KR20040105839A

KR20040105839A - 폴리에틸렌글리콜화 나노 입자를 담지하는 바이오센서 칩표면

Info

Publication number: KR20040105839A
Application number: KR10-2004-7015647A
Authority: KR
Inventors: 가따오까가즈노리; 나가사끼유끼오; 오쯔까히데노리; 우찌다가쯔미; 이시이다께히꼬; 스즈끼유꼬; 아끼야마요시쯔구; 다까에세이지
Original assignee: 도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬
Priority date: 2002-04-03
Filing date: 2003-03-24
Publication date: 2004-12-16
Also published as: EP1496363A4; CA2480770A1; US20050106570A1; EP1496363A1; CN1646912A; WO2003083478A1

Abstract

생물학적 시료에서의 협잡물, 예를 들어 단백질 등의 비특이적 흡착을 억제한 고감도 생물학적 정량 센서계가 제공된다. 센서 재료와 공통되는 금속, 반도체를 내포하는 폴리에틸렌화 입자를 증폭에 사용한다.

Description

폴리에틸렌글리콜화 나노 입자를 담지하는 바이오센서 칩 표면{BIOCHIP SENSOR SURFACE CARRYING POLYETHYLENE GLYCOLATED NANOPARTICLES}

생물학적 시료 중에 존재하는 피검체를 검출하는 방법으로서 다종 다양한 검출 양식을 갖는 바이오센서가 제안되어 있다. 이러한 바이오센서 중에서 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance: 이하, SPR 이라고도 한다) 을 이용하는 센서는, 금속 박막의 표면 및 그 근방에서의 굴절률 변화에 대하여 민감하다 (예를 들어, A. Szabo 등, Curr. Opin. Strnct. Bio 1.5 (1995) 699-705 참조). SPR 은, 표면과 복잡한 생물학적 용액 사이에서 발생하는 과정의 in situ 에서의 관찰이 가능하고, 또 예를 들어 표지를 사용하지 않고 리얼 타임으로 피검체로부터의 데이터를 입수할 수 있기 때문에, 동력학적 및 열역학적인 파라미터를 취득하는 데에 적합하다는 점에서 주목을 모으고 있는 센서의 하나이다.

이러한 표면을 갖는 바이오센서 칩의 전형적인 것으로는, 아마샴 팔마시아바이오테크 (주) 로부터 입수할 수 있는 BIACORE (상표) 가 있다. 이 BIACORE 는, 말단이 카르복실화된 덱스트란의 매트릭스가 반투명 상태로 금의 박막 위에 고정되어 있다. 보다 구체적으로는, 식 HS-R-Y (R 은 10 원자를 초과하는 사슬의 길이를 갖고, 헤테로원자에 의해 중단되어 있어도 되는 탄화수소 사슬이고, Y 는 리간드 또는 생적합성 다공질 매트릭스를 공유 결합시키기 위한 활성기이다) 로 표현되는 유기분자를 사용하여, 그 티올 (또는 메르캅토) 기를 통하여 금, 은 등의 자유 전자 금속의 박막 표면에 결합시켜 치밀하게 채워진 단층으로 그 표면을 피복하고, 이어서, 생적합성 다공질 매트릭스로서, 리간드를 결합시키기 위한 관능기를 가지고 있어도 되는 아갈로오스, 덱스트란, 폴리에틸렌글리콜 등으로 이루어지는 히드로겔이 공유 결합된 표면을 갖는 바이오센서 칩이 제공되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5763191호 참조). 이러한 바이오센서 칩 상에서의 생물학적 물질, 예를 들어 단백질의 검출시에 있어서는, SPR 시그널의 일정한 증폭 및 비특이 흡착의 방지가 달성된다.

또한 주로, 목적으로 하는 피검체 단백질 등의 측정시에 있어서, 생물학적 유체 중 등에 존재하는 협잡물의 센서 칩 표면에 대한 비특이 흡착을 방지하는 것으로서, 지지체 상에 황원자 (메르캅토기의) 를 통하여 결합한 스페이서 분자 (탄소원자수 1∼30 의 알킬렌 사슬) 에 친수성 링커부 (사슬 길이 4 내지 15 원자의 직쇄 분자) 와 고상(固相) 반응물질 (비오틴 유도체 잔기) 이 순서대로 공유 결합한 표면을 갖는 센서 칩도 제공되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제3071823호 참조). 또한, HS-스페이서 분자 (탄소원자수 11 의 알킬렌 사슬)-친수성 링커-(에틸렌옥시드 단위 3 개 또는 6 개로 이루어지는 사슬)- 를 베이스로 하는 화합물을 사용하여, 메르캅토기를 사이에 두고 금 표면에 자기 집성한 단층을 갖는 센서 칩도 제공되어 있다 (예를 들어, Roberts 등, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 6548-6555 참조). 그리고, 에틸렌옥시드 단위가 5∼10000 의 범위에 있는 헤테로텔레킬릭(Heterotelechelic) 폴리머를 담지한 표면을 갖는 센서 칩이 제안되어 있다 (WO 01/86301 A1 참조).

상기 서술한 바와 같이, 이러한 표면을 갖는 센서 칩은 SPR 시그널의 일정한 증폭도 달성된다. 그러나, 더욱 검출 감도를 높일 수 있는 바이오센서계로서, 콜로이드 금 (Au) 을 금 박막 표면 (이들 표면에는 상기한 각 문헌에 기재되어 있는, 덱스트란층, 폴리에틸렌글리콜층을 담지하지 않는다) 을 갖는 센서 칩과 조합하여 사용하는 것도 다수 제공되어 있다. 일반적으로, 이러한 계에서는, 콜로이드 금을 사용하지 않는 계에 비하여 플라스몬각(角)의 큰 시프트, 광폭의 플라스몬 공명 및 최저 반사율의 현저한 증대를 가져오는 것 등을 이점으로서 들고 있다 (예를 들어, L. A. Lyon 등, Anal. Chem. 1998, 70, 5177-5183, 특히 5177 페이지의 서(序) 항; J. Am. Chem. Soc. 2000, 122. 9071-9077; E. Hutter 등, J. Phys. Chem. B 2001, 105, 11159-11168; 일본 공개특허공보 2002-267669호, 일본 공개특허공보 2000-55920호, 참조). 이들 금 콜로이드 또는 금 나노 입자를 SPR 의 증폭 또는 증강에 사용하는 계의 센서 칩 표면은, 공통적으로 금 박막 위를 알칸티올 (예를 들어, 3-메르캅토프로피온산 또는 3-메르캅토에틸아민) 등으로 수식하고, 이어서 비오틴 또는 아비딘 (avidin) 또는 스트렙트아비딘 (streptavidin), 항체등을 공유 결합시키고 있다. 금 콜로이드 또는 금 나노 입자는, 상기한 바와 같은 알칸티올류를 사용하거나 또는 사용하지 않고 단백질을 결합 (화학적 흡착을 포함한다) 하여, 비오틴-스트렙트아비딘, 항원-항체와 같이 생물학적인 특이적 결합쌍을 형성함으로써 상기 센서 칩 표면에 결합시키고 있다. 또한, E. Hutter 등 에서는, 금 또는 은의 지지체 (센서 칩) 위에 2-아미노에탄티올 (AET) 또는 1,6-헥산디티올 (HDT) 을 사용하여 직접 금 나노 입자를 고정하면, Au/AET/Au 계는 증강된 SPR 감도를 나타내지만, Au/HDT/Au 계는 금 나노 입자의 증폭 효과가 상당히 낮아짐이 시사되어 있다 (제 11159 페이지, 서(序) 항 참조). 또한 상기한 바와 같이 금 나노 입자를 사용하여 유리제 센서 칩 상에 자기 집성 단층을 형성하면, 가시-UV 스펙트로포토미터에 의해, 칩 표면 상에서 생물 분자간 상호 작용을 리얼 타임으로 추적할 수 있는 것도 알려져 있다 (예를 들어, N. Nath 등, Anal. Chem. 2002, 74, 504-509 참조).

또, 상기한 바와 같은 바이오센서계를 구성하는 것은 아니지만, 생물학적 정량에서의 표지로서 사용하는 금속 입자의 표면을 폴리에틸렌글리콜 (또는 폴리에틸렌옥시드라고도 한다) 과 같은 수용성이고, 또한 수성 매체 중에서 모빌리티가 높은 폴리머 사슬로 수식하여, 그 입자의 분산 안정성을 개선하는 방법 (V. Pwuelfine 등, J. Am. Chem. Soc. 120(48), 12696-12697 (1998)) 이나, 금속 입자 표면에 결합한 폴리에틸렌글리콜의 그 결합 부위의 다른 말단에 기능성 화합물의 잔기를 갖는 폴리에틸렌글리콜화 [이하, PEG 수식 (PEG modified) 이라고도 한다] 금속 입자, 반도체 입자 또는 자성 입자도 수성 매체 중에서 분산 안정성을 나타내는 것으로서 알려져 있다 (Otsuka 등, J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 8226-8230) ; 일본 공개특허공보 2001-200050호; 일본 공개특허공보 2002-80903호, 참조). 또한, 반도체 나노 입자를 폴리머, 예를 들어 디아세틸렌, 스티렌 등으로 둘러싸도록 한 입자를 생물학적인 물질을 검출하기 위한 프로브로서 사용하는 것도 제안되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제6207392호 명세서 참조).

