KR100737689B1 - 표면 플라즈몬 공명 센서의 신호 증폭 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 표면 플라즈몬 공명법 (Surface Plasmon Resonance, SPR)을 이용한 단백질 정량방법에 관한 것으로, 구체적으로는 시료내 표적 단백질을 SPR 센서로 정량하는 방법과 금나노입자와 효소침전반응을 통한 2차 증폭방법을 이용하여 SPR 신호의 민감도를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법을 SPR 센서에 도입함으로써 극소량의 단백질을 보다 신속하고 정확하게 정량할 수 있으며, 각종 암진단 및 다양한 질병을 진단하는 것이 가능하다.

표면 플라즈몬 공명법, 금나노입자, 효소침전반응

Description

표면 플라즈몬 공명 센서의 신호 증폭 방법{A METHOD FOR AMPLICATION OF SIGNALS OF SURFACE PLASMON RESONANCE SENSOR}

도 1은 금나노입자와 HRP 효소를 이용하여 SPR 신호 증폭을 위한 센서 칩 제작과정의 개념도이다. (a)는 금박막에 에틸렌글리콜 (ethyleneglycol) 자기조립단분자층(self assembled monolayer)을 형성하여 바이오티닐화 (biotinylation) 및 스트렙타비딘 (streptavidin)을 고정화 한 후, GAD (Glutamic Acid Decarboxylase) 항원-항체를 반응 시키는 단계, (b)는 SPR 신호를 증폭시키기 위해 금 나노입자와 IgG-HRP 복합체를 반응시키는 단계, (c)는 SPR 신호의 2차 증폭을 위해 HRP 효소와 DAB/H₂O₂ 용액을 반응시키는 단계이다.

도 2는 안티 (anti)-GAD 농도에 따른 항원-항체의 면역 반응에 의해 실시간 변화되는 SPR 값을 보여주는 그래프이다. (a)는 바이오티닐화된 GAD가 고정화된 표면에 다른 농도의 GAD 항체를 흘려주는 단계, (b)는 GAD 항체의 주입을 멈추는 단계, (c)는 신호증폭을 위해 금 나노입자와 결합된 IgG-HRP 복합체를 흘려주는 단계, (d)는 금 나노입자와 결합된 IgG-HRP 복합체의 주입을 멈추는 단계, (e)는 DAB/H₂O₂ 혼합용액을 주입 하는 단계, (f)는 용액 주입을 정지한 후, 효소반응에 의한 불용해성 물질이 침전되어 신호 증폭이 일어나는 단계이다.

도 3은 0.01에서 100 ng/ml 범위의 농도에서 GAD 항체의 검출을 보여주는 그래프이고, 삽입된 그래프는 SPR 신호의 RU 값 (Response unit value)과 GAD 항체 농도와의 지수적 상관관계를 보여주는 그래프이다. 도 3에서 (a)는 1차 반응, (b)는 금 나노입자에 의한 신호의 1차 증폭, (c)는 효소침전에 의한 신호의 2차 증폭이다.

기술분야

본 발명은 표면 플라즈몬 공명법(Surface Plasmon Resonance, SPR)을 이용한 단백질의 측정방법에 관한 것으로, 구체적으로는 시료내 표적 단백질을 SPR 센서로 정량하는 방법과 금 나노입자와 효소침전반응을 통한 2차 증폭방법을 이용하여 SPR 신호의 민감도를 증가시키는 방법에 관한 것이다.

