JPH1142098A - 基質の定量法 - Google Patents
基質の定量法Info
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- JPH1142098A JPH1142098A JP9203371A JP20337197A JPH1142098A JP H1142098 A JPH1142098 A JP H1142098A JP 9203371 A JP9203371 A JP 9203371A JP 20337197 A JP20337197 A JP 20337197A JP H1142098 A JPH1142098 A JP H1142098A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/004—Enzyme electrodes mediator-assisted
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
- C12Q1/006—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes for glucose
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 酵素反応により還元された電子伝達体を電気
化学的に酸化し、その酸化電流値から基質を定量する方
法における易酸化性妨害物質の影響を削減し、高精度に
基質の定量をおこなう方法を提供することを目的とす
る。 【解決手段】 本発明による基質の定量法は、試料中の
基質と前記基質に特異的に反応する酸化還元酵素とを電
子伝達体の酸化体の存在下で反応させる第1の工程、お
よび前記第1の工程で還元されなかった前記電子伝達体
の酸化体を電気化学的に還元して還元電流値を得る第2
の工程を有する。
化学的に酸化し、その酸化電流値から基質を定量する方
法における易酸化性妨害物質の影響を削減し、高精度に
基質の定量をおこなう方法を提供することを目的とす
る。 【解決手段】 本発明による基質の定量法は、試料中の
基質と前記基質に特異的に反応する酸化還元酵素とを電
子伝達体の酸化体の存在下で反応させる第1の工程、お
よび前記第1の工程で還元されなかった前記電子伝達体
の酸化体を電気化学的に還元して還元電流値を得る第2
の工程を有する。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、血液、尿、および
果汁などの試料中に含まれる基質を、高精度で迅速かつ
容易に定量する方法に関するものである。
果汁などの試料中に含まれる基質を、高精度で迅速かつ
容易に定量する方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】従来、試料液中の特定成分を、試料液の
希釈や攪拌などを行うことなく簡易に定量する方法とし
て、特定成分とこの特定成分を基質とする酸化還元酵素
とを電子伝達体の存在下で反応させ、還元された電子伝
達体を電気化学的に酸化して得られる酸化電流値より求
める方法がある。この方法は、特開平3−202764
号公報に示されるようなバイオセンサを用いて行われる
のが一般的である。
希釈や攪拌などを行うことなく簡易に定量する方法とし
て、特定成分とこの特定成分を基質とする酸化還元酵素
とを電子伝達体の存在下で反応させ、還元された電子伝
達体を電気化学的に酸化して得られる酸化電流値より求
める方法がある。この方法は、特開平3−202764
号公報に示されるようなバイオセンサを用いて行われる
のが一般的である。
【0003】このバイオセンサは、絶縁性基板上にスク
リーン印刷などの方法によって作用極および対極からな
る電極系を形成し、この電極系上に酸化還元酵素と電子
伝達体を含有する反応層を形成したもので、この絶縁性
基板にカバーおよびスペーサを組み合わせてバイオセン
サを作製している。このようなバイオセンサは、様々な
酸化還元酵素を用いることにより、種々の特定成分を定
量することが可能である。
リーン印刷などの方法によって作用極および対極からな
る電極系を形成し、この電極系上に酸化還元酵素と電子
伝達体を含有する反応層を形成したもので、この絶縁性
基板にカバーおよびスペーサを組み合わせてバイオセン
サを作製している。このようなバイオセンサは、様々な
酸化還元酵素を用いることにより、種々の特定成分を定
量することが可能である。
【0004】バイオセンサの一例として、グルコースセ
