WO2009154377A2 - 실시간 연속 검출장치 - Google Patents

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WO2009154377A2
WO2009154377A2 PCT/KR2009/003174 KR2009003174W WO2009154377A2 WO 2009154377 A2 WO2009154377 A2 WO 2009154377A2 KR 2009003174 W KR2009003174 W KR 2009003174W WO 2009154377 A2 WO2009154377 A2 WO 2009154377A2
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recognition component
sample
capture
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백세환
조현규
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고려대학교 산학협력단
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
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Definitions

  • the present invention relates to a real-time continuous detection device, and more particularly to a real-time detection device including a sample inlet channel, a sample analysis site and a sample discharge channel, the sample analysis site is a reversible reactive capture recognition component and analyte in the sample It relates to a real-time continuous detection device of analyte, characterized in that it comprises a sensor for detecting a signal generated from the capture recognition component conjugate.
  • the development trend of the immunoassay system showed the development of solid-phase immunoassay (eg, enzyme-linked immunosorbent immunoassays; ELISA) method using microtiter plates as immobilized homologs, which was applied to various diagnostic and analytical fields.
  • solid-phase immunoassay eg, enzyme-linked immunosorbent immunoassays; ELISA
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent immunoassays
  • BioDetect Test Card for field analysis was introduced.
  • nano biosensor technology which combines nanotechnology and biotechnology, is emerging as a high-tech technology in the 21st century, and research is being actively conducted worldwide, including in Korea, to secure original technologies.
  • the concept of nanosensors which is still at the beginning level, is the concept (Yi Cui et al., Science, Vol. 293, Page 1289-1292, 2001; Jong-in Hahm et al. Nano lett., Vol. 4, Page 51-54, 2004) and vibrating cantilevers Based immunoassays (Y Arntz et al., Nanotechnology, Vol. 14, Page 86-90, 2003) have been reported.
  • Recognition components including antibodies, used in most existing analytical systems, are required to be washed to separate the conjugate after analyte-recognition component binding. At this time, in order to minimize the loss of the formed binder, it is necessary to use a phosphate that has a very low desorption rate. Therefore, the analyte once bound is not dissociated from the recognition component, so most of the sensors cannot be used continuously but only for one-time use.
  • research on non-invasive sensing methods for glucose monitoring has been very active (Ronald T. Kurnik et al., Sensors and Actuators B: Chemical, Vol. 60, Page 19-26, 1999). There is an increasing demand for continuous measurement of relevant indicators, but technical problems do not meet them. However, if the analyte-recognition reaction can be reversibly operated, real-time continuous monitoring is possible for various diseases.
  • biosensors that can be worn or implanted in the body could be developed in the future.
  • biosensors that can be worn or implanted in the body could be developed in the future.
  • it is possible to manage or monitor early diseases such as infectious diseases and adult diseases in high-risk patients (chronic patients, elderly people, etc.) with relatively high probability of disease by continuously measuring and diagnosing biological information.
  • such analytical tool is expected to be an essential tool for future preventive medicine in the era of U-healthcare, which means a healthcare environment that provides 'health care services' based on the ubiquitous computing environment. Anthony PF Turner, Nature Biotechnology, Vol. 15, Page 421-421, 1997).
  • U-healthcare When U-healthcare is realized, 'hospital / treatment center' responds after illness In addition to breaking away from the existing paradigm, chronic diseases and the elderly do not need long-term hospitalization.
  • the present inventors have made intensive studies to overcome the problems of the prior arts. As a result, the present inventors have introduced reversible capture recognition components into the real-time detection apparatus of analytes and continuously recycle them to the concentrations of the analytes participating in reaction. Accordingly, it was confirmed that continuous measurement of the analyte may be possible by generating and measuring a signal in real time, thereby completing the present invention.
  • a main object of the present invention is to provide a real-time continuous detection apparatus of analyte capable of continuously recycling the introduced reversible capture recognition component.