종래기술

게놈 프로젝트 (Genome Project)로 인간유전자의 구조가 대부분 밝혀지면서 인체를 구성하는 유전자의 기능연구 및 프로테오믹스 (Proteomics)가 많은 연구자들의 관심을 끌고 있다. 이러한 추세를 반영하여 바이오칩 연구도 DNA 칩 (Chip) 중심에서 단백질칩, 탄수화물칩, 세포칩 등으로 다변화되고, 응용분야도 약물 스크리닝 (Drug Screening), 질병진단, 환경오염 모니터링, 식품안정성 평가 등으로 확장되는 추세이다. 또한 기존에 단백질 연구방법으로 널리 사용되어 온 2차원 전기 영동법은 재현성이 좋지 않고, 알칼리성 단백질과 고분자 단백질의 분리가 어렵고, 자동화가 용이하지 않다. 질량분석법은 미지 시료를 분석할 수 있으나 소형화가 어렵고 다수의 시료를 초고속으로 분석하기 어렵다는 단점이 지적되고 있으며, ELISA법과 같은 형광법의 경우 모든 생체물질을 형광물질로 균일하게 표지해야 불편함이 따른다. 따라서, 상기한 종래 연구방법들의 단점을 극복할 수 있는 새로운 기술이 요구되고 있다. 현재 대안으로 부각되는 분석기법은 굴절률의 변화를 측정하여 생체물질의 상호작용을 인지할 수 있는 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance)법이다. SPR법은 형광물질과 같은 별도의 표지물질 없이 광학적 원리를 이용하여 분자들 간의 상호작용을 계측할 수 있고, 반응의 진행상황을 실시간으로 측정할 수 있다.

SPR 센서 기술은 단백질과 같은 생체 물질이 센서 표면에 결합될 경우 신호 변화를 일으키는 현상을 이용하여 바이오센서 및 바이오칩 측정방법으로 많이 이용되고 있다. SPR 센서는 일반적으로 비교적 큰 분자를 리간드로 고정화하고 저분자들의 결합 반응 여부를 연구하는데 많이 이용되었고, 항체와 항원 같은 큰 분자들 사이의 결합 반응 연구에는 많이 쓰이지 않았다. SPR이 바이오센서로 이용하기에 적합한 이유는 SPR현상이 금속박막의 표면근처 (거의 500 nm이하)에서 일어나는 물리, 화학적 변화에 공명각도나 파장의 변화로서 매우 민감하게 영향을 받기 때문에 금속박막의 표면처리를 통해 다양한 분야에 응용이 가능하기 때문이다. 또한 SPR은 다른 방법에 비해 계측할 때 샘플에 손상이나 변형을 주지 않고 방사성 물질이나 형광물질을 이용한 별도의 표식없이 광학적 원리만으로 분자들간의 상호계측이 가 능하고 실시간으로 결합 친화도를 측정할 수 있으며 분자인식검출에 높은 감도를 가진다는 것이다. SPR은 금속박막의 굴절률 변화를 민감하게 측정하는 방법으로서, 금속표면에 단백질과 같은 생화학적 물질이 결합될 경우, 그 변화된 양을 감지하여 정량할 수 있는 특징이 있다. 이러한 현상을 나타내는 금속박막은 금 (gold), 은 (silver), 구리 (copper), 알루미늄 (aluminium) 등과 같은 외부 자극에 의해 전자의 방출이 쉽고 음의 유전상수를 갖는 금속들이 주로 사용되는데, 그 중에서 가장 예리한 SPR 공명 피크를 보이는 은 (silver)과 우수한 표면 안정성을 나타내는 금 (gold)이 보편적으로 이용되고 있다. 표면 플라즈몬 공명이 일어나는 공명각, 즉 반사광이 최소가 되는 각도는 금속 박막 표면층 유전체 질량이 증가하거나 구조가 변형되면 결과적으로 유효 굴절률 (effective refractive index)이 변화하여 공명각이 달라지게 된다. 따라서 이러한 물질의 변화를 광학적인 방법으로 계측할 수 있는 SPR 원리를 이용하면 금속 박막 표면 층의 적절한 화학적 변형을 통해 다양한 생화학 물질들 사이의 선택적 결합이나 분리와 같은 생화학적 반응을 공명각의 변화로 감지할 수 있어 SPR 센서는 고감도 생화학 센서로 활용할 수 있게 된다. 이러한 장점으로 SPR은 생체분자측정을 위한 바이오센서분야의 유용한 기술로 평가되고 있다. 그러나 이러한 SPR을 이용한 바이오센서는 극미량 농도의 생체물질을 분석하기에는 그 감도가 떨어지는 문제점이 있다. 결론적으로, 종래의 SPR법은 별도의 신호증폭 없이 생체 시료의 결합을 직접적으로 측정할 수 있는 장점이 있으나, 극미량의 생체 시료를 측정하고자 할 때 별도의 신호 증폭 기술을 요구된다.