상기 서술한 금 나노 입자를 SPR 의 감도 향상에 사용하는 계에서는, 금 나노 입자와 바이오센서 칩의 금 박막 표면 사이의 거리 또는 입자와 표면의 결합 양식에 따라 증감 효과가 다름이 시사되어 있다 (예를 들어, N. Nath 등, 참조). 따라서, 상기 서술한 바와 같은 금 나노 입자와 바이오센서 칩을 사용하는 계를 미국 특허 제5763191호에 기재되어 있는 계에 적용하여도 감도가 저하되거나, 또는 협잡물의 비특이 흡착을 방지할 수 없을 가능성이 있다.

본 발명은, 생물학적 정량(bioassay)의 기술 분야에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 생물학적 유체(流體) 등에 포함되는 피검체 이외의 협잡물(夾雜物)에 의한 비특이 흡착 또는 결합을 저감 또는 방지하거나, 피검체의 검출 감도를 높일 수 있는 바이오센서계, 및 그 바이오센서계를 사용하는 어세이 방법에 관한 것이다.

도 1 은 본 발명에 따른 PEG 수식 금 나노 입자와 센서 칩 표면의 관계를 나타내는 개념도이다. a) 는 금속면 상에 PEG 수식 금 나노 입자가 고정된 고감도 시스템의 개략도이고, (ⅰ) 는 비특이적 흡착을 억제하는 PEG 사슬을 나타내고, (ⅱ) 리간드 분자를 나타내고, 그리고 (ⅲ) 는 SPR 응답을 강화하는 금 입자를 나타낸다. b) 는, 경합 어세이계를 구성하는 약도이다.

도 2 는 lac65 와 렉틴(lectin)의 특이적 결합을 확인하기 위해 실시한 실험 결과의 센서그램이다.

도 3 은 PEG 수식 금 나노 입자 표면 상의 락토오스 밀도와 렉틴 고정화 표면의 리스폰스 관계를 나타내는 그래프이다.

도 4 는 락토오스-렉틴을 통하여 결합한 PEG 수식 금 나노 입자와 센서 칩의 갈락토오스 경합에 의한 해리 상태를 나타내는 센서그램이다.

도 5 는 비결합 말단에 아미노기를 갖는 PEG 수식 금 나노 입자의 제타 전위(zeta potential)의 측정 결과를 나타내는 그래프 (● 표시의 곡선) 와 비결합 말단 아세탈화 포르밀기를 갖는 금 나노 입자의 동일한 측정 결과를 나타내는 그래프 (■표시의 곡선) 이다.

도 6 은 비결합 말단에 비오틴 잔기를 갖는 PEG 수식 금 나노 입자에 대한 단백질의 담지량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 7 은, 금 칩 표면에 비결합 말단에 아미노기를 갖는 PEG 수식 금 나노 입자를 직접 흡착시킨 표면에서의 각종 단백질의 흡착성을 나타내는 그래프이다.

도 8 은, 도 7 에서 사용한 금 나노 입자를 SPDP 를 이용하여 금 칩 표면에 결합시킨 표면의 단백질 흡착성을 나타내는 그래프이다.

발명의 구체적인 기술

본 발명에 따른 바이오센서계의 특히 주시되고 있는 용도는, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 을 이용한 생물학적 정량 (생물 분자의 어세이) 을 향하고 있지만, 본 발명에서 말하는 정량은 SPR 이외의 트레이스할 수 있는 시그널, 방사능, 각종 전자파의 접촉각, 침강, 자외 분광, 라만 산란 등의 변화를 이용하는 것도 포함한다. 본 발명에서 말하는 생물학적 정량이 검출 대상으로 하는 생물 분자는, 소위 생물학적인 특이적 결합쌍 (예를 들어, 생물 분자끼리의 소수 결합, 이온 결합 등에 의해 형성된다), 보다 구체적으로는 비공유 결합쌍을 형성하는 구성원, 리간드와 리셉터, 예를 들어, 항원 또는 합텐(hapten)과 항체, 당과 렉틴, 기질과 효소, 호르몬과 그 수용체, 올리고뉴클레오티드와 그것의 상보 사슬, 비오틴과 아비딘 또는 스트렙트아비딘류와 같은 결합쌍을 형성하는 임의의 구성원일 수 있지만, 이들에한정되지 않는다.

본 발명에서 말하는 「바이오센서계」란, 상기와 같이 어세이하는 데에 사용할 수 있는 각 요소 또는 이들의 집성체 또는 조합물을 의미한다. 그리고 본 명세서에서는, 「미립자」 및 「나노 입자」는 호환 가능하게 사용되고 있으며, 특기하지 않은 한 나노 오더에 한정되지 않고, 서브 나노 또는 수(數)마이크로미터까지 포함하는 것으로서 사용되고 있다.

이하, 본 발명의 구성에 대해 상세히 서술한다.

(A)구조식 I 로 표현되는 PEG 수식 나노 입자에 관해서

PCL 은, 자유 전자 금속 (예를 들어, 금, 은, 백금, 알루미늄, 구리 등), 반도체 (예를 들어, CdS, ZnS, CdSe, InAs 등) 및 금속 산화물 (예를 들어, TiO₄, Cr₂O₃등) 로 이루어지는 군에서 선택되는 재료로 된 미립자일 수 있다. 한정되는 것이 아니지만, 1∼500㎚ 의 평균 횡단면 치수를 갖는 것을 바람직하게 이용할 수 있다.

L 은, 상기 입자 표면에 결합 (화학 결합 또는 화학 흡착, 금속 산화물에서는, 수산화에 의해 발생되는 표면-OH 기를 통한 공유 결합 등) 할 수 있는 기 또는 부분을 통한 결합으로, 본 발명의 목적에 따르는 것이면 어떠한 것도 상관없다.그러나 바람직하게는 , 다음 식 (ⅰ), (ⅱ) 및 (ⅲ)

으로 이루어지는 군에서 선택되는 기를 통한 결합을 나타낸다 (여기서, p 는 2∼12 중 어느 하나의 정수를 나타내고, R¹, R²및 R³은 독립적으로 C₁-C₆알킬기를 나타내고, 그리고 m 은 2∼500, 바람직하게는 5∼100 중 어느 하나의 정수를 나타낸다). 이러한 결합은, 예를 들어 (ⅰ) 및 (ⅲ) 의 기 또는 부분 (또는 세그먼트) 인 경우에는, 상기 입자 표면과의 사이에서 형성되는 것일 수 있고, 또한, (ⅱ) 의 기 또는 부분인 경우에는, 수산화된 금속 산화물 표면의 -OH 와 실라놀기 사이의 탈알코올 반응을 수반하여 형성되는 결합일 수도 있다.

PEG 는, 에틸렌옥시드 단위: (-CH₂CH₂O-)_n(여기서, n 은 5∼10000, 바람직하게는 10∼10000, 보다 바람직하게는 20∼2500 중 어느 하나의 정수이다) 이다.

X 는 바이오센서 칩 표면에 결합할 수 있는 관능기 또는 기능성 부분을 나타낸다. 관능기 또는 기능성 부분은, 상기한 L 을 형성할 수 있는 것으로서 예시한 식 (ⅰ), (ⅱ) 및 (ⅲ) 으로 나타나는 기 또는 부분일 수도 있고, 또 상기 생물학적인 특이적 결합쌍을 형성할 수 있는 1 구성원의 잔기, 및 생물학적 정량에 영향을 미치지 않는 단백질의 잔기일 수도 있다.

그 특이적 결합쌍의 구성원 중 일반적으로 분자량이 작은 것, 예를 들어 합텐, 당, 기질, 호르몬, 올리고뉴클레오티드, 비오틴 유래의 잔기가 바람직하다.

Y 는 C₁-C₆알킬기, X 에 대해서 정의한 기 또는 기능성 부분 또는 그 보호된 형태에 있는 부분 또는 X 와는 별도의 기 또는 기능성 부분 또는 그 보호된 형태에 있는 기 또는 부분일 수 있다. X 와는 별도의 기 또는 부분의 대표적인 것으로는, 다음 식 (ⅳ), (ⅴ) 및 (ⅵ)

(여기서, R^a는 독립적으로, 수소원자 또는 C₁-C₆알킬을 나타내고, R^b는 독립적으로 C₁-C₆알킬옥시 또는 2 개의 R^b가 일체로 되어 옥시 또는 C₁-C₆알킬로 치환되어 있어도 되는 에틸렌기를 형성하는 원자단을 나타낸다) 로 표현되는 기에서 선택되는 것을 들 수 있다.

Y 의 바람직한 것으로는, 상기 식 (ⅳ), (ⅴ) 및 (ⅵ), 그리고 X 에 대해서 정의한, 식 (ⅰ) 및 C₁-C₆알킬기로 이루어지는 군에서 선택되는 기 또는 부분을 들수 있다.

W¹및 W²는 독립적으로, 연결기, 예를 들어 단결합, C₁-C₆알킬렌, -CO0- (산소원자를 통한 에틸렌옥시드 단위의 메틸렌기에 결합한다), -O-, -S-, -(C₁-C₆알킬렌)-COO-, -(C₁-C₆알킬렌)-O- 및 -(C₁-C₆알킬렌)-S- 로 이루어지는 군에서 선택되는 기일 수 있다.