ンサについて説明する。グルコースの定量方法として
は、グルコースオキシダーゼと酵素電極または過酸化水
素電極とを組み合わせた方式が一般に知られている(例
えば、鈴木周一編「バイオセンサ−」講談社)。グルコ
ースオキシダーゼは、反応系の酸素を電子伝達体として
基質であるβ−D−グルコースをD−グルコノ−δ−ラ
クトンに選択的に酸化する。この反応にともない、酸素
は過酸化水素に還元される。このときの酸素消費量を酸
素電極によって測定するか、または過酸化水素の生成量
を白金電極等を用いた過酸化水素電極によって測定する
ことによりグルコースの定量が行われる。
ンサについて説明する。グルコースの定量方法として
は、グルコースオキシダーゼと酵素電極または過酸化水
素電極とを組み合わせた方式が一般に知られている(例
えば、鈴木周一編「バイオセンサ−」講談社)。グルコ
ースオキシダーゼは、反応系の酸素を電子伝達体として
基質であるβ−D−グルコースをD−グルコノ−δ−ラ
クトンに選択的に酸化する。この反応にともない、酸素
は過酸化水素に還元される。このときの酸素消費量を酸
素電極によって測定するか、または過酸化水素の生成量
を白金電極等を用いた過酸化水素電極によって測定する
ことによりグルコースの定量が行われる。
【0005】しかし、上記の方法では、測定対象によっ
ては溶存酸素濃度の影響を大きく受け、また酸素のない
条件下では測定が不可能となる。そこで、酸素を電子伝
達体として用いず、フェリシアン化カリウム、フェロセ
ン誘導体、キノン誘導体等の金属錯体や有機化合物を電
子伝達体として用いるタイプのグルコースセンサが開発
されている。このタイプのバイオセンサでは、既知量の
グルコースオキシダーゼと電子伝達体を安定な状態で電
極上に担持させることが可能となり、電極系と反応層を
乾燥状態に近い状態で一体化することができる。このよ
うなグルコ−スセンサは、使い捨て型であり、また測定
器に挿入されたセンサチップに検体試料を導入するだけ
で容易にグルコ−ス濃度を測定できることから、近年多
くの注目を集めている。
ては溶存酸素濃度の影響を大きく受け、また酸素のない
条件下では測定が不可能となる。そこで、酸素を電子伝
達体として用いず、フェリシアン化カリウム、フェロセ
ン誘導体、キノン誘導体等の金属錯体や有機化合物を電
子伝達体として用いるタイプのグルコースセンサが開発
されている。このタイプのバイオセンサでは、既知量の
グルコースオキシダーゼと電子伝達体を安定な状態で電
極上に担持させることが可能となり、電極系と反応層を
乾燥状態に近い状態で一体化することができる。このよ
うなグルコ−スセンサは、使い捨て型であり、また測定
器に挿入されたセンサチップに検体試料を導入するだけ
で容易にグルコ−ス濃度を測定できることから、近年多
くの注目を集めている。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、試料中
の基質は、一連の酵素反応の結果生じた電子伝達体の還
元体を電極上で酸化して得られる酸化電流値から定量さ
れる。試料中には、電子伝達体の還元体を電極上で酸化
するとき、同時に酸化されて酸化電流を生じ、測定結果
に正の誤差を与える易酸化性物質が含まれる場合があ
る。さらに、基質濃度が高い場合は、酸化電流値にばら
つきがみられる。また、この酸化電流値を作用極と対極
を用いて二電極式で測定する場合は、対極上で還元され
る電子伝達体の酸化体の存在が必要となる。基質濃度が
低い場合は、酵素反応によって還元される酸化体の量が
少ないので、この電子伝達体の酸化体の存在を特に留意
する必要はない。
の基質は、一連の酵素反応の結果生じた電子伝達体の還
元体を電極上で酸化して得られる酸化電流値から定量さ
れる。試料中には、電子伝達体の還元体を電極上で酸化
するとき、同時に酸化されて酸化電流を生じ、測定結果
に正の誤差を与える易酸化性物質が含まれる場合があ
る。さらに、基質濃度が高い場合は、酸化電流値にばら
つきがみられる。また、この酸化電流値を作用極と対極
を用いて二電極式で測定する場合は、対極上で還元され
る電子伝達体の酸化体の存在が必要となる。基質濃度が
低い場合は、酵素反応によって還元される酸化体の量が
少ないので、この電子伝達体の酸化体の存在を特に留意
する必要はない。
【0007】しかし、基質濃度が高い場合は、酵素反応
により大部分の電子伝達体の酸化体が還元体になるた
め、対極上で還元され得る酸化体が不足する。その結
果、対極上での還元反応が律速段階となり、得られる電