이에, 본 발명자들은 바이오칩 및 바이오센서 측정 방법으로 금 나노입자와 효소침전 반응을 이용한 SPR 신호의 증폭을 통하여, 극미량의 농도 및 다양한 농도의 생체분자 분석이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 개질된 SPR칩 표면에서 금 나노입자를 이용한 SPR 신호의 1차 증폭과 효소침전반응에 의한 2차 증폭을 통해 특정질병이나 극소량의 표적 단백질 (지표 물질)을 검출할 수 있는 감도 높은 SPR 센서 칩 및 이를 이용한 측정법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 SPR (Surface Plasmon Resonance) 칩의 금박막 표면에 자기조립단분자층 (self assembled monolayer)을 형성시키고, 표적 단백질에 대한 항체를 상기 자기조립단분자층에 고정화시키고, 상기 고정된 항체에 표적 단백질을 포함한 시료를 반응시키고, 고정된 표적 단백질에 금나노입자로 신호를 증폭시키고, 효소침전반응에 의해 신호를 추가로 증폭시킴으로써 단백질을 정량하는 방법을 제공한다.

본 발명에서는 일구체예로 금박막에 에틸렌글리콜 (ethyleneglycol) 자기조립단분자층을 형성하고 상기 자기조립단분자층의 바이오티닐화 (biotinylation) 및 스트렙타비딘 (streptavidin)을 고정화 한 후, GAD (Glutamic Acid Decarboxylase) 항원-항체를 반응 시키는 단계; SPR 신호를 증폭시키기 위해 금 나노입자 (AuNP)와 IgG-HRP 복합체를 반응시키는 단계; SPR 신호의 2차 증폭을 위해 HRP 효소와 DAB/H₂O₂ 용액을 반응시키는 단계를 포함하는, 극소량의 단백질을 정량하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 표적 단백질이란 질병의 진단에 유용한 지표 물질을 말한다 (예를 들면, 당뇨병의 지표 물질인 안티 (anti)-GAD 항체; 전립선암의 지표 물질인 PSA 단백질; 간암의 지표 물질인 AFP 등).

본 명세서에서 표적 단백질에 대한 항체란 상기 표적 단백질과 항원-항체 반응을 일으키는 단백질 분자를 말한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에 있어서, 상기 SPR 칩에서 금 나노입자와 효소 침전 반응을 이용하는 것은 SPR 신호를 크게 증폭시켜 극미량의 표적 단백질의 정량을 가능하게 하여 의료용 진단 센서로의 활용을 가능하게 한다.

일구체예에서 본 발명의 측정 방법은 상기 SPR 신호증폭을 위하여 금 나노입자와 효소침전반응을 도입하였다 (도 1 참조). 구체적으로, 항체가 고정화된 SPR 칩 표면에 비특이적 흡착을 최소화 할 수 있는 자기조립단분자층을 형성시키고, 표적 단백질에 대한 항체 및 표적 단백질을 차례로 고정화시키고, 금 나노입자와 IgG-HRP 복합체를 도입하여 1차 증폭을 시킨 후, 효소 침전반응을 통해 2차 증폭을 시도하여, 급격한 SPR 신호 변화 감지할 수 있었다 (도 2 참조).