이상의 각 기, 부분 및/또는 세그먼트로 구성되는 식 (Ⅱ) 및 (Ⅲ) :

(Ⅱ) X-W²-PEG-W¹-L 및

(Ⅲ) L-W¹-PEG-W²-Y

로 표현되는 폴리머는, 상기 X 및 Y 의 정의로부터 이해할 수 있도록 동일할 수도 있지만, 상이한 것이 바람직하다. 또한, 이들 식 중의 W²-PEG-W¹-L 은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 식 (Ⅱ) 및 식 (Ⅲ) 으로 나타내는 폴리머는, 각각 독립적으로 1 이상의 정수개 (각각, x 및 y 의 정수에 대응한다) 가 단일 PCL 표면 상에 결합한다. 이들 x＋y 는, PCL 표면을 PEG 사슬이 피복하기에 충분한 정수로 존재한다. 이 수는, 본 발명에 따른, 폴리에틸렌글리콜화 입자 표면 (이러한 입자로 센서 칩 표면이 피복된 경우에는 그 피복 표면) 에 수성 매체 중에서 비특이적인 단백질 등이 흡착되는 것을 억제할 수 있는 수일 것이다. 억제의 정도에 대해서는, 후술하는 실시예를 참고로 할 수 있다. 또, 비특이적인 단백질등의 흡착이란, 예를 들어 X 가 생물학적인 특이적 결합쌍을 형성할 수 있는 일원, 예를 들어 항원인 경우에, 그것에 대한 항체가 결합하는 것과 같은 특이적 결합을 통한 것 이외의 흡착을 의미한다. 한정되는 것은 아니지만, x＋y 의 구체적인 수는, PCL 표면 1㎚²당 0.1∼0.5, 바람직하게는 0.25∼0.40 이 되는 수에 상당하는 어느 하나의 수이다. x 와 y 의 비율은, 상기 서술한 바와 같이 식 (Ⅱ) 과 식 (Ⅲ) 으로 표현되는 폴리머가 동일할 수 있도록, 임의의 비율로 할 수 있다. 그러나, 후술하는 바이오센서 표면과 그 PEG 수식 입자의 생물학적인 특이적 결합에 대한 피검체의 경합 작용을 이용한 어세이에 있어서는, x 와 y 의 총 수당 x 의 비율은 1∼99, 바람직하게는 20∼65 일 수 있다. 이러한 비율로 식 (Ⅱ) (X 가 생물학적인 특이적 결합쌍을 형성하는 일원이다) 의 폴리머와 식 (Ⅲ) (Y 가 X 와 다르고, X 와 결합하지 않은 기 또는 부분이다) 의 폴리머를 PCL 상에 배치할 수 있다. 이러한 양태의 입자는, 신속하고 또 고감도 어세이를 실시하는 데에 도움이 된다.

이상의 폴리에틸렌글리콜화 입자의 전형적인 것이, 상기 서술한 Otsuka 등, J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 8226-8230, 일본 공개특허공보 2001-200050호, 일본 공개특허공보 2002-80903호에 기재되어 있고, 또 이들 기재에 준하여 제조할 수 있다. 또한, 그 입자를 형성하기 위해서 이용할 수 있다. 특히, 헤테로텔레킬릭 폴리머는, 본 발명의 일부가 제안한, WO 96/32434, WO 96/33233, WO 97/06202 에 기재하는 블록 코폴리머의 α, ω- 말단의 기능화를 참고하면 당업자가 용이하게 제조할 수 있을 것이다.

또, 상기한 정의 중에서 사용한, C₁-C₆알킬, C₁-C₆알킬옥시, C₁-C₆알킬렌이 상이한 기 또는 부분에 대해서 사용되고 있는 경우에도, 이들은 공통된 의미를 갖는다. 예를 들어, C₁-C₆알킬은, 메틸, 에틸, n-프로필, iso-프로필, n-부틸, sec-부틸, n-헥실 등을 나타내고, C₁-C₆알킬옥시로는, 상기 C₁-C₆알킬의 각각에 대응하는 알킬옥시가 예시된다. 또한, C₁-C₆알킬렌은, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 1,3-트리메틸렌, 1,6-헥사메틸렌 등이다.

(B)의 바이오센서 칩에 관해서

바이오센서 칩은, 그 표면이 상기 (A) 에서 상세히 서술한 PEG 수식 나노 입자의 X 기 또는 부분과 결합할 수 있고, 생물학적 정량에 이용할 수 있는 것이면, 그 형상 및 치수에 제한이 없다. 그러나 바람직하게는, 그 표면은 세트에서 사용되는 PCL 을 형성하는 재료와 동일 또는 동일한 클래스 (예를 들어, 자유 전자 금속의 경우, 금과 금, 금과 은; 반도체의 경우, CdS 와 CdS, CdS 와 InAs) 가 되도록 선택하는 것이, (A) 의 입자와 그 센서 칩으로부터 얻어지는 상기 서술한 것과 같은 시그널을 증강시키는 데에 바람직하다. 그러나, 가시-UV 스펙트로미터를 사용하여 시그널을 검출하는 경우에는 이들 빛을 투과하는 크리스탈 또는 유리일 수도 있다. 그 표면은, 통상 대응하는 재료를 증착시킨 박막일 수 있다.

이러한 표면은, 상기 (A) 의 입자에서의 X 의 기 또는 부분과의 결합 형성이 촉진될 수 있도록 수식되어 있거나, 또 X 가 단백질인 경우에는, 재료 그 자체일수 있다. 이러한 수식은, 식 (Ⅰ) 에서의 L 에 대해서 기재한 바와 같은, PCL 과의 결합성을 나타내는 기 또는 부분을 적어도 한쪽편 말단에 갖는 유기 화합물에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어, 금, 은, 반도체로 형성된 표면을 갖는 칩에서는, 알칸티올 (예를 들어, 3-메르캅토프로피온산 또는 2-메르캅토아민) 을 사용하여 표면을 수식한 후, 유리된 카르복실기 또는 아미노기를 이용하여, 생물학적인 특이적 결합쌍을 형성할 수 있는 일원 (X 의 일원에 대한 것) 을 공유 결합하여 바람직한 표면을 완성할 수 있다. 이러한 표면을 갖는 바이오센서 칩으로는, 상기 서술한 L. A. Lyon 등, E. Hutter 등, 일본 공개특허공보 2002-267669호, 일본 공개특허공보 2000-55920호에 기재된 것을 예시할 수 있다.

또한, 표면에 덱스트란층을 담지한 BIACORE (상표) 센서 칩, 폴리(옥시에틸렌) 사슬을 중간에 갖는 헤테로텔레킬릭 폴리머로 피복된 표면을 갖는 센서 칩 (예를 들어, WO 01/86301 A1 참조) 을 갖는 것도 본 발명에서 사용할 수 있다.

그 밖의 센서 칩도, 당업자라면 이상의 종래 기술을 참조함으로써 제작할 수 있을 것이다.

이상의 PCL 표면 및 센서 칩 표면을 수식하는 데에 사용할 수 있는 전형적인 헤테로텔레킬릭 폴리머는, 하기의 반응 스킴에 따라서 제조할 수 있다.

반응 스킴 Ⅰ:

반응 스킴 Ⅱ-a:

반응 스킴 Ⅱ-b:

(이상의 각 식 중의 약호는, M 은 칼륨, 나트륨, 리튬을 나타낸다.)

이상의 리빙 중합 공정은, 그 자체 공지된 반응 조건하에서 실시할 수 있다 (예를 들어, 상기 WO 96/32434, WO 97/06202 등을 참조하면 된다). 그 밖에는, 후술하는 실시예에 따르거나 또는 기재되어 있는 조건을 개변하여 실시할 수 있다.

또한, 식

은, 본 발명자들 중 일부에 의한 Kataoka 등, Macromolecules, 1999, 32, 6892-6894 에 기재된 방법에 따라서 얻을 수 있다. PEG Mw=5000g/㏖, PAMA (폴리[(2-N,N-디메틸아미노)에틸메타크릴레이트]) 의 중합도 m=68) 를 후술하는 PEG 수식 미립자의 작성에 사용한다.

이들 폴리머를 사용하는 PCL 의 PEG 수식에 대해서 간단히 서술하면, 구조식 I 에서의 PCL 을 구성하는 자유 전자 금속 미립자, 금속 산화물 미립자 또는 반도체 미립자는, 각각 시판품을 이용하거나, 각각 상당하는 콜로이드를 형성함으로써 얻은 미립자를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 PEG 수식 나노 입자는, 예를 들어, 각각 상당하는 미립자 (예를 들어, 0.5㎚∼1㎛, 바람직하게는 1㎚∼200㎚ 의 평균 입경) 를 형성하는 공정 중에 상기 서술한 전구체 폴리머를 공존시켜 형성함으로써, 전구체 폴리머가 미립자 표면에 결합한 구조식 I 의 표면 또는 그 전구 표면을 작성할 수도 있다.