  • Another object of the present invention to provide a real-time continuous detection method of the analyte using the real-time continuous detection device.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening reversible capture recognition components used in the real-time continuous detection device.
  • the present invention provides a real-time detection device including a sample inlet channel, a sample analysis site and a sample discharge channel, wherein the sample analysis site includes a reversible reactive capture recognition component (10) and an analysis in a sample.
  • Substance (11)-Capture Recognition (10) Provides a real-time continuous detection device of the analyte, characterized in that it comprises a sensor for detecting a signal generated from the combination (see Fig. 1).
  • the 'analyte' refers to a substance injected into the surface of the sensor for the purpose of detection using a sensor included in a sample analysis site
  • the 'capturing recognition component' refers to a sensor chip of the sensor. It refers to a substance that is immobilized and can be specifically combined with an analyte.
  • the capture recognition component is an antibody to the antigen or a receptor for the ligand, respectively.
  • the capture recognition component is Each is its antigen or ligand.
  • the reversible reaction capture recognition component is a recognition component (e.g., an antibody) that has both a fast reaction and desorption rate and a high affinity for desorption and adhesion rate, and captures a high adhesion and desorption rate constant value.
  • Recognition components can be used to maintain high analytical sensitivity even when used continuously.
  • 'affinity' can be expressed as the equilibrium adhesion constant, where the equilibrium adhesion constant (K A ) is defined as the adhesion rate constant (k a ) / desorption rate constant (kd).
  • K A the equilibrium adhesion constant
  • kd the adhesion rate constant
  • 'high sensitivity real-time continuous detection' is possible by using an antibody having both a reversible reaction characteristic and a high affinity at the same time.
  • the recognition component with an affinity of lxlO 6 L / mol or less is used only for the reversible reaction characteristics, the detection sensitivity of the detection device is very low at the ⁇ / L level. There is a problem that is difficult to apply. This is because the lower the affinity of the recognition component, the higher the concentration range of the analyte that can be measured.
  • reversible recognition components eg antibodies
  • the affinity will be lowered to below lxlO 6 L / mol. Therefore, in order to obtain a high affinity reversible recognition component as in the present invention, a special screening method should be introduced.
  • the residual activity is first screened with a lower value than the concentration of the recognition component (see Example 1).
  • a fixed sensor e.g., surface plasmon resonance sensor
  • the reversible reactivity capture recognition component in order for the reversible reactivity capture recognition component to meet the object of the present invention, it is desirable to have a fast reaction kinetics and maintain a high affinity of the equilibrium adhesion constant of IX 10 7 L / mol or more, preferably IX 10 8 It is appropriate to maintain a high affinity between L / mol to IX 10 12 L / mol, more preferably between IX 10 9 L / mol and IX 10 12 L / nl.
  • the reversible reaction capture component is preferably an adhesion rate constant 0 when reacted with the analyte in the sample is IX 10 5 L-mof'-sec "1 to IX 10 8 L-mol ⁇ -sec "1 and the desorption rate constant 0 have reversible reaction characteristics ranging from 1 ⁇ 1 ( 3 sec " 1 to lxKT 1 sec "1 and at the same time the equilibrium adhesion constant of the ratio of the two speed constants is 1 10 8 L / mol or more ( K A ) It is characterized by having.
  • both attachment and desorption rate constants are high, so the response time of the detection device is fast, and real-time detection of the analyte is possible, and the equilibrium adhesion constant is also high. So high There is an advantage in providing measurement sensitivity. However, if it is out of range, especially when the desorption rate constant is lower, dissociation of the analyte associated with the capture recognition component is difficult, resulting in very long response time during continuous measurement or harsh conditions to accelerate black dissociation.