도 1의 모든 과정 단계는 BIACORE 사의 SPR 분석장비에 의해 측정하였다. 첫 번째 면역 반응은 안티(anti) GAD 항체단백질 (표적 단백질)의 0.01 부터 2,000 ng/ml 까지 다양한 농도로 수행되었다. 그러나 첫 번째 면역 반응에서는 안티 GAD 항체단백질의 농도가 0.01에서부터 100 ng/ml 까지는 신호 검출이 되지 않았으며, 직선 범위는 단지 100에서 2,000 ng/ml 에서만 나타났다. 첫 번째 면역 반응의 선형 회귀 (linear regression) 공식은 y = 0.0733x + 1.6553 (R² = 0.9955, n = 5)로서 [도 3의 curve (a)], y는 RU 값을 나타내고 x는 분석시료 농도를 나타낸다. 안티 GAD 항체단백질의 농도가 0일 때 상대적 표준편차 값은 4.8이었다. 검출한계는 블랭크 (blank) 샘플의 평균측정 값으로 세 차례의 표준편차이다. 그러므로 첫 번째 면역반응만 수행했을 경우의 검출한계는 196 ng/ml였다. 흥미롭게도 SPR 면역검출의 상대적인 RU 값은 도 3에 도시한 바와 같이 신호 증폭 전략을 썼을 때는 상당히 많이 향상되는 것으로 나타났다. 상대적 RU 값과 안티 GAD 항체단백질 농도 사이의 대수적 관계는 금 나노입자를 이용해 증폭 했을 때와 효소 침전반응을 이용해 증폭 했을 때 모두 직선관계를 보였다 [도 3의 curve (b), curve (c)]. 금 나노입자를 이용한 증폭에서는 0.1에서부터 100 ng/ml까지 범위에서만 직선 관계를 보였다. 선형 회귀 방정식은 y = 9.0919x + 148.72 (R² = 0.9814, n = 4)이고, 이 공식에서 유도된 상대적 표준편차는 6.7이었다. 또한 금 나노입자를 이용한 증폭 시 검출 한계는 2.2 ng/ml 였다. 이 공식의 기울기로부터 SPR 센서의 민감도는 금 나노입자를 이용하여 SPR 신호를 증폭했을 때, 안티 GAD 항체단백질만 검출을 시도한 것에 비해 기울기 값이 0.0733에서 9.0919로 약 124 배 커짐을 알 수 있다. 금 나노입자 증폭을 기반으로 효소 침전에 의한 2차 증폭에서의 선형 회귀 방정식은 y = 37.096x + 452.68 (R² = 0.9755, n = 6)로 나타낼 수 있었다. 검출 가능한 농도는 0-100 ng/ml 로 얻어졌다. 분석시료의 안티 GAD 항체단백질 농도가 0 일 때 RU 값의 변동은 효소 침전에서는 변동이 없었고, 매우 낮은 상대적 표준편차 (=0.39)를 보였다. 결과적으로 안티 GAD 항체 단백질 검출한계는 0.03 ng/ml (= 120 fM)로 금 나노입자와 효소 친전 반응을 이용한 2차 증폭 시스템으로 매우 낮은 값을 얻을 수 있었다. 그 결과 SPR 민감도는 금 나노입자를 이용한 증폭 보다 선형 회귀 방정식의 기울기가 9.0919에서 37.096으로 약 4.08 배 향상되었고, PSA 단백질만을 검출 했을 때와 비교하면 기울기가 0.0733에서 37.096으로 506배 정도 향상되었다.

따라서 본 발명의 측정 방법은 바람직한 실시예에 있어서 0.01 ng/ml 내지 2,000 ng/ml의 단백질을 용이하게 분석할 수 있었으며, 이것은 ELISA 방법을 이용하여 안티 GAD 항체 단백질을 검출 했을 때 그 검출 한계가 1 내지 1,500 ng/ml 인 것과 비교 했을 때 매우 뛰어난 최소 검출 한계와 넓은 범위의 단백질 측정이 가능함을 나타낸다.

따라서 본 측정 방법의 발명은 SPR 칩 상에서 금 나노입자와 효소 침전반응 기법을 도입함으로써, SPR 신호를 증폭하여 검출한계를 기존 방법보다 훨씬 더 낮출 수 있으므로, SPR센서 시스템을 기반으로 한 질병진단용 센서로 이용이 가능하다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것으로, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명에 개시된 모든 문헌은 참조로서 통합된다.

