JP2000338076A - バイオセンサ - Google Patents

バイオセンサ

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JP2000338076A
JP2000338076A JP11145549A JP14554999A JP2000338076A JP 2000338076 A JP2000338076 A JP 2000338076A JP 11145549 A JP11145549 A JP 11145549A JP 14554999 A JP14554999 A JP 14554999A JP 2000338076 A JP2000338076 A JP 2000338076A
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adsorbent
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reaction layer
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Yoshiko Miyamoto
佳子 宮本
Toshihiko Yoshioka
俊彦 吉岡
Shiro Nankai
史朗 南海
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Matsushita Electric Industrial Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 血液中に存在する赤血球による影響を抑制
し、被検物質を高精度に定量できるバイオセンサを提供
する。 【解決手段】 電気絶縁性基板上に作用極と対極からな
る電極、少なくとも酵素、電子受容体および赤血球吸着
剤を含む反応層を設ける。または、赤血球吸着剤からな
る層を、酵素および電子受容体を含む反応層と接触しな
い位置に設ける。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、血液試料中の特定
成分について、迅速かつ高精度な定量を実施するための
バイオセンサに関する。
【0002】
【従来の技術】試料液の希釈や撹拌などを行うことな
く、試料中の特定成分を簡易に定量しうる方式を利用し
た従来のバイオセンサとしては、例えば特開平3−20
2764号公報に開示されたものがあげられる。このバ
イオセンサは、電気絶縁性基板の上にスクリーン印刷な
どの方法で作用極および対極からなる電極を形成し、さ
らに電気絶縁層を形成した後に、上記電極上に親水性高
分子、酸化還元酵素および電子受容体からなる酵素反応
層を形成して得られるものである。そして、試料中に被
検物質として基質を含む試料液を酵素反応層上へ滴下す
ると、酵素反応層が溶解し、ついて基質と酵素の反応に
より基質が酸化し、これにともなって電子受容体が還元
される。この酵素反応が終了した後、還元された電子受
容体を電気化学的に酸化し、このときに得られる酸化電
流値から試料液中の基質濃度が求められる。
【0003】ところが、上記のような従来のバイオセン
サには、同じ濃度の基質を含むが基質以外の成分の濃度
が異なる血液試料について、その基質濃度を測定する場
合、センサの応答特性に差が生じるという問題がある。
なかでも、赤血球の量がセンサの応答特性に影響するこ
とがわかっている。この赤血球の存在に起因する応答特
性の変動を解消する手段として、反応層上に濾過層を設
け、血液試料中の被検物質以外の成分をトラップする方
法が考えられているが、濾過に時間を用意するため測定
に長時間を要するという問題がある。また、血液試料の
成分の相違による応答特性の差を緩和する方法として、
特定の希釈液を用いて血液試料を希釈する方法も有効で
あるが、工程が煩雑になり、基質濃度の測定に手間がか
かるという問題がある。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の目的
は、血液試料中の被検物質以外の成分の影響を受けず、
簡易で高精度の定量が可能なバイオセンサを提供するこ
とにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明は、電気絶縁性基
板、前記基板上に形成された作用極および対極を含む電
極、ならびに前記電極上に配置された少なくとも酵素、
電子受容体および赤血球吸着剤を含有する反応層を具備
するバイオセンサに関する。さらに、本発明は、電気絶
縁性基板、前記基板上に形成された作用極および対極を
含む電極、前記電極上に配置された少なくとも酵素およ
び電子受容体を含有する反応層、ならびに前記反応層に
接触しない赤血球吸着剤を含有する層を具備するバイオ
センサにも関する。これらの場合、赤血球吸着剤がデキ
ストランであるのが好ましい。
【0006】
【発明の実施の形態】前述のように、血液試料中の基質
濃度を測定する場合、赤血球の存在がバイオセンサの応
