JP2003532090A - 集積センサ・チップを有する生物学的同定システム - Google Patents

集積センサ・チップを有する生物学的同定システム

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Abstract

(57)【要約】 様々なイオン分子および高分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、または蛋白質）を感知または検出することができるマイクロエレクトロメカニカル・システム（ＭＥＭＳ）および集積回路ベースのバイオセンサ（２１０）。ＭＥＭＳベースのバイオセンサ（２１０）は、感度改善およびシステム小型化のためにハイブリダイゼーションおよび酵素増幅スキームと電気化学検出スキームとを利用することができる。１つまたは複数のバイオセンサ（２１０）が、単一基板（２００）上に組み込まれる。好ましくは、バイオセンサ・システムが少なくとも２つの電極を備える。電極は、作業電極（２２０）と、基準電極（２４０）と、カウンタ（補助）電極（２３０）とを備えることができる。１つまたは複数のバイオセンサ（２１０）はまた、小さなスケールでの表面張力を使用して、１つまたは複数のバイオセンサ（２１０）内に試薬および／または溶液を閉じ込めるための装置および方法を提供する。閉込めシステムは、制御可能な表面性質および表面張力を使用して、（１つまたは複数の）試薬および／または（１つまたは複数の）溶液と、１つまたは複数のバイオセンサ（２１０）の構成要素（すなわち電極）との間の制御された接触を提供する。閉込めシステムは、携帯型またはハンドヘルド・デバイス内への１つまたは複数のバイオセンサ（２１０）の組み込みを可能にし、振動および／またはフラッピングに耐性がある。本発明はまた、集積回路（ＩＣ）技術を用いて集積された１つおよび／または複数のバイオセンサ（２１０）を提供する。好ましくは、１つまたは複数のセンサ・システム全体が、単一ＩＣ基板（２００）またはチップ上に製造され、１つまたは複数の完全な検出システムに外部構成要素および／または器具を必要としない。好ましくは、１つまたは複数のセンサ・システムが、シリコン基板（２００）上に、ＩＣプロセスを使用して製造される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、２０００年５月３日出願の米国仮特許出願第６０／２０１６０３号
の特権を特許請求するものである。
【０００２】 （政府出資研究開発に関する陳述） 本発明は、米国海軍省によって与えられたＧｒａｎｔ Ｎｏ．Ｎ６６００１−
９６−Ｃ−８６３２の下で政府支援を受けた。米国政府は、本明細書にいくらか
の権利を有する。
【０００３】 （発明の分野） 本発明の分野は、一般に、イオン分子（例えば、鉄、クロム、鉛、銅、カルシ
ウム、またはカリウム）および高分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または蛋白質
）を含めた様々なターゲット分析物を感知または検出するための装置および方法
に関し、より詳細には、バイオセンサと、バイオセンサを使用する方法と、バイ
オセンサを作成する方法とに関する。
【０００４】 （発明の背景） 病原性バクテリアなどの生体材料を検出するために様々なバイオセンサが開発
されている。バクテリアを検出するための従来の方法は通常、有機体の形態学的
評価を含み、そのような評価に必要な数の有機体の成長に依拠している（または
しばしばそれが必要である）。そのような方法は、時間がかかり、通常は現場条
件下で実用的でない。高速検出および携帯性の要求が、病原体認識を信号変換と
結合するシステムの開発をもたらした。バクテリアの光学検出と電気化学検出の
両方が報告されている（イヴニツキ等，１９９９年、Ｔ．ワン等，２０００年）
（本明細書で引用する文献に対する完全な引用は本明細書の最後に与える）。し
かし、本発明の実体は、電気化学方法のほうが、小型化に関して修正可能である
という利点を有することを突き止めた。
【０００５】 理想的な検出器に対する要件には、比較的短時間で完了させることができるプ
ロトコルを使用する高い特異性および高い感度が含まれる。さらに、小型化し、
自動化することができるシステムが、特に現場で検出が必要とされる場合に、現
在の技術に勝る大きな利点を提供する。
【０００６】 電気化学方法は、電気回路完成の原理を使用する。電気回路を完成させるため
に、カウンタ電極を使用して、試料溶液または試薬に対するリターン経路を提供
し、基準電極を基準点として使用して、それに対して１つまたは複数の別の電極
の電位（典型的には作業電極または測定電極の電位）が求められる。このコンタ
クトは、電気化学手段、すなわち化学溶液または試薬に浸漬された金属電極によ
って提供しなければならないので、電極により発生する電位と直列に電位が発生
するのを回避するのは不可能である。電気化学方法の従来の理論では、基準電極
電位が非常に安定しており、溶液中での化学変化による影響を受けないことが重
要である。したがって、非常に安定した基準電位を提供する銀／塩化銀基準電極
が、今日基準電極に使用される最も一般的なタイプの電極である。
【０００７】 図１を参照すると、典型的な銀／塩化銀基準電極１０が、塩化銀（ＡｇＣｌ）
で飽和された塩化カリウム（３．５Ｍ ＫＣｌ）の溶液５中に浸漬された塩素処
理銀ワイヤ１（塩化銀の層が銀ワイヤ上に被覆されている）を含む。この内部充
填溶液５は、有孔セラミック接合２０を介して電極１０から徐々に浸みだし、基
準要素１と試料の間の電気接続として作用する。安価であり、通常は測定に干渉
しないので、塩化カリウムが使用される。溶液５はまた、基準要素１上のコーテ
ィングの溶解を防止するために塩化銀を含む。したがって、充填溶液穴４０を使
用して、電極１０内の溶液５のレベルを維持する必要がある。
【０００８】 しかし、本発明の実体は、上述した知られている基準電極電位を有する２層の
基準電極（例えば銀で被覆された塩化銀）を必要とせずに、頑強かつ精密な生物
学的検出を、電気化学方法を使用して、より正確にはレドックス（酸化還元）方
法を使用して達成することができることを突き止めた。
【０００９】 次に図２を参照すると、電気化学方法は、フィードバック・ループ内に試験セ
ルが配置された制御増幅器であるポテンショスタット５０を必要とした。目的は
、第３の補助電極（カウンタ電極）８０を介する電流の印加によって、試験電極
（作業電極）６０と基準電極７０の電位差を制御することである。実際、最小限
の構成要素を使用して、かなり良好なポテンショスタットを構築することができ
る。ここで示す回路では、９０Ａおよび９０Ｂは、正のパワー・レールと負のパ
ワー・レールの間に接続された１．２２Ｖバンドギャップ基準ダイオードである
。次いで、ポテンショメータ１００を使用して、主増幅器１１０の非反転入力に
加えられる必要なセル極性を設定する。作業電極６０は回路の接地に接続し、基
準電極７０は、主増幅器１１０の反転入力に接続する。出力能力をいくぶん上げ
るために（ほとんどの動作増幅器が、約２０ｍＡに制限され、容量負荷に良好に
は耐えられない）、単一の利得バッファ増幅器１２０が使用される。好ましくは
、利得バッファ増幅器１２０は増幅器１１０よりもはるかに大きな帯域幅を有す
る。そうでないと、容量電池を駆動するときに回路が振動しやすい。バッファ増
幅器１２０の出力は、電流測定レジスタ１４０を介して補助電極８０に接続する
。次いで差動増幅器１３０を使用して、このレジスタ１４０の両端間の電圧降下
を測定し、それを接地基準出力電圧に変換する。
【００１０】 マイクロエレクトロメカニカル・システム（ＭＥＭＳ）技術は、様々な設計適
用例で感知および作動を行うためにトランスデューサを用意する。ＭＥＭＳ技術
の重要な点は、電子回路と共に集積し、大量にバッチ製造することができるミク
ロンサイズの機械部品を可能にすることである。ＭＥＭＳデバイスは、マイクロ
加工のプロセスによって製造され、バッチ製造プロセスはリソグラフィを採用す
る。マイクロ加工は、事前設計レジスト・パターン（マスク）を使用して３次元
構造を作成するために、リソグラフィ方法の使用に大きく依拠している（ホーお
よびタイ，１９９６年，１９９８年）。ＭＥＭＳは、マイクロ製造デバイスまた
はその態様を作成するための１つの適切な技術である。マイクロ製造デバイスは
通常、ＭＥＭＳおよび／または集積回路（ＩＣ）技術を使用することによって製
造されるデバイスと定義される。集積回路（ＩＣ）は、基板材料の小さなチップ
と定義され、その上に、電子構成要素およびその相互接続の複合体がエッチング
される、または印刷される。
【００１１】 本発明の実体は、電気化学方法に固有の小型化および携帯性の特徴が、この方
法を、ＭＥＭＳデバイスへの集積に優れた候補にすること、さらに様々なイオン
分子および高分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、または蛋白質）を検出するためにＭＥＭＳ
技術をバイオセンシング方法と統合することが有利であることを突き止めた。
【００１２】 また、本発明の実体は、バクテリアのバイオセンシングの分野で、高い特異性
を達成する最も効果的な手段の１つはバクテリアの遺伝材料（例えばｒＲＮＡ、
ｍＲＮＡ、変性ＤＮＡ）を検出することであることを突き止めた。ターゲット・
バクテリアのｒＲＮＡまたはｓｓＤＮＡのみに配列が相補的である一本鎖ＤＮＡ
（ｓｓＤＮＡ）プローブを選択することによって、ハイブリダイゼーション・イ
ベントの監視が、ターゲット細胞の選択的センシングを可能にする。感度を最大
にするために、ハイブリダイゼーション・イベントと酵素反応の組合せが信号増
幅をもたらす。これは、各基質から生成物への転換が信号全体に寄与するためで
ある。酵素反応によって増幅されるＤＮＡハイブリダイゼーションを検出するた
めのバイオセンシングは、本発明によれば、依然として比較的短時間で完了する
ことができる。
【００１３】 したがって、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する原型電流測定検出
器が、上述した決定および技術に基いて開発されている（チェン等，２０００年
、ガウ等，２０００年）。ＭＥＭＳ、自己組織化単層（ＳＡＭ）、ＤＮＡハイブ
リダイゼーション、および酵素増幅の技術は全て、小型化された特定の高感度Ｅ
．ｃｏｌｉ検出器の設計に寄与する。ＤＮＡ電気化学プローブは、すでに報告さ
れており（ワン等，１９９７年、マラザ等，１９９９年）、通常はグラファイト
または炭素電極が使用される。使い捨て試験ストリップ上のスクリーン印刷炭素
電極を使用する、Ｅ．ｃｏｌｉからのＤＮＡの電流測定検出用の市販ユニットも
利用可能である。スクリーン印刷は、低コストであるという利点を有するが、高
次元精度を達成することは容易でない。そこで、本発明の実体は、金属（例えば
Ａｕ、Ａｇ）や炭素など広い範囲の材料をμｍサイズ寸法で正確にパターン形成
するためにリソグラフィを使用する方法を開発する必要性を突き止めた。さらに
、ビオチン−ＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨドデカンアミドの自己組織化単層（ＳＡＭ）
など表面修正を利用することが、ＭＥＭＳ表面上で分子を選択的に不動化する１
つの好ましい方法である。Ａｕ、Ａｇ、および他の金属上へのＳＡＭの形成がよ
く研究されており（レベル等，１９９８年、モテシャライ等，１９９８年、シャ
ー等，１９９８年、ライリ等，１９９９年）、蛋白質および他の生体分子を、Ｓ
ＡＭを使用してＡｕなどの表面上に簡単に不動化することができる（オスツーニ
等，１９９９年、ケーン等，１９９９年、スピンケ等，１９９３年、ハウスリン
グ等，１９９１年）。基板上でＳＡＭを使用する電流測定方法は、ターゲット分
析物を正常に検出することができることが実証されている（サン等，１９９８年
、ホウ等，１９９８年、マーシー等，１９９８年）。
【００１４】 このＥ．ｃｏｌｉ検出システムで、本発明は、各技術に固有のいくつかの利点
を識別し、利用する。ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび酵素増幅を使用して
、本発明は、必要な特異性および感度を達成する。ＭＥＭＳおよびＳＡＭを使用
して、本発明の実体は、携帯型器具内に開発することができる小型システムを製
造した。最後に、本発明は、この検出システムが広い範囲の病原性バクテリアに
適用可能であることを実証した。例えば、検出モジュールおよびアッセイ・プロ
トコルを、尿路病原性バクテリアの検出、および中耳炎（中耳感染）をもたらす
微生物の同定に適合させることができる。
【００１５】 したがって、本発明の目的は、新規なバイオセンサと、バイオセンサを使用す
る新規な方法と、バイオセンサを作成する新規な方法とを提供することである。
この目的は、主要な請求項の特徴の組合せによって解決され、従属請求項がさら
に、本発明の有利な実施態様を開示する。
【００１６】 （発明の概要） 本発明のこの概要は、本明細書で詳述する全ての必要な特徴を必ずしも説明す
るものではなく、本発明はまた、ここで説明する特徴、および本明細書の他の場
所で説明する特徴の副次的組合せも含む。
【００１７】 本発明の第１の態様は、単一基板（シリコン、ガラス、プラスチックなど）に
組み込まれたバイオセンサを使用して、特に高分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、
または蛋白質）およびイオン分子（例えば、鉄、クロム、鉛、銅、カルシウム、
またはカリウム）を含めた様々なターゲット分析物を感知または検出する装置お
よび方法を提供する。基板に構成されたバイオセンサ・システムは、通常は、基
板上に単一シリーズ・マイクロ製造プロセス・ステップとして一体に製造された
少なくとも２つの電極を備える。しかし、システムを製造するために連続マイク
ロ製造ステップを採用することもできる。
【００１８】 １つの好ましい実施態様では、電極は全て、（例えば従来技術のＡｇ／ＡｇＣ
ｌ電極に比べて）純粋な金属から作成される。別の好ましい実施態様では、基板
に構成されたバイオセンサ・システムが、作業電極、基準電極、およびカウンタ
（補助）電極を備える。好ましくは、基板に構成されたバイオセンサ・システム
は、従来の電気化学バイオセンサと同じ電気化学性能を有する。さらに、基板に
構成されたバイオセンサ・システムは、集積回路（ＩＣ）および／またはＭＥＭ
Ｓ製造プロセスに適合性があり、かつ小さな領域に構成することができるものに
すべきである。
【００１９】 本発明の第２の態様は、小さなスケールでの表面張力を使用して、バイオセン
サ内に試薬および／または溶液を閉じ込める装置および方法を提供する。試薬お
よび／または溶液は、生物学的センシングに必要とされる必要な電解質および／
または分析物を含む。
【００２０】 １つの好ましい実施態様では、本発明の装置および方法は、制御可能な表面性
質および小さなスケールでの表面張力を使用することによって、様々なイオン分
子（例えば鉄、クロム、鉛、銅、カルシウム、またはカリウム）および高分子（
例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、または蛋白質）を感知または検出するために使用される
各電極を、電解質および／または分析物が必要とされるときに試薬および／また
は溶液と選択的に接触できるようにする。
【００２１】 別の好ましい実施態様では、表面張力を使用して試薬および／または溶液（し
たがって、試薬および／または溶液中の電解質および／または分析物）を閉じ込
めるための装置および方法が、携帯型またはハンドヘルド・デバイスに組み込ま
れ、デバイスの振動に対する耐性をもつ。さらに、試薬および／または溶液は、
バイオセンサが逆さになったとしても表面張力を使用してバイオセンサによって
定位置に堅く保持されるべきである。
【００２２】 本発明の第３の態様は、集積回路（ＩＣ）技術を用いて、１つおよび／または
複数の電気化学センサの構成要素（例えば電極）と、１つまたは複数の電気化学
センサ内の追加の必要な電子回路構成要素（例えば増幅器）とを集積する装置お
よび方法を提供する。１つおよび／または複数のセンサ・システム全体を、単一
の半導体（例えばシリコンまたはガリウム砒素）基板またはチップなど、単一の
ＩＣ基板またはチップ上に組み込むことができる。好ましくは、１つまたは複数
のシステムを完成させるのに、外部構成要素および／または器具が全く必要ない
、またははるかに少数しか必要とされない。１つまたは複数のセンサは、好まし
くは、ＩＣプロセスを使用して製造される。
【００２３】 高分子電気化学検出に使用される任意の実施態様で、本発明の好ましい特徴は
、少なくとも１つの電極の表面を修正することである。好ましくは、表面は、表
面上に高分子を係留するように修正される。好ましくは、表面は、ビオチンスト
レプトアビジンなど自己組織化単層（ＳＡＭ）を使用して修正される。好ましく
は、ＳＡＭは、電気化学センサ内の作業電極の表面上に配置される。任意選択で
、ゾルゲルおよび／または炭素ペーストなどの材料を使用して表面を修正するこ
とができる（ＳＡＭの代用として、またはＳＡＭと組み合わせて）。
【００２４】 上述した「発明の概要」は、例示のみを表し、限定を与えない。本発明のさら
なる実施形態および副次的組合せ、修正、変更、および強化は、本明細書で以下
に続く発明の詳細な説明で明らかになろう。
【００２５】 図面中、いくつかの図を通じて同じ参照番号が同じ要素を示す。
【００２６】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 次に、本発明の特定の実施形態を図面を参照しながら説明するが、本発明の精
神、範囲、および企図から逸脱することなく様々な変更および修正を加えること
ができることを理解されたい。実際、図面および本明細書での説明は、例として
提供されており、限定を与えるものではない。
【００２７】 本発明の第１の形態は、電気化学検出の原理を使用する様々なターゲット分析
物、特にイオン分子（例えば、鉄、クロム、鉛、銅、カルシウム、またはカリウ
ム）および高分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または蛋白質）の検出に関する。
電気化学検出の原理は、レドックス電池の使用と、電池内での電気化学反応とを
必要とする。
【００２８】 レドックス電池は、電池内で化学反応が起きたときに化学エネルギーを電気エ
ネルギーに変換する、または電気エネルギーを化学エネルギーに変換するデバイ
スである。典型的には、この電池は、水溶液（電解質）中に浸漬された３つの電
極からなり、電極溶液面で電極反応が生じる。
【００２９】 電池は、イオン伝導相（例えば、水溶液または非水溶液、溶融塩、イオン伝導
固体）によって接続された２つの電子伝導相（例えば、固体または液体金属、半
導体など）からなる。電流が流れる際、電子電流からイオン電流へモードを変更
し、電子電流に戻さなければならない。伝導モードのこの変更には、酸化還元反
応が伴う。各モード変更反応は半電池と呼ばれる。
【００３０】 各電気化学反応は、レドックス電池内で生じる酸化還元（レドックス）反応で
ある。例えば、酸素によって水素を酸化して水を生成する間の自発的「化学反応
」では、電子は、水素から酸素に直接移る。対照的に、レドックス電池内での自
