜とから構成されている。赤血球膜は、
脂質の二重膜と、これを裏打ちする構造タンパク質、お
よび膜中に含まれる膜タンパク質で構成されている。

【０００８】グルコースは、膜タンパク質の一部である
グルコーストランスポーターに一旦吸着されたのち、こ
こを通過して赤血球内部に浸透することが知られてい
る。そのため、グルコーストランスポーターは、血液中
のグルコースを吸引しようとする等の作用を絶えずグル
コースに及ぼしている。また、このような作用を受けた
グルコースは酵素と反応しにくくなるため、酵素と反応
し得るグルコースの量が減少し、その結果、センサの応
答特性が悪くなると考えられる。

【０００９】本発明者らは、反応系にグルコーストラン
スポーターがグルコースに及ぼす作用を抑制する物質を
含ませると、センサの応答特性を向上させることができ
ることを見いだした。特に、この物質が、グルコースが
グルコーストランスポーターに吸着されるのを阻害する
ものであれば、グルコーストランスポーターの影響を効
果的に削減することができて好適である。このような物
質としては、サイトカラシンＢ、カルシウム塩およびヘ
キソースなどが挙げられる。

【００１０】サイトカラシンＢは、グルコースよりもグ
ルコーストランスポーターに吸着されやすい。また、グ
ルコースよりも巨大であるため、吸着された後は、グル
コーストランスポーターがグルコースを吸着しようとす
る作用を抑制することができる。カルシウム塩は、グル
コーストランスポーターの機能を変化させて、グルコー
ストランスポーターがグルコースを吸着しようとする能
力を低下させる働きがある。このようなカルシウム塩と
しては、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カル
シウム、チオシアン酸カルシウム、酢酸カルシウム、次
亜塩素酸カルシウムおよび過塩素酸カルシウムなどから
選ばれる少なくとも一種が好ましく用いられる。

【００１１】また、ヘキソースは、グルコースと同様の
作用をグルコーストランスポーターから受けるため、こ
れをグルコースよりも過剰に反応系に存在させることに
よって、グルコールがグルコーストランスポーターに吸
着されるのを効果的に抑制することができる。このよう
な働きをするヘキソースとしては、ガラクトース、マン
ノース、フルクトース、ソルボース、タロース、タガト
ースおよびプシコースなどから選ばれる少なくとも一種
が好ましく用いられる。

【００１２】上記のような物質を少なくとも酵素を含む
反応層に含ませる構成にすると、グルコーストランスポ
ーターがグルコースに及ぼす作用を効果的に抑制でき
る。また、酵素を含む反応層と上記物質を含む層を隔離
して形成すると、上記物質が酵素や電子受容体と接触す
るのを抑制できて都合がよい。センサ内における反応層
や上記物質を含む層の配置には、種々の形態がある。

【００１３】本発明のグルコースセンサに用いられる酵
素として、グルコースオキシダーゼ、ＮＡＤを補酵素と
するグルコースデヒドロゲナーゼおよびピラノースオキ
シダーゼなどが挙げられる。また、基板上に形成された
電極系表面を酵素類などから保護するために、電極系表
面を親水性高分子等で被覆するのが好ましい。このよう
な親水性高分子としては、カルボキシメチルセルロー
ス、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピル
セルロース、カルボキシエチルメチルセルロース、ポリ
ビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ゼラチン、
及びその誘導体、無水マレイン酸及びその塩の重合体か
ら選ばれる一種が用いられる。

【００１４】電子受容体には、フェリシアン化ナトリウ
ム、フェリシアン化カリウム、ｐ−ベンゾキノン、フェ
ナジンメトサルフェート、インドフェノール及びその誘
導体、β−ナフトキノン−４−スルホン酸ナトリウム、
β−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウム、メチレン
ブルー、フェロセン及びその誘導体などが使用できる。
なお、酵素と基質を反応させる方式として、反応層が試
料液に溶解して酵素と基質を反応させる方式と、反応層
を固定化して試料液に浮遊しないようにし、反応層の表
面でのみ酵素と基質を反応させる方式があり、いずれの
方式にも本発明は適用することができる。また、上記実
施例では、作用極と対極のみの二極電極系について述べ
たが、参照極を加えた三電極方式にすれば、より正確な
測定が可能である。

【００１５】

【発明の実施の形態】図１は、本発明の一実施例として
作製したグルコースセンサの反応層を除いた分解斜視図
である。１はポリエチレンテレフタレートからなる絶縁
性の基板を示す。この基板１上に、スクリーン印刷によ
り銀ペーストを印刷してリード２、３および電極系の下
地を形成してある。そして、基板１上に、さらに、樹脂
バインダーを含む導電性カーボンペーストを印刷するこ
とにより測定極４と対極５を含む電極系を形成し、ま
た、絶縁性ペーストを印刷することにより絶縁層６をそ
れぞれ形成している。測定極４は、リード２に、また対
極５はリード３にそれぞれ接続されている。絶縁層６
は、測定極４および対極５の露出部分の面積を一定と
し、かつリードを部分的に覆っている。