실시예

실시예 1: SPR 칩상에서의 항원-항체 면역 반응

1) 금박막 표면에 에틸렌글리콜을 이용한 자기조립단분자층의 형성

깨끗하게 세척한 금박막칩의 항체 고정화를 위해 말단기가 카르복실기 (-COOH)로 치환되어 있는 EG₆ 올리고머 {HS(CH₂)₁₁(OH₂CH₂)₆OCH₂COOH}와 말단기가 하이드록실기 (-OH)로 치환되어 있는 EG₃ 올리고머 {HS(CH₂)₁₁(OH₂CH₂)₃OH}를 0.5 mM 순수 에탄올 용액에 적절한 비율 (본 실시예에서는 1:9로 혼합)로 혼합하여 SPR 센서칩에 자기조립박막을 형성하였다. 그리고 금박막 표면에 고정화되지 못한 잔여물을 초순수 증류수 (18.2 mΩ/cm)와 순수 에탄올을 이용하여 차례로 세척하였다.

2) 카르복실기와 GAD 항원 단백질의 바이오티닐화

스트렙타비딘 (Streptavidin)의 고른 배향성을 갖게 하기 위해 EG 말단의 카르복실기에 바이오틴 (biotin)을 합성하였다. 고체표면에서 말단기가 카르복실기인 자기조립박막을 바이오티닐화하는 방법은 용액속에서 실시하는 것과 비슷한 방법으로 선행기술을 참고로 하여 수행하였다 [참고문헌: O'Shannessey, D.J., Quarles, R.H., J. Immunol. Methods 99:153-161. (1987)]. 먼저 준비된 표면을 0.1 M MES 완충액 (pH = 4.7 내지 5.5)으로 씻어주었다. 그리고 카르복실기를 활성화 시키고 바이오틴을 컨쥬게이션 (conjugation)하기 위하여, 100mg/ml EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride)의 65 μl 와 바이오틴 하이드 라지드 (biotin hydrazide) (50 mM)를 섞은 용액에 12시간 동안 담가 놓았다. 이 때 온도는 상온이었고 30 rpm으로 약하게 교반시켜주었다. 그리고 나서 반응시킨 칩 표면을 상온에서 고순도 질소 가스로 5 초 간 건조시켜 주었다.

또한 스트렙타비딘 항체에 고정화할 GAD 항원을 바이오티닐화하기 위해 상용 바이오티닐화 키트 (EZ-link sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit, Pierce)를 이용하여, 제조사가 제공하는 프로토콜에 따라 순차적으로 수행하였다.

3) SPR 센서를 이용한 스트렙타비딘과 GAD 항원 단백질의 고정화

상기 절차까지 수행한 칩을 SPR 바이오센서 시스템 (BIACORE 2000, BIACORE 사)에 장착하였다. 본 실시예에서 용액의 흐름속도는 5 μl/ml 로 수행하였고, 모든 실험은 25 ℃의 온도에서 진행하였다. 스트렙타비딘 고정화를 위해 SPR 시스템의 Fc2 (flow cell 2)에 스트렙타비딘 용액 (20 mg/ml, pH = 7.4 인 HBS 완충액에 녹임)을 7분 동안 주입하였다. 또한 스트렙타비딘의 주입을 한번 더 수행하여 공정화 효율을 최대화하였다. Fc1은 보다 정확한 반응신호를 보기 위해 표준참조세포 (reference cell)로서 사용하였다. 또한 SPR 신호의 값은 Fc2에서 Fc1을 뺀 값을 이용하였다. 그리고 나서 스트렙타비딘을 고정화 한 후에, 미 반응된 표면을 비특이적 흡착을 줄이기 위해 1M 에탄올아민-HCl을 이용하여 7분 동안 흘려주었다.

다음으로는 바이오티닐화된 GAD 항원 단백질 (HBS 완충액 중에 2 μg/ml) (표적 단백질에 대한 항체)를 SPR 센서칩 표면에 약 7분 동안 흘려주었다. 이후에 스트렙타비딘에 고정화 되지 않은 바이오티닐화된 GAD 항원을 씻어내기 위해, 25 mM NaOH 용액과 0.2 M NaCl 용액의 혼합용액을 2분 동안 흘려주었다. 상기 실험 절 차를 끝으로 당뇨병의 지표물질인 안티 GAD 항체 (표적 단백질)를 검출할 수 있는 SPR센서 칩이 완성되었다.