発的電気化学反応では、２つの個別電極反応が、実質的に同時に、または並行し
て発生する。
【００３１】 レドックス電池の重要な特徴は、同時に発生する酸化還元反応が、空間的に離
れていることである。例えば、水素は、電子をアノード電極に移動することによ
ってアノード電極で酸化され、酸素は、電子をカソード電極から受け取ることに
よってカソード電極で還元される。全電気化学反応は、２つの電極反応を合わせ
たものである。電極反応で発生するイオン、この場合はプラスの水素イオンとマ
イナスの水酸イオンが、溶液中で再結合されて、反応の最終生成物である水を生
成する。
【００３２】 このプロセス中、電子は、電子電流を測定することができる外部電気回路を介
してアノード電極からカソード電極に伝導される。この反応を逆にすることもで
きる。電解槽内に電力を印加することによって水を水素と酸素に分解することが
できる。
【００３３】 本発明の３電極システムは、作業電極、カウンタ電極（または補助電極）、お
よび基準電極を含む電気化学電池である。電流が、作業電極とカウンタ電極の間
を流れることができ、作業電極の電位が基準電極に対して測定される。このセッ
トアップは、作業電極表面上、または電気分析適用例で発生する電極反応の速度
論および機構を検査するために、基本的な研究で使用することができる。本発明
の好ましい実施形態での検出モジュールは３電極システムに基づいている。
【００３４】 カウンタ電極は、電流を作業電極に印加することができるように電解質への電
気接続を形成するために使用される。カウンタ電極は通常、その溶解を回避する
ために不活性材料（貴金属または炭素／グラファイト）から作成される。本発明
に関連して、大きな電流がカウンタ電極から引き出されたときに、カウンタ電極
での小さなフィーチャまたは小さな断面が周囲溶液を加熱することが観察された
。電流が連続的にオーバーフローした場合には気泡が発生し、最終的には電極の
溶解が生じる。したがって、電流および／または電極サイズを制御することによ
って気泡発生を回避することができる。本発明の１つの好ましい実施形態では、
カウンタ電極の幅を、大きな電流のときでさえこの加熱の問題を回避するのに十
分な大きさにする。
【００３５】 基準電極は基準点として使用され、その基準点に対して他の電極の電位（典型
的には作業電極または測定電極の電位）を電気化学電池内で測定することができ
る。銀／塩化銀電極、カロメル電極、または水素電極などいくつかの一般的に使
用されている（通常は市販されている）電極アセンブリは全て、電池内で使用さ
れる電解質とは無関係に電極電位を有する。しかし、本発明の実体は、金電極の
単一層など単一層電極が基準電極に関する要件を満たす場合があることを突き止
めた。さらに、銀、銅、白金、クロム、アルミニウム、チタン、ニッケルなど他
の材料も、正しい条件下で単一層基準電極として働く場合がある。
【００３６】 作業電極は、本発明の電気化学バイオセンサで中心的な役割をする。作業電極
で発生する反応を使用して、電解質溶液の電気化学分析を行うことができる。作
業電極は、加えられる極性に応じて、アノードまたはカソードとして働くことが
できる。いくつかの「従来型２電極」電池における電極の１つも、例えば、（基
準電極に対する）測定電極の電位が溶液中の１つの種の濃度の尺度である電位差
測定電気分析セットアップでは、「作業」（「測定」、「インジケータ」、また
は「感知」）電極と考えることができる。
【００３７】 １つの好ましい３電極実施形態では、カウンタ電極および基準電極が、バイオ
センサの作業電極の周縁の周りに概して延在するように構成される。適切な構成
は、例えば図３、４、５、１２、１３、および２３に見られる。
【００３８】 １つの好ましい実施形態では、電気化学バイオセンサは、マイクロエレクトロ
メカニカル・システム（ＭＥＭＳ）技術を使用して製造される。ここで図３を参
照すると、二酸化珪素（ＳｉＯ２、１０００Å）の層が、ベア・シリコン・ウェ
ハ２００（第１級、ｐ型＜１００＞、厚さ５００〜５５０μｍ）上に堆積され、
窒化珪素（Ｓｉ３Ｎ４、１０００Å）の下でパッド層として働いて、応力を解放
し、接着性を改善する。複数のＭＥＭＳバイオセンサ（バイオセンサ２１０など
）が、様々な寸法の作業電極（作業電極２２０など）と共に製造された。好まし
くは、各作業電極は、エッチングされて、深さが最大３５０μｍのウェルを形成
する。
【００３９】 窒化物被覆シリコン・ウェハ２００は、パターン形成され、［１１１］および
［１００］結晶面に沿ってＫＯＨを使用してバルク・エッチングされる。ウェル
の深さは、ＫＯＨエッチング時間および温度によって制御される。１００μｍ幅
の補助電極（補助電極２３０など）および基準電極（基準電極２４０など）が、
対応する作業電極２２０から２００μｍだけ離隔される。図３は、ＭＥＭＳバイ
オセンサ（バイオセンサ２１０など）を製造する際に使用されるパターンの概略
図を示す。
【００４０】 窒化物および酸化物がＨＦエッチングによって除去されて内部応力が解放され
、電気絶縁のために別の酸化物層（５０００Å）が堆積された。電極は、ＰＲ５
２１４フォト・レジスト・リバース・イメージングおよびＡｕ（２０００Å）／
Ｃｒ（２００Å）の電子ビーム堆積を用いた電子リフトオフ・プロセスによって
パターン形成された。最後に、ウェハ２００が、１５０℃で１０分のホット・ベ
ークの後、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）蒸気中に３分間浸されて、周囲
のＳｉ領域に疎水性表面が生成された。作業電極（作業電極２２０など）の３次
元性質と共に、周囲領域の疎水性が、溶液中の対象の分子を作業電極に不動化す
る初期センシング・ステップ中に、作業電極２２０上での液体水滴の封じ込めを
可能にする。この設計は、ＭＥＭＳアレイの他の領域への生体分子の不特定結合
を効果的に最小限に抑えた。
【００４１】 好ましくは、全ての電気化学電極に使用される材料が金（Ａｕ）である。ＭＥ
ＭＳ技術で利用可能ないくつかの伝導材料が、リフトオフ・プロセスによってシ
リコン基板上にパターン形成され、３電極システムの特徴が、フェリシアン化物
溶液を用いてサイクリック・ボルタンメトリによって試験された。金、白金、チ
タン、アルミニウム電極の様々な組合せが試験され、Ａｕ／Ａｕ／Ａｕの３電極
システムが最良のＣ−Ｖ曲線およびレドックス特性を与えた。
【００４２】 図４は、バイオセンサ３１０など複数の円形バイオセンサを有する正方形基板
３００（シリコン、ガリウム砒素、プラスチック、および／またはガラスなど）
上に製造されたバイオセンサの一実施形態を示す。バイオセンサ３１０は、作業
電極３２０、基準電極３３０、およびカウンタ（補助）電極３４０を備える。前
述したように、好ましくは、電極が、ＭＥＭＳ技術で利用可能な伝導材料の単一
層から構成される。さらに、好ましくは、全ての電極を金（Ａｕ）で構成すべき
である。
【００４３】 図５は、本発明のさらに別の好ましい実施形態を示す。バイオセンサ４１０が
、基板上に製造された作業電極４２０と、基準電極４３０と、カウンタ（補助）
電極４４０とを備える。好ましくは、電極は金から作成される。作業電極４２０
は、基板内にある、深さが最大３５０μｍのビルトイン・ウェル４５０内に形成
される。ウェル４５０は、よく区画された空間内部に所望の試薬を閉じ込めるよ
うに設計されている。図５に示されるように、本明細書で説明するマイクロ製造
方法によって製造されるウェル４５０は、ＫＯＨエッチングの後に（１１１）シ
リコン面によって境界を画される。上述したマイクロ製造方法によって形成され
る作業電極４２０は、ウェル４５０表面全体をカバーする。
【００４４】 動作の際、上述した実施形態は、製造が容易であるという利点を有し、基板上
に、単一シリーズ・マイクロ製造プロセス・ステップとしてまとめて製造するこ
とができる。しかし、製造に連続マイクロ製造ステップを採用することもできる
。さらに、以下に示す分析および実験のように、これらの低コストであり、製造
が容易なバイオセンサは、再利用可能であり、従来のバイオセンサと同じ頑強性
および可逆電気化学性質を有する。
【００４５】 １つの実験では、サイクリック・ボルタンメトリ（ＣＶ）分析技法が使用され
る。ＣＶは、電気活性種およびバイオセンサの特徴の研究で使用される最も多用
途の分析技法の１つである。電気化学システムの基本的な特徴では、産業および
学術研究ツールとして広く使用されている。サイクリック・ボルタンメトリでは
、制御された（典型的には固定された）掃引速度（Ｖ／秒）で初期電位（Ｅ０）
から最大電位（Ｅｍ）に電位が傾斜している。図６はその概念を例示する。分析
物の還元および酸化の反復サイクルは、作業電極内外で交互にアノード電流とカ
ソード電流を発生する。溶液および／または試薬が攪拌されないので、様々な分
析物濃度および様々なスキャン率で拡散効果が観察される。
【００４６】 アノード電流ピーク（ｉｐａ）とカソード電流ピーク（ｉｐｃ）の離隔距離を
使用して、レドックス反応に関わる電子の数を予測することができる。ピーク電
流はまた、分析物濃度Ｃ、およびスキャン率ｖに正比例している。実験結果は通
常、図７に示したグラフと同様に、電流対電位としてプロットされる。
【００４７】 図７に示されるＣＶスキャンでは、電位が、ｘ軸に沿ってグラフに描かれてお
り、より正（または酸化）の電位が右にプロットされており、より負（または還
元）の電位が左にプロットされている。電流は、ｙ軸にプロットされており、カ
ソード（すなわち還元）電流が負の方向に沿って下へプロットされており、アノ
ード（すなわち酸化）電流が正方向にプロットされている。
【００４８】 以下に述べる制御実験で使用された分析物は、窒化カリウムＫＮＯ３（１０１
．１１ｇ／ｍｏｌ）の緩衝液中で＋３酸化状態の鉄原子（ＦｅＩＩＩ）を含むフ
ェリシアン化カリウムＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６（３２９．２６ｇ／ｍｏｌ）であった
。作業電極の表面で、単一の電子をフェリシアン化物陰イオンに追加することが
できる。これは、その陰イオンを、＋２酸化状態の鉄原子（ＦｅＩＩ）を含むフ
ェリシアン化物陰イオンＦｅＩＩ（ＣＮ）６ ４−に還元させる。分析物と電極の
この単純な１電子交換は、良好に挙動する可逆反応である。これは、分析物を、
ＦｅＩＩ（ＣＮ）６ ４−に簡単に還元し、その後、酸化してＦｅＩＩＩ（ＣＮ）６ ３− に簡単に戻すことができることを意味する。
【００４９】 レドックス・カップルは、酸化状態のみが異なる一対の分析物である。ＦｅＩ ＩＩ （ＣＮ）６ ３−／ＦｅＩＩ（ＣＮ）６ ４−レドックス・カップルに関する電
気化学半反応は、以下のように書くことができる。 FeIII(CN)6 3-+e-⇔FeII(CN)6 4- E0=+0.358V(NHE) （１）
【００５０】 図８に示されるボルタモグラムは、一方がカソードのピーク（ｉｐｃ）であり
他方がアノードのピーク（ｉｐａ）である２つの非対称ピークを示す。標準水素
電極（ＮＨＥ）など標準の基準電極を使用すると、この半反応に関連する見掛電
位は＋３５８ｍＶ前後になる。作業電極が、＋４００ｍＶよりもプラス側の電位
で保持される場合、分析物は、ＦｅＩＩＩ（ＣＮ）６ ３−形態に酸化される傾向
がある。作業電極でのこの酸化は、溶液から電極内に電子を進めて、アノード電
流をもたらす。＋４００ｍＶよりもマイナス側の電位では、分析物がＦｅＩＩＩ （ＣＮ）６ ４−に還元される傾向がある。作業電極でのこの還元は、電極から溶
液中に電子を流して、カソード電流をもたらす。本発明の好ましいセンサ設計実
施形態は、ＮＨＥ、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）、または飽和カロメル電極（
ＳＣＥ）など標準の基準電極を利用しないので、かつ３つの電極全てが金（Ａｕ
）であるので、この実験での静止（不偏）電位が０ボルトに近づく。
【００５１】 サイクリック・ボルタモグラムの重要なパラメータは、カソードおよびアノー
ド・ピーク電流（それぞれｉｐｃおよびｉｐａ）、ならびにこれらの電流が観察
される電位（それぞれＥｐｃおよびＥｐａ）の大きさである。これらのパラメー
タを使用して、見掛還元電位（Ｅ０、これはＥｐａとＥｐｃの中間に取られる）
、および電荷移動反応で輸送される電子の数（ｎ）を計算することができる。
【００５２】 ピーク電流（ｉｐａまたはｉｐｃ）は、ランドルス・セヴシックの式で表すこ
とができる。 ｉｐ＝０．４４６３ｎＦＡＣ［ｎＦｖＤ／ＲＴ］１／２ （２） ここで、 ｎ＝レドックス・カップルに関する半反応で現れる電子の数 Ｆ＝ファラデー定数（９６４８５Ｃ／ｍｏｌ） Ａ＝電極面積（ｃｍ２） ｖ＝電位が掃引される速度（Ｖ／秒） Ｄ＝分析物の拡散係数（ｃｍ２／秒） Ｒ＝一般気体定数（８．３１４Ｊ／ｍｏｌ・Ｋ） Ｔ＝絶対温度（Ｋ） である。２５℃で、ランドルス・セヴシックの式は、以下のように変形すること
ができる。 ｉｐ＝（２．６８７×１０５）ｎ３／２ｖ１／２Ｄ１／２ＡＣ （３） ここで、この定数は単位を有する（すなわち２．６８７×１０５Ｃｍｏｌ−１Ｖ−１／２ ）。
【００５３】 ランドルス・セヴシックの式は、ボルタモグラムが様々なスキャン率で取られ
たときに、掃引速度の平方根にピーク電流が比例することを予想している。図９
に示されるように、ピーク電流と掃引速度の平方根との関係のプロットは直線に
なる。ランドルス・セヴシックの式を、以下のように、この直線の傾きに関する
表現を与えるように修正することができる。 傾き＝（２．６８７×１０５Ｃｍｏｌ−１Ｖ−１／２）ｎ３／２Ｄ１／２Ａ
Ｃ （４） ピーク電位およびピーク電流に依存するスキャン率を用いて、レドックス反応に
関与する電子の数を評価し、かつ反応全体での可逆性の度合の定性的評価を与え
る。可逆レドックス・カップルに関して電極反応（ｎ）中に移動される電子の数
は、ピーク電位の離隔距離（ΔＥｐ＝Ｅｐａ−Ｅｐｃ）から求められる。単純な
可逆（高速）レドックス・カップルでは、アノード・ピーク電流とカソード・ピ
ーク電流の比が１となるはずである。好ましいセンサ設計を使用した実験の結果
は、１からわずかしかずれない。大きな逸脱は、電極プロセスに関連する干渉化
学反応を示し、しかし１からのわずかな逸脱は、理想的なシステムではないこと
を単に示唆するにすぎない。図１０は、第１のサイクルからわずかに逸脱した１
２の連続サイクルに関するＣＶスキャンを示す。これらの結果は、明らかに、高
い可逆性のあるシステムと、頑強な電池設計とを示す。
【００５４】 従来のセンサと同じ性能を有しながら容易に、かつ安価に製造することに加え
、本発明の上述した実施形態はまた、集積回路（ＩＣ）およびＭＥＭＳ製造プロ
セスに適合性があるという利点を有する。さらに、図３および４に示されるよう
に、これらの実施形態は、バイオセンサのアレイ内で、小さい領域内に構成する
ことができる。
【００５５】 本発明の第２の態様は、小さなスケールでの表面張力を使用する、バイオセン
サの試薬および／または溶液の閉込めに関する。試薬および／または溶液は、バ
イオセンシングに必要な（１つまたは複数の）ターゲット分析物および／または
（１つまたは複数の）化学物質を含む。
【００５６】 バイオセンサの性能は、その特異性および感度によって主に決定される。シリ
コンなどの基板上に試薬を閉じ込めるという概念は本発明に関連する研究で発見
され、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの分析物または他の
試薬もしくは溶液成分が作業電極の周縁の周りの領域上に不特定結合し、高い検
出ノイズを生じ、高い偽陽性率を生み出すことによって生じる高レベルの検出ノ
イズを低減するための解決策となる。ＨＲＰは、本実施形態ではシグナリング酵
素として使用される。表面のＨＲＰ残留物からノイズが生じないことを検証する
ために、簡単な試験を行って、この望ましくない結合の寄与を推定する。ＨＲＰ
は、ベア・シリコン・チップに導入され、その後、基板溶液の追加前にいくつか
の洗浄ステップが行われた。基板溶液を追加した後、非常に高レベルの酵素反応
が即座に観察された。
【００５７】 予想されるように、ＨＲＰは、他の蛋白質と同様に、シリコン表面に簡単かつ
密接に付着する。不特定結合を低減する大きな改良は行わずに、いくつかの市販
されている洗浄溶液および阻止蛋白質が試験された。その結果、望ましくない結
合の効果を回避する最良の方法は、まずそれが起こらないようにすることである
ことが突き止められた。本発明のバイオセンサの作業電極の外側の領域は、生物
学的センシングを達成するためにＨＲＰ溶液にさらす必要はない。しかし、従来
技術では、常に水成システム中に３つの電極全てを浸漬することが慣例であり、
全ての試薬が表面領域全体を介して流れる。
【００５８】 本発明の実体によって発見された、よく区画された空間内部に何らかの試薬を
閉じ込めるための最も簡単な方法は、バイオセンサ内にウェルを形成することで
ある。図５に示されるように、マイクロ製造ウェルは、ＫＯＨエッチングの後、
シリコン結晶面４００によって境界を画される。リフトオフ・プロセスによって
形成される作業電極４２０がウェル表面全体をカバーする。したがって、不特定
結合する可能性がある試薬または溶液含有成分（例えばＨＲＰ）を始めはウェル
領域に閉じ込めて、ウェル内で電極（好ましくは作業電極）への所望の結合を達
成することができ、その一方でバイオセンサの周縁領域への不特定結合を回避す
る。次いで、試薬または溶液をバイオセンサから洗浄除去し、追加の試薬および
／または溶液を後で追加して、センシング・プロセスを完了することができる。
【００５９】 バイオセンサを設計する際に、表面および材料科学の重要性を過小評価するこ
とはできない。希釈された試薬がウェハ表面の周りを流れている状態で、受け入
れられない量の不特定結合が洗浄プロセス中に依然として生じている場合がある
。例えばＨＲＰを含む洗浄溶液が周縁領域に留まる時間は、結合時定数よりもは
るかに長い。したがって、ウェル構造を製造するのに加えて、好ましくは、周縁
領域の表面を他の機構によって保護すべきである。
【００６０】 したがって、表面が望ましくない試薬または結合成分に接触しないようにする
別の方法は、表面を疎水性にすることである。シリコン表面のシラン化は、浮遊
構造が表面張力によって基板に付くのを防止するために広く使用されている。こ
こでは、この手法を使用して、シリコン基板の周縁領域への生体分子の直接接触
を防止する。
【００６１】 様々な機能末端基を有するシランベースの分子を使用して、シリコン・ウェハ
、窒化珪素チップ、および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）チップの表面性質を修正し
た。表面修正のためのシラン化合物は、末端Ｓｉ（Ｃｌ）ｎまたはＳｉＯ−Ｃ２ Ｈ５基の加水分解により、シリコン酸化物表面に化学的に繋がれた頑強な単層を
形成する。
【００６２】 生体系と接触する人工材料の性能は、２つの材料の表面相互作用によって決定
される。表面相互作用は、ノイズ増大および構造損傷をもたらす可能性があるの
で、表面修正が、この問題を回避するための一方法である。最も簡単な方法は、
構造の表面性質を変更すること、またはプラスチックを使用することによるもの
である。表面を生体適合性または生体不活性表面に変換することにより、表面に