流測定値に影響を与える。本発明は、対極上での電子伝
達体の酸化体の不足による電流値への影響を抑制し、ま
た易酸化性妨害物質による電流値への影響を削減するこ
とにより、広い濃度範囲、特に高濃度範囲における基質
の定量を高精度におこなう方法を提供することを目的と
する。
により大部分の電子伝達体の酸化体が還元体になるた
め、対極上で還元され得る酸化体が不足する。その結
果、対極上での還元反応が律速段階となり、得られる電
流測定値に影響を与える。本発明は、対極上での電子伝
達体の酸化体の不足による電流値への影響を抑制し、ま
た易酸化性妨害物質による電流値への影響を削減するこ
とにより、広い濃度範囲、特に高濃度範囲における基質
の定量を高精度におこなう方法を提供することを目的と
する。
【0008】
【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み、本発明
による基質の定量法は、試料中の基質と前記基質に特異
的に反応する酸化還元酵素とを電子伝達体の酸化体の存
在下で反応させる第1の工程、および前記第1の工程で
還元されなかった前記電子伝達体の酸化体を電気化学的
に還元して還元電流値を得る第2の工程を有する。
による基質の定量法は、試料中の基質と前記基質に特異
的に反応する酸化還元酵素とを電子伝達体の酸化体の存
在下で反応させる第1の工程、および前記第1の工程で
還元されなかった前記電子伝達体の酸化体を電気化学的
に還元して還元電流値を得る第2の工程を有する。
【0009】
【発明の実施の形態】易酸化性妨害物質には、血液中に
含まれるようなアスコルビン酸や尿酸などがある。この
ような易酸化性妨害物質は、電気化学的に還元されにく
いため、還元電流を生じることはない。従って、一連の
酵素反応で還元されなかった電子伝達体の酸化体を還元
し、得られる還元電流値から基質を定量する方法による
と、易酸化性妨害物質の影響を削減することができ、よ
り精度の高い定量をおこなえる。
含まれるようなアスコルビン酸や尿酸などがある。この
ような易酸化性妨害物質は、電気化学的に還元されにく
いため、還元電流を生じることはない。従って、一連の
酵素反応で還元されなかった電子伝達体の酸化体を還元
し、得られる還元電流値から基質を定量する方法による
と、易酸化性妨害物質の影響を削減することができ、よ
り精度の高い定量をおこなえる。
【0010】還元電流値を二電極式で測定する場合、基
質濃度が低い範囲では、酵素反応によって生じた電子伝
達体の還元体の量は少ないので、電極上の酸化還元反応
は、この還元体の酸化反応が律速段階となり、還元電流
値は、基質濃度の増加とともに増加する。電子伝達体の
酸化体は、基質濃度の増加とともに減少するので、ある
基質濃度から酸化体が不足するようになる。したがっ
て、電極上の酸化還元反応は、電子伝達体の酸化体の還
元反応が律速段階となり、還元電流値が減少しはじめ
る。このときの還元電流値は、酵素反応により還元され
なかった電子伝達体の酸化体の量がそのまま反映するの
で、基質濃度に対して優れた応答特性を有する。
質濃度が低い範囲では、酵素反応によって生じた電子伝
達体の還元体の量は少ないので、電極上の酸化還元反応
は、この還元体の酸化反応が律速段階となり、還元電流
値は、基質濃度の増加とともに増加する。電子伝達体の
酸化体は、基質濃度の増加とともに減少するので、ある
基質濃度から酸化体が不足するようになる。したがっ
て、電極上の酸化還元反応は、電子伝達体の酸化体の還
元反応が律速段階となり、還元電流値が減少しはじめ
る。このときの還元電流値は、酵素反応により還元され
なかった電子伝達体の酸化体の量がそのまま反映するの
で、基質濃度に対して優れた応答特性を有する。
【0011】また、基質濃度が低い範囲でも、電子伝達
体の酸化体の還元反応を律速段階にするために、酵素反
応を電子伝達体の酸化体の存在下で反応させる反応系
に、さらに電子伝達体の還元体を存在させることが好ま
しい。電子伝達体の還元体を反応系に存在させることに
より、より広い濃度範囲での基質の定量を高精度におこ
なうことができるようになる。還元電流の測定方法とし
ては、上記した作用極と対極のみの二電極式と、参照極
を加えた三電極式があり、三電極方式の方がより正確
で、高濃度の基質の定量が可能である。
体の酸化体の還元反応を律速段階にするために、酵素反
応を電子伝達体の酸化体の存在下で反応させる反応系
に、さらに電子伝達体の還元体を存在させることが好ま
しい。電子伝達体の還元体を反応系に存在させることに