4) Anti GAD 항체 단백질의 측정

이 절차의 실험에서 모든 용액의 흐름속도는 5 μl/분을 유지하였다. 안티 GAD 항체 (표적 단백질)를 pH 7.4 인 HBS 완충액에 0 내지 2,000 ng/ml의 농도로 희석하여 Fc2에 각각 10분 동안 주입하여 항원-항체 반응을 이용하여 고정화하였다. 이 실험에서 0 ng/ml 농도의 Anti GAD 항체를 주입했다는 것은, 블랭크 (blank)를 잡기 위해 HBS 완충액만 흘려준 것을 의미한다. 면역반응 측정 후 칩의 재사용을 위해서, 센서칩에 50 mM NaOH와 1 M NaCl의 혼합용액을 이용하여 2분 동안 흘려주고 칩을 다시 이용하였다.

상기 SPR 바이오센서를 이용하여 안티 GAD 항체를 각 농도 별로 분석한 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, GAD 항원과 안티 GAD 항체와의 1차 면역반응에서의 SPR 신호 값은 안티 GAD 항체의 농도가 높아짐에 따라 증가했으나, 증폭방법을 사용했을 때보다 RU 값의 변화가 거의 없음을 알 수 있었다. 안티 GAD 항체 농도 1 ng/ml를 Fc 에 흘려 주었을 때는 RU 값이 9 였고, 10 ng/ml 농도에서는 14 RU, 100 ng/ml 에서는 32 RU, 500 ng/ml 에서는 69 RU, 1000 ng/ml 에서는 119 RU 값을 얻을 수 있었다. 하지만 BIACORE 사에 따르면, SPR 시스템에서 RU 값이 블랭크 시료(항원 첨가없이 완충액만 존재하는 시료)때의 3배 이상이 되어야만 시료가 검출한계 값을 가질 수 있다고 정의하였다. 실험 결과 블랭크 시료만 흘려주었을 때의 RU 값은 7 이었으므로, 그 3배가 되는 21 RU 이상이 나와야 한다. 따라서 안티 GAD 항체 만 흘려주어 항원-항체 면역 반응만을 수행한 경우의 검출 한계는 100 ng/ml 까지 임을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 금나노입자와 효소침전반응을 통한 SPR 신호의 증폭

상기와 같은 항원-항체의 면역 반응 만으로는 100 ng/ml 이하의 농도를 가진 안티 GAD 항체를 분석해 낼 수 없었다. 이러한 검출한계는 SPR 센서를 이용한 질병진단에 있어 심각한 한계를 드러낸다. 예를 들어, 전립선암이 걸렸을 때 그 수치가 높아지는 PSA 단백질은 정상범위가 4 ng/ml 이하의 값을 갖고, 그 이상이 되었을 때 전립선암이라고 진단할 수 있는데, 검출 한계가 100 ng/ml 이하이면 실제로 암이 진행되었어도 검출이 안된다는 심각한 문제를 드러내게 된다. 또 다른 암지표물질인 AFP(Alpha-fetoprotein, 알파태아단백질, 간암)의 정상범위도 15 ng/ml 이하이고, 다른 암지표물질도 정상범위가 100 ng/ml 이하이기 때문에 SPR 센서를 이용하여 질병진단을 하기 위해서는 검출 한계를 더 낮춰야만 한다.

따라서 상기의 문제점을 해결하기 위해, SPR 센서 시스템에서 금 나노입자와 효소침전반응을 도입에 의해 SPR 신호의 2차 증폭 방법을 개발하였다.