答特性に悪影響を与える。この原因の一つとして、赤血
球が電極近傍に接近し、電極表面を覆うことが考えられ
る。そのため、電極面積が減少し、赤血球の存在量の違
いによって応答値が変化するのである。そこで、本発明
者らは、バイオセンサ中に赤血球吸着剤を含めて血液試
料中の赤血球を捕捉すれば、赤血球の電極表面への吸着
を抑制し、センサの応答特性の変動を抑制することがで
きる点に着目し、本発明を完成するに至った。すなわ
ち、本発明のバイオセンサは、赤血球吸着剤を酵素およ
び電子受容体とともに反応層に含ませる点、または反応
層とは別に、反応層に接触しない位置に赤血球吸着剤を
含有する層を設ける点に最大の特徴を有する。
【0007】まず、本発明のバイオセンサは血液試料中
の被検物質である基質の濃度を測定するものである。こ
の被検物質としては、例えばグルコース、コレステロー
ル、乳酸、アスコルビン酸、ビリルビン、尿酸などがあ
げられる。つぎに、本発明のバイオセンサを構成する要
素は、概ね従来公知のものでよいが、以下に簡単に説明
する。
【0008】本発明において用いる電気絶縁性基板は、
例えばポリエチレンテレフタレートなどから従来公知の
方法で作製すればよい。また、前記基板上に形成する作
用極および対極を含む電極は、例えば銀、白金などの金
属、もしくは炭素またはこれらの混合物などを用い、例
えばスクリーン印刷法などにより設ければよい。また、
作用極および対極を形成する二極電極系ではなく、より
精度の高い測定をするために参照極を設けて三極電極系
を採用してもよい。
【0009】さらに、基板上に形成された電極の表面
を、後述する酵素などから保護するために、親水性高分
子で被覆するのが好ましい。このような親水性高分子と
しては、例えばカルボキシメチルセルロース、ヒドロキ
シエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、
カルボキシエチルメチルセルロース、ポリビニルピロリ
ドン、ポリビニルアルコール、ゼラチンもしくはその誘
導体、無水マレイン酸もしくはその塩の重合体などがあ
げられる。これらは、センサ応答性に悪影響を与えない
範囲で組み合わせて用いてもよい。
【0010】つぎに、本発明のバイオセンサにおける反
応層は、少なくとも酵素、電子受容体を用いて、従来公
知の方法で形成する。前述のように、赤血球吸着剤をこ
の反応層に含ませてもよい。また、電極上に設けられる
反応層中の酵素および電子受容体と、赤血球吸着剤とを
接触しない構造により、電極への赤血球の接近をより有
効に阻止することができるという点から、赤血球吸着剤
を前記反応層に含ませず、赤血球吸着剤からなる層を、
前記反応層と別個に設けてもよい。ここで、赤血球吸着
剤としては、赤血球を捕捉するものであればよい。例え
ば血液中から白血球を分離するために用いられるデキス
トランなどがあげられる。
【0011】本発明における反応層を構成する酵素は、
被検物質の種類に応じて適宜選択すればよいが、例えば
グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナー
ゼ、ピラノースオキシダーゼ、コレステロールオキシダ
ーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールデ
ヒドロゲナーゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナ
ーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、アスコルビン酸デ
ヒドロゲナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ウリカーゼ
などがあげられる。これらの酵素は、被検物質の種類に
応じて組み合わせて用いてもよい。
【0012】また、前記反応層を構成する電子受容体と
しては、例えばフェリシアン化ナトリウム、フェリシア
ン化カリウム、p−ベンゾキノン、フェナジンメトサル
フェート、インドフェノールもしくはその誘導体、β−
ナフトキノン−4−スルホン酸ナトリウム、β−ナフト
キノン−4−スルホン酸カリウム、メチレンブルー、ま
たはフェロセンもしくはその誘導体などがあげられる。
なかでも、血液中の赤血球に変化を与える可能性が少な
いという点から、フェリシアン化ナトリウムを用いるの
が好ましい。
【0013】前記親水性高分子、酵素および電子受容体
は、溶媒に溶解して本発明のバイオセンサの製造に供す
るが、この溶媒としては、例えば水、リン酸緩衝液、ク
エン酸緩衝液、酢酸緩衝液またはトリス塩酸緩衝液など
の緩衝液などを用いることができる。
【0014】前記反応層中の酵素の含有量は、測定対象
となる試料中の基質の量に影響されることなく酵素反応
が行われる範囲であればよい。前記反応層中の電子受容
体の含有量は、試料中の基質濃度に応じた範囲であれば
よい。反応層中のその他の成分としては、例えば親水性
高分子や緩衝液の成分などを、本発明の効果を損なわな
い範囲で含んでいてもよい。
