CN113447470B - 一种表面增强拉曼散射基底、检测芯片及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表面增强拉曼散射基底、检测芯片及制备方法，在基体的表面制备一层金膜，然后向金膜滴加生物素；同时将链霉亲和素与金纳米颗粒孵化反应，离心后去除上清液，再滴加在金膜上，自组装形成单层的金膜‑金球结构，产生法诺共振光学响应，制得高增强的SERS基底。本发明的SERS基底与PDMS微流控芯片结合，提高了微流控芯片的应用范围及检测水平，并且制作方法简单，操作简单，便于携带，可实现同时检测血清和血液。

Description

一种表面增强拉曼散射基底、检测芯片及制备方法
技术领域
本发明涉及表面增强拉曼光谱分析和微流控芯片技术领域，具体涉及一种表面增强拉曼散射基底、检测芯片及制备方法。
背景技术
拉曼散射光谱可以检测分析物的指纹峰，具有窄谱带和超高灵敏度，还可以非常迅速提供分析物信息，实时检测。另外拉曼光谱可以对样品进行无接触检测，光谱成像简单，分析快速，操作简单。但是普通拉曼光谱的信号极弱，因此在应用上存在很大局限性。表面增强拉曼散射(SERS)的出现解决了拉曼散射微弱的问题，SERS是一种强大的振动光谱技术，可通过放大由局部表面等离子体激元激发而产生的电磁场，来对低浓度分析物进行高灵敏度的结构检测。
微流控是指在微米级别尺度上实现操作微观物体及分析微量样品的技术。微流控芯片的设计理念和最终目的就是将分析实验室的功能转移到便携的微型化、集成化的芯片上，实现个人化，家用化。自微流控芯片发展以来，芯片的制作材料、加工技术操作及检测方法日渐成熟。微流控的优势在于消耗样品少、高通量化、集成小型化和自动化，污染少。因此，近年来微流控在生物医学领域的应用受到格外重视，如核酸检测、蛋白质检测、临床诊断、细胞分析等。微流控芯片与检测器结合构成微流控芯片分析系统，使得微流控芯片的研发及应用不断获得发展。
基于上述，进一步寻找提高表面增强拉曼散射基底的增强效果、提高微流控芯片的应用范围及检测水平，具有重要应用价值。
发明内容
基于上述背景，本发明提供了解决上述问题的一种表面增强拉曼散射基底、检测芯片及制备方法，提高了表面增强拉曼散射基底的增强效果，并通过设计微流控结构，提高微流控芯片的应用范围及检测水平，适用于在有机分子官能团的检测或光学信号检测中的应用。
本发明通过下述技术方案实现：
一种表面增强拉曼散射基底，采用金膜-单分子金颗粒自组装结构，金膜与金颗粒通过生物素-亲和素链接，且生物素采用带有PEG-SH官能团的生物素，亲和素采用带有SH官能团的亲和素。
进一步优选，所述金膜的厚度为200nm～300nm。
进一步优选，所述金颗粒的直径为200nm～250nm。
进一步优选，所述生物素携带的PEG的分子量为1000D～10000D。
生物素携带的PEG的分子量优选为1000D、3400D或10000D，可以根据分子量的大小调节金球与金膜的距离。此外，金膜的厚度以及金颗粒的粒径大小均会影响到金膜与金颗粒之间的距离。
Fano共振是一种会产生非对称线形的散射共振现象，通过调控Fano共振的峰位和凹陷深度，可以实现不同激光波长的SERS增强。本发明利用biotin-avidin链接金颗粒和金膜实现自组装颗粒膜结构，可以根据调整颗粒膜结构的尺寸(如金膜与金颗粒之间的距离)，调控Fano共振的共振峰位和凹陷深度，适用于785nm的拉曼激光。
一种表面增强拉曼散射基底的制备方法，包括以下步骤：
步骤A：在基体上制备形成一层金膜；
步骤B：在金膜上滴加带有PEG-SH官能团的生物素；
步骤C：孵化SH官能团的亲和素与纳米金颗粒，离心后去除上清液，滴加在步骤B处理后的金膜上，继续反应获得金膜-单分子金颗粒自组装结构基底。
进一步优选，通过调整金膜与金颗粒结构尺寸，以实现调控Fano共振的共振峰位和凹陷深度；调整因素包括PEG-SH官能团的生物素的浓度、生物素携带的PEG的分子量和金颗粒的直径中的一个或多个。
进一步优选，所述带有PEG-SH官能团的生物素的浓度为0.1mM～10mM；和/或生物素携带的PEG的分子量为1000D～10000D；和/或金颗粒的直径为200nm～250nm。
一种表面增强拉曼散射检测芯片，包括PDMS微流控板和表面增强拉曼散射基底层，所述表面增强拉曼散射基底采用上述的一种表面增强拉曼散射基底，或者采用上述的一种表面增强拉曼散射基底的制备方法制备的基底。