(A) 의 입자와 (B) 의 센서 칩의 세트에 관해서

(B) 의 센서 칩 표면이 BIACORE (상표) 와 같은 덱스트란층을 갖는 것 또는 WO 01/86301 A1 에 기재되어 있는 바와 같이 폴리(에틸렌옥시드) 사슬을 중간에 갖는 폴리머로 수식된 것 외에는, 피검체를 포함하는 것이 의심되는 시료액과 접촉하는 표면이 (A) 의 입자로 실질적으로 피복되도록 (A) 의 입자와 (B) 의 센서 칩이 사용되고, 특히 이들은 결합한 상태로 사용된다. 이렇게 해서, (A) 의 입자가 (B) 의 센서 칩 표면을 피복한 형태에 있는 표면은, (A) 의 입자 표면 상의 식 (Ⅱ) 및 식 (Ⅲ) 으로 표현되는 폴리머의 작용에 의해 표면에 대한 단백질 등의 비특이적 흡착을 유의하게 억제할 수 있다. 물론, 입자에 의한 각종 시그널의 증폭 효과도 당연히 얻어진다.

또한, (A) 의 입자에서의 X 가 생물학적인 특이적 결합쌍을 형성하는 일원이고, (B) 의 센서 칩 표면 상에 그 일원에 대한 다른 일원이 존재하는 경우에는, 어세이의 개념에 대해서 개략적으로 나타낸 도 1 에 나타내는 것과 같은 양태로, (A) 의 입자와 (B) 의 센서 칩의 세트를 사용할 수 있다. 도면 중의 삼각 표시는, 예를 들어, 당, 비오틴, 항원 또는 합텐, 호르몬, 올리고뉴클레오티드 등을 나타내고, 그 삼각이 끼워지는 표시는, 각각, 렉틴, 아비딘 또는 스트렙트아비딘, 항체, 수용체 단백질, 상보성 올리고뉴클레오티드 또는 그 뉴클레오티드 배열을 함유하는 폴리뉴클레오티드 등을 나타낸다. 또한, 이들 표시에 결합하는 파선은 폴리(에틸렌옥시드) 세그먼트일 수 있다.

이러한 개념도로 표현되는 생물학적 정량 방법도 본 발명의 일 양태이다.

일반적으로는, (a) 상기에 따라서 제조될 수 있는 (a) 의 입자를 준비하고,

(b) 그 나노 입자의 PCL 의 재료에 대응하는 박막 표면을 갖고, 그 나노 입자의 X 의 생물학적인 특이적 결합쌍의 일원에 대한 다른 일원이 직접 또는 적어도 C₁-C₆알킬렌기 또는 (-CH₂CH₂O-)_n(여기서, n 은 5∼10000 중 어느 하나의 정수이다) 을 통하여 담지된 표면을 갖는 바이오센서 칩을 준비하고,

(c) (a) 의 입자 및 (b) 의 바이오센서 칩을 그 생물학적인 특이적 결합을 형성할 수 있는 구성원 중 어느 하나의 일원을 피검체로서 포함하는 것이 의심되는 생물학적 유체와 접촉시켜,

(d) 피검체의 경합 작용에 의한 (a) 의 입자와 (b) 의 바이오센서 칩 표면의 결합 정도의 변화를 결정하고,

(e) 그 변화를 생물학적 유체 중의 피검체 농도의 지표로 하는,

것을 포함하여 이루어지는 생물학적 유체 중의 피검체의 검출 방법이 제공된다. 상기 단계 (d) 에서의, (a) 의 입자와 (b) 의 센서 칩의 결합 정도의 변화는 표면 플라스몬 공명 스펙트럼의 변화, 예를 들어 플라스몬각의 시프트, 최저 반사율의 증대인 것이 바람직하다.

이러한 어세이 방법은, 생물학적인 특이적 결합쌍을 형성하는 일원 (피검체) 을 포함하는 것이 의심되는 모든 수성 액체 시료에 이론상 적용할 수 있지만, 특히 생물학적 유체, 예를 들어 혈청, 혈장, 뇨, 타액 등, 또는 이들의 농축 또는 희석액에 적용하는 것을 의도하고 있다.

이러한 방법에 의하면, 신속하면서 또한 고감도 어세이가 가능하다.

본 발명자들은, BIACORE (상표) 의 센서 칩이나, 폴리에틸렌글리콜 수식 표면을 갖는 센서 칩과, 주로 수성 매체 중에서의 분산 안정성을 개선하는 것으로서 제공되어 있는 폴리에틸렌글리콜 수식 금속 입자 또는 반도체 입자를 조합하여 사용하면 대응하는 센서 칩에 의한 생물학적 정량의 감도를 높일 수 있는 동시에, 협잡물에 의한 비특이 흡착을 방지 또는 억제할 수 있음을 발견하였다. 본 발명은, 이러한 지견에 근거하여 완성된 것이다.

본 발명에 의하면, (A) 구조식 I:

(X-W²-PEG-W¹-L)_x-PCL-(L-W¹-PEG-W²-Y)_y(Ⅰ)

식 중, PCL 은 자유 전자 금속 미립자, 금속 산화물 미립자 또는 반도체 미립자를 나타내고,

X 는 바이오센서 칩 표면에 결합할 수 있는 관능기 또는 기능성 부분을 나타내고,

Y 는 C₁-C₆알킬기, X 의 관능기 또는 기능성 부분을 형성하는 데에 사용할 수 있는 보호되어 있어도 되는 관능기 및 X 와 동일하거나 또는 상이한 기능성 부분으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 기 또는 부분을 나타내고,

L 은 PCL 에 결합하는 기 또는 결합 부분을 나타내고,

W¹및 W²는, 단결합 또는 동일하거나 또는 상이한 연결기를 나타내고,

PEG 는, 에틸렌옥시드 단위: (-CH₂CH₂O-)_n(여기서, n 은 5∼10000 중 어느 하나의 정수이다) 를 나타내고,

여기서, (X-W²-PEG-W¹-L)_x와 (L-W¹-PEG-W²-Y)_y에서의 W²-PEG-W¹-L 은 동일하거나 또는 상이할 수 있고, 그리고

x 및 y 는, 독립적으로 1 이상의 정수이고, 또한 일체로 되어 PEG 사슬이 수성 매체 중에서 PCL 의 표면을 피복하기에 충분한 정수를 나타낸다

의 폴리에틸렌글리콜 수식 나노 입자와,

(B) (A) 의 입자가 X 를 통하여 결합할 수 있고, 또한 유리 등의 유전체 또는 PCL 의 재료에 담당하는 재료로 이루어지는 표면을 갖는 바이오센서 칩의 세트를 포함하여 이루어지는 생물학적 정량에 사용하기 위한 바이오센서계가 제공된다.

다른 양태의 본 발명으로, 상기한 구조식 I 에서의 X 가 생물학적인 특이적 결합쌍을 형성하는 일원의 잔기이고, Y 가 생물학적인 특이적 결합쌍을 형성하는 잔기 이외의 기이고,

L 은, 식

(여기서, p 는 2∼12 중 어느 하나의 정수를 나타내고, R¹, R²및 R³은 독립적으로 C₁-C₆알킬을 나타내고, 그리고 m 은 2∼100 중 어느 하나의 정수를 나타낸다) 의 기를 나타내고, x＋y 는 PCL 의 표면 1㎚²당 0.1∼0.5, 바람직하게는 0.25∼0.40 에 상당하는 어느 하나의 수이고, (x/x＋y)×100 이 1∼99, 바람직하게는 20∼65 의 정수이며, 그리고 PCL 의 횡단면의 평균 치수가 1∼500nm, 바람직하게는 5∼500㎚ 인 폴리에틸렌글리콜 수식 나노 입자도 제공된다.

또 다른 양태의 발명으로서, (a) 상기 폴리에틸렌글리콜 수식 나노 입자를준비하고,

것을 포함하여 이루어지는 생물학적 유체 중의 피검체의 검출 방법도 제공된다.

본 발명에 따른, (A) 의 입자와 (B) 의 바이오센서 칩 세트는, 이들이 결합 (공유 결합 또는 비공유 결합 (예를 들어, 생물학적인 특이적 결합에서 볼 수 있는 소수 결합, 이온 결합, 화학 흡착 등)) 을 형성하면, 예를 들어 공명 라만 산란을 표면 증감 효과에 의해 증대시킨다.

특히, 자유 전자 금속 미립자에 있어서는 표면 플라스몬 공명 시그널의 현저한 변화 (플라스몬각의 커다란 시프트, 광폭의 플라스몬 공명 및 최저 반사율의 증대) 를 가져온다. 놀랍게도 이러한 변화는, 바이오센서 칩 상에 상당한 두께를 갖는 덱스트란층을 담지하는 BIACORE (상표) 센서 칩과 그 (A) 의 입자가 결합한 경우에도 인정된다.

또한, 본 발명에 따른, (A) 의 입자로 피복된 (B) 의 바이오센서 칩 표면은, 가령 그 칩 표면이 상기한 바와 같이 덱스트란층이나 폴리에틸렌글리콜 수식이 되어 있지 않더라도, 예를 들어 생물학적 유체 중에 존재하는 단백질 등의 비특이적 흡착을 유의하게 억제할 수 있다.

이하, 구체예를 들어 더욱 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다.

제조예 1: PEG 수식 금 미립자의 제조법 (제 1):

사용 폴리머: Acetal-PEG-SH (Mn=5000)

Acetal-PEG-SH:HAuCl₄=1/6:1 (몰비) 의 비로 혼합한 수용액에 HAuCl₄에 대하여 1O 배 몰량의 NaBH₄를 첨가하고, 환원법에 의해 금 콜로이드를 조정하였다. 말단 아세탈기를 pH 2 염산으로 처리하여 알데히드기로 변환 후, p-아미노페닐-β-D-락토피라노시드와 반응시켜, 락토오스-PEG-SH 로 수식한 금 콜로이드 수용액 (평균 입경: 8.7㎚) 을 얻었다.