堅く繋がれた分子層の生成によって不特定の相互作用を最小限に制限する、また
はなくす。最も広く実施されている手法は、主にＣ．Ｄ．ベインおよびＧ．Ｍ．
ホワイトサイズによって８０年代に開発されたよく確立された処置に従ってシリ
コン酸化物表面上にＳＡＭを形成するために、金表面およびシラン分子上への化
学吸着によってチオール分子からの自己組織化単層（ＳＡＭ）を使用する。ゾル
ゲルおよび炭素ペーストなど他の材料を使用して表面を修正することもできる。
【００６３】 次に図１１（ａ）を参照すると、操作の際、試薬は疎水性作業電極によって成
形され、小滴が、Ａｕ作業電極表面を覆うように良好に形成される。図１１（ｂ
）は、試薬の体積の増大と共に、試薬によってカバーされる領域が徐々に広がり
、その後、他の２つの電極をカバーすることを実証している。図１１（ｃ）は、
余剰の試薬の流れがピペットによって投与されるときに、疎水性シリコン基板上
に広がるのではなく、試薬の玉４６５が形成されることを示す。
【００６４】 次に図１２および１３に移ると、各個別の電極が、制御可能な表面性質および
小さなスケールでの表面張力を使用することによって、必要とされるときにのみ
電解質および／または分析物、ならびに他の成分５０９に接触する。次に、図１
３のみを参照すると、電気化学検出に関して、全ての電極を、検出時間にのみ、
電解質および／または分析物５０９中に浸漬しなければならない。ほとんどの適
用例で、作業電極５１０上に電解質および／または分析物５０９を不動化するた
めの図１２に示される試料調製に大部分の時間が費やされる。図１２および１３
に示されるこの実施形態では、電極の上の電解質および／または分析物５０９の
カバー範囲は、表面性質および試薬体積５２０によって制御される。
【００６５】 したがって、上述の実施形態は、小さなスケールでの表面張力を利用して、電
解質および／または分析物、ならびに他の成分を閉じ込める。さらに、上述した
実施形態は、はるかに少ない試薬（ｐＬ〜ｍＬ程度）しか必要とせず、大量の溶
液の必要性をなくする。さらに、少量の試薬使用のため、上述した実施形態は、
電極の近く（ｐｍ〜ｍｍ）に分析物を有するという利点を有し、それにより、電
極に対する分析物の適切な露出を拡散効果のみを使用して達成することができ、
攪拌または他の混合の必要性がなくなる。上述した実施形態の別の利点は、電極
に対する電解質および／または分析物のカバー範囲の制御および／または変更が
容易であることである。さらに、上述した試薬および／または溶液閉込め実施形
態は、不特定結合を大幅に低減することによって、ターゲット分析物の損失を低
減し、バイオセンサの感度を改善する。さらに、上述した実施形態は、バイオセ
ンサの振動に対して比較的耐性があり、携帯型またはハンドヘルド・システムに
適している。最後に、表面張力閉込め効果により、センサが逆さになったとして
も、試薬は表面張力によってしっかりと保持される。
【００６６】 任意選択で、図１２および１３に示されるように、バイオセンサ実施形態は反
応ウェル５３０を備え、試薬５２０を定位置に保持する助けをし、試薬５２０の
形状を制御することができる。しかし、そのようなウェル５３０は必要ではなく
、試薬５２０の閉込めは、単純な平らな表面によって達成することができる。
【００６７】 次に図１４を参照すると、これは、このバイオセンサ（センサチップ）の実施
形態の好ましい製造の最初のステップを示す。図１４に示されるように、二酸化
珪素（ＳｉＯ２、１０００Å）の層６２０がまず、ベアＳｉウェハ６１０（第１
級または試験級、ｐ型またはｎ型＜１００＞、厚さ５００〜５５０μｍ）上に堆
積される。二酸化珪素６２０は、窒化珪素６３０（Ｓｉ３Ｎ４、１０００Å）の
下でパッド層として働いて、応力を解放し、接着を改善する。
【００６８】 次に、図１５および１６を参照すると、窒化物ウェハ６００は、マスク６４０
によってパターン形成され（図１５）、［１１１］および［１００］結晶面に沿
ってＫＯＨを使用してバルク・エッチングされる（図１６）。エッチングにより
ウェル６５０が作成される。ウェル６５０の深さ（最大３５０μｍ）は、ＫＯＨ
エッチング時間および温度によって制御される。
【００６９】 次に図１７を参照すると、次いで、窒化物６３０および酸化物６２０がＨＦエ
ッチングによって除去されて、内部応力が解放され、電気絶縁のために別の酸化
物６６０層（５０００Å）が堆積される。
【００７０】 図１８および１９は、必要な電極を製造するためのリフトオフ・プロセスを示
す。バイオセンシング用の電極が、二酸化珪素層６６０上でＰＲ５２１４フォト
レジスト層６７０を使用することによって基板６１０上にパターン形成される。
次に、マスク６７１を使用して、（望ましくないフォト・レジスト層６７０の除
去を含めた）リバース・イメージング・プロセスを使用することによってフォト
・レジスト層６７０上に所望のパターンを転写する。金Ａｕ（２０００Å）の層
６８０が、所望のフォト・レジスト・パターン層６７０を有する二酸化珪素層６
６０上に電子ビーム堆積される。好ましくは、二酸化珪素層６６０上へのＡｕの
接着を改善するために、Ａｕ（２０００Å）６８０の堆積の前に、クロム（Ｃｒ
２００Å）など接着剤６９０の堆積が行われる。さらに、チタンまたは膠など
他の材料も接着剤として働く場合がある。最後に、図１９を参照すると、フォト
・レジスト６７０および望ましくないＡｕ６８０およびＣｒ６９０が、フォト・
レジスト・パターン層６７０を溶解することによって除去される。
【００７１】 最終的に、ウェハ６００は、１５０℃で１０分のホット・ベークの後、ヘキサ
メチルジシラザン（ＨＭＤＳ）蒸気中に３分間浸されて、周囲のＳｉ領域に疎水
性表面が生成される。
【００７２】 好ましくは、不特定結合を防止するために、表面修正ステップによってバイオ
センサ（センサ・チップ）の表面が修正される。一例として、図２０を参照する
と、始めに濃縮「ピラニア」溶液（７０体積％のＨ２ＳＯ４、３０体積％のＨ２ Ｏ２）を用いてＡｕ表面６８０を浄化するステップと、脱イオン水（ｄＨ２Ｏ）
を用いて入念にすすぎ洗いするステップとによって、高分子バイオセンサの表面
を修正することができる。次に、図２０を参照すると、ビオチン−ＤＡＤ−Ｃ１
２−ＳＨ（１２メルカプト（８−ビオチンアミド−３，６−ジオキサオクチル）
ドデカンアミド）（ロシュ ＧｍＢＨ、ドイツ）のＳＡＭなどの表面修正材料が
堆積される。ビオチン−ＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨのＳＡＭを堆積する際、スピンケ
他（１９９３年）の処置が使用され、試料は、４．５×１０−４Ｍ １１−メル
カプト−１−ウンデカノールを有するエタノール中の５０ｍＭビオチン−ＤＡＤ
−Ｃ１２−ＳＨ溶液（アルドリッチケミカル社 ４４，７５２−８）中で約１８
時間インキュベートされ、エタノールおよび水ですすぎ洗いされた。最後に、図
２１を参照すると、次いで、ビオチン被覆Ａｕ表面７００が約１０分間、１．０
ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン溶液に露出され、やはりｄＨ２Ｏを用いてすすぎ
洗いされて、ストレプトアビジン被覆Ａｕ表面７１０が形成された。
【００７３】 本発明の第３の形態は、単一集積回路（ＩＣ）チップ上に電気化学（レドック
ス）バイオセンサ全体を集積することに関する。集積回路（ＩＣ）は、基板材料
の小さなウェハと定義され、その上に、電子構成要素およびその相互接続の複合
体がエッチングされる、または印刷される。
【００７４】 ＭＥＭＳデバイスは、小さなフィーチャの結果として特有の性質を有し、しか
し、ＭＥＭＳベースのセンサからの信号レベルは、従来センサに比べて比較的低
い。オフチップ増幅モジュールを使用することによって感度を改善することがで
きるが、ノイズおよびシステム・サイズも増大する。したがって、本発明の実体
は、オンチップ増幅回路（バイオセンサ・チップ自体に組み込まれた増幅回路）
および検出回路（例えばバイアス電位、電流測定、順次制御および信号処理を提
供する）を設計して、チップ間干渉を低減する。検出回路と増幅回路はどちらも
、バイポーラ・トランジスタ（ＢＪＴ）および／または相補型金属酸化膜半導体
（ＣＭＯＳ）デバイスを使用することによって提供することができる。
【００７５】 本発明の一実施形態では、オンチップ増幅デバイスが、通常は電気化学センサ
電池の最大領域である作業電極の下に配置される。オープンベース・バイポーラ
（ＢＪＴ）フォトセンサに類似して、ベース領域は、電流利得βをもつトランス
デューサから電流を受け取り、電流利得βは８０〜１５０の範囲にある。電気化
学電池と共に実装することができる２つのタイプのＢＪＴ、すなわち垂直ＢＪＴ
と水平ＢＪＴが存在する。電流利得はベース領域の長さによって決定される。垂
直ＢＪＴでは、これは、イオン注入エネルギーとドーピング濃度の関数である。
水平ＢＪＴでは、この長さは、リソグラフィ分解能、イオン注入角度、および熱
拡散の関数である。これらの理由から、垂直ＢＪＴは、チップ間またはチップ内
利得均一性の点でより信頼性がある。
【００７６】 図２２は、好ましくは電気化学センシングに使用される３つの金属電極を備え
るバイオセンサを含むチップ内増幅器回路の一実施形態を断面で示す。好ましく
は、３つの電極が集積回路（ＩＣ）プロセスを使用して製造され、相互接続およ
び絶縁のために比較的大きな領域を有する。バイオセンサ・チップ７００全体を
、２つのステージ（電気化学センシング・ステージ７３０とバイポーラ・トラン
ジスタ（ＢＪＴ）増幅ステージ７２０）で積層することができ、Ａｕ作業電極７
１０が、ＢＪＴデバイス７２０用の電気化学シールドとして働くことができる。
作業電極コンタクト（コンタクト７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、お
よび７３８など）は、コンタクト界面７４０に接触し、また、より高い信号のた
めに作業電極７１０の表面積を増大する。全てのコンタクトおよび電極構造を、
金などの金属の単一層を備えるように作成することができる。さらに、バイオセ
ンサ・チップ７００はシリコン基板７４４を備える。基板７４４は、ベース領域
７４３と、コレクタ７４２と、エミッタ７４１とを含む。ベース領域７４３は、
作業電極７１０から電子流を受け取る。コレクタ７４２は、電源に接続され、増
幅の理由での何らかのベース条件の下で電流利得を提供する。次いで、ベース７
４３およびコレクタ７４２からの、結果として得られる電流がエミッタ７４１で
測定される。
【００７７】 引き続き図２２を参照すると、金属相互接続７５０が、信号出力（図示せず）
およびエミッタ７４１に接続される。金作業電極７１０は、エッチングによって
第１の二酸化珪素層７６０を介してベース領域７４３に接続する。第２の二酸化
珪素層７７０が、ＢＪＴ７２０と信号線を絶縁し、第１の層７６０は、３つの電
極（作業電極７１０、基準電極７８０、およびカウンタ電極７９０）を絶縁する
。作業電極７１０上のコンタクト（コンタクト７３３、７３４、７３５、７３６
、７３７、および７３８など）は、表面積を増大し、またＢＪＴ７２０と共に固
体コンタクトを形成する。コンタクトの寸法（それぞれ約数十μｍ）は、作業電
極７１０上の任意の蛋白質ＳＡＭのサイズ（約数十Å）よりもはるかに大きく、
したがって蛋白質吸着に影響はない。
【００７８】 図２４は、図２３に示された基板８０５上にある複数のバイオセンサの好まし
い実施形態を表す、バイオセンサ・ユニット８００の別の好ましい実施形態の断
面図である。図２４に見られるように、バイオセンサ・ユニット８００は、ＣＭ
ＯＳおよび／またはＢＪＴ層８３０、電気化学層８４０、および試薬封じ込め層
８５０を備え、すでに述べた図２２の実施形態と概して同様である。
【００７９】 したがって、図２２、２３、および２４に示されるように、本発明の第３の形
態は、センサ内の構成要素を、生物学的検出に必要な他の構成要素とチップ間接
続することなく、直接集積することができるようにするバイオセンシング・シス
テムに関する。このシステムは、完全なシステムを構成するために、外部構成要
素（器具）を必要としない、または最小数の外部構成要素しか必要としない。さ
らに、このオールインワン・バイオセンシング・システムは、生物学的センシン
グのコストおよびノイズ・レベルを低減し、そのようなセンシングのプロセスを
簡略化する。
【００８０】 次に図２５を参照すると、これは、本発明のバイオセンサ（センサチップ）の
一実施形態を、好ましくは１つおよび／または複数のＣＭＯＳデバイスと共に集
積回路（ＩＣ）技術によって製造することができる方法の一例を示す。さらに、
１つおよび／または複数のＢＪＴデバイス（図示せず）を含むこともできる。図
２５に示されるように、集積回路（ＩＣ）は半導体基板９００上に製造され、ポ
リシリコン・ゲート９０７を有する二酸化珪素層９０５が活性ウェル領域９０９
の上にある。ポリシリコン・ゲート９０７は、アモルファス・シリコンから製造
され、低抵抗ソース９１７およびドレイン９１９を備えるトランジスタを切り換
えるために使用される。
【００８１】 次に図２６を参照すると、次いで、電気絶縁のために酸化物層（５０００Å）
９２０が基板９００上に堆積される。次に図２７を参照すると、次いで、リソグ
ラフィおよびエッチング方法を使用することによって二酸化珪素層９２０が選択
的にエッチングされて、電気接続穴９４０が形成される。次に図２８を参照する
と、次いで、伝導プラグ９５０が、コンタクト穴９４０内に取り付けられる。伝
導プラグ９５０は、伝導性電極９６０と、低抵抗ソース９１７および／またはド
レイン９１９との相互接続として使用される。
【００８２】 図２９は、必要な電極を製造するためのリフトオフ・プロセスを示す。二酸化
珪素層９２０上でＰＲ５２１４フォト・レジスト層９７０を使用することによっ
て、バイオセンシング用の電極が基板９００上にパターン形成される。次に、マ
スク９２１を使用して、（望ましくないフォト・レジスト層９７０の除去を含め
た）リバース・イメージング・プロセスを使用することによってフォト・レジス
ト層９７０上に所望のパターンを転写する。金Ａｕ（２０００Å）および／また
はＣｒ（２００Å）の層９６０が、所望のフォト・レジスト・パターン層９７０
を有する二酸化シリコン層９２０上に電子ビーム堆積される。最後に、図３０を
参照すると、フォト・レジスト９７０および望ましくないＡｕ／Ｃｒ９６０が、
フォト・レジスト・パターン層９７０を溶解することによって除去される。
【００８３】 次に図３１を参照すると、これは、本発明のバイオセンサ（センサチップ）１
０００の一実施形態を、好ましくは鉄（Ｆｅ）などのイオン分子を検出するため
に使用することができる方法の一例を示す。この実施形態では、センサ表面１０
１０が修正されておらず、上述した製造実施形態で示される製造後浄化の後に、
使用できる準備が整う。この実施形態で使用された分析物は、窒化カリウムＫＮ
Ｏ３（１０１．１１ｇ／ｍｏｌ）の緩衝液中で＋３酸化状態の鉄原子（ＦｅＩＩ Ｉ ）を含むフェリシアン化カリウムＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６（３２９．２６ｇ／ｍｏ
ｌ）であった。図示されるように、図３１で、分析物（または電解質を有する試
薬）を有する混合溶液１０２０が、３つの電極（作業電極１０３０、基準電極１
０４０、カウンタ電極１０５０）全ての上に塗布される。溶液１０２０の体積が
調節され、それにより小滴は、表面張力によって３つの電極全ての上に閉じ込め
られる。
【００８４】 次に、図３２を参照すると、サイクリック・ボルタンメトリ（ＣＶ）電流とバ
イアス電位の関係が、ピコアンプ・ブースタおよびファラデー・ケージを有する
ＣＨインストゥルメンツ６６０Ａエレクトロケミカル・ワークステーションを使
用して測定された。電位は、０．１ボルトと−０．４ボルトの間で掃引され、電
流は、作業電極１０３０を介して測定される。
【００８５】 測定後、センサ１０００を再利用する場合は、Ａｕ表面が、アセトン、アルコ
ール、および濃縮「ピラニア」溶液（７０体積％のＨ２ＳＯ４、３０体積％のＨ２ Ｏ２）を用いて浄化され、脱イオン水（ｄＨ２Ｏ）を用いて入念にすすぎ洗い
された。
【００８６】 図３３は、高分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質）検出のための１つの好ま
しい実施形態を示す。好ましくは、高分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質）の濃度の
検出は、ビオチン／ストレプトアビジン層のセンサ表面修正を含む。上述した表
面修正プロセスで示したように、センサ表面は、適切な生物化学溶液を用いて修
正されて、製造後浄化の後にストレプトアビジン層を形成する。バイオセンサ１
１００の表面が修正された後、まず２５０ｍｌのバクテリア溶液の試料に５０ｍ
ｌの溶菌試薬（０．４Ｍ ＮａＯＨ）を追加することによって病原体の電流測定
バイオセンシングが行われ、室温で５分間インキュベートされる。次いで、１０
０ｍｌのプローブ溶液（アンカリングおよびシグナリング・プローブ）が追加さ
れ、混合物が６５℃で１０分間インキュベートされた。次いで、５μＬの溶菌Ｅ
．ｃｏｌｉ／プローブ溶液混合物１１２０が、バイオセンサ１１００のストレプ
トアビジン被覆作業電極１１３０上に配置され、室温で１０分間インキュベート
された。
【００８７】 次に図３４を参照すると、次いで、バイオセンサ１１００が、ビオチン洗浄溶
液（キルケゴールアンドペリー・ラボラトリー、５０−６３−０６）を用いて洗
浄される。次に、希釈剤（ＰＢＳ／０．５％カゼイン）を用いて０．７５Ｕ／ｍ
ｌまたは０．１５Ｕ／ｍｌまで希釈された５μＬのＡｎｔｉ−Ｆｌ−ＰＯＤ（ア
ンチフルオレセインペルオキシダーゼ、１５０Ｕ、ロシュ社、１４２６３４６）
１１４０が、作業電極１１３０上に配置され、室温で１０分間インキュベートさ
れる。
【００８８】 次に図３５を参照すると、次いで、バイオセンサが再び洗浄溶液で洗浄される
。洗浄後、３つの電極（作業電極１１３０、基準電極１１４０、カウンタ電極１
１５０）全てが基質溶液１１６０によってカバーされるように、１０μＬのＫ−
ｂｌｕｅ基質（ネオゲン社 ３００１７６）１１６０がバイオセンサ上に配置さ
れる。
【００８９】 最後に、電気化学（より具体的にはレドックス）測定値が即座に行われる。電
流測定電流と時間の関係は、ピコアンプ・ブースタおよびファラデー・ケージを
有するＣＨインストゥルメンツ６６０Ａエレクトロケミカル・ワークステーショ
ンを使用して測定される。バイオセンサ上の試料が順次に測定される。電圧は（
基準に対して）−０．１Ｖで固定すべきであり、カソード電流（電流測定信号）
読取りは２０秒間で行うべきである。これは、２０秒で電流値が安定状態に到達
するはずだからである。細胞濃度（細胞数）は、連続的な希釈および培養皿カウ
ンティングを使用することによって決定される。
【００９０】 測定後、センサ１１００を再利用する場合は、次いでＡｕ表面をアセトン、ア
ルコール、および濃縮「ピラニア」溶液（７０体積％のＨ２ＳＯ４、３０体積％
のＨ２Ｏ２）で浄化し、脱イオン水（ｄＨ２Ｏ）で入念にすすぎ洗いすべきであ
る。
【００９１】 好ましくは、上述したバイオセンサ実施形態の任意のもので、バイオセンサが
、実際の試料検出の前に較正される。バイオセンサは、好ましくは、既知量の（