より、より広い濃度範囲での基質の定量を高精度におこ
なうことができるようになる。還元電流の測定方法とし
ては、上記した作用極と対極のみの二電極式と、参照極
を加えた三電極式があり、三電極方式の方がより正確
で、高濃度の基質の定量が可能である。
【0012】本発明による基質の定量法を、絶縁性基板
上に形成された少なくとも作用極と対極を有する電極系
と、この電極系上に形成された少なくとも酸化還元酵素
を含む反応層を具備するバイオセンサに利用すると、生
体試料中に含まれる特定成分の定量を高精度で行うこと
ができて好ましい。また、反応層に親水性高分子を含有
させると、電極系表面へのタンパク質などの吸着を防ぐ
ことができて好ましい。さらに、反応層の表面を脂質を
含む層で被覆すると、試料を反応層に円滑に供給するこ
とができるので、用途に応じて用いることができる。
上に形成された少なくとも作用極と対極を有する電極系
と、この電極系上に形成された少なくとも酸化還元酵素
を含む反応層を具備するバイオセンサに利用すると、生
体試料中に含まれる特定成分の定量を高精度で行うこと
ができて好ましい。また、反応層に親水性高分子を含有
させると、電極系表面へのタンパク質などの吸着を防ぐ
ことができて好ましい。さらに、反応層の表面を脂質を
含む層で被覆すると、試料を反応層に円滑に供給するこ
とができるので、用途に応じて用いることができる。
【0013】酸化還元酵素としては、グルコ−スオキシ
ダ−ゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、乳酸オキシダー
ゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ウリカ−ゼ、フルクトース
デヒドロゲナーゼなどを用いることができる。また、グ
ルコースオキシダーゼとインベルターゼ、グルコースオ
キシダーゼとインベルターゼおよびムタロターゼ、フル
クトースデヒドロゲナーゼとインベルターゼなどのよう
に複数の酸化還元酵素を組み合わせてを用いることもで
きる。電子伝達体としては、フェリシアン化カリウム、
p−ベンゾキノン、フェナジンメトサルフェート、メチ
レンブルー、フェロセン誘導体等を用いることができ
る。
ダ−ゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、乳酸オキシダー
ゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ウリカ−ゼ、フルクトース
デヒドロゲナーゼなどを用いることができる。また、グ
ルコースオキシダーゼとインベルターゼ、グルコースオ
キシダーゼとインベルターゼおよびムタロターゼ、フル
クトースデヒドロゲナーゼとインベルターゼなどのよう
に複数の酸化還元酵素を組み合わせてを用いることもで
きる。電子伝達体としては、フェリシアン化カリウム、
p−ベンゾキノン、フェナジンメトサルフェート、メチ
レンブルー、フェロセン誘導体等を用いることができ
る。
【0014】親水性高分子としては、カルボキシメチル
セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコ
ール、ゼラチンおよびその誘導体、アクリル酸およびそ
の塩、メタアクリル酸およびその塩、スターチおよびそ
の誘導体、無水マレイン酸およびその塩、さらに、ヒド
ロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチル
セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒド
ロキシエチルセルロースおよびカルボキシメチルエチル
セルロース等のセルロース誘導体を用いることができ
る。脂質としては、レシチン、ホスファチジルコリン、
ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質で、両親
媒性脂質が好適に用いられる。
セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコ
ール、ゼラチンおよびその誘導体、アクリル酸およびそ
の塩、メタアクリル酸およびその塩、スターチおよびそ
の誘導体、無水マレイン酸およびその塩、さらに、ヒド
ロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチル
セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒド
ロキシエチルセルロースおよびカルボキシメチルエチル
セルロース等のセルロース誘導体を用いることができ
る。脂質としては、レシチン、ホスファチジルコリン、
ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質で、両親
媒性脂質が好適に用いられる。
【0015】
【実施例】以下に、具体的な実施例を挙げて本発明をよ
り詳細に説明する。図1は、二電極式のグルコ−スセン
サの反応層を除いた分解斜視図を示す。ポリエチレンテ
レフタレ−トからなる絶縁性の基板1上に、スクリ−ン
印刷により銀ペーストを印刷し、リ−ド2、3を形成し
ている。ついで、樹脂バインダーを含む導電性カーボン
ペーストを基板1上に印刷して作用極4を形成してい
る。この作用極4は、リ−ド2と接触している。さら
に、この基板1上に、絶縁性ペ−ストを印刷して絶縁層
6を形成している。絶縁層6は、作用極4の外周部を覆
っており、これにより作用極4の露出部分の面積を一定
に保っている。そして、樹脂バインダーを含む導電性カ
ーボンペーストをリード3と接触するように基板1上に
印刷してリング状の対極5を形成している。この絶縁性
基板1、空気孔11を備えたカバー9およびスペーサー
10を図1中の一点鎖線で示すような位置関係をもって
接着し、バイオセンサを作製する。スペーサー10に
は、基板とカバーとの間に試料液供給路を形成するため
のスリット13が設けてある。12は、その試料液供給
路の開口部に相当する。
り詳細に説明する。図1は、二電極式のグルコ−スセン
サの反応層を除いた分解斜視図を示す。ポリエチレンテ
レフタレ−トからなる絶縁性の基板1上に、スクリ−ン
印刷により銀ペーストを印刷し、リ−ド2、3を形成し
ている。ついで、樹脂バインダーを含む導電性カーボン
ペーストを基板1上に印刷して作用極4を形成してい
る。この作用極4は、リ−ド2と接触している。さら
に、この基板1上に、絶縁性ペ−ストを印刷して絶縁層
6を形成している。絶縁層6は、作用極4の外周部を覆
っており、これにより作用極4の露出部分の面積を一定
に保っている。そして、樹脂バインダーを含む導電性カ
ーボンペーストをリード3と接触するように基板1上に
印刷してリング状の対極5を形成している。この絶縁性
基板1、空気孔11を備えたカバー9およびスペーサー
10を図1中の一点鎖線で示すような位置関係をもって
接着し、バイオセンサを作製する。スペーサー10に
は、基板とカバーとの間に試料液供給路を形成するため
のスリット13が設けてある。12は、その試料液供給
路の開口部に相当する。
【0016】図2は、三電極式のグルコースセンサの反
応層を除いた分解斜視図である。対極5の外側に、絶縁
層6から露出させてカーボンペーストからなる参照極1
5を設け、さらにそのリード14を設けた他は図1のも
のと同じ構成である。図3は、本発明を用いる一実施例
として使用したバイオセンサで、スペーサー、カバーを
除いた要部の縦断面図である。図1のようにして電極系
を形成した電気絶縁性の基板1上に、酵素類および電子
伝達体を含む反応層7が形成され、反応層7上にレシチ
ン層8が形成されている。
応層を除いた分解斜視図である。対極5の外側に、絶縁
層6から露出させてカーボンペーストからなる参照極1
5を設け、さらにそのリード14を設けた他は図1のも
のと同じ構成である。図3は、本発明を用いる一実施例
として使用したバイオセンサで、スペーサー、カバーを
除いた要部の縦断面図である。図1のようにして電極系
を形成した電気絶縁性の基板1上に、酵素類および電子
伝達体を含む反応層7が形成され、反応層7上にレシチ
ン層8が形成されている。
【0017】《実施例1》図1の基板1の電極系上に、
グルコースオキシダーゼ(EC1.1.3.4、以下G
ODと略す。)とフェリシアン化カリウムの混合水溶液
を滴下し、乾燥して反応層を形成した。次に反応層上に
レシチンのトルエン溶液を滴下し、乾燥して、レシチン
層を形成した。そして、基板1とカバ−9およびスペ−
サ−10を図1中、一点鎖線で示すような位置関係をも
って接着してグルコ−スセンサを作製した。
グルコースオキシダーゼ(EC1.1.3.4、以下G
ODと略す。)とフェリシアン化カリウムの混合水溶液
を滴下し、乾燥して反応層を形成した。次に反応層上に
レシチンのトルエン溶液を滴下し、乾燥して、レシチン
層を形成した。そして、基板1とカバ−9およびスペ−
サ−10を図1中、一点鎖線で示すような位置関係をも