【００１６】このようにして電極系を形成した絶縁性基
板１と、スペーサー１２と空気孔１３を備えたカバー１
１とを、図１中、一点鎖線で示すような位置関係をもっ
て接着しグルコースセンサを作製する。このような構成
のグルコースセンサでは、基板１とカバー１１との間に
おいて、スぺーサー１２のスリット１５の部分に試料液
供給路を構成する空間部が形成される。そして、試料液
供給路口となる開口部１４に、試料液を接触させるだけ
の簡易操作で、試料液は容易にセンサ内部へ導入され
る。

【００１７】図２は、スペーサー１２とカバー１１を重
ね合わせたカバー部材の斜視図であり、図１とは上下逆
に配置してある。このカバー部材と基板を組み合わせ
て、試料液供給路を構成する空間部が形成される。１６
は、この試料液供給路を構成する空間部に露出するカバ
ー部材側の面を示す。

【００１８】図３は、本発明の一実施例におけるグルコ
ースセンサの要部の縦断面図である。絶縁性基板１の電
極系上に、親水性高分子層７を形成し、その上に反応層
８を形成している。反応層８は、酵素および電子受容体
の他に、グルコーストランスポーターがグルコースに及
ぼす作用を抑制する物質を含んでいる。そして、試料供
給路を構成する空間部に露出するカバー部材側の面１６
にレシチン層９を形成している。

【００１９】図４は、本発明の他の実施例におけるグル
コースセンサの要部の縦断面図である。図１と同様にし
て、絶縁性基板１上に形成した電極系上に、親水性高分
子層７を形成し、酵素および電子受容体を含む反応層
８’を形成している。そして、試料供給路を構成する空
間部に露出するカバー部材側の面１６に、グルコースト
ランスポーターがグルコースに及ぼす作用を抑制する物
質を含む層１０が形成され、この層上にレシチン層９が
形成されている。

【００２０】

【実施例】以下に、具体的な実施例を挙げて、本発明を
より詳細に説明する。《実施例１》本実施例では、図３の構成のバイオセンサ
を以下のようにして作製した。まず、図１の基板１上の
電極系上に、親水性高分子であるカルボキシメチルセル
ロースのナトリウム塩（以下、ＣＭＣと略す。）の０．
５ｗｔ％水溶液を滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０
分間乾燥させて親水性高分子層７を形成した。次に、グ
ルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４；以下ＧＯ
Ｄと略す）２００ユニットとフェリシアン化ナトリウム
４０μｍｏｌおよびサイトカラシンＢ５μｍｏｌを水１
ｍｌに溶解して混合水溶液を調製した。

【００２１】この混合水溶液を親水性高分子層７の上に
５μｌ滴下し、５０℃の温風乾燥機中で１０分間乾燥さ
せて、反応層８を形成した。つぎに、レシチンの０．５
ｗｔ％トルエン溶液を調製し、カバー１１の試料液供給
路を形成する空間部に露出する面１６に滴下し乾燥させ
て、レシチン層１０を形成した。そして、基板１にカバ
ー１１およびスペーサー１２を図１中一点鎖線で示すよ
うな位置関係をもって接着してグルコースセンサを作製
した。

【００２２】《実施例２》実施例１のサイトカラシンＢ
の代わりに、塩化カルシウム５０μｍｏｌを用いて混合
水溶液を作成し、実施例１と同様にしてグルコースセン
サを作製した。

【００２３】《実施例３》実施例１のサイトカラシンＢ
の代わりに、ガラクトース５０μｍｏｌを用いて混合水
溶液を作成し、実施例１と同様にしてグルコースセンサ
を作製した。

【００２４】《実施例４》本実施例では、図４の構成の
バイオセンサを以下のようにして作製した。まず、実施
例１と同様にして、図１の基板１の電極系上に親水性高
分子層７を形成した。次に、ＧＯＤ２００ユニットとフ
ェリシアン化ナトリウム４０μｍｏｌを水１ｍｌに溶解
した混合水溶液を調製した。この混合水溶液を親水性高
分子層７の上に５μｌ滴下し、５０℃の温風乾燥機中で
１０分間乾燥させて、酵素および電子受容体を含む反応
層８’を形成した。

【００２５】つぎに、表１に示す物質の溶液をそれぞれ
調製した。そして、調製した溶液を試料液供給路を形成
する空間部に露出する面１６に３μｌ滴下し、５０℃の
温風乾燥機中で１０分間乾燥して、層１０を形成した。
さらに、レシチンの０．５ｗｔ％トルエン溶液を調製
し、層１０上に滴下し乾燥させて、レシチン層９を形成
した。そして、実施例１と同様にしてグルコースセンサ
を作製した。