【0015】また、前記赤血球吸着剤からなる層を設け
る場合は、赤血球吸着剤を水または溶媒に溶解した溶液
を用いて形成する。溶媒としては、前記反応層形成時に
用いたものと同じものを用いることができる。
【0016】ここで、図1に示す本発明のバイオセンサ
の一実施の形態に代表させて、本発明のバイオセンサの
構造について説明する。図1は、本発明のバイオセンサ
の一実施の形態の構造を示す概略縦断面図である。な
お、図1においては、カバーおよびスペーサーは省略し
ている。図1に示すように、本発明のバイオセンサを得
るためには、まず、ポリエチレンテレフタレートからな
る電気絶縁性基板1上に、スクリーン印刷法などにより
銀ペーストなどを印刷してリード2および3を形成す
る。さらに、基板1上には、同様の印刷法により、樹脂
バインダーを含む導電性カーボンペーストなどからなる
作用極4および対極5を含む電極、ならびに電気絶縁性
ペーストなどからなる電気絶縁層6を形成する。電気絶
縁層6は、バイオセンサの性能を一定にして使い捨てに
適したものとするという点から、作用極4および対極6
の露出部分の面積を一定とし、かつリード2および3を
部分的に覆うように形成するのが好ましい。このように
電極を形成した電気絶縁性基板1上に、親水性高分子層
7、酵素、電子受容体および赤血球吸着剤を含む反応層
8を形成する。
【0017】つぎに、図2は、図1に示す本発明のバイ
オセンサの概略分解斜視図を示す。図2に示すように、
カバー12の内側となる部分には、試料の供給を容易に
するために、レシチン層10を形成するのが好ましい。
なお、図1および図2に示す本発明のバイオセンサにお
いては、反応層8に酵素、電子受容体および赤血球吸着
剤を含めたが、赤血球吸着剤を反応層8に含めず、例え
ばカバー12の内側となる部分に、赤血球吸着剤からな
る層9およびレシチン層10を形成してもよい(図3参
照)。
【0018】
【実施例】以下に、実施例を用いて本発明をより具体的
に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるもので
はない。 《実施例1》ここでは、バイオセンサとして、図1に示
す構造を有するグルコースセンサを製造した。まず、絶
縁性基板1上に親水性高分子としてカルボキシメチルセ
ルロース(CMC)の0.5重量%水溶液5μlを電極
表面に滴下し、50℃の温風乾燥機中で10分間乾燥さ
せて親水性高分子層7を形成した。つぎに、酵素として
グルコースオキシダーゼ(EC1.1.3.4、GO
D)200ユニット、電子受容体としてフェリシアン化
ナトリウム40μmol、および赤血球吸着剤としてデ
キストラン30mgを、水1mlに溶解して混合水溶液
を調製した。この混合水溶液5μlを親水性高分子層7
の上に滴下し、50℃の温風乾燥機中で10分間乾燥さ
せて、酵素、電子受容体および赤血球吸着剤を含む反応
層8を形成した。また、レシチンの0.5重量%トルエ
ン溶液を調製し、カバー12の内側に滴下乾燥させて、
レシチン層10を形成した。上記のようにして基板上に
親水性高分子層7、ならびに酵素、電子受容体および赤
血球吸着剤を含む反応層8を形成し、レシチン層10を
カバー側に形成した後、カバー12およびスペーサー1
1を図2中の一点鎖線で示すような位置関係をもって絶
縁性基板1と接着してグルコースセンサを作製した。
【0019】[評価方法]このグルコースセンサの血液
試料として、グルコース濃度が300mg/dl、赤血
球容積比(ヘマトクリット値)が0%(血漿)、25
%、38%および50%の血液を調製した。ヘマトクリ
ット値が0%の試料液3μlを試料供給孔13より供給
すると、血液試料は空気孔14まで達し、反応層8が溶
解した。そして、試料を供給してから60秒後に、電極
の対極5と作用極4の間に+0.5Vの電圧を印加し、
5秒後の電流値を測定した。同様にして、ヘマトクリッ
ト値が25%、38%、50%の試料液を用いて測定し
た。測定結果を図4に示す。図4は、ヘマトクリット値
(%)と電流値(μA)の関係を示す図である。図4よ
り、得られた電流値は、血液試料中のヘマトクリット値
に関わらず、一定であった。
【0020】《実施例2》図3に示す構造を有するグル
コースセンサを製造した。これは、図1に示す構造を有
するグルコースセンサにおいて、反応層8に赤血球吸着
剤を含ませず、別途赤血球吸着剤からなる層を設けたも
のである。絶縁性基板1上にCMCの0.5重量%水溶
液5μlを電極表面に滴下し、50℃の温風乾燥機中で
10分間乾燥させて親水性高分子層7を形成した。つぎ
に、GOD200ユニットとフェリシアン化ナトリウム
40μmolを水1mlに溶解した混合水溶液を調製し
た。この混合水溶液を親水性高分子層7の上に5μl滴
下し、50℃の温風乾燥機中で10分間乾燥させて、酵
素および電子受容体を含む反応層8を形成した。つぎ
に、デキストランの3%水溶液を調製し、カバー12の
内側となる部分に3μl滴下して50℃の温風乾燥機中
で10分間乾燥させ、赤血球吸着剤層9を形成した。さ