って接着してグルコ−スセンサを作製した。
【0018】グルコ−ス標準水溶液3μlを試料液供給
路の開口部12より供給した。試料液は、空気孔11部
分まで達し、電極系上の反応層7が溶解した。反応層7
が溶解すると、試料液中のグルコースは、GODによっ
てグルコノラクトンに酸化される。この酵素反応によっ
て、フェリシアン化イオンは、フェロシアン化イオンに
還元される。そして、試料液を供給してから一定時間後
に、対極5を基準にして作用極4に−1.0Vの電圧を
印加した。この電圧の印加により、作用極ではフェリシ
アン化カリウムの還元反応が、そして対極では、フェロ
シアン化カリウムの酸化反応が生じて電流が流れるの
で、電圧を印加した5秒後に電流値を測定した。図4に
グルコース濃度が約700mg/dlのときの電流値を
100%として、各グルコース標準水溶液に対するセン
サの応答特性を示す。
路の開口部12より供給した。試料液は、空気孔11部
分まで達し、電極系上の反応層7が溶解した。反応層7
が溶解すると、試料液中のグルコースは、GODによっ
てグルコノラクトンに酸化される。この酵素反応によっ
て、フェリシアン化イオンは、フェロシアン化イオンに
還元される。そして、試料液を供給してから一定時間後
に、対極5を基準にして作用極4に−1.0Vの電圧を
印加した。この電圧の印加により、作用極ではフェリシ
アン化カリウムの還元反応が、そして対極では、フェロ
シアン化カリウムの酸化反応が生じて電流が流れるの
で、電圧を印加した5秒後に電流値を測定した。図4に
グルコース濃度が約700mg/dlのときの電流値を
100%として、各グルコース標準水溶液に対するセン
サの応答特性を示す。
【0019】グルコース濃度が、0〜700mg/dl
の範囲では、グルコース濃度が増加するにつれて、セン
サ応答が直線的に増加した。これは、酵素反応によって
生じるフェロシアン化イオンの量が少ないため、対極に
おけるフェロシアン化カリウムの酸化反応が律速段階で
あることを示唆している。グルコース濃度が、700m
g/dlを超える範囲では、グルコース濃度が増加する
につれて、センサ応答が減少した。これは、酵素反応に
よって生じるフェロシアン化イオンの量が十分多いた
め、作用極におけるフェリシアン化イオンの還元反応が
律速段階であることを示している。図4に示すように、
基質濃度がどのような濃度範囲にあっても、優れた応答
特性が得られた。
の範囲では、グルコース濃度が増加するにつれて、セン
サ応答が直線的に増加した。これは、酵素反応によって
生じるフェロシアン化イオンの量が少ないため、対極に
おけるフェロシアン化カリウムの酸化反応が律速段階で
あることを示唆している。グルコース濃度が、700m
g/dlを超える範囲では、グルコース濃度が増加する
につれて、センサ応答が減少した。これは、酵素反応に
よって生じるフェロシアン化イオンの量が十分多いた
め、作用極におけるフェリシアン化イオンの還元反応が
律速段階であることを示している。図4に示すように、
基質濃度がどのような濃度範囲にあっても、優れた応答
特性が得られた。
【0020】《実施例2》図1の基板1の電極系上に、
カルボキシメチルセルロース(以下、CMCと略す。)
の水溶液を滴下し、乾燥させてCMC層を形成した。そ
して、実施例1と同様にして、反応層およびレシチン層
を形成した。そして実施例1と同様にして、グルコ−ス
センサを作製し、そのグルコース標準液に対する応答を
測定したところ、実施例1と同様の応答特性が得られ
た。
カルボキシメチルセルロース(以下、CMCと略す。)
の水溶液を滴下し、乾燥させてCMC層を形成した。そ
して、実施例1と同様にして、反応層およびレシチン層
を形成した。そして実施例1と同様にして、グルコ−ス
センサを作製し、そのグルコース標準液に対する応答を
測定したところ、実施例1と同様の応答特性が得られ
た。
【0021】《実施例3》図1の基板1の電極系上に、
CMCの水溶液を滴下し、乾燥させてCMC層を形成し
た。このCMC層上にGODとフェリシアン化カリウム
およびフェロシアン化カリウムの混合水溶液を滴下し、
乾燥させて反応層を形成した。そして、実施例1と同様
にして、グルコースセンサを作製し、そのグルコース標
準液に対する応答を測定した。図5に、グルコース濃度
が、0mg/dlのときに得られた応答電流値を100
%として、各グルコース標準液に対するセンサの応答特
性を示す。
CMCの水溶液を滴下し、乾燥させてCMC層を形成し
た。このCMC層上にGODとフェリシアン化カリウム