１種または複数種の）ターゲット分析物を含む較正溶液と、検出不可能な量（例
えば、ゼロ）の（１つまたは複数の）ターゲット分析物を含む別の較正溶液とを
用いて較正される。任意選択で、バイオセンサを、複数の較正溶液を用いて較正
することができる。この複数の較正溶液はそれぞれ、既知量のターゲット分析物
を含む。好ましくは、較正溶液は、異なる濃度レベルでターゲット分析物を含む
。これらの較正溶液を、上述した検出プロセスによってバイオセンサで測定して
、１つおよび／または複数の基準信号を得る。次いで、１つおよび／または複数
の基準信号が、試料溶液からの測定信号と比較されて、試料試薬中の分析物の存
在および量を求める。（１つまたは複数の）分析物の存在および量（例えば濃度
または絶対量）の割出しは、従来の生物学的補間方法によって求めることができ
る。
【００９２】 添付書類Ａは、本発明をさらに特徴付けるために追加の資料を提供する。
【００９３】 本出願の添付書類にある参考文献を含めた本明細書における外部文献への全て
の参照を、それらが、本明細書で採用される方法、技法、および／または構成を
補足し、説明し、その背景を提供し、または教示する範囲で参照により本明細書
に組み込む。さらに、以下に列挙する参考文献も、それが、本明細書で採用され
る方法、技法、および／または構成を補足し、説明し、その背景を提供し、また
は教示する範囲で参照により本明細書に組み込む。
【００９４】 （参考文献） 「生体材料に対する医学的防御に関するＵＳＡＦパンフレット−生体材料に対
する医学的防御」ディフェンス・テクニカル・インフォメーション・センター（
１９９７年２月１１日公開） Ｎ．Ｌ．アボット；Ｃ．Ｂ．ゴーマン；Ｇ．Ｍ．ホワイトサイズ「印加電位お
よび自己組織化単層を使用する濡れの活性制御」ラングミュア，１１，１９９５
年１月１日発行，１６−１８） Ｎ．Ｌ．アボット；Ｄ．Ｒ．ロリソン；Ｇ．Ｍ．ホワイトサイズ「高分子を製
造するためのマイクロ加工と分子自己組織化の組合せ」ラングミュア，１０，１
９９４年８月８日発行，２６７２−２６８２ Ｉ．アブデルハミッド，Ｄ．イヴニツキ，Ｐ．アタナゾフ，Ｅ．ウィルキンス
，１９９８年 部分的に浸漬された免疫電極を使用するＥ．ｃｏｌｉ ０１５７
：Ｈ７に関する高速電流測定アッセイ（エレクトロアナリシス １０（１１），
７５８−７６３） Ｉ．アブデルハミッド，Ｄ．イヴニツキ，Ｐ．アタナゾフ，Ｅ．ウィルキンス
，１９９９年 Ｅ．ｃｏｌｉ ０１５７：Ｈ７の高速検出のためのフロースルー
免疫濾過アッセイ・システム（Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔ． １４，３
０９−３１６） Ｊ．Ｄ．アンドレイド「生物医学ポリマーの表面および界面様相：蛋白質吸着
」米国ニューヨーク州プレナム，１９８５年 Ｃ．Ｄ．ベイン；Ｅ．Ｂ．トラフトン；Ｙ．Ｔ．タオ；Ｊ．エバル；Ｇ．Ｍ．
ホワイトサイズ；Ｒ．Ｇ．ナッゾ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８９，１
１１，３２１） イアン・バクスター；リサ・Ｄ．コザー；キャロル・デュピュイ；ポールＤ．
リッキス；アンドリューＪ．Ｐ．ホワイト；およびデビッドＪ．ウィリアム「シ
ラノールへの水素結合」英帝国科学工学医学大学 化学科（ロンドン ＳＷ２Ａ
Ｙ，英国） Ｋ．Ｅ．ビーム「シリコンの異方性エッチング」（電子デバイスに関するＩＥ
ＥＥ会報，１９７８年１０月） Ｅ．Ｗ．ベッカー；Ｈ．ベッツ；Ｗ．エアフェルド；Ｗ．グラスハウザー；Ａ
．ホイベルガー；Ｈ．Ｊ．ミッシェル；Ｄ．ミュンヒメーヤー；Ｓ．ポングラッ
ツ；Ｒ．Ｖ．シーメンス「Ｘ線リソグラフィとガルバノプラスチックスの組合せ
によるウラニウム・エンリッチメントのための個別ノズル・システムの製造」ナ
チュアビッセンシャフテン，６９，（１９８２）５２０〜５２３ Ｃ．ブレーク，Ｂ．Ｊ．グールド １９８４年 免疫アッセイ技法での酵素の
使用（Ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ａｎａｌｙｓｔ １０９，５３３−５４７） Ｊ．Ｐ．ブローディー；Ｐ．イェーガー；Ｒ．Ｅ．ゴールドシュタイン；Ｒ．
Ｈ．オースチン「低レイノルド数での生物工学」Ｊ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７１，１
９９６，３４３０−３４４１ Ｙ．Ｆ．チェン，Ｊ．Ｍ．ヤン，Ｊ．Ｊ．ガウ，Ｃ．Ｍ．ホー，Ｙ．Ｃ．タイ
２０００年 生物剤検出のためのマイクロ流体システム（技術と流体力学の相
互作用に関する第３回国際会議（スイス、チューリッヒ）の議事録） Ｙ．Ｆ．チェン；Ｊ．Ｍ．ヤン；Ｊ．Ｊ．ガウ；Ｃ．Ｍ．ホー；Ｙ．Ｃ．タイ
「生物剤検出のためのマイクロ流体システム」技術と流体力学の相互作用に関す
る第３回国際会議（スイス、チューリッヒ，２０００年） Ｎ．クーパー「ヒトゲノム計画」ロスアラモス研究所 サイエンス，２０，１
−３３８ １９９２年 Ｅ．Ｌ．クスラー 拡散−流体システムの大量移動 第２版 ケンブリッジ大
学出版 １９９７年 Ｓ．Ａ．ダースト；Ｍ．アーラー；Ｐ．Ｈ．メーラー；Ｅ．Ｗ．クバレク；Ｒ
．ブランケンブルク；Ｈ．Ｏ．リビ；Ｈ．リングスドルフ；Ｒ．コルンベルク「
ビオチン化脂質層上でのストレプトアビジンの２次元結晶」Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ
．５９（１９９１）３８７−３９６ Ｊ．エバース；Ｋ．Ｅ．エバース；Ｍ．Ｂ．グリシャム編 化学および生物学
でのペルオキシダーゼ 第２巻（ＣＲＣ出版，フロリダ州ボカラトン，ｐｐ．１
−２４）におけるＨ．Ｂ．ダンフォード １９９１年 ホースラディッシュペル
オキシダーゼ：構造および速度論性質 Ｇ．エーテシャミ；Ｎ．ラーナ；Ｐ．ラウ；Ｆ．シャドマン「酸化中の、不純
物と珪素および二酸化珪素との相互作用」マイクロ汚染制御の核心（ＮＳＦ Ｉ
／Ｕ ＣＲＣ） リチャードＰ．ファインマン「Ｔｈｅｒｅ’ｓ Ｐｌｅｎｔｙ ｏｆ Ｒｏｏ
ｍ ａｔ ｔｈｅ Ｂｏｔｔｏｍ」エンジニアリングアンドサイエンス，カルテ
ック，１９６０年２月 Ｊ．Ｊ．ガウ，Ｅ．Ｈ．ラン，Ｂ．ダン，Ｃ．Ｍ．ホー ２０００年 ＤＮＡ
アレイ・チップを有する酵素ベースの電気化学バイオセンサ（マイクロ・トータ
ル分析システム（μＴＡＳ）に関する第４回国際シンポジウム（オランダ、エン
シェーデ）の議事録） Ａ．Ｌ．ギンジリス，Ｐ．アタナゾフ，Ｅ．ウィルキンス １９９７年 酵素
触媒直接電子移動：基礎と分析適用例（エレクトロアナリシス ９，６６１−６
７４） Ｌ．ゴートン，Ａ．リンドレン，Ｔ．ラーソン，Ｆ．Ｄ．ムンテーニュ，Ｔ．
ラズガス，Ｉ．ガザリアン １９９９年 第３世代バイオセンサの基礎としての
、ヘム含有酵素と電極の間の直接電子移動（Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ４
００，９１−１０８） Ｅ．Ａ．Ｈ．ホール １９９１年 バイオセンサ（プレンティス・ホール，ニ
ュージャージー州イングリウッド・クリフス） Ｌ．ハウスリング，Ｈ．リングスドルフ，Ｆ．Ｊ．シュミット，Ｗ．クノール
１９９１年 金上でのビオチン機能化自己組織化単層：特定の認識反応の表面
プラズモン光学研究（ラングミュア ７（９），１８３７−１８４０） Ｃ．Ｍ．ホー，Ｙ．Ｃ．タイ １９９６年 レビュー：流れ制御のためのＭＥ
ＭＳおよびその応用（Ｊ．Ｆｌｕｉｄｓ Ｅｎｇ．１１８，４３７−４４７） Ｃ．Ｍ．ホー，Ｙ．Ｃ．タイ １９９８年 マイクロエレクトロメカニカル・
システム（ＭＥＭＳ）と流体の流れ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｆｌｕｉｄ Ｍｅｃｈ．
３０，５７９−６１２） Ｓ．Ｆ．ホウ，Ｋ．Ｓ．ヤン，Ｈ．Ｑ．ファン，Ｈ．Ｙ．チャン １９９８年
自己組織化単層表面上に多層でグルコースオキシダーゼを不動化することによ
る電流測定グルコース酵素電極（タランタ ４７，５６１−５６７） Ｒ．Ｔ．ハウおよびＲ．Ｓ．ミュラー「多結晶シリコン・マイクロメカニカル
・ビーム」電気化学会ジャーナル：固体科学および技術，１９８３年６月 Ｄ．イヴニツキ，Ｉ．アブデルハミッド，Ｐ．アタナゾフ，Ｅ．ウィルキンス
１９９９年 病原性バクテリアの検出のためのバイオセンサ（Ｂｉｏｓｅｎｓ
．Ｂｉｏｅｌｅｃｔ．１４，５９９−６２４） Ｄ．イヴニツキ，Ｉ．アブデルハミッド，Ｐ．アタナゾフ，Ｅ．ウィルキンス
，Ｓ．ストリッカー ２０００年 食物病原性バクテリアを検出するための電気
化学バイオセンサの応用（エレクトロアナリシス １２（５），３１７−３２５
） Ｌ．Ｓ．ユング，Ｋ．Ｅ．ネルソン，Ｃ．Ｔ．キャンベル，Ｐ．Ｓ．ステート
ン，Ｓ．Ｓ．イー，Ｖ．ペレスルナ，Ｇ．Ｐ．ロペス １９９９年 混合ビオチ
ン含有アルキルチオレート単層上のワイドタイプおよび変異ストレプトアビジン
の結合および解離の表面プラズモン共鳴測定（センサーズ・アクチュエータズ
Ｂ ５４，１３７−１４４） Ｒ．Ｓ．ケイン，Ｓ．タカヤマ，Ｅ．オスツーニ，Ｄ．Ｅ．イングバー，Ｇ．
Ｍ．ホワイトサイズ １９９９年 ソフトリソグラフィを使用する蛋白質および
細胞のパターン付け（バイオマテリアルス ２０， ２３６３−２３７６） Ｄ．ケブレスおよびＬ．フード「符号の符号：ヒトゲノム計画における科学的
および社会的問題」ハーバード大学出版，マサチューセッツ州ケンブリッジ，１
９９２年 Ｊ．ライリ，Ｅ．オスツーニ，Ｇ．Ｍ．ホワイトサイズ １９９９年 マイク
ロコンタクト印刷による反応性ＳＡＭ上へのリガンドのパターン付け（ラングミ
ュア １５（６） ２０５５−２０６０） Ａ．リンドレン，Ｆ．Ｄ．ムンテーニュ，Ｉ．Ｇ．ガザリアン，Ｔ．ラズガス
，Ｌ．ゴートン １９９８年 グラファイト電極上のホースラディッシュペルオ
キシダーゼのための直接および間接電子移動の速度論を研究するための、回転デ
ィスクと壁ジェット電極システムの比較（Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅ
ｍ．４５８，１１３−１２０） Ｇ．マラザ；Ｉ．キアネラ；Ｍ．マシーニ「環境監視のための使い捨てＤＮＡ
電気化学バイオセンサ」Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３８
７（１９９９），２９７−３０７ Ｋ．モテシャライ，Ｄ．Ｃ．ミレス １９９８年 金上へのアルカンチオール
の機能化自己組織化単層に関する分子認識（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２
０（２９），７３２８−７３３６） Ａ．Ｓ．Ｎ．マーシー，Ｊ．シャルマ １９９８年 金電極でのビス（４−ピ
リジル）二硫化物の自己組織化単層に結合されたグルコースオキシダーゼ：グル
コースの電流測定算出（Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ３６３，２１５−２２
０） Ｈ．Ｃ．ナサーソン；Ｗ．Ｅ．ネウェル；Ｒ．Ａ．ウィックストローム；およ
びＪ．Ｒ．デービスＪｒ．「共鳴ゲート・トランジスタ」電子デバイスに関する
ＩＥＥＥ会報，１９６７年３月 Ａ．Ａ．オオカ，Ｋ．Ａ．クーア．Ｎ．チョ，Ｇ．Ｌ．ガレル １９９９年
コロイド状銀および金上での、ａ，ｗ−アミノ酸の相同な列の表面相互作用（バ
イオスペクトロスコーピー ５，９−１７） Ｅ．オスツーニ，Ｌ．ヤン，Ｇ．Ｍ．ホワイトサイズ １９９９年 金および
銀上での、蛋白質および細胞とアルカンチオレートの自己組織化単層との相互作
用（コロイド表面 Ｂ１５，３−３０） Ｊ．ラオ，Ｌ．ヤン，Ｂ．スー，およびＧ．Ｍ．ホワイトサイズ １９９９年
Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａを表す自己組織化単層に対するバンコマイシンおよび
そのダイマーの結合を研究するための表面プラズモン共鳴の使用（Ｊ．Ａｍ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１（１１），２０２９−２０３０） Ｄ．Ｊ．レベル，Ｊ．Ｒ．ナイト，Ｄ．Ｊ．ブリス，Ａ．Ｈ．ヘインス，Ｄ．
Ａ．ラッセル １９９８年 自己組織化炭水化物単層：形成および表面選択分子
認識（ラングミュア １４（１６）４５１７−４５２４） Ｔ．ラズガス，Ｌ．ゴートン，Ｊ．エムニス，Ｇ．マルコバーガ グラファイ
ト電極上のホースラディッシュペルオキシダーゼ作用の速度論モデル（Ｊ．Ｅｌ
ｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３９１，４１−４９） Ｔ．ラズガス；Ｅ．コズレギ；Ｊ．エムニス；Ｌ．ゴートン；Ｇ．マルコバー
ガ「ペルオキシダーゼ修正電極：基礎と応用」Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉ
ｃａ Ａｃｔａ ３３０（１９９６），１２３−１３８ Ａ．Ｂ．シーバル；Ａ．Ｌ．デミレル；Ｊ．Ｗ．Ｍ．ニシンク；Ｍ．Ｒ．リン
フォード；Ｊ．Ｈ．ファンデルマース；Ｗ．Ｈ．デジュ；Ｈ．ズイルホフ；Ｅ．
Ｊ．Ｒ．ズードヒュルター「シリコン（１００）表面上での非常に安定なＳｉ−
Ｃリンク機能化単層」（ラングミュア １９９８，１４，１７５９−１７６８） Ａ．Ｂ．シーバル；Ｈ．ズイルホフ；Ｅ．Ｊ．Ｒ．ズードヒュルター；Ｆ．Ｍ
．シュールマンス；Ｗ．Ｃ．シンク「有機単層によるシリコンの表面パッシベー
ション」光起電力太陽エネルギー変換に関する第２回世界会議およびエキシビシ
ョンの議事録（ウィーン １９９８年） Ｇ．Ｂ．シーガル，Ｃ．バンダッド，Ａ．バルベリス，Ｊ．ストロミンガー，
Ｇ．Ｍ．ホワイトサイズ １９９６年 表面プラズモン共鳴によるヒスチジンタ
グ付き蛋白質の結合および研究のための自己組織化単層（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．
６８，４９０−４９７） Ｊ．スピンケ，Ｍ．リリー，Ｈ．Ｊ．グデー，Ｌ．アンゲルマイヤー，Ｗ．ク
ノール １９９３年 自己組織化単層での分子認識：多成分多層の構成（ラング
ミュア ９（７），１８２１−１８２５） Ｘ．サン，Ｐ．ヘー，Ｓ．リュー，チャンイー，Ｙ．ファン １９９８年 Ｄ
ＮＡ電気化学センサ適用例のための自己組織化アミノエタンチノール単層を用い
た金電極上での一本鎖デオキシリボ核酸の不動化（タランタ ４７，４８７−４
９５） ロバート・テーラー「バイオテロリズム・スペシャルリポート：Ａｌｌ ｆａ
ｌｌ ｄｏｗｎ」ニューサイエンティスト 第１５０巻，発行２０２９，１９９
６年５月１１日 Ｗ．Ｓ．Ｎ．トリマー「マイクロロボットおよびマイクロメカニカル・システ
ム」センサーズアンドアクチュエータズ，１９，第３号，１９８９年９月，２６
７−２８７ ウィリアム・トリマー「Ｇｒａｎｄ ｉｎ Ｐｕｒｐｏｓｅ， Ｉｎｓｉｇｎ
ｉｆｉｃａｎｔ ｉｎ Ｓｉｚｅ」ＭＥＭＳに関する第１０回年次国際ワークシ
ョップ（日本、名古屋）議事録ＩＥＥＥカタログ番号９７ＣＨ３６０２１，１９
９７，９−１３ Ａ．アルマン ラングミュア・ブラジェットから自己組織化への超薄有機被膜
（アカデミックプレス：ニューヨーク，１９９１年） Ａ．アルマン ラングミュア・ブラジェットから自己組織化への超薄有機被膜
に対する緒言（アカデミックプレス社 米国カリフォルニア州サンディエゴ １
９９１年） Ａ．アルマン編 有機薄膜の特徴；バターワース−ハインマン：ボストン，１
９９５年 ドナルド・フート；Ｊ．フート「生物化学 第２版」ウィリー，ニューヨーク
，９１６−９１９ Ｐ．ワグナー；Ｍ．ヘグナー；Ｈ．Ｊ．グンテロット，Ｇ．セメンサ「超平坦
テンプレートストリップ金表面上に化学吸着された単層の形成およびｉｎ Ｓｉ
ｔｕ修正」ラングミュア １１（１９９５）３８６７−７５ Ｊ．ワン，Ｇ．リバス，Ｘ．カイ，Ｅ．パレセック，Ｐ．ニールセン，Ｈ．シ
ライシ，Ｎ．ドンサ，Ｄ．ルオ，Ｃ．パラド，Ｍ．チッチャロ，Ｐ．Ａ．Ｍファ
リアス，Ｆ．Ｓ．バレラ，Ｄ．Ｈ．グラント，Ｍ．オズソス，Ｍ．Ｎ．フレア
１９９７年 環境監視用のＤＮＡ電気化学バイオセンサ（Ａ Ｒｅｖｉｅｗ．Ａ
ｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ３４７，１−８） Ｔ．Ｈ．ワン，Ｙ．Ｆ．チェン，Ｓ．マセット，Ｃ．Ｍ．ホー，Ｙ．Ｃ．タイ
２０００年 分子ビーコンベースの微生物検出システム（医学および生物科学
における数学および設計技術に関する２０００年国際会議（ＭＥＴＭＢＳ’２０
００ 米国ネバダ州カリフォルニア）の議事録） Ｐ．Ｃ．ウェーバー，Ｄ．Ｈ．オーレンドルフ，Ｊ．Ｊ．ウェンドロスキー，
Ｆ．Ｒ．サレメ １９８９年 ストレプトアビジンに対する高親和力ビオチン結
合の構造起源（サイエンス ２４３，８５−８８） Ｇ．Ｍ．ホワイトサイズ；Ｐ．Ｅ．ライビニス ラングミュア １９９０，６
，８７ Ｔｈ．ウィンク；Ｓ．Ｊ．ファンツイレン；Ａ．バルト；Ｗ．Ｐ．ファンベネ
コム「バイオセンサ用の自己組織化単層」アナリスト，１９９７年４月，１２２
，４３Ｒ−５０Ｒ Ｋ．Ｄ．ワイス；Ｔ．Ｎ．ジャクソン；Ｎ．Ａ．マスナリ；Ｍ．Ｂ．ロビンソ
ン；Ｄ．Ｅ．ソロモン；Ｇ．Ｈ．ワットケ；Ｗ．Ｂ．レンセル「熱核溶融研究で
の使用のための半導体技術を使用する半球構造の製造」（真空科学技術ジャーナ
ル，１９７９年５／６月） Ｙ．シー，Ｇ．Ｍ．ホワイトサイズ １９９８年 ソフトリソグラフィ（Ａｎ
ｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７，５５０−５７５） Ｒ．Ｈ．ヤン，Ｋ．Ｍ．ワン，Ｄ．シャオ，Ｋ．ルオ，Ｘ．Ｈ．ヤン ３，３
Ａ，５，５Ａ−テトラメチルベンジジンジヒドロクロライドの蛍光焼入れに基づ
くジまたはトリニトロフェノールに関する回復可能な液体ドロップ・センサ（ア
ナリスト，２０００，１２５、８７７−８８２）
【００９５】 以上により、新規な「バイオセンシング」システムが図示され、説明された。
当然、本発明の精神および範囲を逸脱することなく様々な修正を行うことができ
る。例えば、本明細書で開示したバイオセンサを使用して、非生体要素および化
合物を感知または検出することができる。したがって、本発明は、頭書の特許請
求の範囲の意図を除いては、制限を受けない。
【００９６】 添付書類Ａ マイクロ・トータル分析システム２０００写本 ＤＮＡアレイ・チップを有する酵素ベースの電気化学バイオセンサ 要旨 高速生物剤検出のための再利用可能ＤＮＡセンサをシリコン・チップ上に製造
した（図１）。ＤＮＡベースのプローブは、抗体を使用する間接プロービングで
はなく、分析物のＤＮＡ／ＲＮＡ配列を標的とする。ハイブリダイゼーション・
イベントを信号酵素と組み合わせることによって感度が大幅に高まる。自己組織
化単層センサ表面の形成、ｉｎ−ｓｉｔｕ ＤＮＡハイブリダイゼーション、信
号測定、およびセンサ再生成を、４０分以内に行うことができる。ＰＣＲを使用
しない場合でさえ、このセンサ・アレイを使用して、１６ｓｒＲＮＡによって１
０００以上のエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を検出することができる
（図２）。各センサ領域の寸法は、２５ｍｍ２〜１６０μｍ２の範囲である。 キーワード：電気化学センサ、マイクロエレクトロメカニカル・システム（Ｍ
ＥＭＳ）、自己組織化単層（ＳＡＭ）、ＤＮＡハイブリダイゼーション