또, 아세탈 PEG-SH 는, 하기한 바와 같이 제조하였다.

아르곤 치환된 수기(受器) 중에 증류 테트라히드로푸란 (THF) 20mL 와 개시제 3,3-디에톡시-1-프로판올 0.2m㏖ (0.032mL) 을 첨가하고, 또 당량의 칼륨나프탈렌을 첨가하여 15 분 교반함으로써 메탈화를 실시하였다. 그 후, 에틸렌옥시드 22.7m㏖ (1135mL) 을 첨가하고, 실온에서 2 일간 교반하여 중합시켰다. 정지제로서 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜티오)프로피오네이트 (SPDP) 0.4m㏖ (0.125g) 을 소량의 증류 THF 에 용해시키고, 이 용액에 대하여 상기한 중합 반응 용액을 등압 적하 깔때기로 빙랭하에서 적하하였다. 하룻밤 교반하여 정지 반응시킨 후, 포화 식염수 세정ㆍ클로로포름 추출, 에테르 재침(再沈), 벤젠 동결 건조를 거쳐 폴리머를 회수하였다. 회수한 폴리머는¹H-NMR 로 구조를 확인하고, 말단에 도입된 SPDP 잔기의 양은, 2-메르캅토에탄올과 반응시킴으로써 유리된 2-티오피리돈의 UV 흡수에 의해서도 확인하였다.

PEG-SS-Py 2.0×10^-2m㏖ (100㎎) 을 증류수 4mL 에 용해시키고, 다시 5 배 몰량의 디티오트레이톨(dithiothreitol) 0.1m㏖ (15.42㎎) 을 첨가하여, 실온에서 30 분 교반하였다. 반응 후, 포화 식염수 세정ㆍ클로로포름 추출ㆍ에테르 재침을 거쳐 폴리머 (이하, PEG 5000 으로 약기한다) 를 회수하였다. 회수한 폴리머는¹H-NMR 에 의해 구조를 확인하고, 다시 2-피리딜디술피드(2-PDS) 와의 반응에 의해 말단 SH 기를 정량하였다.

제조예 2: PEG 수식 금 미립자의 제조법 (제 2):

사용 폴리머: Acetal-PEG-SH (Mn=3200)

(1) 사용 폴리머의 제조

반응 스킴 I 에 따라서, 개시제로 3,3-디에톡시-1-프로판올, 정지제로 메틸술포닐클로라이드를 사용하여 아세탈기와 메틸술포닐기를 갖는 헤테로 2 관능성PEG 를 음이온 중합에 의해 합성하였다. 또, 테트라히드로푸란 (THF) 중에서 칼륨오르토에틸디티오카르보네이트와 실온에서 3 시간 반응시킴으로써, 메틸술포닐기를 에틸디티오카르보네이트기로 전화한 폴리머를 얻었다.

그 후, 동일하게 THF 중에서 프로필아민과의 반응에 의해 상기 식으로 나타내는 α-말단에 메르캅토기를 갖는 헤테로 2 관능성 PEG (Acetal-PEG-SH) 를 얻었다.

(2) 금 입자의 PEG 수식

Acetal-PEO-SH (Mn=3200) 와 아세탈 PEO-OH (비교예) (Mn=3000) 를, 각각 폴리머와 금 입자의 몰비가 5.0×10⁶: 1 이 되도록 계측하여 순수 2.0mL 에 용해시켰다. 그리고, NaOH 용액에 의해 pH 6.5 로 조정하고, 금 콜로이드 1.0mL (2.58×10^-13㏖, pH 6.5) 를 첨가하여 실온에서 3 시간 격렬하게 교반시켰다. 이어서, 원심 분리 [42O00g (g 는 중력 가속도), 30 분] 후, 용액을 제거하고, 잔류물에 THF 3mL 를 첨가하여 초음파를 가해 재분산시켰다. 이들 샘플에 대해서 UV 를 사용하여 특성 해석을 하였다.

이 폴리머를 사용한 금 입자의 조제에 있어서는, 원심 분리 후, THF 용액에 재분산시켰을 때의 UV-vis 스펙트럼으로부터, 미수식 금 입자의 UV 스펙트럼은 입자의 응집에 근거하는 600㎚ 이상의 큰 흡수 피크를 나타내고 있음을 확인할 수 있었다. Acetal-PEO-OH (비교예) 로 처리한 금 입자는 미수식 금 입자의 UV 스펙트럼과 같이 600nm 이상의 큰 피크를 가지지 않았지만, 전체적으로 피크가 고파장측으로 시프트하여 다소 미립자 분산이 불안정화되어 있음이 확인되었다. 한편, 원심 조작 후, pH 3 의 수용액 중에 재분산시켰을 때도 Acctal-PEG-SH 만이 매우 안정적이고, 벤젠을 사용한 동결 건조 후의 재분산성도 양호함을 확인할 수 있었다.

(3) PEG 수식 금 미립자의 특성 (제타 전위)

통상적인 금 미립자의 수용액 분산계에서는 입자 표면을 음으로 하전시키는 것에 의해 그 차지 반발에 의해 분산 안정화시키고 있음에 대하여, PEG 화 금 미립자에서는 그 표면에 전혀 차지가 없는 것이 제타 전위 측정 (오오쓰카 전자: ELS 8000) 에 의해 확인되었다. 즉, 시판되는 금 미립자는 -34.5mV 인 데 대하여, 이번에 작성한 금 미립자-헤테로 PEG 복합체 (Acetal-PEG-SH/Au) 에서는 -0.86mV 로 되어 있어, 거의 오차의 범위 내에서 입자 표면에 차지가 없다고 할 수 있어, 표면이 PEG 사슬로 덮여 있는 것으로 추측된다.

측정 데이터를 표 1 에 나타낸다.

아세탈-PEG-SH/금 (Au) 입자의 제타 전위

샘플	제타 전위 (mV)
미수식 금 입자	-34.5
아세탈-PEG-SH/Au	-0.86(3 회의 평균값)

측정 용액:

완충제 NaH₂PO₄ㆍ2H₂O 와 Na₂HPO₄ㆍ12H₂O 를 10mM (몰 농도) 첨가하고, 그 이온 강도를 0.015, pH 를 7.5 로 조정한 인산 완충 용액.

측정 기기: ELS-8000 (오오쓰카 전자)

제조예 3: PEG 수식 금 미립자의 제조법 (제 3):

이 예에서는, 사용 폴리머 (Acetal-PEG-PAMA):

(상기 서술한 Kataoka 등, Macromolecules, 1999, 32, 6892-6894 에 기재된 방법에 따라서 얻어졌다. PEG Mw=5000g/㏖, PAMA (폴리[(2-N,N-디메틸아미노)에틸메타크릴레이트]) 의 n=130, m=100) 를 사용하여 폴리에틸렌글리콜화 CdS 반도체 미립자를 작성하였다. 2.5㎎/mL 의 염화 금산 (HAuCl₄) 수용액 1mL 와, 6㎎/mL 의 아세탈 PEG/PAMA 블록 공중합체 수용액 5mL (NH:Au=8:1) 를 혼합하여 실온에서 24 시간 교반하였다. 소정 시간마다 UV-vis 스펙트럼을 측정한 결과, 금 미립자에 유래되는 540㎚ 의 피크가 점차 상승하여, 환원제를 첨가하지 않은 상태로 금 콜로이드 입자 (미립자) 분산체가 생성되어 있음이 확인되었다. 이 용액을 광 산란에 의해 측정 (DLS: 동적 광산란) 한 결과, 평균 입경 12㎚ 의 단분산 콜로이드 입자가 생성되어 있음이 확인되었다.

그리고, 투과형 전자 현미경에 의해 완전히 균일한 입자가 생성되어 있음이 확인되었다. 이 용액을 pH=2∼10 의 범위에서 변화시켜 1 일간 방치하여도 전혀 스펙트럼에 변화가 보이지 않아, 이 계에서 매우 안정적인 금 콜로이드 입자 (미립자) 가 얻어졌음이 확인되었다.

이 용액에 블록 공중합체의 10 배 당량의 1,2-디아미노-4,5-디메톡시 2 염산염 (DDB) 을 첨가하고, NaCl 에 의해 pH 를 2.45 로 조정하였다. 용액을 분획 분자량 500 의 투석막으로 투석하고, 여기 파장 269㎚ 로 형광 측정한 결과, 410㎚ 에서 강한 형광을 나타내었다. 이 결과로부터, 조정된 금 입자 표면에 Acetal-PEG/PAMA 블록 공중합체의 말단 아세탈기가 알데히드기로 변환되어, DDB 와 효율적으로 반응하고 있음이 확인되었다. 이렇게 해서 형성한 알데히드기를 통하여 각종 기능성 부분을 가져올 수 있다.

제조예 4: PEG 수식 반도체 미립자의 제조 :

증류수 80mL 중에 상기 서술한 Acetal-PEG/PAMA 블록 (4.19×10^-7㏖), CdCl₂(6×10^-6㏖) 및 Na₂Sㆍ9H₂O (6×10^-6㏖) 를 첨가하여, 교반기 (750rpm) 로 20 분간 교반하였다. 얻어진 PEG 수식 반도체 (CdS) 미립자 (입경 4㎚) 를 여기 파장 300㎚ 으로 형광을 측정한 결과 CdS 미립자 특유의 강한 형광이 나타났다.