およびフェロシアン化カリウムの混合水溶液を滴下し、
乾燥させて反応層を形成した。そして、実施例1と同様
にして、グルコースセンサを作製し、そのグルコース標
準液に対する応答を測定した。図5に、グルコース濃度
が、0mg/dlのときに得られた応答電流値を100
%として、各グルコース標準液に対するセンサの応答特
性を示す。
【0022】図5に示すように、グルコース濃度が増加
するにつれてセンサ応答が減少した。これは、反応層中
にあらかじめフェロシアン化カリウムを含有させたた
め、対極で酸化されるフェロシアン化イオンは常に十分
存在することになり、基質が低濃度であっても、作用極
でのフェリシアン化イオンの還元反応が律速段階となる
ためである。また、基質濃度がどのような濃度範囲にあ
っても、優れた応答特性が得られた。
するにつれてセンサ応答が減少した。これは、反応層中
にあらかじめフェロシアン化カリウムを含有させたた
め、対極で酸化されるフェロシアン化イオンは常に十分
存在することになり、基質が低濃度であっても、作用極
でのフェリシアン化イオンの還元反応が律速段階となる
ためである。また、基質濃度がどのような濃度範囲にあ
っても、優れた応答特性が得られた。
【0023】《実施例4》図2の絶縁性基板1の参照極
15を除く電極系上に、CMCの水溶液を滴下し、乾燥
させてCMC層を形成した。このCMC層上にGODと
フェリシアン化カリウムの混合水溶液を滴下し、乾燥さ
せて反応層を形成した。この反応層上にレシチンのトル
エン溶液を滴下し、乾燥させてレシチン層を形成した。
そして、基板1に、カバー9およびスペーサ10を図2
中の一点鎖線で示すような位置関係をもって接着し、グ
ルコースセンサを作製した。
15を除く電極系上に、CMCの水溶液を滴下し、乾燥
させてCMC層を形成した。このCMC層上にGODと
フェリシアン化カリウムの混合水溶液を滴下し、乾燥さ
せて反応層を形成した。この反応層上にレシチンのトル
エン溶液を滴下し、乾燥させてレシチン層を形成した。
そして、基板1に、カバー9およびスペーサ10を図2
中の一点鎖線で示すような位置関係をもって接着し、グ
ルコースセンサを作製した。
【0024】グルコース標準液3μ1を試料液供給路の
開口部12より供給した。試料液を供給してから一定時
間後に参照極15を基準にして、作用極5に−0.8V
の電位を印加した5秒後に、作用極15と対極8間の電
流値を測定した。図6に、グルコース濃度が、0mg/
dlのときに得られた応答電流値を100%として、各
グルコース標準液に対するセンサの応答特性を示す。図
6に示すように、センサの応答特性は、広い基質濃度範
囲において優れており、6000mg/dl付近までの
定量が可能であった。
開口部12より供給した。試料液を供給してから一定時
間後に参照極15を基準にして、作用極5に−0.8V
の電位を印加した5秒後に、作用極15と対極8間の電
流値を測定した。図6に、グルコース濃度が、0mg/
dlのときに得られた応答電流値を100%として、各
グルコース標準液に対するセンサの応答特性を示す。図
6に示すように、センサの応答特性は、広い基質濃度範
囲において優れており、6000mg/dl付近までの
定量が可能であった。
【0025】《実施例5》実施例4と同様にしてグルコ
ースセンサを作製した。そして、グルコース標準液とし
て既知量のアスコルビン酸を含ませたグルコース標準液
を用いる他は、実施例4と同様にして、センサの応答特
性を測定した。その結果、アスコルビン酸が存在するに
も係わらずセンサの応答特性は、実施例4とほぼ同じで
あり、優れた応答特性を示した。
ースセンサを作製した。そして、グルコース標準液とし
て既知量のアスコルビン酸を含ませたグルコース標準液
を用いる他は、実施例4と同様にして、センサの応答特
性を測定した。その結果、アスコルビン酸が存在するに
も係わらずセンサの応答特性は、実施例4とほぼ同じで
あり、優れた応答特性を示した。
【0026】
【発明の効果】以上のように、本発明によると、広い濃
度範囲、特に高濃度範囲における基質の定量を高精度に
おこなうことができる。
度範囲、特に高濃度範囲における基質の定量を高精度に
おこなうことができる。
【図1】本発明を使用した一実施例である二電極式のグ
ルコ−スセンサの反応層を除いた分解斜視図である。
ルコ−スセンサの反応層を除いた分解斜視図である。
【図2】本発明を使用した一実施例である三電極式のグ
ルコ−スセンサの反応層を除いた分解斜視図である。