微流控芯片与SERS相结合的系统可对微量生物样品进行无损、快速、高灵敏度且高通量的检测分析，在生物医学领域有巨大的应用潜力。本发明利用biotin-avidin链接金颗粒和金膜实现自组装颗粒膜结构，利用PEG作为介质层膜，实现对Fano共振的激发，增强SERS强度。
进一步优选，所述PDMS微流控板由上至下依次包括第一微流控层、第二微流控层和基体；所述第一微流控层上设有第一微流控通道，所述第一微流控通道设有一个入口和两个出口，呈Y字型结构；第一微流控通道的入口用于注入检测样本；所述第二微流控层上设有第二微流控通道，所述第二微流控通道为两条独立通道；每条独立通道沿检测样本流通方向，包括入口、检测区和出口；第一个通道的入口与第一微流控通道的一个出口连通，第二个通道的入口设有过滤膜、且与第一微流控通道的另一个出口连通；所述基体的检测区设有表面增强拉曼散射基底层，用于拉曼光谱检测；两条独立通道的检测区与基体的检测区对应。
本发明设置过滤膜的目的是，对待检测血液样本中细胞进行分离，实现血清和血液分区独立检测。工作原理为：将待检测的血液样本由第一微流控通道的入口注入，然后通过Y字型结构通道分成两条支路，分别流到Y字型结构通道的两个出口；部分待检测血液样本经一个出口直接进入第二微流控通道的第一个通道的入口处，这样没经过过滤处理的待检测血液样本进入第一通道；另一部分待检测血液样本经另一个出口进入第二微流控通道的第二个通道的入口处，经过滤膜过滤处理后进入第二通道；两个独立通道内的待检测血液样本由入口处流通至两个对应的检测区，检测区与玻璃片上的检测区对应，进入检测；最后废液从两个通道的出口排出。
进一步优选，所述第一微流控通道和第二微流控通道的宽度均为100um～300um，深度均为100um～300um。
本发明具有如下的优点和有益效果：
本发明实质上提供了一种自组装Fano共振SERS芯片、制备方法以及基于微流控的自组装Fano共振SERS芯片。首先，在基体的表面制备一层金膜，然后向金膜滴加生物素；同时将链霉亲和素与金纳米颗粒孵化反应，离心后去除上清液，再滴加在金膜上，自组装形成单层的金膜-金球结构，产生法诺共振光学响应，制得高增强的SERS基底。本发明的SERS基底与PDMS微流控芯片结合，提高了微流控芯片的应用范围及检测水平，并且制作方法简单，操作简单，便于携带，可实现同时检测血清和血液。
本发明金膜-单分子金颗粒自组装结构形成的SERS基底制备过程简单，不需要太昂贵的设备，不用耗费太长的时间。本发明制备的微流控Fano共振SERS芯片具有很好的拉曼增强效果，在物质检测方面有很好的前景。在分离细胞方面操作简单，并且可以根据滤膜孔径的大小调控需要分离的细胞的大小，在微流控领域有一定前景。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为本发明的表面增强拉曼散射基底制备流程图；
图2为本发明的表面增强拉曼散射基底SEM图；其中，图2(a)表示标尺大小为5μm的SEM图，图2(b)表示标尺大小为20μm的SEM图；
图3为本发明的表面增强拉曼散射检测芯片结构示意图；
图4为本发明对4-ATP的拉曼检测光谱图；
图5为微流控模拟分离细胞前后的对比图；其中，图5(a)表示分离细胞前的微流控通道图，图5(b)表示分离细胞后的微流控通道图。
附图中标记及对应的零部件名称：1-第一微流控层，2-过滤膜，3-第二微流控层，4-基体，5-第二微流控层的检测区，6-基体的检测区。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
本实施例提供了一种表面增强拉曼散射基底，制备过程如图1所示，采用磁控溅射技术在玻璃片上对应的检测区溅射一层金膜，形成稳定均一的金膜，然后在金膜上滴加单分子层金纳米小球。具体步骤如下：
步骤1：依次用丙酮、无水乙醇、去离子水清洗玻璃片并吹干，遮挡非检测区域；
步骤2：采用磁控溅射技术在玻璃片上对应的检测区溅射一层金膜，形成稳定均一的金膜；
步骤3：配置浓度为1mM的biotin-PEG-SH，然后取10μml滴加在金膜上，孵化30min后冲洗多余的biotin-PEG-SH。