【外１】 細胞数 図１ ＤＮＡセンサ・アレイ・チップ 図２ 感度および特異性チェック
【００９７】 １．緒言 酵素ベースの電気化学バイオセンサは、現場使用時にバクテリア、ウィルス、
または様々な生物学種の濃度の高速監視が可能な、非常に高感度であり選択性の
あるプロトコルを求めることによって主に動機付けされている。そのようなプロ
トコルは、遠隔操作のものであり、十分に自動化されており、コンパクトであり
、頑強である［１］。したがって、光学システムよりも、最少電力消費およびよ
り小さなサイズを有する電気化学トランスデューサが好ましい［２］。偽陽性信
号および偽陰性信号を低減するためにＤＮＡハイブリダイゼーションを使用する
ことによって高い特異性を達成することができる。グラファイトまたは炭素電極
を使用するＤＮＡ電気化学バイオセンサがすでに報告されている［３、４］。し
かし、炭素ベース電極は通常、小さな（＜μｍ）寸法が必要とされるときにＭＥ
ＭＳ技術に適合可能でない。本研究では、電極としてＡｕを使用し、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ ｒＲＮＡを捕捉するために蛋白質自己組織化単層（ＳＡＭ）を用いた。本研
究では、生物学的増幅因子として酵素を使用して、ＰＣＲを用いずに高感度を得
る。Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ４１００対ボルデテラＳＢ５４に関する感度および特異
性チェックが図２に示されている。
【００９８】 ２．検出原理 ＨＲＰは、分析目的およびバイオセンサへの塗布に最も広く使用されている酵
素の１つである［５］。酵素増幅は、電気化学的に検出することができる反応の
高転換数により生じる。ここでは、媒介物として３，３’５，５’−テトラメチ
ルベンジジン（ＴＭＢ）を有するホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ
）に基づく電流測定バイオセンサを説明する（図３）。電極表面での電子移動が
電流測定によって測定されて、ターゲット細胞の１６ｓリボゾームＲＮＡによる
ＤＮＡハイブリダイゼーションによって不動化される酵素の数を表す。したがっ
て、出力電流は、溶液中のターゲット細胞の数に比例する。
【００９９】
【外２】 ＰＲ：還元ペルオキシダーゼ ＰＯ：酸化ペルオキシダーゼ ＭＯ：酸化媒介物 ＭＲ：還元ペルオキシダーゼ 図３ ＨＲＰ酵素反応の電子輸送
【０１００】 ３．実験 ３電極電気化学電池が、作業電極用のマイクロ製造反応ウェルを有して構成さ
れる（図４ａ）。導電層として金（Ａｕ）が堆積され、絶縁層としてＳｉ３Ｎ４ ／ＳｉＯ２が堆積される（図４ｂ）。周囲のＳｉ表面は、疎水性になるように修
正される。３次元反応ウェルは、周囲領域の疎水性と共に、液体小滴を作業電極
内によく含むことができるようにする。この設計は、センサ・チップの他の領域
への生体分子の不特定結合を最小限に抑える。Ａｕ作業電極は、チオレート化ビ
オチンＳＡＭによって、または金の上への直接蛋白質吸着によって、基板上に不
動化されたストレプトアビジンの単層を有する（図４ｃ）。Ｅ．ｃｏｌｉを含む
試料溶液は溶菌バッファで処理され、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からのターゲットＤＮＡ
／ＲＮＡが、細胞デブリの存在下でアニーリング温度（約６５℃）で、アンカリ
ングｓｓＤＮＡプローブとラベリングｓｓＤＮＡプローブの両方を用いてハイブ
リダイゼーションされる（図４ｄ）。アンカリング・プローブ（ビオチンに結合
された）とラベリング・プローブ（フルオレセインに結合された）は、２つの明
確に異なる保存的配列を認識し、それによりハイブリッドは、ターゲット生物剤
からの特定の遺伝子セグメントのみを用いて生成される。次いで、オリゴヌクレ
イック・ハイブリッドが作業電極上に、ビオチンストレプトアビジン結合によっ
て不動化され、結合されていない成分が洗浄除去される。次いで、ＨＲＰリンク
・アンチフルオレセイン抗体が各ハイブリッド上に担持される（図４ｅ）。基質
の追加後、酵素反応が、３電極電池を使用して電流測定で測定される電流信号を
生じる（図４ｆ）。プロトコル全体が４０分で完了する。
【外３】 図４ センサ・ユニット・プロセスの流れ Anchroring probe: アンカリング・プローブ Target strand: ターゲット鎖
【０１０１】 ４．実験結果 ＤＮＡセンサ上のＳＡＭは、単層のみが堆積されたかどうかを判定し、また蛋
白質堆積の速度論を求めるための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および原子間力
顕微鏡検査（ＡＦＭ）によって特徴付けられる。このデータから、一体型流体シ
ステム内でのｉｎ ｓｉｔｕセンサ表面形成に必要な時間スケールを確かめるこ
とができる。ストレプトアビジンＳＡＭを堆積するための２つの異なる方法が使
用され、一方がチオレート化ビオチンを使用し、他方が直接蛋白質吸着を使用し
た。どちらの場合にも、ＳＰＲデータは、ただ１つの単層が基板上に堆積された
ことを示す（図５）。ストレプトアビジンの結晶単層は、２．８ｎｇ／ｍｍ２の
予想表面カバー範囲を有する［６］。本実験の結果は、チオレート化ビオチンを
使用して単層全体が得られ、直接蛋白質吸着によって約８０％のカバー範囲が得
られたことを示す。さらに、蛋白質結合／吸着は約１０秒以内に生じた。
【外４】 図５ ビオチンＳＨ／ＡｕまたはベアＡｕ上のストレプトアビジンの表面プラズ
モン共鳴 Time(seconds): 時間（秒） Response Units: 反応ユニット Streptavidin on biotin-SH/Su SAM/Su: ビオチン−ＳＨ／Ａｕ ＳＡＭ／Ａｕ
上のストレプトアビジン Streptavidin on bare Au: ベアＡｕ上のストレプトアビジン
【０１０２】 ５．０ｎＮの力を有するウルトラレバー・チップを使用して接触モードで原子
間力顕微鏡検査（ＡＦＭ）が行われた。Ａｕ基板は、ワグナー等の方法に従って
準備された［７］。ベアＡｕは、トポグラフィ・フィーチャ＜１０Åを有し（図
６ａ）、「全」単層のコンタクトＡＦＭは、蛋白質ドラッギングの証拠をもつ滑
らかな表面を示した（図６ｂ）。「部分」単層上の蛋白質島の高さは約４５Åで
あり、ストレプトアビジン蛋白質の寸法と一致した。ＡＦＭ観察により、１つの
単層のみが堆積されたＳＰＲ結果を確認する。
【外５】 図６ Ａｕ上のＳＡＭ形成のＡＦＭ。（ａ）ベアＡＵのみ（ｂ）蛋白質ドラッギ
ングを有する全カバー範囲（ｃ）蛋白質島を有する部分カバー範囲
【０１０３】 ５．結論 ＭＥＭＳ技術と、確立されたＤＮＡ技術との組合せにより、病原性バクテリア
に関する高い特異性および感度の検出器が得られる。ＳＡＭを用いた電気化学検
出を使用する生物学的同定が、１０００未満のＥ．ｃｏｌｉ細胞を検出すること
ができる感度で、シリコン・ウェハに正常に組み込まれた。
【０１０４】 参考文献 １．Ｙ．Ｆ．チェン，Ｊ．Ｍ．ヤン，Ｊ．Ｊ．ガウ，Ｃ．Ｍ．ホー，およびＹ．
Ｃ．タイ「生物剤検出のためのマイクロ流体システム」技術と流体力学の相互作
用に関する第３回国際会議（スイス、チューリッヒ，２０００年） ２．Ｄ．イヴニツキ，Ｉ．アブデルハミッド，Ｐ．アタナゾフ，Ｅ．ウィルキン
ス「レビュー：病原性バクテリアを検出するためのバイオセンサ」バイオセンサ
アンドバイオエレクトロニクス １４（１９９９），５９９−６２４ ３．Ｇ．マラザ；Ｉ．キアネラ；Ｍ．マシーニ「環境監視のための使い捨てＤＮ
Ａ電気化学バイオセンサ」Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３
８７（１９９９），２９７−３０７ ４．Ｊ．ワン等「環境監視用のＤＮＡ電気化学バイオセンサ」Ａ Ｒｅｖｉｅｗ
，Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３４７（１９９７），１−
８ ５．Ｔ．ラズガス；Ｅ．コズレギ；Ｊ．エムニス；Ｌ．ゴートン；Ｇ．マルコバ
ーガ「ペルオキシダーゼ修正電極：基礎と応用」Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍ
ｉｃａ Ａｃｔａ ３３０（１９９６），１２３−１３８ ６．Ｓ．Ａ．ダースト；Ｍ．アーラー；Ｐ．Ｈ．メーラー；Ｅ．Ｗ．クバレク；
Ｒ．ブランケンブルク；Ｈ．Ｏ．リビ；Ｈ．リングスドルフ；Ｒ．コルンベルク
「ビオチン化脂質層上でのストレプトアビジンの２次元結晶」Ｂｉｏｐｈｙｓ
Ｊ．５９（１９９１）３８７−３９６ ７．Ｐ．ワグナー；Ｍ．ヘグナー；Ｈ．Ｊ．グンテロット，Ｇ．セメンサ「超平
坦テンプレートストリップ金表面上に化学吸着された単層の形成およびｉｎ Ｓ
ｉｔｕ修正」ラングミュア １１（１９９５）３８６７−７５
【０１０５】 ＡＳＭＥ文書 生物学的検出のためのＤＮＡマイクロセンサ・アレイの最適化 ｉ．要旨 本論文は、以前の刊行物で開発されている高速生物剤検出のための再利用可能
ＤＮＡマイクロセンサ・アレイの特徴および最適化を示す（図１）［１〜３］。
このＭＥＭＳベースのＤＮＡセンサは、不特定結合を最小限に抑えるように新規
のマイクロ製造構造を備える標準の３電極電気化学電池構成を利用する。センサ
・モジュールは、様々なプロトコルに簡単に適合され、泌尿器中の尿路エシェリ
キア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）および中耳炎（中耳感染）をもたらす微生物などタ
ーゲットからの高分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の高速検出のために使用することがで
きる。尿道感染の患者の尿サンプルから、１０５未満のＥ．ｃｏｌｉ細胞を検出
することができる。適切なセンサ特徴および表面修正によって感度が高められる
。試料調製を含めた総検出時間は、ＰＯＤ結合オリゴヌクレオチドを使用するこ
とにより２５分まで短縮することができる。
【０１０６】 ｉｉ．緒言 従来の電気化学検出は、システム要件および構成により、ＭＥＭＳ技術および
製造プロセスに全く適合していない。電気化学電池は、少なくとも２つの電極（
作業電極、基準電極）と電解質とからなっていなければならない。電気化学電極
は、電荷移動の機構が電子輸送とイオン輸送の間で切り換わる界面である［４］
。電解質は、イオンの移動によって電荷移動を行うことができる媒体である。電
気化学検出は、基準電極によって供給される第２の不変電位を必要とし、半バッ
テリーを形成する。典型的な基準電極はＡｇ／ＡｇＣｌである。現在、シリコン
基板上にこの基準電極を製造するのは困難である。ほとんどのＭＥＭＳベースの
電気化学センサは、作業電極のみをマイクロ製造することに焦点を当てている。
本研究は、標準のＭＥＭＳプロセスによって製造されるシリコン上のＭＥＭＳベ
ース電気化学センサの特徴および適用を考察する。電気化学センサ上でのＤＮＡ
ハイブリダイゼーションを伴う臨床尿試料の試験は、シリコン上のＭＥＭＳベー
ス・センサを生医学検出に使用することができることを実証する。
【０１０７】 ｉｉｉ．検出スキーム 化学的に分裂されたターゲット細胞からの核酸分子（ＲＮＡ／ＤＮＡ）が、細
胞デブリの存在下で、アンカリングｓｓＤＮＡプローブ（ビオチンに結合）とラ
ベリングｓｓＤＮＡプローブ（フルオレセインに結合）の両方を用いてハイブリ
ダイゼーションされる（図２ａ）。これら２つのプローブは、２つの異なる保存
的配列を認識し、したがって、ハイブリッドは、ターゲット生物剤からの特定の
遺伝セグメントのみを用いて生成される。次いでオリゴヌクレオチド・ハイブリ
ッドが作業電極上に、ビオチンストレプトアビジン結合によって不動化され、結
合されていない成分が洗浄除去される（図２ｂ）。次いで、ペルオキシダーゼ（
ＰＯＤ）リンク・アンチフルオレセイン抗体が各ハイブリッド上に担持される（
図２ｃ）。媒介物（テトラメチルベンジジン、ＴＭＢ）を有する基質の追加後、
酵素反応が、図３に示されるＲＥＤＯＸ反応から電流測定で測定される電流信号
を生じる。プロトコル全体を４０分で完了させることができ、センサは、浄化プ
ロセス後に再び活動化される。
【０１０８】 ｉｖ．センサ特性 ほとんどのバイオセンサ・チップがオフチップ光学検出を利用する。本研究は
、信号ノイズ比の改善のためにセンサ最適化および表面修正を用いるオンチップ
電気化学検出に向かっている。ＭＥＭＳ技術は、小さな寸法の導電金属電極をシ
リコン基板上に正確に堆積し、パターン形成することができるため、小型電気化
学電池の開発を可能にする。本研究から、Ａｕが、３つの電極（作業電極、補助
電極、および基準電極）全てに対する適切な候補であり、フェロセンなどよく知
られている１電子システムを使用するＡｕ／Ａｕ／Ａｕ電極電池の特徴から、従
来の可逆１電子電池が得られることが確認された。
【０１０９】 ｖ．サイクリック・ボルタンメトリ フェロセンの可逆１電子移動に関するサイクリック・ボルタンメトリは、アノ
ード・ピークとカソード・ピークの間の約５７ｍＶのピーク離隔距離、同じピー
ク最大値、およびピーク電流と［スキャン率］１／２との線形関係によって特徴
付けられる［４］。図４に見られるように、様々なスキャン率でＭＥＭＳベース
の電気化学センサを使用するフェロセンのボルタモグラムが、予想される挙動を
示し、ピーク最大値でのピーク電流と［スキャン率］１／２とのプロットが線形
である。ペルオキシダーゼを使用する電気化学電池のさらなる特徴により、酵素
電流測定も実現可能であることが確認された。媒介物で行われるサイクリック・
ボルタンメトリは、ＴＭＢに関して予想されるように２電子レドックス移動を示
し（図５）、ペルオキシダーゼ酵素の追加により、−０．１Ｖバイアス電位で明
らかに測定することができる還元電流の増大がもたらされる。
【０１１０】 ｖｉ．不特定結合の減少 センサ表面は、作業電極上にターゲットＲＮＡ／ＤＮＡを捕捉するために蛋白
質自己組織化単層を有し、ＳＡＭは、原子間力顕微鏡検査（ＡＦＭ）および表面
プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって特徴付けられる［２］。信号対ノイズは、不
特定結合を減少させるための適切な表面修正によって大幅に改善することができ
る。第１の手法は、不特定結合する可能性がある結合部位をなくするために表面
阻止蛋白質を導入することである（図６）。第２の手法は、Ｔｅｆｌｏｎ（登録
商標）またはポリイミドのシラン化処理または薄膜コーティングを用いて周辺領
域の疎水性修正を追加する。蛋白質カバーされたＡｕ作業電極の疎水性により、
試薬は作業電極のみに閉じ込められて、周辺および他の２つの電極に対する酵素
の堆積を最小限に抑える（図７、８）。どちらの場合にも、不特定結合によるノ
イズが低減された。典型的には、第２の手法（疎水性修正）がＭＥＭＳ製造で使
用され、第１のものはプローブ試薬に組み入れられる。
【０１１１】 ｖｉｉ．プロトコル簡略化 試料調製は、ほとんどのバイオセンサに関して最も時間のかかるステップであ
る。任意の追加のプロトコル・ステップが、より流動性があるデバイス、および
より長い検出時間を必要とする。簡略化されたプロトコルが図９に示されており
、検出器ＤＮＡプローブ上へのＰＯＤ結合を用いた酵素担持のステップがなくな
っている。ハイブリダイゼーション条件は、６５℃に加熱した後にＰＯＤ酵素活
性を保持するように制御された。次いで、プロトコルを、４０分から２５分に短
縮することができ、試薬の必要数を１つだけ減らすことができる。
【０１１２】 ｖｉｉｉ．結果 以前の研究から、マイクロＤＮＡセンサの感度が約１０３個のＥ．ｃｏｌｉ細
胞であることが実証されている。近年のデータは、リボゾームＲＮＡ含有によっ
て静止段階で細胞培養から１０未満のＥ．ｃｏｌｉ細胞を検出することができる
ことを示す。次いで、センサが、ＵＣＬＡの感染症科からの臨床尿試料にさらさ
れて試験された。図１０に示されるように、尿試料中のＥ．ｃｏｌｉの最小検出
可能細胞数は、離隔することなく予備的結果から１０５である。尿試料での感度
は、さらなる最適化によって改善することができる。別のタイプのバクテリア、
ボルデテラは、負の制御として使用され、希釈剤を含めた全てのＥ．ｃｏｌｉ試
料が、負の制御よりも高い信号を有する。
【０１１３】 マイクロＤＮＡセンサは、従来の基準電極を利用することなく電気化学検出の
ために使用することができる。これは、バイアス電位が比較的低く（−０．１Ｖ
）、検出が、補助電極での電荷の蓄積を回避するのに十分短い（２０秒）ためで
ある。これは、フェロセンおよびＰＯＤ溶液のボルタモグラムを用いて確認され
た。
【０１１４】 Ｅ．ｃｏｌｉなどの病原体の電気化学検出のためにマイクロＤＮＡセンサを使
用することができることを実証した。ＭＥＭＳ技術によってシリコン上にパター
ン形成されたＡｕ／Ａｕ／Ａｕ３電極電池は、酵素反応の電流測定で正常に使用
された。これらのセンサは、マイクロ・トータル分析システム（μ−ＴＡＳ）ま
たは「Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ」内に組み入れることができる見込みを示し
ている。
【０１１５】 ｉｘ．結論 従来のＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いずに伝導電気化学検出が可能であることを実
証するために、電流測定によって酵素反応を検出することができ、フェロセンお
よびＰＯＤを用いたイクリック・ボルタンメトリを使用することによって特徴付
けられたマイクロＤＮＡセンサが製造された。ノイズ低減は、表面修正および阻
止蛋白質の導入によって達成された。作業電極内のウェルの構造設計およびシリ
コン基板上の表面処理が、作業電極を覆う試薬閉込めを可能にする。試薬電極コ
ンタクトを制御して、不特定結合を低減することができ、これは従来のビーカー
・セットアップでは可能でない。尿試料試験は、このＤＮＡセンサが、短い検出
時間およびより短いシステム・サイズでの臨床診断に適していることを示す。
【０１１６】 ｘ．参考文献 １．Ｙ．Ｆ．チェン，Ｊ．Ｍ．ヤン，Ｊ．Ｊ．ガウ，Ｃ．Ｍ．ホー，Ｙ．Ｃ．タ
イ，２０００年。「生物剤検出のためのマイクロ流体システム」技術と流体力学
の相互作用に関する第３回国際会議（スイス、チューリッヒ ２０００年）の議
事録 ２．Ｊ．Ｊ．ガウ，Ｅ．Ｈ．ラン，Ｂ．ダン，Ｃ．Ｍ．ホー ２０００年。「Ｄ
ＮＡアレイ・チップを有する酵素ベースの電気化学バイオセンサ」マイクロ・ト
ータル分析システム（μＴＡＳ）に関する第４回国際シンポジウム（オランダ、
エンシェーデ）の議事録 ３．Ｊ．Ｊ．ガウ，Ｅ．Ｈ．ラン，Ｂ．ダン，Ｃ．Ｍ．ホー ２０００年。「Ｅ
．ＣｏｌｉバクテリアのためのＭＥＭＳベース電流測定検出器−自己組織化単層
の使用」バイオセンサに関する第６回世界会合（米国サンディエゴ）の議事録 ４．Ｂ．エギーン １９９６年 バイオセンサ（ジョーン・ウィリー・アンド・
サンズ，ニューヨーク） ５．Ｅ．Ａ．Ｈ．ホール バイオセンサ（プレンティス・ホール，ニュージャー
ジー州イーグルウッド・クリフス，ｐｐ．９７−１３９，１９９１）
【０１１７】
【外６】 図１ ＤＮＡマイクロセンサ・アレイ・チップ （ａ）表面体積比を増大するための表面フィーチャを有する４つのセンサ （ｂ）１ｃｍ２の１４個のセンサ
【０１１８】
【外７】 図２ センサおよびプロトコル・プロセスの流れ（ａ）ハイブリダイゼーション