らに、レシチンの0.5重量%トルエン溶液を調製し、
赤血球吸着剤層9の上に滴下して乾燥させ、レシチン層
10を形成した。上記のようにして絶縁性基板1上に親
水性高分子層7、ならびに酵素および電子受容体を含む
反応層8を形成し、赤血球吸着剤層9およびレシチン層
10をカバー12側に形成した後、カバー12およびス
ペーサー11を、図2中の一点鎖線で示すような位置関
係をもって絶縁性基板1と接着してグルコースセンサを
作製した。
【0021】得られたグルコースセンサについて、実施
例1と同様にして評価を行った。ヘマトクリット値が0
%の試料液3μlを試料供給孔13より供給すると、血
液試料は空気孔14まで達し、赤血球吸着剤層9と反応
層8が溶解した。そして、試料を供給してから60秒後
に、電極系の対極5と作用極4の間に+0.5Vの電圧
を印加し、5秒後の電流値を測定した。ヘマトクリット
値が25%、38%、50%の試料液を用いて測定した
結果、得られた電流値は、試料中のヘマトクリット値に
関わらず、一定であった。
【0022】《比較例1》電極上に親水性高分子層7な
らびに酵素および電子受容体を含む反応層8を形成し、
カバー12の内側にレシチン層10のみを形成したほか
は、実施例2と同様にして、比較用のグルコースセンサ
を作製した。得られたグルコースセンサについて、実施
例1と同様にしてセンサの応答特性を測定した。その結
果を図3に示す。図3より、電流値は、ヘマトクリット
値の増加にともなって減少した。この減少割合を表1に
示す。なお、ヘマトクリット値が0%のときの電流値を
100とした。
【0023】
【表1】
【0024】《実施例3》本実施例においては、図1に
示す構造を採用し、グルコースオキシターゼ200ユニ
ットの代わりにコレステロールオキシターゼ500ユニ
ットを用いたほかは、実施例1と同様にしてコレステロ
ールセンサを作製し、その評価を行った。このコレステ
ロールセンサの血液試料として、コレステロール濃度が
300mg/dl、赤血球容積比(ヘマトクリット値)
が0%(血漿)、25%、38%および50%の血液を
調製し、実施例1と同様にセンサの応答特性を測定した
ところ、ヘマトクリット値に関わらず、電流値は一定で
あった。
【0025】《実施例4》本実施例においては、図3に
示す構造を採用し、グルコースオキシターゼ200ユニ
ットの代わりにコレステロールオキシターゼ500ユニ
ットを用いたほかは、実施例2と同様にしてコレステロ
ールセンサを作製し、実施例3と同様にしてその評価を
行った。その結果、ヘマトクリット値に関わらず、電流
値は一定であった。
【0026】《実施例5》本実施例においては、図3に
示す構造を採用し、グルコースオキシターゼ200ユニ
ットの代わりに乳酸オキシターゼ500ユニットを用い
たほかは、実施例2と同様にして乳酸センサを作製し、
その評価を行った。血液試料として、乳酸濃度が10m
g/dl、赤血球容積比(ヘマトクリット値)が、0%
(血漿)、25%、38%、50%の血液を調製した。
そして、実施例1と同様にして、センサの応答特性を測
定したところ、ヘマトクリット値に関わらず、電流値は
一定であった。
【0027】
【発明の効果】以上のように、本発明によれば、血液試
料中の被検物質以外の成分、特に赤血球の影響を受け
ず、高精度の定量が可能なバイオセンサを提供すること
ができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明のバイオセンサの一実施の形態の構造を
示す概略縦断面図である。
【図2】図1に示す本発明のバイオセンサの概略分解斜
視図である。
【図3】本発明のバイオセンサの別の一実施の形態の構
造を示す概略縦断面図である。
【図4】実施例1および比較例1におけるヘマトクリッ
ト値(%)と電流値(μA)の関係を示す図である。
【符号の説明】
1 電気絶縁性基板 2 リード 3 リード 4 作用極 5 対極 6 電気絶縁層 7 親水性高分子層 8 反応層 9 赤血球吸着剤からなる層 10 レシチン層 11 スペーサー 12 カバー 13 試料供給路の開口部 14 空気孔

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 電気絶縁性基板、前記基板上に形成され
    た作用極および対極を含む電極、ならびに前記電極上に
    配置された少なくとも酵素、電子受容体および赤血球吸
    着剤を含有する反応層を具備するバイオセンサ。
  2. 【請求項2】 電気絶縁性基板、前記基板上に形成され
    た作用極および対極を含む電極、前記電極上に配置され
    た少なくとも酵素および電子受容体を含有する反応層、
    ならびに前記反応層に接触しない赤血球吸着剤を含有す
    る層を具備するバイオセンサ。
  3. 【請求項3】 赤血球吸着剤がデキストランである請求
    項1または2記載のバイオセンサ。
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