1) 금나노입자와 단백질의 복합체 형성

금나노입자의 형성은 소듐 시트레이트 (Sodium citrate)에 의한 하이드로겐 테트라클로로아우레이트 (hydrogen tetrachloroaurate, HAuCl₄)의 환원을 기반으로 한다. 50 ml 에를렌마이어 플라스크 (Erlenmeyer flask)에 HAuCl₄ 1.0 mM, 20 ml를 교반 (1,000 rpm)과 가열 (100 ℃)을 하며 넣고, 이 끓는 용액에 1 % 소듐 시트레 이트 용액을 2 ml 첨가하여 빠르게 교반하였다 (1,000 rpm). 그리고 약 30분간 더 가열(100 ℃)과 교반 (1,000 rpm)을 해주고 나서 상온에서 냉각하였다. 골드 졸 (Gold sol)은 시트레이트 (citrate)가 gold(III)에 환원됨에 따라 점차적으로 형성되어진다. 이러한 방법으로 진홍색을 가진 평균 약 21 nm 크기 금 나노입자를 만들 수 있다. 콜로이드 용액의 합성 후, 금 나노입자들은 9 ml의 금 용액과 1 ml의 HS-OEG₃-COOH 용액의 혼합에 의해 HS-OEG₃-COOH의 티올 (thiol) 기에 효과적으로 흡착 된다. 상온에서 6시간 동안 약하게 교반한 후 (30 rpm), 혼합된 용액에서 금 나노입자와 HS-OEG₃-COOH 사이에 카르복실화 (carboxyltion) 반응이 일어나지 않은 것을 원심분리기를 이용하여 분리하였다 (14,000 rpm, 15분). 그리고 나서, 펠렛 (pellet)을 0.1 M MES 완충액 (pH 6.0)에 다시 넣고 원심분리하였다 (14,000 rpm, 15 분). 이러한 과정을 세 차례 반복한 후 HS-OEG₃-COOH 와 최종적으로 결합한 금 나노입자들은 0.1 M MES 완충액에서 4℃ 온도에서 보관하였다.

Au-IgG-HRP 복합체를 만들기 위해, 카르복실기로 치환된 금 나노입자들 용액 500 μl를 0.01 M EDC/NHS 2 μl와 혼합한 후, 그 즉시 금 나노입자를 활성화시키기 위해 1 ml IgG-HRP (PBS buffer에서 1 mg/ml, pH 7.2)를 첨가하였다. 그리고 나서, 잘 혼합된 용액은 상온에서 적어도 2시간 동안 천천히 교반했다. Au-IgG-HRP 복합체를 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 상등액을 버리고 금 나노입자로 표지된 농축입자를 0.1 M PBS 완충액 1 ml에 넣어 주었다.

2) 금나노입자에 의한 SPR 신호의 1차 증폭

GAD 항원과 안티 GAD 항체와의 면역반응이 끝난 후, SPR 신호 값을 증폭시켜 검출한계를 낮추기 위해, Au-IgG-HRP 복합체 (HBS 완충액 중에 50 μg/ml)를 10 분 동안 5 μl/분의 흐름속도로 Fc2에 주입하였다.

그 결과, 도 2의 c-d 구간에서 보여지는 바와 같이, 일차적인 항원-항체 면역반응만 일어났을 때보다 금 나노입자 복합체를 이용하여 다시 반응시켜주었을 때, SPR 신호 값이 훨씬 증폭됨을 알 수 있었다. 금 나노입자를 이용한 증폭에서는 0.1에서부터 100 ng/ml까지 범위에서만 직선 관계를 보였다. 선형 회귀 방정식은 y = 9.0919x + 148.72 (R² = 0.9814, n = 4)이고, 이 공식에서 유도된 상대적 표준편차는 6.7이었다. 또한 금 나노입자를 이용한 증폭 시 검출 한계는 2.2 ng/ml 였다. 이 공식의 기울기로부터 SPR 센서의 민감도는 금 나노입자를 이용하여 SPR 신호를 증폭했을 때, 안티 GAD 항체단백질만 검출을 시도한 것에 비해 기울기 값이 0.0733에서 9.0919로 약 124 배 커짐을 알 수 있었다.

3) 효소침전 반응에 의한 SPR 신호의 2차 증폭

상기 실시예 2의 2)에서 Au-IgG-HRP 복합체와의 반응이 끝난 후 바로 0.2X DAB (3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride)/H₂O₂ 기질 용액을 3분 동안 칩 표면에 흘려주어 반응시켰다. 칩 영역에 산화된 불용해성 부산물의 침전물은 SPR 각의 이동을 초래하여 SPR 바이오센서의 민감도를 증폭시키게 된다. 칩의 재사용을 위해서, 센서칩에 50 mM NaOH와 1 M NaCl의 혼합용액을 이용하여 2분 동안 흘려주고 칩을 다시 이용하였다.