실시예 1: PEG 수식 미립자의 센서 칩 표면에 대한 고정화:

(1) 센서 칩 표면의 조제

N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 와 SPDP 의 디술피드 결합 환원제인 디티오트레이톨 (DTT) 을 각각 1mM, 2mM 이 되도록 혼합한 에탄올 용액을 센서 칩의 금 표면에 2 시간 반응시켰다. 그 후, 세정한 금 표면을 이 용액에 30 분 침지시키고, 다시 0.1㎎/mL 스트렙트아비딘 PBS 용액 (pH 6.4) 을 20 분간 흐르게 함으로써, 금 표면을 스트렙트아비딘화하였다.

(2) 제조예 2 에 따라서 얻어진 PEG (Acetal-PEG-SH) 수식 금 미립자를 조제한 후, pH 2 로 금 미립자 용액을 조정하고 2 시간 아세탈기의 탈보호를 실시하여, 알데히드기로 변환하였다. 용액을 pH 6 으로 조정하고, PEG 에 대하여 4 배량의 비오시틴히드라지드를 첨가하여 6 시간 교반하면서 반응시켰다 (여기서, PEG 에 대하여 4 배량이란, 금 미립자의 표면적을 입경으로부터 산출하고, PEG 의 표면 밀도를 0.25∼0.40개/㎚²로 가정하였다. 이 값은 미립자의 개수로부터 PEG 의 개수를 산출한 값이다. 통례적으로 표면 밀도는 0.25 를 사용하고 있다. 0.25 의 값은 PEG 화 금 미립자의 Tg 로부터 산출한 것이다). 그 후, NaBH₄를 첨가하여 3 일간 교반하였다. 원심 정제 후, 10mM-PBS (pH 6.4) 를 용매 치환 용액을 조제하였다. 이렇게 해서 얻어진 비오티닐화된 PEG 수식 금 미립자 용액에 (1) 에서 조제한 금 표면을 갖는 칩을 침지시킴으로써, 그 표면에 PEG 수식 금 미립자가 고정되었다.

(3) 표면의 특성

(2) 에서 조제된 PEG 수식 금 미립자 고정화 표면을 0.1㎎/mL 소 혈청 알부민 (BSA) PBS 용액 (pH 6.4) 에 1 시간 침지시켜, 표면에 대한 흡착량을 SPR 에 의해 측정하였다. 그 결과, 미처리된 금 표면에 대한 BSA 흡착은 SPR 각도 변화에 의해 △ θ=0.21°였지만, PEG 수식 금 미립자 고정화 표면에서는 △θ=0.02° 였다. 이들 데이터는, PEG 수식 금 미립자 고정화 표면은 혈액 중의 단백질 BSA 의, 비특이적 흡착을 억제하는 것을 나타낸다.

실시예 2: PEG 수식 금 나노 입자를 이용한 SPR 에 의한 정량

이하 SPR 의 유속은 항상 10μL/min 이고, 설정 온도는 25℃ 이다. 또 버퍼는 모두 0.22㎛ 필터를 통과시킨 후, 탈기한 것을 사용하였다. 또한, 별도의 유로는 렉틴을 고정화하지 않은 컨트롤의 유로로 하였다. 또한, 센서 칩 표면의 렉틴에 결합한 금 나노 입자를 전부 해리시키는 재생 용액에는, 100㎎/mL 의 갈락토오스를 함유하는 버퍼를 사용하였다.

A)센서 칩에 대한 렉틴의 고정화

실험 방법과 결과

SPR 센서 칩 (CM5: BIACORE 로부터 입수) 을 삽입하여, 인산 완충 용액 (pH 7.4, 10.15) 을 SPR 의 유로에 안정될 때까지 흐르게 했다. 다음으로 EDC (N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염) 와 NHS(N-히드록시숙신이미드) 의 1:1 혼합 용액을 100μL 인젝트하여, 칩 상의 카르복실기를 활성화시켰다. 계속해서 RCA₁₂₀(50㎍/mL, 용매는 pH 5.0 의 아세트산 완충 용액) 을 인젝트하여 고정화시키고, 마지막으로 1M 에탄올아미드염산염을 70μL 인젝트하여, 남은 활성화NHS 기를 블로킹하였다. 이 때의 RU 와 최초의 RU 의 차에 의해 렉틴 고정량은 5600 RU (^∼5.6ng/㎜²=2.8×10^-2렉틴 ㎚²) 가 되었다.

B)lac65 와 렉틴의 특이적 결합의 확인(lac65 란 금 나노 입자 (PEG 520 개) 위의 PEG 의 말단의 65% 에 락토오스를 갖는 샘플)

실험 방법

40㎍/mL 의 lac65 를 1800 초간 (300μL) 인젝트함으로써 센서 칩 표면의 렉틴과 금 나노 입자의 결합을 측정하였다. 그 후 버퍼를 3000 초간 흐르게 함으로써, 금 나노 입자의 해리를 측정하고, 마지막으로 100㎎/mL 의 갈락토오스를 인젝트함으로써 센서 칩을 재생하였다.

결과와 고찰

도 2 에 lac65 의 센서그램을 나타낸다. 동일한 농도를 갖는 프리 락토오스-PEG-S-S-PEG-락토오스는 거의 RU 의 증가가 없었던 것에 대하여, lac65 는 5200 RU 의 증가가 얻어졌다. 또한, 락토오스를 표면에 갖는 미셀계 (micellar system) 와 비교하면, 7000 RU 의 렉틴이 결합하고 있는 센서 칩 상에 500㎍/mL 의 미셀을 인젝트하면^∼1400 RU 의 리스폰스가 얻어지지만, 본 실험에서 사용한 금 나노 입자의 입경은 이 미셀과 동일 정도이지만 10 분의 1 농도로 4 배의 리스폰스가 얻어진 점에서, 금 나노 입자에 의해 리스폰스가 크게 상승했다고 할 수 있다. 이와 같이 큰 리스폰스가 얻어진 이유로는, 하나는 금 나노 입자의 비중이 매우 크기 때문에 칩 표면의 유전율이 크게 상승한 것과, 칩의 금 기판과 금 나노 입자의표면 플라스몬끼리의 상호 작용을 들 수 있다.

다음으로 버퍼를 흘렸을 때의 해리에 대해서 서술하면, 버퍼를 흐르게 해도 거의 해리되지 않았다. 이 때문에, 금 나노 입자와 렉틴 결합은 대단히 강한 것이라고 생각된다.

또한, lac0 은 결합이 확인되지 않았던 것에 반하여, lac65 는 결합이 확인된 점과, 갈락토오스를 첨가함으로써 큰 리스폰스의 감소 즉 금 나노 입자의 해리가 확인된 것에서, 금 나노 입자 표층의 락토오스와 RCA120 렉틴의 특이적 결합이 시사되었다.

C)결합에 있어서의 리간드 밀도의 효과

실험 방법

락토오스 밀도 0∼65% 의 금 나노 입자 (lac0, lac10, lac20, lac30, lac40, lac50, lac65) 를 각각 40, 10, 1, 0.1㎍/mL 의 농도로 300μL 인젝트하여, 그 결합량을 측정하였다.

결과와 고찰

먼저, lac0-lac65 에서의 농도와 리스폰스의 관계를 도 3(a) 에 나타낸다. 여기에서, 락토오스 밀도가 클수록 또한 농도가 클수록 RU 는 증가한다는 결과가 얻어졌다. 또한, 10㎍/mL 의 농도로 인젝트했을 때의 lac0-lac65 까지의 센서그램을 도 3(b) 에, 리간드 밀도와 결합량 (RU) 의 관계를 도 3(c) 에 나타낸다. 이들 결과로부터, lac1O 은 렉틴과 락토오스가 거의 결합하지 않고, 1ac20 은 조금 결합이 확인되며, 또 그 이상에서는 리간드 밀도의 증가에 따라서 결합이 촉진되게되어, 이것은 UV 의 결과와 거의 일치한다. UV 실험의 고찰에서는 임계값이 20% 인 이유로서, 1) 렉틴이 과잉으로 용액 중에 존재하기 때문에 입자가 렉틴에 의해 캡핑된다, 2) 스펙트럼의 변화로서 표면 플라스몬을 검출하기 위해서는 어느 정도 이상의 금 나노 입자의 응집이 필요하다, 3) 다가 결합의 3 가지 이유를 생각하였으나, SPR 에서는 캡핑이 일어나지 않고, UV 때와 동일하게 표면 플라스몬의 스펙트럼 변화를 보고 있는 것도 아니기 때문에 임계값의 이유는 다가 결합을 생각할 수 있다. 구체적으로는, 리간드 밀도가 크면 다수의 리간드와 렉틴이 결합하여 강고한 결합이 생기지만, 작은 리간드 밀도에서는, 1 대 1 의 리간드와 렉틴의 결합과 같이 소수의 리간드밖에 결합에 관여할 수 없는 것으로 생각된다.

D)해리에 있어서의 리간드 밀도의 효과

실험 방법

락토오스 밀도 30-65% 의 금 나노 입자 (lac30, lac40, lac50, lac65) 40㎍/mL 를 각각 수 10μL 인젝트하여 약 400 RU 금 나노 입자를 결합시켰다. 그 후, 갈락토오스 0.1, 1㎍/mL 를 함유하는 버퍼를 인젝트하여, 각 갈락토오스 농도에서의 해리량을 측정하였다.