【００２６】

【表１】

【００２７】《比較例》実施例４と同様にして、図１の
基板１の電極系上に、親水性高分子層７を形成し、酵素
および電子受容体を含む反応層８’を形成した。そし
て、カバー１１の試料液供給路を形成する空間部に露出
する面１６にレシチン層９を形成して、グルコースセン
サを作製した。

【００２８】試料液として、グルコース濃度が、３００
ｍｇ／ｄｌ、赤血球容積比（ヘマトクリット値）が、０
％（血漿）、２５％、３８％、５０％の血液を調製し
た。そして、ヘマトクリット値が０％の試料液を実施例
１〜４および比較例で作製したグルコースセンサの試料
供給路の開口部１４より供給した。そして、試料液を供
給してから６０秒後に、電極系の対極５を基準にして作
用極４にアノード方向へ＋０．５Ｖの電圧を印加し、５
秒後に測定極と対極に流れる電流値を測定した。同様に
して、ヘマトクリット値が２５％、３８％、５０％の試
料液を用いて、電流値を測定した。

【００２９】実施例３と比較例で作製したバイオセンサ
で得られた電流値を縦軸、ヘマトクリット値を横軸にプ
ロットして、応答特性図を作成した。その結果を図５に
示す。図５より、得られた電流応答値は、試料中のヘマ
トクリット値に関わらず一定であった。しかし、比較例
で作製したグルコースセンサは、ヘマトクリット値の増
加に伴って、電流応答値が減少した。また、実施例１、
２および４で作製したバイオセンサの場合も、実施例３
と同様の結果が得られた。

【００３０】

【発明の効果】上記のように、本発明によるグルコース
センサおよびグルコースの定量法は、血液試料液中に含
まれる成分の影響を抑制することができるため、グルコ
ースの高精度な定量を可能とすることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例で作製したグルコースセンサ
の反応層を除いた分解斜視図である。

【図２】同バイオセンサのカバーとスペーサーを重ね合
わせたカバー部材で、図１とは、上下逆に配置した斜視
図である。

【図３】同グルコースセンサの要部の縦断面図である。

【図４】本発明の他の実施例で作製したグルコースセン
サの要部の縦断面図である。

【図５】実施例３および比較例で作製したバイオセンサ
の応答特性図である。

【符号の説明】

１電気絶縁性の基板２、３リード４作用極５対極６絶縁層７親水性高分子層８、８’ 反応層９レシチン層１０層１１カバー１２スペーサー１３空気孔１４開口部１５スリット１６試料供給路を構成する空間部に露出するカバー部
材側の面

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者吉岡俊彦大阪府門真市大字門真1006番地松下電器産業株式会社内 (72)発明者南海史朗大阪府門真市大字門真1006番地松下電器産業株式会社内Ｆターム(参考） 2G045 AA13 BB60 CA02 CA25 DA31 FA34 FB01 FB05 HA09

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】電気絶縁性の基板、前記基板上に形成さ
れた少なくとも作用極と対極を有する電極系、および前
記電極系上に配置された反応層を具備し、前記反応層
が、少なくとも酵素とグルコーストランスポーターがグ
ルコースに及ぼす作用を抑制する物質とを含有すること
を特徴とするグルコースセンサ。
【請求項２】電気絶縁性の基板、前記基板上に設けら
れた少なくとも測定極と対極を有する電極系、前記基板
に組み合わされて基板との間に前記電極系に試料液を供
給する試料液供給路を形成するカバー部材、前記電極系
上に配置された少なくとも酵素を含有する反応層、およ
び前記反応層の近傍に形成され、グルコーストランスポ
ーターがグルコースに及ぼす作用を抑制する物質を含む
層を具備することを特徴とするグルコースセンサ。
【請求項３】前記物質が、グルコーストランスポータ
ーがグルコースを吸着するのを阻害するものである請求
項１または２記載のグルコースセンサ。
【請求項４】前記物質が、サイトカラシンＢである請
求項３記載のグルコースセンサ。
【請求項５】前記物質が、カルシウム塩である請求項
３に記載のグルコースセンサ。
【請求項６】前記カルシウム塩が、塩化カルシウム、
臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、チオシアン酸カル
シウム、酢酸カルシウム、次亜塩素酸カルシウムおよび
過塩素酸カルシウムからなる群より選ばれる少なくとも
１種である請求項５記載のグルコースセンサ。
【請求項７】前記物質が、ヘキソースである請求項３
に記載のグルコースセンサ。
【請求項８】前記ヘキソースが、ガラクトース、マン
ノース、フルクトース、ソルボース、タロース、タガト
ースおよびプシコースからなる群より選ばれる少なくと
も１種である請求項７記載のグルコースセンサ。
【請求項９】血液中の基質および前記基質と特異的に
反応する酵素を電子受容体の存在下で反応させる工程、
および前記酵素反応に伴って還元された電子受容体を電
気化学的に測定する工程を含み、前記酵素反応の反応系
に、カルシウム塩を含ませて、血液中に含まれる赤血球
がグルコースに及ぼす作用を抑制することを特徴とする
グルコースの定量法。