금 나노입자 증폭을 기반으로 효소 침전에 의한 2차 증폭에서의 선형 회귀 방정식은 y = 37.096x + 452.68 (R2 = 0.9755, n = 6)로 나타낼 수 있었다. 검출 가능한 농도는 0 내지 100 ng/ml 로 얻어졌다. 분석시료의 안티 GAD 항체 농도가 0일 때 RU 값의 변동은 효소 침전에서는 변동이 없었고, 매우 낮은 상대적 표준편차 (=0.39)를 보였다. 결과적으로 안티 GAD 항체 단백질 검출한계는 0.03 ng/ml(= 120 fM)로 금 나노입자와 효소 친전 반응을 이용한 2차 증폭 시스템으로 매우 낮은 값을 얻을 수 있었다. 그 결과 SPR 민감도는 금 나노입자를 이용한 증폭 보다 선형 회귀 방정식의 기울기가 9.0919에서 37.096으로 약 4.08 배 향상되었고, 안티 GAD 항체 단백질만을 검출 했을 때와 비교하면 기울기가 0.0733에서 37.096으로 506배 정도 향상되었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 측정방법은 금 나노입자와 효소침전 반응을 이용함으로써 SPR 신호를 증폭할 수 있어, 극미량의 단백질을 분석해야하는 질병진단용 센서, 프로테오믹스 연구 등에 다양하게 적용될 수 있는 획기적인 분석 방법으로 사용될 수 있다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 기술분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (8)

1. i) SPR (Surface Plasmon Resonance)칩의 금박막 표면에 자기조립단분자층 (self assembled monolayer)을 형성하는 단계;

   ii) 자기조립단분자층에 표적 단백질에 대한 항체를 고정화시키는 단계;

   iii) 상기 고정된 항체에 표적 단백질을 포함한 시료를 반응시키는 단계;

   iv) 고정된 표적 단백질에 Au-IgG-HRP 복합체를 반응시켜 SPR 신호를 1차 증폭시키는 단계;

   v) 고정화된 Au-IgG-HRP 복합체에 DAB/H₂O₂ 기질 용액을 반응시켜 효소침전 반응을 일으켜 SPR 신호를 2차 증폭시키는 단계; 및

   vi) SPR 칩의 금박막 표면에 고정화된 물질에 대한 굴절지수변화 관계를 이용하여 목적 단백질의 양을 환산하는 단계를 포함하는, 단백질 정량방법.
2. 제 1항에 있어서, 단계 i)에서 자기조립단분자층은 말단이 카르복실기(-COOH)와 하이드록실기(-OH)로 구성된 에틸렌글리콜 (ethyleneglycol) 화합물로 형성됨을 특징으로 하는 단백질 정량방법
3. 제 2항에 있어서, 에틸렌글리콜 화합물은 말단기가 카르복실기(-COOH)인 에틸렌글리콜과 말단기가 하이드록실기(-OH)인 에틸렌글리콜의 1:9 비율을 갖는 혼합 물임을 특징으로 하는 단백질 정량방법.
4. 제 1항에 있어서, 단계 i)이 자기조립분자층의 바이오티닐화 (biotinylation) 단계 및 스트렙타비딘 (streptavidin)을 고정시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 단백질 정량방법.
5. 제 1항에 있어서, 단계 ii)의 표적 단백질에 대한 항체는 미리 바이오티닐화됨을 특징으로 하는 단백질 정량방법.
6. 제 1항에 있어서, 표적 단백질은 안티 (anti) GAD (Glutamic Acid Decarboxylase) 항체 단백질임을 특징으로 하는 단백질 정량방법.
7. 제 1항에 있어서, 표적 단백질의 농도는 0.01 ng/ml 내지 2,000 ng/ml 범위임을 특징으로 하는 단백질 정량방법.
8. 제 1항 내지 제 7항에 따른 방법에 따라 금 나노입자에 의한 SPR 신호의 1차 증폭 및 효소침전반응에 의한 SPR 신호의 2차 증폭을 통해 극소량의 단백질을 정량하기 위한 SPR 센서 시스템.

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