步骤4：取90μml的金纳米溶液与10μml的avidin-SH混合放置孵化反应30min，然后以转速为3000rpm离心3min，再去除离心后溶液的上清液，将剩余的带有avidin-SH的金纳米溶液滴加在已经处理好的金膜上，再放置30min，冲洗多余的金球，得到金膜-单分子层金球结构，作为SERS基底，得到的SEM图如图2所示。
其中，金膜的厚度为200nm～300nm，可以根据溅射时间长短控制金膜的厚度；金球的直径为200nm～250nm；biotin-PEG-SH中PEG的分子量可以为1000D、3400D或10000D，不同分子量的PEG的链长也不同，可以用于调节金球与金膜之间的距离；biotin-PEG-SH的浓度可以为10mM、1mM或100uM，可以调节金球与金膜之间的距离；通过调整金球的尺寸、PEG的分子量以及biotin-PEG-SH的浓度，可以调控球膜结构激发Fano共振的法诺凹陷的位置，以供785nm激光使用。
本实施例中，设计金膜的厚度为300nm，金球的直径为250nm；biotin-PEG-SH中PEG的分子量为10000D，以供785nm激光使用。
实施例2
本实施例提供了一种表面增强拉曼散射检测芯片，如图3所示，由PDMS微流控板和实施例1提供的表面增强拉曼散射基底层构成，整体分为三层结构，PDMS微流控板由上至下依次为第一微流控层、第二微流控层和基体，此处的基体采用玻璃片。
第一层(第一微流控层)：第一微流控层上设有第一微流控通道，第一微流控通道设有一个入口和两个出口，呈Y字型结构；第一微流控通道的入口用于注入待检测的血液样本。
第二层(第二微流控层)：第二微流控层上设有第二微流控通道，第二微流控通道为两条独立通道，两条通道均呈直线型、且相互平行；每条独立通道沿检测样本流通方向，包括入口、检测区和出口；第一个通道的入口与第一微流控通道的一个出口连通，第二个通道的入口设有过滤膜、且与第一微流控通道的另一个出口连通；即在第二个通道的入口与第一微流控通道的另一个出口之间贴合一个过滤膜，用于分离血液中的细胞，过滤膜的孔径大小可以根据待检测样本的细胞大小进行选择，实现不同尺寸细胞的分离，本实施例选择直径3mm的过滤膜。
第三层(玻璃片)：在玻璃片的检测区制备实施例1的表面增强拉曼散射基底层，用于拉曼光谱检测；两条独立通道的检测区与基体的检测区对应。
工作原理为：
将待检测的血液样本由第一微流控通道的入口注入，然后通过Y字型结构通道分成两条支路，分别流到Y字型结构通道的两个出口；部分待检测血液样本经一个出口直接进入第二微流控通道的第一个通道的入口处，这样没经过过滤处理的待检测血液样本进入第一通道；另一部分待检测血液样本经另一个出口进入第二微流控通道的第二个通道的入口处，经过滤膜过滤处理后进入第二通道；两个独立通道内的待检测血液样本由入口处流通至两个对应的检测区，检测区与玻璃片上的检测区对应，进入检测；最后废液从两个通道的出口排出。
第一微流控通道第二微流控通道的宽度均为300um、深度均为200um，所有入口和出口的直径为2mm；设计Y型结构通道的夹角为70°。
实施例3
本实施例提供了一种表面增强拉曼散射检测芯片的制备方法，具体步骤如下所示：
步骤1：绘图。
用CAD画出实施例2中的PDMS微流控通道的结构，并制备掩模版。
步骤2：制备SU-8光刻胶模具。
光刻的工艺流程如下：
步骤21.预处理硅片。将硅片依次在丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗5min，然后放在120℃的热台上烘10min。
步骤22.在硅片上滴加适量的SU-8光刻胶，静置10min。
步骤23.甩胶。将有SU-8胶的硅片放置在甩胶机上，先500rad/min转10s，然后1000rad/min转30s。
步骤24.前烘。将甩胶后的硅片放置在热台上，65℃烘15min，95℃烘45min。
步骤25.曝光时间为95s。
步骤26.后烘。将曝光后的硅片放置在热台上，65℃烘5min，95℃烘10min。
步骤27.显影。显影时间为10min。
步骤28.坚模。将显影清洗后的模具在热台上烘5min，获得SU-8光刻胶模具。
步骤3：制备PDMS微流控通道。在培养皿中按预聚体和溶剂按1:10配置好聚二甲基硅氧烷(PDMS)，然后真空抽气泡，将处理后的PDMS倒在SU-8光刻胶模具上再一次真空抽汽泡后放入烘箱中75℃加热固化1h，最后小心地将PDMS从模具上剥离，得到PDMS微流控通道结构。