결과와 고찰

도 4(a) 에 갈락토오스 0.1㎍/mL 를 인젝트했을 때의 센서그램을 나타낸다. 여기서는 lac30, lac40 은 시간이 경과함에 따라서 서서히 해리되어 가는 것이 확인되었지만, lac65, lac50 은 거의 해리가 확인되지 않았기 때문에, 리간드 밀도와 해리량의 관계를 도 4(b) 에 나타내었다. 여기에서 40% 와 50% 사이에 현저한차가 보였다. 즉, lac30, lac40 의 해리량에 비하여, lac50, lac65 의 해리량은 상당히 적었다. 이것은 UV 의 실험에 있어서도 40% 와 50% 사이에서 NIA 의 증가에 커다란 차가 있었던 것과 관련이 있는 것으로 생각된다. 아마도, 이 리간드 밀도에서 다가 결합의 가(價)수에 변화가 있었던 것으로 추측된다.

또한, 해리에 의해 고감도로 검출되는 것을 생각하면, 리간드 밀도가 30% 이하이면 0.1㎍/mL 이하까지 검출할 수 있다는 것도 알 수 있었다. 이에 대하여 50% 이상이면 검출 한계는 그 이상의 농도가 되고, 해리에 있어서는 리간드 밀도가 어느 정도 낮은 쪽이 보다 고감도로 검출할 수 있게 되어, 리간드 밀도의 효과를 상세하게 조사함으로써 이러한 응용도 생각할 수 있다.

제조예 5: 비결합 말단 아미노화 입자의 제조

시판되는 금 미립자 용액 (5㎚) 에 대하여 5×10⁴배량의 acetal-PEG-SH 에 환원제로서 NaBH₄를 첨가하여 1 시간 반응시킨 후, 금 미립자 용액과 동일하게 pH=6.5 로 조정한 것을 금 미립자 용액과 혼합하여 1 시간 교반 반응시켰다. HO-PEG-OH 를 1㎎/mL 첨가하고 워터 배스 75℃ 로 유지하여 2 시간 반응시켰다. 이 안정화 금 콜로이드 용액 (금 미립자 입경: 5㎚, PEG 4500) 을 원심 분리 (4℃, 350000×g, 40 분) 함으로써 잉여 폴리머를 제거한 후, HCl 을 사용하여 pH 2 로 조정하고, 아세탈기를 탈보호하였다 (2 시간). 탈보호 후, NaOH 를 사용하여 pH 6 으로 조정하고, 하기 표 2 에 나타낸 조건으로 아세트산암모늄을 첨가하여 3 시간 반응시켰다. 3 시간 후 PEG 에 대하여 각각 환원제를 첨가하여 교반하였다. 24 시간 후, 원심 정제 (4℃, 350000×g, 30 분) 하고, 초순수에 재분산시켰다. 말단 아미노화의 확인으로서 ξ전위를 측정하였다.

아미노화 반응의 조건

시행(RUN)	아세트산암모늄첨가량	환원제의 종류	환원제 첨가 방법
1	10㎎/mL	트리아세테이트	PEG 의 10 배량을 2 시간마다 3회 첨가한 후, 1 일 교반
2	10㎎/mL	수소화 붕소나트륨	PEG 의 10 배량을 첨가한 후, 1 일 교반

측정 결과를 도 5 에 나타낸다. 도면으로부터, 낮은 pH 에서의 제타 전위가 플러스가 되고, 아미노화가 확인되었다.

실시예 3: 금 나노 입자를 SPR 칩 표면에 직접 고정화하고, PEG 말단을 비오틴화하는 방법

오존 세정한 금 칩 (오존 세정기로 15 분) 을 준비하였다. 이것을, 별도로 준비한 아미노기를 갖는 PEG 화 금 나노 입자 (PEG 4500 입경 5㎚, 0.76×10^-10㏖/mL) 를 함유하는 PEG-OH (2000) 1㎎/mL 에 침지 (하룻밤) 하였다 (샘플 1).

BiaCore 3000 에 장착하고, 술포숙신이미딜 D-비오틴 (0.1㎎/mL 유속 20㎕/분) 을 10 분간 흐르게 하여 PEG 말단 아미노기를 비오틴화하였다 (샘플 2). 이어서, 무수 아세트산 10% 수용액 (유속 10㎕/분) 을 20 분 흐르게 하여, 미반응 아미노기를 아세틸화하였다 (샘플 3). 이렇게 해서 조제한 SPR 센서 칩 표면에 대하여 단백질 흡착 시험을 실시하였다.

실시예 4:SPR 센서 칩 표면에 SPDP 로 활성 에스테르를 도입하여, 아미노기를 갖는 PEG 화 금 나노 입자를 고정화하는 방법

오존 세정한 금 칩 (오존 세정기로 15 분) 을 준비하였다. 이것을 1mM SPDP 및 2mM DTT 함유 에탄올 용액에 30 분간 침지하였다.

또 별도로, 준비한 아미노화 금 나노 입자 (PEG 4500 입경 5㎚, 0.76×10^-10㏖/mL) 를 함유하는 PEG-OH (2000) 1㎎/mL 에 침지 (하룻밤) 하였다 (샘플 4).

BiaCore 3000 에 장착하고, 술포숙신이미딜 D-비오틴 (0.1㎎/mL 유속 20㎕/분) 을 10 분간 흐르게 하여 PEG 말단 아미노기를 비오틴화하였다 (샘플 5). 이어서, 무수 아세트산 10% 수용액 (유속 10㎕/분) 을 20 분 흐르게 하여, 미반응 아미노기를 아세틸화하였다 (샘플 6). 이렇게 해서 조제한 SPR 센서 칩 표면에 대하여 단백질 흡착 시험을 실시하였다.

결과를 도 6 에 나타낸다. 도 6 중의 Run 1 은 샘플 1 을 사용한 결과, Run 2 는 샘플 1 대신에 acetal-PEG 금 나노 입자를 사용한 결과, Run 3 은 샘플 4 를 사용한 결과, Run 4 는 샘플 4 대신에 acetal-PEG 금 나노 입자를 사용한 결과를 나타낸다. 도 6 으로부터, 아미노기를 갖는 PEG 화 금 나노 입자의 SPR 센서 칩 표면에 대한 담지량이 크다는 것을 알 수 있다.

또한, 각 표면 조제의 각 단계에서의 리스폰스 변화 상태를 하기 표 3 에 나타낸다.

각 순서 단계에서의 리스폰스 변화의 상태

	직접 흡착에 의한 고정화 1-(1)(×10^-40)	SPDP 에 의한 고정화 1-(2)(×10^-40)
SPDP 에 의한 변화량	-	2800
금 미립자에 의한 변화량	5500	2980
활성 에스테르비오틴에 의한 변화량	397	949
무수 아세트산에 의한 변화량	390	158

금 칩 표면에 직접 아미노화 금 미립자를 침지시켜 조제한 직접 흡착에 의한 표면 (1) 에 있어서 특이ㆍ비특이 흡착을 관찰한 결과를 도 7 에 나타낸다. 도 7 중, 가장 위의 선은 스트렙트아비딘, 중간선은 BSA (아미노기 잔여 상태), 가장 밑의 선은 BSA 의 흡착을, 막대 그래프는 왼쪽에서부터 순서대로, 샘플 1 에 스트렙트아비딘을, 샘플 2 에 BSA 를, 그리고 샘플 3 에 BSA 를 흡착시킨 시험 결과이다.

한편, 금 칩 표면에 SPDP 를 이용하여 아미노화 금 미립자를 고정화한 표면 (2) 에 있어서 특이ㆍ비특이 흡착을 관찰한 결과를 도 8 에 나타낸다.

도 7 및 도 8 로부터, 도 8 의 SPDP 로 고정화한 표면 (2) 에 있어서 스트렙트아비딘과의 특이적 흡착이 보다 많이 관찰되고 있음을 알 수 있다. 지금까지 조제해 온 비오틴화 금 미립자를 사용한 표면에서는 스트렙트아비딘과 BSA 의 흡착을 관찰하여도 특이ㆍ비특이라고 말할 수 있을 만한 큰 차이가 관찰되지 않았던 것에 대하여, 도 8 에서는 2500(×10^-40) 과 9(×10^-40) 라는 커다란 차이를 확인할 수 있다.

본 발명에 따르면, 생물학적 유체 중의 피검체를 검출함에 있어서, 협잡 단백질 등의 비특이적 흡착을 억제하고, 그 위에 고감도를 갖는 생물학적 정량의 센서계가 제공된다. 따라서, 각종 진단기기의 제조업 및 진단업에 본 발명을 이용할 수 있다.