ルコ−スセンサの反応層を除いた分解斜視図である。
【図3】同グルコ−スセンサのスペーサー、カバーを除
いた要部の縦断面図である。
いた要部の縦断面図である。
【図4】本発明を使用した一実施例である二電極式のグ
ルコースセンサのグルコース標準試料液に対する応答特
性図である。
ルコースセンサのグルコース標準試料液に対する応答特
性図である。
【図5】本発明を使用した他の実施例である二電極式グ
ルコースセンサのグルコース標準試料液に対する応答特
性図である。
ルコースセンサのグルコース標準試料液に対する応答特
性図である。
【図6】本発明を使用した他の実施例である三電極式の
グルコースセンサのグルコース標準試料液に対する応答
特性図である。
グルコースセンサのグルコース標準試料液に対する応答
特性図である。
1 絶縁性の基板 2、3 リ−ド 4 作用極 5 対極 6 絶縁層 7 反応層 8 レシチン層 9 カバ− 10 スペ−サ− 11 空気孔 12 試料液供給路の開口部 13 スリット 14 リ−ド 15 参照極
Claims (5)
- 【請求項1】 試料中の基質と前記基質に特異的に反応
する酸化還元酵素とを電子伝達体の酸化体の存在下で反
応させる第1の工程、および前記第1の工程で還元され
なかった前記電子伝達体の酸化体を電気化学的に還元し
て還元電流値を得る第2の工程を有することを特徴とす
る基質の定量法。 - 【請求項2】 前記第1の工程の反応系に、さらに電子
伝達体の還元体を存在させる請求項1記載の基質の定量
法。 - 【請求項3】 電気絶縁性の基板、前記基板上に形成さ
れた作用極と対極からなる電極系、および前記電極系上
に配置された酸化還元酵素と電子伝達体を含有する反応
層を具備するバイオセンサを用いる請求項1または2記
載の基質の定量法。 - 【請求項4】 電気絶縁性の基板、前記基板上に形成さ
れた作用極と対極と参照極を有する電極系、および前記
電極系上に配置された酸化還元酵素と電子伝達体を含有
する反応層を具備するバイオセンサを用いる請求項1ま
たは2記載の基質の定量法。 - 【請求項5】 前記反応層が、さらに親水性高分子を含
有する請求項3または4記載の基質の定量法。
Priority Applications (5)
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DE69822949T DE69822949T2 (de) | 1997-07-29 | 1998-07-24 | Verfahren zur quantitativen Messung eines Substrats |
EP98113887A EP0901018B1 (en) | 1997-07-29 | 1998-07-24 | Method for quantitative measurement of a substrate |
US09/122,591 US6225078B1 (en) | 1997-07-29 | 1998-07-27 | Method for quantitative measurement of a substrate |
CN98116847A CN1095991C (zh) | 1997-07-29 | 1998-07-29 | 底物的定量方法 |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH1142098A true JPH1142098A (ja) | 1999-02-16 |
JP3375040B2 JP3375040B2 (ja) | 2003-02-10 |
Family
ID=16472934
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP20337197A Expired - Fee Related JP3375040B2 (ja) | 1997-07-29 | 1997-07-29 | 基質の定量法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6225078B1 (ja) |
EP (1) | EP0901018B1 (ja) |
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CN (1) | CN1095991C (ja) |
DE (1) | DE69822949T2 (ja) |
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