（ｂ）不動化（ｃ）ＰＯＤ担持 Labeling ssDNA: ラベリングｓｓＤＮＡ 16srRNA from E coli: Ｅ．ｃｏｌｉからの１６ｓｒＲＮＡ Anchoring ssDNA: アンカリングｓｓＤＮＡ Biotin: ビオチン florescence: フルオレセイン Signaling Enzyme horseradish peroxidase: シグナリング酵素−ホースラディ
ッシュペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） Streptavidin Self-Assenmbled Monolayer(SAM): ストレプトアビジン自己組織
化単層（ＳＡＭ） Counter Electrode: カウンタ電極 Working Electrode: 作業電極 Reference Electrade: 基準電極
【０１１９】
【外８】 ＰＲ：還元ペルオキシダーゼ、ＰＯ：酸化ペルオキシダーゼ ＭＯ：酸化媒介物、 ＭＲ：還元媒介物 図３ ホースラディッシュペルオキシダーゼの酵素反応の電子移動
【０１２０】
【外９】 図４ サイクリック・ボルタンメトリによるセンサ特性 Potential: 電位 Current: 電流 Scan Rate: スキャン率 Peak current: ピーク電流
【外１０】 図５ ＨＲＰ酵素化を伴うセンサ特性 Potential: 電位 Current: 電流 Oxida: 酸化 Reduc: 還元 Substrate: 基質
【外１１】 図６ 不特定結合をなくするために阻止蛋白質を追加することによるノイズ低減 Amperometry Detection Time: 電流測定検出時間（１０秒） Baseline Current(Anp): ベースライン電流（アンペア） No blocking protein: 阻止蛋白質なし with Bovine Senum Albumin(BSA): ウシ血清アルブミン使用 with KPL Detector Block: KPL Detector Block（登録商標）の使用
【０１２１】
【外１２】 図７ （ａ）従来のセンサと（ｂ）マイクロＤＮＡセンサとの間の電極試薬コン
タクトの比較 Auxiliary slectrode: 補助電極 Reference electrode: 基準電極 Micro fabricated working electrode: マイクロ製造作業電極 Electrolyte: 電解質 （ａ）従来のビーカー・セットアップ ・３つの電極が常に溶液中にある ・拡散制限効果 ・攪拌が必要 Hydrophobic surface: 疎水性表面 （ｂ） マイクロＤＮＡセンサ：関連電極のみが電解質小滴によってカバーされ
る
【外１３】 図８ マイクロＤＮＡの電極を覆う電解質閉込めのイメージ Auxiliary slectrode: 補助電極 Working electrode: 作業電極 Electrolyte: 電解質 Reference electrode: 基準電極 ＃１ ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび不動化中にのみ作用電極を覆う電解
質 ＃２ 基質溶液の追加によって、電流測定検出中に、３つの電極全てを覆う電解
質 ＃３ 表面修正によって構築される表面張力により、オーバーシュート小滴が元
の構造に戻る
【０１２２】
【外１４】 図９ ＰＯＤ結合ラベリング・プローブを用いた簡略化プロトコル（ａ）ハイブ
リダイゼーション（ｂ）不動化 Labeling ssDNA: ラベリングｓｓＤＮＡ 16srRNA from E coli: Ｅ．ｃｏｌｉからの１６ｓｒＲＮＡ Anchoring ssDNA: アンカリングｓｓＤＮＡ Biotin: ビオチン florescence: フルオレセイン Signaling Enzyme horseradish peroxidase: シグナリング酵素−ホースラディ
ッシュペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） Streptavidin Self-Assenmbled Monolayer(SAM): ストレプトアビジン自己組織
化単層（ＳＡＭ） Counter Electrode: カウンタ電極 Working Electrode: 作業電極 Reference Electrade: 基準電極 ＃１ シグナリング酵素−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） ＃２ フルオレセイン ＃３ ストレプトアビジン自己組織化単層（ＳＡＭ）
【外１５】 図１０ 尿試料を用いたマイクロＤＮＡセンサの感度チェック ＃１ 尿試料のＥ．ｃｏｌｉ細胞数 ＃２ 電流出力 ＃３ 検出前にｒＲＮＡを抽出するために溶菌された細胞 ＃４ センサ上での５μＬ試料体積 ＃５ 負の制御：２×Ｅ６ ボルデテラ細胞＝０．１１１ｕＡ
【０１２３】 自己組織化単層を使用するＥ．ｃｏｌｉバクテリア用のＭＥＭＳベースの電流測
定検出器 要旨 マイクロエレクトロメカニカル・システム（ＭＥＭＳ）、自己組織化単層（Ｓ
ＡＭＳ）、ＤＮＡハイブリダイゼーション、および酵素増幅の統合に基づくエシ
ェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の電流測定検出のためのシステムを開発した。
ＭＥＭＳ技術を使用して、Ｓｉウェハ上に堆積された複数の電極を有する検出器
アレイが製造され、完全に再利用可能であった。ＳＡＭを使用して、蛋白質スト
レプトアビジンの単層が、Ｅ．ｃｏｌｉからｒＲＮＡを捕捉するために作業電極
（Ａｕ）表面上に不動化された。ベアＡｕ上に蛋白質を直接吸着する、Ａｕ上で
ビオチン化チオールＳＡＭに蛋白質を結合する、Ａｕ上でビオチン化二硫化物単
層に蛋白質を結合するという３つの異なる手法を使用して、Ａｕ上にストレプト
アビジンを不動化することができる。ビオチン化チオール手法が最良の結果を生
んだ。Ｅ．ｃｏｌｉに関する高い特異性は、ｓｓＤＮＡ−ｒＲＮＡハイブリダイ
ゼーションを使用して達成され、高い感度は、酵素としてペルオキシダーゼを用
いた酵素増幅を使用して達成された。分析プロトコルは、数マイクロリットル程
度の溶液体積で行い、４０分間で完了することができる。検出システムは、Ｅ．
ｃｏｌｉと、バクテリアであるボルデテラブロンキセプチカとに関する高い特異
性をもって、ポリメラーゼ鎖反応を伴わずに１０００個のＥ．ｃｏｌｉを検出す
ることができた。
【０１２４】 キーワード マイクロエレクトロメカニカル・システム（ＭＥＭＳ）、自己組織化単層（Ｓ
ＡＭ）、電流測定検出、エシェリキア・コリ・バクテリア、ＤＮＡハイブリダイ
ゼーション
【０１２５】 １．緒言 光学的なものと電気化学的なもの両方の様々なバイオセンサが、病原性バクテ
リアの検出に関して開発されている（イヴニツキ等，１９９９年，２０００年）
。バクテリアを検出するための従来の方法は通常、有機体の形態学的評価、およ
び成長可能性の試験を含むが、そのような方法は非常に時間がかかり、現場条件
下で実現可能でない。高速検出および携帯性に関する要求が、病原体認識をシグ
ナル伝達と組み合わせるシステムの開発をもたらした。バクテリアの光学検出と
電気化学検出の両方が報告されており、しかし電気化学方法は、小型化に関して
より修正可能であるという利点を有する（イヴニツキ等，１９９９年、Ｔ．ワン
等，２０００年）。理想的な検出器に関する要件には、比較的短時間で完了させ
ることができるプロトコルを使用した高い特異性および高感度が含まれる。さら
に、小型化し、自動化することができるシステムは、特に検出が現場で必要とさ
れる場合に、現行技術に勝る大きな利点を提供する。
【０１２６】 マイクロエレクトロメカニカル・システム（ＭＥＭＳ）技術は、様々な設計適
用例で感知および作動を行うためにトランスデューサを提供する。ＭＥＭＳ技術
の重要な点は、電子回路と共に集積し、大量にバッチ製造することができるミク
ロンサイズの機械的部品を可能にすることである。ＭＥＭＳデバイスは、マイク
ロ加工のプロセスによって製造され、バッチ製造プロセスはリソグラフィを採用
する。マイクロ加工は、事前設計レジスト・パターン（またはマスク）を使用し
、次いで、望ましくない部分を選択的にエッチング除去して３次元構造を作成す
るために、リソグラフィ方法の使用に大きく依拠している（ホーおよびタイ，１
９９６年，１９９８年）。ＭＥＭＳは、小型化デバイスを作成するための権能付
与技法であり、本研究では、ＭＥＭＳ技術をバイオセンシング方法と組み合せて
、Ｅ．ｃｏｌｉバクテリアを検出する。
【０１２７】 高い特異性を達成する最も効果的な手段の１つは、バクテリアの遺伝物質を検
出することである（例えばｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、変性ＤＮＡ）。ターゲット・バ
クテリアのｒＲＮＡまたはｓｓＤＮＡのみに配列が相補的である一本鎖ＤＮＡ（
ｓｓＤＮＡ）プローブを選択することによって、ハイブリダイゼーション・イベ
ントの監視が、ターゲット細胞の選択的感知を可能にする。感度を最大にするよ
うに、ハイブリダイゼーション・イベントと酵素反応の組合せが信号増幅をもた
らす。これは、各基質から生成物への変換が信号全体に寄与するからである。酵
素反応によって増幅されるＤＮＡハイブリダイゼーションの検出に対するバイオ
アッセイは、依然として比較的短持間で完了することができる。最後に、電気化
学プローブに固有の小型化および携帯性が、それらのプローブを、ＭＥＭＳデバ
イスへの組込みに優れた候補とする。
【０１２８】 １つの検出システムにいくつかの良く確立された技術を組み合わせることに基
づいたエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に関するプロトタイプ電流測定検出
器を開発した（チェン等，２０００年、ガウ等，２０００年）。ＭＥＭＳ、自己
組織化単層（ＳＡＭ）、ＤＮＡハイブリダイゼーション、および酵素増幅の技術
は全て、小型化された特定の高感度のＥ．ｃｏｌｉ検出器の設計に寄与する。Ｄ
ＮＡ電気化学プローブは、すでに報告されており（ワン等，１９９７年、マラザ
等，１９９９年）、通常はグラファイトまたは炭素電極が使用される。使い捨て
試験ストリップ上のスクリーン印刷炭素電極を使用する、Ｅ．ｃｏｌｉからのＤ
ＮＡの電流測定検出に関する市販ユニットも利用可能である（アンドケア社、米
国ノースカロライナ州ダラム）。スクリーン印刷は、低コストであるという利点
を有するが、高次元精度を達成するのは簡単でない。リソグラフィを使用して、
金属（Ａｕ、Ａｇ）および炭素を含めた広い範囲の材料の薄膜を、μｍサイズ寸
法で正確にパターン形成することができる。さらに、ＳＡＭは、ＭＥＭＳ表面上
で分子を選択的に不動化する優れた方法である。Ａｕ、Ａｇ、および他の金属へ
のＳＡＭの結合は、良く研究されており（レベル等，１９９８年、モテシャライ
等，１９９８年、シャー等，１９９８年、ライリ等，１９９９年）、蛋白質およ
び他の生体分子を、ＳＡＭを使用してＡｕなどの表面上に簡単に不動化すること
ができる（オスツーニ等，１９９９年、ケーン等，１９９９年、スピンケ等，１
９９３年、ハウスリング等，１９９１年）。さらに、電極上のＳＡＭを使用する
電流測定方法は、ターゲット分析物を正常に検出することができることが実証さ
れている（サン等，１９９８年、ホウ等，１９９８年、マーシー等，１９９８年
）。
【０１２９】 本Ｅ．ｃｏｌｉ検出システムでは、各技術に固有の利点を活用する。ＤＮＡハ
イブリダイゼーションおよび酵素増幅を使用して、必要な特異性および感度を達
成する。ＭＥＭＳおよびＳＡＭを使用して、小型システムを製造し、これにより
携帯型器具をもたらすことができる。最後に、この検出システムが広い範囲の病
原性バクテリアに適用可能であることを実証する。例えば、検出モジュールおよ
びアッセイ・プロトコルを、尿路Ｅ．ｃｏｌｉの検出、および中耳炎（中耳感染
）をもたらす微生物の同定に適合させることができる。
【０１３０】 ２．実験 ２．１．ＭＥＭＳ検出器アレイ 二酸化珪素（ＳｉＯ２、１０００Å）の層が、ベアＳｉウェハ（第１級、ｐ型
＜１００＞、厚さ５００〜５５０μｍ）上に堆積され、窒化珪素（Ｓｉ３Ｎ４、
１０００Å）の下でパッド層として働いて、応力を解放し、接着を改善した。Ｍ
ＥＭＳアレイは、深さ３５０μｍのウェルを形成するようにエッチングされた３
．６ｍｍ×３．６ｍｍの作業電極を有して製造された。窒化物ウェハは、パター
ン形成され、［１１１］および［１００］結晶面に沿ってＫＯＨを使用してバル
ク・エッチングされ、ウェルの深さは、ＫＯＨエッチング時間および温度によっ
て制御された。１００μｍ幅補助電極および基準電極が、対応する電極から２０
０μｍだけ離隔された。図１は、ＭＥＭＳアレイを製造する際に使用されたパタ
ーンの概略図を示す。窒化物および酸化物がＨＦエッチングによって除去されて
、内部応力が解放され、電気絶縁のために別の酸化物層（５０００Å）が堆積さ
れた。電極は、ＰＲ５２１４フォト・レジスト・リバース・イメージングおよび
Ａｕ（２０００Å）／Ｃｒ（２００Å）の電子ビーム堆積を用いたリフトオフ・
プロセスによってパターン形成された。最後に、１５０℃で１０分のホット・ベ
ークの後、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）蒸気中に３分間浸されて、周囲
のＳｉ領域に疎水性表面が生成された。作業電極の３次元性質と共に、周囲領域
の疎水性が、作業電極内への液体小滴の封じ込めを可能にする。この設計は、Ｍ
ＥＭＳアレイの他の領域への生体分子の不特定結合を効果的に最小限に抑えた。
【０１３１】 ２．２．Ａｕ上へのストレプトアビジンＳＡＭの堆積 １）ベアＡｕ上にストレプトアビジンを直接吸着する、２）ビオチン化チロー
ル、ビオチン−ＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨのＳＡＭを堆積し、後でストレプトアビジ
ンを結合する、３）ビオチン化二硫化物、ビオチン−ＨＰＤＰのＳＡＭを堆積し
、後でストレプトアビジンを結合するという３つの異なる方法を使用して、スト
レプトアビジン単層をＡｕ上に堆積した。全ての場合に、Ａｕ表面は、濃縮「ピ
ラニア」溶液（７０体積％のＨ２ＳＯ４、３０体積％のＨ２Ｏ２）を用いて浄化
され、脱イオン水を用いて完全にすすぎ洗いされた。ベアＡｕ上にストレプトア
ビジンを堆積する際、０．０２Ｍ Ｎａ燐酸塩緩衝液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、
ｐＨ７．２中の１．０ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン溶液（シグマケミカル社
Ｓ０６７７）が、基板上に配置され、１０分間留めることができ、脱イオン水で
すすぎ洗いされた。ビオチン−ＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨ（１２−メルカプト（８−
ビオチンアミド−３，６−ジオキサオクチル）ドデカンアミド）（ロシュ Ｇｍ
ＢＨ、ドイツ）のＳＡＭを堆積する場合、スピンケ等（１９９３年）の処置が使
用され、試料は、４．５×１０−４Ｍ １１−メルカプト−１−ウンデカノール
を有するエタノール中の５０μＭビオチン−ＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨ溶液（アルド
リッチケミカル社 ４４，７５２−８）中で約１８時間インキュベートされ、エ
タノールおよび水ですすぎ洗いされた。次いでビオチン被覆Ａｕ表面が約１０分
間、１．０ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン溶液に露出され、やはり水ですすぎ洗
いされた。ビオチン−ＨＰＤＰのＳＡＭ（Ｎ−［６−（ビオチンアミド）ヘキシ
ル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド、ピアス社，２１３４
１）を堆積する際、試料は、エタノール中の５０μＭビオチン−ＨＰＤＰ溶液中
で約１８時間インキュベートされ（４．５×１０−４Ｍメルカプトプロパノール
を用いて、または用いずに）、エタノールおよび水ですすぎ洗いされた。次いで
、表面が、約１０分間１．０ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン溶液に露出され、や
はり水ですすぎ洗いされた。
【０１３２】 ２．３．Ｅ．ｃｏｌｉの電流測定検出に関するアッセイ・プロトコル アッセイ・プロトコルは以下のように行われた。１）５０μｌの溶菌試薬（ア
ンドケア社、４００２−１１）が、培養媒体中のバクテリアの２５０μｌ試料に
追加され、室温で５分間インキュベートされた。２）次いで、１００μｌのプロ
ーブ溶液（アンドケア社、４００２−１３）が追加され、混合物が６５℃で１０
分間インキュベートされた。３）５μｌの溶菌Ｅ．ｃｏｌｉ／プローブ溶液混合
物が、ＭＥＭＳ検出器アレイのストレプトアビジン被覆作業電極上に配置され、
室温で１０分間インキュベートされた。４）ＭＥＭＳ検出器アレイがビオチン洗
浄溶液で洗浄された（キルケゴールアンドペリー・ラボラトリー、５０−６３−
０６）。５）希釈剤（アンドケア社、４００２−１４）を用いて０．７５Ｕ／ｍ
ｌまたは０．１５Ｕ／ｍｌに希釈された５μｌのＡｎｔｉ−Ｆｌ−ＰＯＤ（アン
チフルオレセインペルオキシダーゼ、１５０Ｕ、ロシュ社、１４２６３４６）が
、作業電極上に配置され、室温で１０分間インキュベートされた。６）ＭＥＭＳ
アレイ・チップが、やはり洗浄溶液を用いて洗浄された。７）３つの電極（作業
電極、補助電極、基準電極）全てが基板溶液によってカバーされるように、１０
μｌのＫ−ｂｌｕｅ基質（ネオゲン社 ３００１７６）が検出器アレイ上に配置
された。８）電気化学測定値が即座に取られた。全プロトコルが４０分以内に完
了した。ピコアンプ・ブースタおよびファラデー・ケージを有するＣＨインスト
ゥルメンツ６６０Ａエレクトロケミカル・ワークステーションを使用して、電流
測定電流対時間が測定された。ＭＥＭＳ検出器アレイ上の試料が、順次に測定さ
れた。電圧は（基準に対して）−０．１Ｖで固定され、２０秒のカソード電流が
電流測定信号として取られた。２０秒で電流値が安定状態に到達した。細胞濃度
（細胞数）は、連続的な希釈および培養皿カウンティングを使用して決定された
。
【０１３３】 ２．４．自己組織化単層の特徴 検出器の性能は、不動化されたストレプトアビジン単層の性質に大きく依存し
ている。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、バイアコアＸシステム、バイアコア社）
および原子間力顕微鏡検査（ＡＦＭ）を行って、単層を特徴付けた。ベアＡｕへ
のストレプトアビジン結合のＳＰＲ研究では、ベアＡｕチップ（Ｊ１センサ・チ
ップ）が使用された。ビオチン−ＤＡＤ−Ｃ−１２−ＳＨ／Ａｕまたはビオチン
−ＨＰＤＰ／Ａｕへのストレプトアビジン結合の研究では、ビオチンＳＡＭは、
ＳＰＲ実験前に、すでに述べたようにベアＡｕチップ上に堆積された。最良の結
果として、ベアＡｕを用いてＳＰＲを行う、またはビオチンＳＡＭを堆積する前
に、希釈Ｈ２ＳＯ４／Ｈ２Ｏ２溶液で約２分間、新たなチップが洗浄された。全