Claims

(A) 구조식 I:

(X-W²-PEG-W¹-L)_x-PCL-(L-W¹-PEG-W²-Y)_y(Ⅰ)

식 중, PCL 은 자유 전자 금속 미립자, 금속 산화물 미립자 또는 반도체 미립자를 나타내고,

X 는 바이오센서 칩 표면에 결합할 수 있는 관능기 또는 기능성 부분을 나타내고,

Y 는 C₁-C₆알킬기, X 의 관능기 또는 기능성 부분을 형성하는 데에 사용할 수 있는 보호되어 있어도 되는 관능기 및 X 와 동일하거나 또는 상이한 기능성 부분으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 기 또는 부분을 나타내고,

L 은 PCL 에 결합하는 기 또는 결합 부분을 나타내고,

W¹및 W²는, 단결합 또는 동일하거나 또는 상이한 연결기를 나타내고,

PEG 는, 에틸렌옥시드 단위: (-CH₂CH₂O-)_n(여기서, n 은 5∼10000 중 어느 하나의 정수이다) 를 나타내고,

여기서, (X-W²-PEG-W¹-L)_x와 (L-W¹-PEG-W²-Y)_y에서의 W²-PEG-W¹-L 은 동일하거나 또는 상이할 수 있고, 그리고

x 및 y 는, 독립적으로 1 이상의 정수이고, 또한 일체로 되어 PEG 사슬이 수성 매체 중에서 PCL 의 표면을 피복하기에 충분한 정수를 나타낸다

의 폴리에틸렌글리콜 수식 나노 입자와,

(B) (A) 의 입자가 X 를 통하여 결합할 수 있고, 또한 유리 또는 PCL 의 재료에 담당하는 재료로 이루어지는 표면을 갖는 바이오센서 칩의 세트를 포함하여 이루어지는 생물학적 정량(bioassay)에 사용하기 위한 바이오센서계.
제 1 항에 있어서, (A) 의 입자와 (B) 의 바이오센서 칩 표면이 X 를 통하여 결합함으로써, (A) 의 입자가 (B) 의 바이오센서 칩 중 하나의 표면의 일부 영역 또는 전체 영역을 실질적으로 피복하도록 담지된 바이오센서계.
제 1 항에 있어서, (A) 의 입자와 (B) 의 바이오센서 칩 표면이, 서로 결합될 수 있거나, 또는 수성 매체 중에서 피검체의 경합 작용에 의해 피검체에 의해 치환되도록 결합한 상태로 사용되는 것인 바이오센서계.
제 1 항에 있어서, 구조식 I 에서의 -L- 이

(여기서, p 는 독립적으로 2∼12 중 어느 하나의 정수를 나타내고, R¹, R²및 R³은 독립적으로 C₁-C₆알킬기를 나타내고, 그리고 m 은 2∼100 중 어느 하나의 정수를 나타낸다) 의 기를 나타내고,

W¹및 W²가 독립적으로, 단결합, C₁-C₆알킬렌, -COO- (산소원자를 통하여 에틸렌옥시드 단위의 메틸렌기에 결합한다), -O-, -S-, -(C₁-C₆알킬렌)-COO-, -(C₁-C₆알킬렌)-O- 및 -(C₁-C₆알킬렌)-S- 로 이루어지는 군에서 선택되는 기를 나타내는 바이오센서계.
제 1 항에 있어서, (A) 의 입자에서의 구조식 I 의 X 가 생물학적인 특이적 결합쌍을 형성하는 일원의 잔기이고, (B) 의 센서 칩이 구조식 I 의 PCL 을 형성하는 재료에 대응하는 재료로 된 박막 표면을 가지고 있고, 그리고 그 표면에 X 의 생물학적인 특이적 결합쌍을 형성하는 일원에 대한 다른 일원이 직접 또는 적어도C₁-C₆알킬렌기 또는 (-CH₂CH₂O-)_n(여기서, n 은 5∼10000 중 어느 하나의 정수이다) 을 통하여 담지되어 있는 바이오센서계.
제 1 항에 있어서, (A) 의 입자에서의 구조식 I 의 X 가

(여기서, p 는 독립적으로 2∼12 중 어느 하나의 정수를 나타내고, R¹, R²및 R³은 독립적으로 C₁-C₆알킬을 나타낸다) 의 기를 나타내고, (B) 의 센서 칩이 구조식 I 의 PCL 을 형성하는 재료 중 어느 하나로부터 제조된 박막 표면이나 또는 유리 표면을 가지고 있고, 그리고, (A) 의 입자와 (B) 의 표면이 X 의 관능기를 통하여 결합하고 있으며, 단, (B) 의 표면이 유리제인 경우에는 X 가 트리알콕시실릴을 갖는 바이오센서계.
제 5 항에 있어서, (A) 의 입자의 구조식 I 에서의 Y 가 식

(여기서, R^a은 독립적으로, 수소원자 또는 C₁-C₆알킬을 나타내고, R^b는 독립적으로 C₁-C₆알킬옥시 또는 2 개의 R^b가 일체로 되어 옥시 또는 C₁-C₆알킬로 치환되어 있어도 되는 에틸렌기를 형성하는 원자단을 나타낸다) 의 기인 바이오센서계.
제 1 항에 있어서, (A) 의 입자의 구조식 (Ⅰ) 에서의 x＋y 가 1㎚²당 O.1∼0.5 에 상당하는 어느 하나의 정수인 바이오센서계.
제 1 항에 있어서, (A) 의 입자 중의 PCL 이 5∼500㎚ 의 평균 횡단면 길이를 갖는 바이오센서계.
구조식 I:

(X-W²-PEG-W¹-L)_x-PCL-(L-W¹-PEG-W²-Y)_y(Ⅰ)

식 중, PCL 은 자유 전자 금속 미립자, 금속 산화물 미립자 또는 반도체 미립자를 나타내고,

X 는 바이오센서 칩 표면에 결합할 수 있는 관능기 또는 기능성 부분을 나타내고,

Y 는 C₁-C₆알킬기, X 의 관능기 또는 기능성 부분을 형성하는 데에 사용할 수 있는 보호되어 있어도 되는 관능기 및 X 와 동일하거나 또는 상이한 기능성 부분으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상의 기 또는 부분을 나타내고, L 은 PCL 에 결합하는 기 또는 결합 부분을 나타내고,

W¹및 W²는, 단결합 또는 동일하거나 또는 상이한 연결기를 나타내고,

PEG 는, 에틸렌옥시드 단위: (-CH₂CH₂O-)_n(여기서, n 은 5∼10000 중 어느 하나의 정수이다) 를 나타내고,

여기서, (X-W²-PEG-W¹-L)_x와 (L-W¹-PEG-W²-Y)_y에서의 W²-PEG-W¹-L 은 동일하거나 또는 상이할 수 있고, X 가 생물학적인 특이적 결합쌍을 형성하는 일원의 잔기이고, Y 가 생물학적인 특이적 결합쌍을 형성하는 잔기 이외의 기이고,

L 은, 식

(여기서, p 는 2∼12 중 어느 하나의 정수를 나타내고, R¹, R²및 R³은 독립적으로 C₁-C₆알킬을 나타내고, 그리고 m 은 2∼100 중 어느 하나의 정수를 나타낸다) 의 기를 나타내고,

x＋y 는 PCL 의 표면 1㎚²당 0.1∼0.5 에 상당하는 어느 하나의 수이고, (x/x＋y)×100 이 1∼99 의 정수이며,

그리고 PCL 의 횡단면의 평균 치수가 5∼500nm 인 폴리에틸렌글리콜 수식 나노 입자.
제 10 항에 있어서, X 의 생물학적인 특이적 결합쌍을 형성하는 일원이 단당 또는 올리고당, 항원 또는 합텐, 기질, 호르몬 및 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 물질 유래의 잔기인 폴리에틸렌글리콜화 나노 입자.
(a) 제 10 항에 기재된 폴리에틸렌글리콜 수식 나노 입자를 준비하고,

(b) 그 나노 입자의 PCL 의 재료에 대응하는 박막 표면을 갖고, 그 나노 입자의 X 의 생물학적인 특이적 결합쌍의 일원에 대한 다른 일원이 직접 또는 적어도 C₁-C₆알킬렌기 또는 (-CH₂CH₂O-)_n(여기서, n 은 5∼10000 중 어느 하나의 정수이다) 을 통하여 담지된 표면을 갖는 바이오센서 칩을 준비하고,

(c) (a) 의 입자 및 (b) 의 바이오센서 칩을 그 생물학적인 특이적 결합을 형성할 수 있는 구성원 중 어느 하나의 일원을 피검체로서 포함하는 것이 의심되는 생물학적 유체와 접촉시켜,

(d) 피검체의 경합 작용에 의한 (a) 의 입자와 (b) 의 바이오센서 칩 표면의 결합 정도의 변화를 결정하고,

(e) 그 변화를 생물학적 유체 중의 피검체 농도의 지표로 하는,

것을 포함하여 이루어지는 생물학적 유체 중의 피검체의 검출 방법.
제 12 항에 있어서, 단계 (d) 의, (a) 의 입자와 (b) 의 바이오센서 칩의 결합 정도의 변화가 표면 플라스몬 공명 스펙트럼의 변화에 의해 검출되는 검출 방법.
제 12 항에 있어서, 생물학적인 특이적 결합쌍을 형성할 수 있는 구성원이 당과 그것에 대한 렉틴, 항원 또는 합텐과 그것에 대한 항체, 기질과 그것에 대한 효소, 호르몬과 그것에 대한 수용체 단백질, 올리고뉴클레오티드와 그것의 상보 사슬 배열을 함유하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 검출 방법.
제 12 항에 있어서, (a) 의 입자와 (b) 의 바이오센서 칩 표면이 생물학적인 특이적 결합쌍을 형성하여 미리 결합되어 있는 검출 방법.