步骤4：制备表面增强拉曼散射基底，采用实施例1提供的方法。
步骤5：将PDMS微流控通道结构和玻璃片洗净吹干后，经过等离子40s处理后，键合在一起，获得表面增强拉曼散射检测芯片。
实施例4
采用实施例3制备的表面增强拉曼散射检测芯片对4-ATP进行表面增强拉曼散射检测。
配置浓度为10μM的4-ATP溶液。采用拉曼光谱仪进行分析，选择785nm的激光，激光强度为65，积分时间为1s，积分次数为1次。对每个样本的检测10个不同位置，并标注特征峰1090cm-1处强度的平均值。
如图4，为4-ATP溶液的拉曼光谱图，具有很强的增强效果。本发明在分子检测方面具有操作简单，增强效果稳定，高效能等优势。
实施例5
采用实施例2中的PDMS微流控通道结构分离直径为20μm的PS小球，过滤膜的孔径大小为2μm。
如图5(a)为键合完成后的微流控芯片，图5(b)为分离PS小球后的微流控芯片。可以明显地观察到带有过滤膜的通道成功地过滤了PS小球，只剩下清澈的溶剂，而没有滤膜的通道则带有PS小球。由于只是模拟分离细胞，所以检测区没有制备SERS基底。
本发明在分离细胞方面操作简单，并且可以根据滤膜孔径的大小调控需要分离的细胞的大小，在微流控领域有一定前景。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种表面增强拉曼散射基底的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A：在基体上制备形成一层金膜；
步骤B：在金膜上滴加带有PEG-SH官能团的生物素；
步骤C：孵化SH官能团的亲和素与纳米金颗粒，离心后去除上清液，滴加在步骤B处理后的金膜上，继续反应获得金膜-单分子金颗粒自组装结构基底；
通过调整金膜与金颗粒结构尺寸，以实现调控Fano共振的共振峰位和凹陷深度；调整因素包括PEG-SH官能团的生物素的浓度、生物素携带的PEG的分子量和金颗粒的直径中的一个或多个；
表面增强拉曼散射基底，其特征在于，采用金膜-单分子金颗粒自组装结构，金膜与金颗粒通过生物素-亲和素链接，且生物素采用带有PEG-SH官能团的生物素，亲和素采用带有SH官能团的亲和素。
2.根据权利要求1所述的一种表面增强拉曼散射基底的制备方法，其特征在于，所述带有PEG-SH官能团的生物素的浓度为0.1mM～10mM；
和/或生物素携带的PEG的分子量为1000D～10000D；
和/或金颗粒的直径为200nm～250nm。
3.根据权利要求1所述的一种表面增强拉曼散射基底的制备方法，其特征在于，所述金膜的厚度为200nm～300nm。
4.根据权利要求1所述的一种表面增强拉曼散射基底的制备方法，其特征在于，所述金颗粒的直径为200nm～250nm。
5.根据权利要求1所述的一种表面增强拉曼散射基底的制备方法，其特征在于，所述生物素携带的PEG的分子量为1000D～10000D。
6.一种表面增强拉曼散射检测芯片，其特征在于，包括PDMS微流控板和表面增强拉曼散射基底层，所述表面增强拉曼散射基底，是采用权利要求1-5任一项所述的一种表面增强拉曼散射基底的制备方法制备的基底。
7.根据权利要求6所述的一种表面增强拉曼散射检测芯片，其特征在于，所述PDMS微流控板由上至下依次包括第一微流控层、第二微流控层和基体；
所述第一微流控层上设有第一微流控通道，所述第一微流控通道设有一个入口和两个出口，呈Y字型结构；第一微流控通道的入口用于注入检测样本；
所述第二微流控层上设有第二微流控通道，所述第二微流控通道为两条独立通道；每条独立通道沿检测样本流通方向，包括入口、检测区和出口；第一个通道的入口与第一微流控通道的一个出口连通，第二个通道的入口设有过滤膜用于细胞过滤、且与第一微流控通道的另一个出口连通；
所述基体的检测区设有表面增强拉曼散射基底层，用于拉曼光谱检测；
两条独立通道的检测区与基体的检测区对应。
8.根据权利要求7所述的一种表面增强拉曼散射检测芯片，其特征在于，所述第一微流控通道和第二微流控通道的宽度均为100um～300um，深度均为100um～300um。
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