ての場合に、０．０２Ｍ Ｎａ燐酸塩、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２緩衝
液中の１．０ｍｇ／ｍｌストレプトアビジンが使用された。ベアＡｕ上のストレ
プトアビジンに関する吸着実験では、流量は１〜５μｌ／分の範囲にあった。ス
トレプトアビジンおよびビオチン−ＤＡＤ−Ｃ１２−ＳＨ／Ａｕに関する実験で
は、流量は１０〜２５μｌ／分の範囲にあった。ストレプトアビジンおよびビオ
チン−ＨＰＤＰ／Ａｕに関する実験では、流量が５〜１０μｌ／分の範囲にあっ
た。脱着実験では、以下の溶液２５μｌが、２５μｌ／分でチャネルを介して順
次に流れた（総露出時間は１分）。１．０Ｍ ＫＣｌ、８Ｍ尿素、０．５％ＳＤ
Ｓ、０．１Ｍ ＨＣｌ、０．１Ｍ ＮａＯＨ、および４０体積％ホルムアミド。
【０１３４】 ＡＦＭ（オートプローブＣＰ、サーモマイクロスコープ社）は、５．０ｎＮの
力を有するウルトラレバー・チップを使用して接触モードで行われた。平坦なＡ
ｕ表面を保証するために、ワグナー等（１９９５年）の方法が使用され、Ａｕが
まずマイカ上に電子ビーム蒸着によって堆積され、次いでＳｉに転写された。本
実験の場合、マイカは、溶媒を使用せずにＡｕから清潔に除去するためにへき開
された。
【０１３５】 ３．結果 ３．１ マイクロエレクトロメカニカル・システム（ＭＥＭＳ） 図２は、ＭＥＭＳ検出器アレイの写真を示す。対応する補助電極および基準電
極と共に１６個の作業電極が、２．８ｃｍ×２．８ｃｍ領域内にパターン形成さ
れた。検出器アレイは、Ｈ２ＳＯ４／Ｈ２Ｏ２溶液を使用して表面を浄化するこ
とができるので、完全に再利用可能であった。表面を適切に浄化し、作業電極上
にＳＡＭを再堆積することによって同じＭＥＭＳ検出器アレイを複数回再利用し
た。
【０１３６】 ３．２ ＤＮＡハイブリダイゼーションを使用するＥ．ｃｏｌｉ検出 本ＭＥＭＳシステムでは、Ｅ．ｃｏｌｉ検出は、ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ンと、それに続く酵素反応に基づく。電極表面を例示する概略図を図３に示す。
ストレプトアビジン単層が、Ａｕ作業電極表面上に不動化されて、Ｅ．ｃｏｌｉ
からｒＲＮＡを捕捉する。２つのｓｓＤＮＡセグメントがこのシステムで使用さ
れる。ストレプトアビジン結合のためにビオチンに結合された捕捉ｓｓＤＮＡは
、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒＲＮＡの一端にハイブリダイゼーションする。酵素ペルオキ
シダーゼ（ＰＯＤ）にリンクされたアンチフルオレセインへの結合のためにフル
オレセインに結合された検出器ｓｓＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒＲＮＡの多端に
ハイブリダイゼーションする。捕捉ｓｓＤＮＡと検出器ｓｓＤＮＡは、２つの異
なる保存的配列を認識し、それによりハイブリッドは、Ｅ．ｃｏｌｉからの特定
の遺伝子セグメントを用いてのみ生成される。オリゴヌクレオチド・ハイブリッ
ドはＡｕ作業電極上に、ビオチンストレプトアビジン結合によって不動化され、
結合されていない成分が洗浄除去される。ストレプトアビジンは、通常は高い親
和力（Ｋｄ 約１０−１５Ｍ）でビオチンに結合する（ウェーバー等，１９８９
年）。（Ａｎｔｉ−Ｆｌ−フルオレセイン結合を介する）ハイブリッド上へのＰ
ＯＤの担持後、基質が追加され、酵素反応が電流測定で検出される。基質溶液は
、基質Ｈ２Ｏ２と、媒介物である３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（
ＴＭＢ）との両方を含む。酵素および電極反応が図４に示される。
【０１３７】 ３．３ ｒＲＮＡ捕捉のためのストレプトアビジン自己組織化単層 図５に示すように、電極表面上でストレプトアビジン単層を不動化するために
３つの異なる手法を使用した。第１の手法では、ストレプトアビジン単層が、蛋
白質吸着によってベアＡｕ上に堆積された。第２の手法では、ビオチン化チオー
ルを使用してビオチンのＳＡＭがＡｕ上に堆積され、その後、ストレプトアビジ
ンがビオチンに結合された。第３の手法では、ビオチンのＳＡＭが、ビオチン化
二硫化物を使用してＡｕ上に堆積され、その後、ストレプトアビジンがビオチン
に結合された。
【０１３８】 ３．４ ストレプトアビジン単層の特徴 ストレプトアビジン単層は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）と原子間力顕微鏡
検査（ＡＦＭ）の両方を使用することで特徴付けられる。ＳＰＲは、溶液金属界
面での分子と金属（Ａｕ、Ａｇ）薄膜との相互作用を監視するための実行可能技
法であることが実証されている。この技法を使用して、堆積層の厚さを評価し、
会合および解離の速度論を測定することができる（ハウスリング等，１９９１年
、スピンケ等，１９９３年、シーガル等，１９９６年、ラオ等，１９９９年、ユ
ング等，１９９９年）。３つの手法全てを使用して、Ａｕ上のストレプトアビジ
ンの堆積を監視するためにＳＰＲを行った。ＳＰＲ結果が図６に示されている。
製造業者（バイアコア）による較正に基づくと、ＳＰＲ信号の１０００レゾナン
ス・ユニット（ＲＵ）が、表面蛋白質濃度中の約１ｎｇ／ｍｍ２の変化に相当す
る。ストレプトアビジンは、約５５×４５×５０Å（ダースト等，１９９１年）
の寸法を有する。ストレプトアビジンの完全な単層は、２次元結晶単層（ユング
等，１９９９年、ダースト等，１９９１年）に基づいて計算される約２．８ｎｇ
／ｍｍ２の予想密度を有する。図６から、本質的にストレプトアビジンの完全な
単層が、ビオチン化チオールＳＡＭ／Ａｕ（約３０００ＲＵ）上に堆積され、約
８０％の「カバー範囲」が、ベアＡｕ（約２４００ＲＵ）上に堆積されたストレ
プトアビジンを用いて得られ、約５２％の「カバー範囲」が、ビオチン化二硫化
物ＳＡＭ／Ａｕ（約１５５０ＲＵ）上に堆積されたストレプトアビジンを用いて
得られた。ビオチン化二硫化物に関して、溶液中のメルカプトプロパノールの存
在は、ＳＰＲ信号がわずか約１０％（約１７００ＲＵ、データは図示せず）しか
増大しないので、表面カバー範囲に対する効果を無視できる。全ての場合に、蛋
白質溶液の第２の注入時の追加の蛋白質堆積が最小限になった。さらに、流量は
、堆積された蛋白質の割合または量に対する効果を無視できる。ＳＰＲ結果は、
３つの手法全てで、多層ではなくストレプトアビジンの単層のみがＡｕ上に堆積
したことを示す。最後に、これらの結果は、ストレプトアビジンビオチン結合お
よびＡｕ上へのストレプトアビジン吸着のほとんどが数秒以内で生じ、数分程度
で完了させることができることを立証している。
【０１３９】 ストレプトアビジンを脱着することができるかどうか、すなわち表面を再生成
するために、ストレプトアビジンをベアＡｕから、またはビオチンへの結合から
解離できるかどうかを判定するための実験を行った。表Ｉは、蛋白質リガンド結
合および／または変性蛋白質を解離するために知られている様々な試薬を用いた
処理後のＳＰＲ信号（ＲＵ）の損失を列挙する。表Ｉに見られるように、わずか
８Ｍの尿素、０．５％のＳＤＳ、および０．１Ｍ ＮａＯＨが、表面からストレ
プトアビジンを脱着するのに幾分効果的であった。１．０Ｍ ＫＣｌ、０．１Ｍ
【０１４０】 ＨＣｌ、および４０％ホルムアミドは効果的でなかった。ストレプトアビジン
は、任意の試薬によって完全には脱着することができず、全ての試薬に表面をさ
らした後にいくらかの蛋白質が残った。これらの結果は、ストレプトアビジンが
、ビオチンＳＡＭとベアＡｕとの両方にかなり良好に結合し、ストレプトアビジ
ンアン単層が比較的安定であったことを示す。
【０１４１】 ＡＦＭの使用により、ベアＡｕに直接吸着されたストレプトアビジンのイメー
ジングによって表面をさらに特徴付けることができる。ベアＡｕは、トポグラフ
ィ・フィーチャ＜１０Åを有し、「部分」単層上の蛋白質島は約４５Åであり、
ストレプトアビジンの寸法に適合していた（図７）。ＡＦＭ結果は、Ａｕ上にた
だ１つの単層が堆積されるというＳＰＲの知見を確証する。「完全な」蛋白質単
層に関する接触モードでのＡＦＭが、蛋白質ドラッギングの痕跡があるフィーチ
ャレス表面を示し（データは図示せず）、したがって表面カバー範囲に関する追
加の情報は提供しなかった。以前に報告されているように、ビオチン化ＳＡＭを
使用し、その後、ストレプトアビジンを結合するときにも単層堆積が得られる（
スピンケ等，１９９３年、ユング等，１９９９年）。
【０１４２】 ３．５ ＭＥＭＳ検出器アレイを用いた電気化学測定 本ＭＥＭＳ検出器アレイでは、３つの電極、すなわち作業電極、補助電極、お
よび基準電極の全てに関してＡｕを用いた３電極システムを使用した。通常、Ａ
ｇ／ＡｇＣｌまたは飽和カロメル電極（ＳＣＥ）が、基準電極で固定電位での可
逆酸化／還元が生じるように、基準電極として使用された。しかし、本ＭＥＭＳ
検出器アレイでは、基準電極としてＡｕを使用して、製造を簡略化し、完全に再
利用可能なアレイを可能にした。一定の電位の維持は、（２電極システムに対し
て）３電極システムの使用によって可能になった。ＴＭＢの還元が監視されるこ
の特定の適用例では、基準電極としてＡｕを正常に使用することができる。これ
は、低い電圧差（−０．１Ｖ）が短い時間（＜１分）維持されたためである。
【０１４３】 ２つの個別の実験によって電気化学検出に関してＡｕ／Ａｕ／Ａｕ電極システ
ムを特徴付けた。第１の実験では、フェロセン被膜が電極上に配置され、サイク
リック・ボルタンメトリが、レドックス反応を監視するために行われた。従来の
可逆の１電子移動に関するサイクリック・ボルタンメトリは、アノード・ピーク
とカソード・ピークの間の約５７ｍＶのピーク離隔距離、ピーク最大値での同じ
ピーク電流、およびピーク電流と［スキャン率］１／２との線形関係によって特
徴付けられる（ホール，１９９１年）。図８は、様々なスキャン率でフェロセン
を用いて得られるボルタモグラムを示す。図８に見られるように、従来のレドッ
クス挙動が観察され、ピーク電流対［スキャン率］１／２のプロットが線形であ
る（図９）。
【０１４４】 Ａｕ／Ａｕ／Ａｕ電極システムを用いた第２の実験では、サイクリック・ボル
タンメトリが、基質溶液（Ｈ２Ｏ２＋ＴＭＢ）のみに対して行われ、次いで再び
ＰＯＤ酵素を用いて同じ溶液に対して行われた。スキャン率１０ｍＶ／秒で−０
．２Ｖ〜＋０．５０Ｖでサイクルして、基質溶液が、ＴＭＢの２電子レドックス
挙動を示した（図１０）。基質溶液へのＰＯＤの追加は、還元電流の増大をもた
らした。次いで、ＰＯＤ酵素活性の測定に関して、（基準に対する）−０．１０
Ｖの定電位が選択された。この電位では、電流バックグラウンドがゼロに近く、
基質酸化が行われない。この電位は、酵素活性判定に最適であり、少量の生成物
（酸化ＴＭＢ）が、高濃度の基質の存在下で測定された。
【０１４５】 ３．６ Ｅ．ｃｏｌｉの検出 Ｅ．ｃｏｌｉ ｒＲＮＡの電流測定検出に関して、まず、３つの異なるストレ
プトアビジン単層表面の性能を比較した。ストレプトアビジンは、前述した３つ
の異なる手法を使用してＡｕ上で不動化され、バクテリアＥ．ｃｏｉｌおよびボ
ルデテラブロンキセプチカ（ボルデテラ）に関してアッセイ・プロトコルが行わ
れた。ｓｓＤＮＡプローブはＥ．ｃｏｉｌに特有なものであるので、ボルデテラ
・バクテリアは負の制御試料として働いた。この実験の目的は、ビオチン−ｒＲ
ＮＡ−ＰＯＤハイブリッドを捕捉するために不動化ストレプトアビジンの効率を
比較することであった。Ｅ．ｃｏｉｌの２つの濃度が使用され、一方の試料を他
方の１０倍の濃度にした。さらに、ボルデテラからの信号が、不特定結合のレベ
ルまたは達成可能な「ベースライン」を示す。この実験からの結果が図１１に示
される。同じバクテリア溶液（Ｅ．ｃｏｌｉまたはボルデテラ）が使用されたの
で、異なる表面の直接の比較を行うことができる。図１１に見られるように、ビ
オチン化チオールによって不動化されたストレプトアビジンが、Ｅ．ｃｏｌｉ検
出に関する最良の条件であった。ビオチン−チオールＳＡＭを使用して、ボルデ
テラからの低いベースライン信号を達成しながらＥ．ｃｏｌｉに関する良好な信
号を得た。Ａｕに対してビオチン二硫化物によって不動化されたストレプトアビ
ジンでは、Ｅ．ｃｏｌｉに関する電流信号（両方の濃度）が大幅に低くなり、ベ
ースラインは、ビオチン−チオール／ストレプトアビジンに関するものと同じで
あった。Ａｕに直接吸着されたストレプトアビジンの場合、ボルデテラからの信
号ははるかに高く、表面に対するＰＯＤのより高レベルの不特定結合を示した。
【０１４６】 Ａｕ／ビオチン−ＳＨ／ストレプトアビジンが最適なストレプトアビジン表面
になったことを確かめた後、システムの感度を求めるためにＥ．ｃｏｌｉおよび
ボルデテラを使用してプロトコルを繰り返した。ビオチン−ＳＨ ＳＡＭによっ
てストレプトアビジンを不動化して、負の制御としてボルデテラを有して、一連
のＥ．ｃｏｌｉ希釈液に対するアッセイを行った。その結果を図１２に示した。
データは、ＭＥＭＳシステムを使用して少なくとも１０００個のＥ．ｃｏｌｉ細
胞を検出することができることを示す。予想されるように、電流信号は、試料溶
液中のＥ．ｃｏｌｉ細胞の数の増加の関数として増大した。さらに、アッセイ・
プロトコルで使用されるＰＯＤ濃度を低下させる（０．７５Ｕ／ｍｌから０．１
５Ｕ／ｍｌに）ことにより、より少ないＥ．ｃｏｌｉ細胞数で、信号のより良い
区別を達成した（図１３）。図１３に見られるように、１０００個のＥ．ｃｏｌ
ｉ細胞に関する電流信号は、２．５×１０５のボルデテラ細胞に関するものの２
倍よりも大きかった。本ＭＥＭＳシステムを使用する結果は、Ｅ．ｃｏｌｉバク
テリアが、バクテリアｒＲＮＡを捕捉するために電流測定およびＳＡＭを使用し
て正常に検出されたことを確証する。
【０１４７】 ４．考察 本結果は、ＭＥＭＳ技術をＳＡＭ、ＤＮＡハイブリダイゼーション、および酵
素電流測定と組み合わせることで、Ｅ．ｃｏｌｉなどのバクテリアに関する高い
特異性および感度をもつ電気化学検出器がもたらされることを示す。各成分から
の寄与は、システムの全体の正常性に重要である。ＭＥＭＳ技術は、複数の３電
極「電池」のアレイをＳｉウェハ上に堆積することができるようにし、説明した
ＭＥＭＳ検出器アレイは、ＳＡＭを除去することができ、適切な浄化を用いてＡ
ｕ表面が再生成されるので十分に再利用可能である。さらに、マイクロ加工チャ
ネル、弁、ポンプ、および集積電子回路を用いて、試料調製およびアッセイ・プ
ロトコルを完全に自動化することができる。
【０１４８】 ＳＡＭは、捕捉生体分子、例えばストレプトアビジンを不動化するようにＡｕ
作業電極を機能させる効果的な手段を提供する。ＤＮＡハイブリダイゼーション
は、ｓｓＤＮＡプローブの配列をターゲットのみと相補的になるように注意深く
選択することができるので、病原性バクテリアに対する高い特異性をもつことが
できるようにする。ハイブリダイゼーション・イベントを酵素反応と組み合わせ
ることで、信号増幅が提供され、感度が高まる。最終的に、電気化学変換を使用
することによって、最少電力消費の小型化携帯型システムを開発することができ
る。
【０１４９】 高速検出および携帯型器具は、病原体センシングに望ましい。このシステムを
使用して約４０分以内で検出を達成することができることが実証された。小さい
寸法および小さい試料体積により、ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび酵素結
合に関して現在使用されているインキュベーション時間（１０分）を短縮するこ
とによって、アッセイ時間をさらに短縮することができる。ＭＥＭＳの明らかな
利点は、非常に小さな体積（数μｌ）および電極表面積（現在、作業電極では０
．１３ｃｍ２、補助および基準電極では＜０．０２ｃｍ２）を使用することがで
きることである。本実験の結果は、少なくとも約１０３個の細胞を、ポリメラー
ゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いずにこのシステムを使用して検出することができるこ
とを示す。ＭＥＭＳシステムでの小さな体積および作業電極表面積により、絶対
細胞数に関する検出限界は、細胞濃度（細胞／ｍｌ）に関する検出限界を報告す
るよりも適している。１０２〜１０３細胞／ｍｌ程度の検出限界が報告され、し
かし通常は、約１ｃｍ２の作業電極表面積を有する約１．０ｍｌの試料体積が使
用された（アブデルハミッド等，１９９８年，１９９９年）。電流測定酵素免疫
濾過アッセイでは、信号は、１．０ｍｌ試料を使用するときよりも０．１ｍｌ試
料を使用するときに１桁以上大きかった。
【０１５０】 Ｅ．ｃｏｌｉ ｒＲＮＡを検出するための電流測定実験の結果は、ビオチン化
チオールＳＡＭ手法によって不動化されたストレプトアビジン単層が最良の結果
を生み出すことを示している。ＳＰＲデータが、ビオチン化チロールを使用する
ときに最大のストレプトアビジン表面密度または「カバー範囲」を示しているの
で、この知見は驚くべきものではない。よく秩序化された自己組織化単層は、ビ
オチン化チオールを用いてのみ生成され、最大のストレプトアビジン表面密度を
もたらす可能性が高い。ビオチン化二硫化物の場合、Ａｕ表面へのビオチンの取
付けはＡｕ−Ｓ結合によって行われるが、追加の有機基はおそらく稠密単層の形
成を妨げる。Ａｕへの直接の吸着によって不動化されたストレプトアビジンは、
作業電極に対するＰＯＤ酵素の非常に大きい不特定結合をもたらした。様々な蛋
白質（例えばストレプトアビジン、免疫グロブリン）に取り付けられたコロイド
状Ａｕ粒子が市販されている（ナノプローブ社、ニューヨーク州ヤップハンク）
ので、Ａｕへの蛋白質吸着がよく知られている。ストレプトアビジンは、システ
インまたはメチオニンの残留物を含まず（ウェーバー等，１９８９年）、したが
って、Ａｕ−Ｓ結合によってＡｕに付着しない。Ａｕへの蛋白質吸着は、カルボ
キシル基とＡｕとの相互作用によって生じる場合があり（オーカ等，１９９９年
）、ストレプトアビジンＡｕ付着に関する有望な機構である。ストレプトアビジ
ン単層を直接吸着によってＡｕに付着することができるが、自己組織化または分
子秩序が生じるかどうかは疑問である。ＳＰＲ脱着実験は、ストレプトアビジン
Ａｕ付着がストレプトアビジンビオチン結合と同じくらい頑強になることを示し
た。すなわち尿素、ＳＤＳ、およびＮａＯＨによって除去されるストレプトアビ
ジンの量は、ビオチンに付着されたストレプトアビジンと異なり、Ａｕ上に直接
吸着されたストレプトアビジンの場合と同様であった。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉに
関するアッセイ・プロトコルを行うとき、試料溶液は、オリゴヌクレオチド、お
よび溶菌Ｅ．ｃｏｌｉからの細胞デブリを含んでいた。本データは、他の蛋白質
および生体分子の存在が、Ａｕからのストレプトアビジンの脱着を加速し、表面
への酵素ＰＯＤの不特定結合の増大をもたらしたことを示唆している。
【０１５１】 ５．結論 Ｅ．ｃｏｌｉバクテリアは、ＭＥＭＳにＳＡＭ、ＤＮＡハイブリダイゼーショ
ン、および酵素増幅を組み込むことによって正常に検出された。Ｅ．ｃｏｌｉに
関して特有であり、ＰＣＲを用いずに１０００個の細胞を検出することができる
ＭＥＭＳベースの検出システムを実証した。プロセス時間は４０分以下にするこ
とができる。さらに、数マイクロリットル程度の溶液体積を用いてアッセイを行
うことができる。ＳＡＭ、ＤＮＡハイブリダイゼーション、および酵素増幅方法
をＭＥＭＳ技術と統合することにより、病原性検出に関する新世代のデバイスを
可能にする。
【０１５２】 参考文献 Ｉ．アブデルハミッド，Ｄ．イヴニツキ，Ｐ．アタナゾフ，Ｅ．ウィルキンス
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【０１５３】
【表１】
【０１５４】
【外１６】
【外１７】
【外１８】
【外１９】
【図面の簡単な説明】
【図１】 従来の基準電極の一実施形態の概略図である。
【図２】 電気化学方法で使用されるポテンショスタットの一実施形態の概略図である。
【図３】 本発明による円形基板ウェハ上の複数の電気化学バイオセンサの一実施形態の
概略図である。
【図４】 本発明による正方形基板上の複数の電気化学バイオセンサの代替実施形態の概
略図である。
【図５】 本発明による基板上の電気化学バイオセンサの別の実施形態の概略図である。
【図６】 時間の経過に伴うサイクリック・ボルタンメトリ（ＣＶ）スキャン電位のグラ
フである。
【図７】 本発明によるバイオセンサによって取られる１サイクル・サイクリック・ボル
タンメトリ（電流対バイアス電位）である。
【図８】 本発明によるバイオセンサによって取られる様々なスキャン率でのサイクリッ
ク・ボルタンメトリ（電流対バイアス電位）である。
【図９】 本発明によるバイオセンサによって取られるスキャン率対ピーク電流の平方根
のグラフである。
【図１０】 本発明によるバイオセンサによって取られる一定のスキャン率での複数のサイ
クルにおけるサイクリック・ボルタンメトリ（電流対バイアス電位）である。
【図１１（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）】 本発明による表面張力および処理による試薬および／または溶液閉込めを示す
線図である。
【図１２】 本発明によるバイオセンサ上の作業電極のみを選択的に覆う試薬および／また
は溶液閉込めを示す線図である。
【図１３】 本発明によるバイオセンサ上の全ての電極を覆う試薬および／または溶液閉込
めを示す線図である。
【図１４】 本発明のバイオセンサの一実施形態を製造することができる方法の第１のステ
ップを示す側面図である。
【図１５】 バイオセンサを製造することができる方法の第２のステップを示す線図である
。
【図１６】 バイオセンサを製造することができる方法の第３のステップを示す線図である
。
【図１７】 バイオセンサを製造することができる方法の第４のステップを示す線図である
。
【図１８】 バイオセンサを製造することができる方法の第５のステップを示す線図である
。
【図１９】 バイオセンサを製造することができる方法の第６のステップを示す線図である
。
【図２０】 不特定結合を防止するように本発明のバイオセンサの一実施形態の表面を修正
することができる方法を示す線図である。
【図２１】 図２０での表面修正プロセスのバイオセンサ表面上での最終結果を示す線図で
ある。
【図２２】 バイオセンサが集積回路構成要素と集積されている、バイオセンサ・システム
の本発明の一実施形態の断面図である。
【図２３】 集積回路構成要素と集積された複数のバイオセンサの本発明の一実施形態の線
図である。
【図２４】 他の同様のユニットと共に、図２４の集積回路構成要素と集積された複数のバ
イオセンサを作成するバイオセンサ・ユニットの断面図である。
【図２５】 ＣＭＯＳデバイスがバイオセンサ（センサチップ）自体に集積して、本発明の
バイオセンサ（センサチップ）の一実施形態を集積回路（ＩＣ）技術によって製
造することができる方法の第１のステップを示す線図である。
【図２６】 バイオセンサ（センサチップ）を集積回路（ＩＣ）技術によって製造すること
ができる方法の第２のステップを示す線図である。
【図２７】 バイオセンサ（センサチップ）をＩＣ技術によって製造することができる方法
の第３のステップを示す線図である。
【図２８】 バイオセンサ（センサチップ）をＩＣ技術によって製造することができる方法
の第４のステップを示す線図である。
【図２９】 バイオセンサ（センサチップ）をＩＣ技術によって製造することができる方法
の第５のステップを示す線図である。
【図３０】 バイオセンサ（センサチップ）をＩＣ技術によって製造することができる方法
の第６のステップを示す線図である。
【図３１】 本発明のバイオセンサの一実施形態を使用してイオン分析物（または分子）を
検出することができる方法を示す線図である。
【図３２】 図３１のセンサによって取られたサイクリック・ボルタンメトリ（ＣＶ）（電
流対バイアス電位）グラフである。
【図３３】 本発明のバイオセンサの一実施形態を使用して高分子（例えばＤＮＳ、ＲＮＡ
、蛋白質）を検出することができる方法の第１のステップを示す線図である。
【図３４】 高分子の検出の第２のステップを示す線図である。
【図３５】 高分子の検出の第３のステップを示す線図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ｇ０１Ｎ 27/46 ３３６Ｍ ３３８ 27/30 ３５３Ｒ ３３１Ａ ３３１Ｍ ３３１Ｎ 27/46 ３３６Ｎ Ｓ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ 【要約の続き】 イオセンサ（２１０）の構成要素（すなわち電極）との 間の制御された接触を提供する。閉込めシステムは、携 帯型またはハンドヘルド・デバイス内への１つまたは複 数のバイオセンサ（２１０）の組み込みを可能にし、振 動および／またはフラッピングに耐性がある。本発明は また、集積回路（ＩＣ）技術を用いて集積された１つお よび／または複数のバイオセンサ（２１０）を提供す る。好ましくは、１つまたは複数のセンサ・システム全 体が、単一ＩＣ基板（２００）またはチップ上に製造さ れ、１つまたは複数の完全な検出システムに外部構成要 素および／または器具を必要としない。好ましくは、１ つまたは複数のセンサ・システムが、シリコン基板（２ ００）上に、ＩＣプロセスを使用して製造される。

Claims (50)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 試料試薬中のターゲット分析物の存在を検出する、またはタ
    ーゲット分析物の量を測定する方法であって、 マイクロ製造電気化学バイオセンサを試料試薬と接触させるステップであって
    、前記マイクロ製造電気化学バイオセンサが、 （ａ）基板と、 （ｂ）集積回路技術によって基板上に製造された少なくとも２つの導電性電極
    であって、それぞれが導電性材料の単層からなる導電性電極と を備えるステップと、 前記導電性電極と接触させた状態で試料試薬を含むステップと、 マイクロ製造電気化学バイオセンサから電気信号出力を測定するステップと、 信号出力から、試料試薬中のターゲット分析物の存在および／または量を求め
    るステップと を含む方法。
  2. 【請求項２】 電気化学バイオセンサがさらに、各電極の下に接着剤を備え
    、接着剤が各電極の基板へのより良い接着を可能にする請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 試料試薬が、高分子を含む生物学的流体である請求項２に記
    載の方法。
  4. 【請求項４】 試料試薬が、イオン分子または原子を含む生物学的流体であ
    る請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 基板が、シリコン、ガリウム砒素、プラスチック、およびガ
    ラスからなる群から選択される請求項２に記載の方法。
  6. 【請求項６】 基板が、シリコンからなる材料を備える請求項２に記載の方
    法。
  7. 【請求項７】 導電性材料が、金、アルミニウム、クロム、銅、白金、チタ
    ン、ニッケル、およびチタンからなる群から選択される請求項２に記載の方法。
  8. 【請求項８】 導電性材料が金である請求項２に記載の方法。
  9. 【請求項９】 接着剤が、クロム、チタン、および膠からなる群から選択さ
    れる請求項２に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 接着剤がクロムを備える請求項２に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 基板がさらに、少なくとも１つの電極を含むウェル構造を
    備える請求項２に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 電気化学バイオセンサが、少なくとも３つの導電性電極を
    備える請求項２に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 各導電性電極が金の単一層からなる請求項１２に記載の方
    法。
  14. 【請求項１４】 信号出力から、試薬中のターゲット分析物の存在および／
    または量を求めるステップがさらに、 既知量の検出すべきターゲット分析物を含む第１の較正溶液と、検出不可能な
    量の検出すべきターゲット分析物を含む第２の較正溶液とを用いて電気化学バイ
    オセンサを較正するステップと、 基準信号出力を得るステップと、 基準信号を測定信号と比較して、試料試薬中の分子の存在および／または量を
    求めるステップと を含む請求項２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 基板が、シリコン、ガリウム砒素、プラスチック、および
    ガラスからなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 導電性材料が、金、アルミニウム、クロム、銅、白金、ニ
    ッケル、チタンからなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 導電性材料が金である請求項１４に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 接着剤が、クロム、チタン、および膠からなる材料の群か
    ら選択される請求項１４に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 基板がさらに、少なくとも１つの電極の下にウェル構造を
    備える請求項１４に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 少なくとも１つの電極の表面が、基板上に高分子を係留す
    るために表面修正される請求項１４に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 試料試薬中の少なくとも１つの分子の存在を検出する、ま
    たは少なくとも１つの分子の量を測定する方法であって、 マイクロ製造電気化学バイオセンサを試料試薬と接触させるステップであって
    、前記マイクロ製造電気化学バイオセンサが、 （ａ）シリコン基板と、 （ｂ）集積回路技術によって基板上に製造された３つの導電性電極であって、
    それぞれが金の単層からなる導電性電極と を備えるステップと、 前記導電性電極と接触させた状態で試料試薬を含むステップと、 マイクロ製造電気化学バイオセンサから信号出力を測定するステップと、 信号出力から、試料試薬中の分子の存在および／または量を求めるステップと
    を含む方法。
  22. 【請求項２２】 シリコン基板と、 集積回路技術によって基板上に製造されたレドックス・センシング用の３つの
    導電性電極であって、それぞれが金の単層からなる導電性電極と を備えるマイクロ製造電気化学バイオセンサ。
  23. 【請求項２３】 ターゲット分析物の検出方法であって、 バイオセンサおよび少なくとも１つの試薬を提供するステップであって、バイ
    オセンサが、 （ａ）試薬中に含まれるターゲット分析物を不動化するための第１の表面性質
    を有する第１の領域と、 （ｂ）第１の表面性質とは異なる第２の表面性質を有する第２の領域とを備え
    、それにより、試薬の試料を、第１の領域と第２の領域の間に表面張力によって
    閉じ込めることができ、前記第２の領域が、ターゲット分析物を検出するための
    構成要素を備えるステップと、 ある体積の試薬をバイオセンサに塗布するステップであって、バイオセンサを
    覆う試薬のカバー範囲が、試薬の体積および表面張力によって制御されるステッ
    プと、 バイオセンサによってターゲット分析物の存在を検出し、かつ／またはターゲ
    ット分析物の量を測定するステップと を含む方法。
  24. 【請求項２４】 前記構成要素が、カウンタ電極および基準電極からなる群
    から選択される少なくとも１つの電極を含む請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 少なくとも１つの試薬が第１の試薬と第２の試薬を含む請
    求項２３に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 バイオセンサに試薬を塗布するステップが、 第１の領域を覆って第１の試薬をカバーするステップと、 第２の領域を覆って第２の試薬をカバーするステップと を含む請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 第１の領域が、第１の領域内部に第１の試薬を閉じ込める
    ように設計された第１の幾何形状で形状を取られている請求項２６に記載の方法
    。
  28. 【請求項２８】 第２の領域が、第２の領域内部に第２の試薬を閉じ込める
    ように設計された第２の幾何形状で形状を取られている請求項２７に記載の方法
    。
  29. 【請求項２９】 第１の試薬が、ターゲット分析物を含む生物学的流体であ
    り、第２の試薬が、ターゲット分析物の生物学的検出に適した化学的溶液である
    請求項２５に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 ターゲット分析物が、イオン分子および高分子からなる群
    から選択される請求項２３に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 ターゲット分析物の存在および／または量を検出するステ
    ップがさらに、 既知量の検出すべき分析物を含む第１の較正溶液と、検出不可能な量の検出す
    べき分析物を含む第２の較正溶液とを用いてバイオセンサを較正すること、 較正結果を利用して、試薬中のターゲット分析物の存在および量を検出するこ
    と を含む請求項２３に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 第１および第２の領域の表面性質が、バイオセンサへの試
    薬の塗布前に表面修正される請求項２３に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 第１および第２の領域の表面性質が、外力場によって制御
    される請求項２３に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 液体試薬中の少なくとも１つの分析物のレドックス・イベ
    ントを検出するためのデバイスであって、 少なくとも１つの集積回路（ＩＣ）およびマイクロエレクトロメカニカル・シ
    ステム（ＭＥＭＳ）技術を使用することによって半導体上に製造されるレドック
    ス・センサであって、信号出力およびバイアス制御に関する少なくとも２つの導
    電性電極を含むレドックス・センサと、 電極と半導体の間にある絶縁層と、 半導体の上、かつ絶縁層の下にある集積回路（ＩＣ）であって、検出回路、お
    よび検出回路にバイアス電位を提供するためのバイアス電位回路を備える集積回
    路と を備え、絶縁層が、電極を集積回路（ＩＣ）に電気的に接続するための導電性コ
    ンタクト部分を有する デバイス。
  35. 【請求項３５】 導電性電極が、金、アルミニウム、クロム、銅、白金、ニ
    ッケル、およびチタンからなる材料の群から選択される請求項３４に記載のデバ
    イス。
  36. 【請求項３６】 導電性電極が金からなる請求項３４に記載のデバイス。
  37. 【請求項３７】 半導体が、シリコンおよびガリウム砒素からなる群から選
    択される請求項３４に記載のデバイス。
  38. 【請求項３８】 半導体がシリコンである請求項３４に記載のデバイス。
  39. 【請求項３９】 検出回路が電流測定デバイスを備えて、レドックス・イベ
    ントから、対応する電気接続電極を介して電流信号を検出する請求項３４に記載
    のデバイス。
  40. 【請求項４０】 バイアス電位が、少なくとも２つの異なる電極間の電位差
    であって、電流検出のための電子移動を可能にする請求項３９に記載のデバイス
    。
  41. 【請求項４１】 液体試薬中の少なくとも１つの分析物のレドックス・イベ
    ントを検出するためのデバイスであって、 半導体上にあるレドックス・センサであって、基準電極、作業電極、およびカ
    ウンタ電極を備えるレドックス・センサと、 レドックス・センサと半導体の間にある絶縁層と、 半導体の上、および絶縁層の下にある集積回路（ＩＣ）であって、検出回路、
    および検出回路にバイアス電位を提供するためのバイアス電位回路を備える集積
    回路と を備え、 絶縁層が、電極を集積回路（ＩＣ）に電気的に接続するための導電性コンタク
    ト部分を有するデバイス。
  42. 【請求項４２】 各電極が、導電性材料の単一層からなる請求項４１に記載
    のデバイス。
  43. 【請求項４３】 導電性材料が金である請求項４２に記載のデバイス。
  44. 【請求項４４】 半導体がシリコンである請求項４３に記載のデバイス。
  45. 【請求項４５】 検出回路が電流測定デバイスを備えて、レドックス・イベ
    ントから、対応する導電性電極を介して電流信号を検出する請求項４４に記載の
    デバイス。
  46. 【請求項４６】 バイアス電位が、少なくとも２つの異なる電極間の電位差
    であって、電流検出のための電子移動を可能にする請求項４５に記載のデバイス
    。
  47. 【請求項４７】 半導体が、シリコンおよびガリウム砒素からなる群から選
    択される請求項４１に記載のデバイス。
  48. 【請求項４８】 半導体がシリコンである請求項４１に記載のデバイス。
  49. 【請求項４９】 検出回路が電流測定デバイスを備えて、レドックス・イベ
    ントから、対応する導電性電極を介して電流信号を検出する請求項４１に記載の
    デバイス。
  50. 【請求項５０】 バイアス電位が、少なくとも２つの異なる電極間の電位差
    であって、電流検出のための電子移動を可能にする請求項４９に記載のデバイス
    。
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