  • monoclonal antibodies as typical recognition components for a particular analyte are generally hybridoma methods for immunizing an animal against analyte (Kohler. G et al., Nature, Vol. 256, Page 495-). 497, 1975), genetic recombination methods (HP Fell et al., PNAS, Vol. 86, Page 8507-8511, 1989), phage display methods (Nicholas A. Watkins et al., Vox Sanguinis, Vol. 78, Page 72-79, 2000), but a special process is required to screen for reversible antibodies.
  • a washing process is used to remove excess components remaining after reaction.
  • a screening system equipped with an unlabeled sensor such as a surface plasmon resonance sensor capable of tracking real-time reaction reactions during reaction and cleaning was used.
  • the density of the conjugate formed and dissociated by antigen-antibody-antibody attachment and desorption reaction on the surface From the sensor Measured by time.
  • a screening system based on a surface plasmon resonance sensor was used to select the reversible capture element.
  • an appropriately diluted concentration of antibody solution is injected into the system, the signal increases with time by the binding reaction.
  • washing that is, the change in the binder density at the antibody concentration '0' changes depending on the reversible characteristics of each antibody ( 2).
  • irreversible antibodies Fig. 2, 20E7 that do not desorb during the washing process are absolutely preferred over reversible antibodies (1B5). This is because after washing, it is possible to generate a signal proportional to the analyte concentration from the antigen-antibody conjugate remaining in the solid phase.
  • Antibodies that exhibit reversible reactivity may have a high desorption rate of the antigen-antibody conjugate, which may cause a decrease in the sensitivity of the assay due to a decrease in affinity (equilibrium adhesion constant, K A ).
  • affinity affinity
  • K A affinity
  • high affinity reversible male antibodies generally require k a > IX 10 5 L-mor'-sec "1 , since antibodies with conditions of K A > 1X10 8 L-mol " 1 are generally required to maintain high sensitivity.
  • ⁇ > 1X10— 3 sec Can be defined as an antibody with "1 character.
  • the antibody is serially diluted to a standard concentration and reacted with an antigen immobilized on a surface plasmon resonance sensor to determine the lowest antibody concentration that can detect a signal.
  • This is possible (see Figure 4).
  • the reversible antibody 1B5 reacts with the antigen even in the concentration range below the pg / mL concentration, and this result shows a very high affinity compared with the case of the conventional irreversible antibody.
  • the reversible antibodies used in the results of Figure 4 can be seen that the reaction in the equilibrium different from the fixed antigen in a relatively wide concentration range, it is very suitable for the production of biosensors.
  • the reversible reaction capture recognition component (10) is a biological metabolite, protein, hormone, nucleic acid, cell, food test substance, environmentally harmful substance or defense, which is an analyte 11 in a sample Antibodies, receptors, nucleic acids, enzymes, aptamers, peptides, or molecular prints that can specifically bind CBRs It is characterized in that the film.
  • the senor is a non-labeled sensor 12 (see FIG. 1A) that directly detects a signal generated from an analyte (11) -capture recognition component (10) combination, or
  • An analyte (11) -capture recognition component (10) is characterized in that it is a label sensor (15) which detects via a label (14) which generates a signal in proportion to the binder density (Fig. 1B).
  • the unlabeled sensor measures as a signal the mass on the sensor that changes in proportion to the analyte-capture recognition component combination, the resistance of the vibrator, the surface distortion due to the charge distribution change, and energy transfer.
  • SPR Surface plasmon resonance
  • Cantilever sensor for detecting charge distribution (Hans-Jur gen Butt, Journal of Colloid and Interface Science, Vol.
  • the label sensor further reacts the detection recognition component labeled with a label to measure a signal from the labeling substance in order to generate a signal in proportion to the analyte-capture recognition component combination.
  • the 'detection recognition component' means that the labeled material is physically or chemically bound and specifically reacts with the analyte. Means a possible substance.
  • the spot on the analyte molecule to which the detection recognition component reacts is different from the site where the capture recognition component reacts, so the two components may simultaneously react with the analyte.
  • Phosphors, light emitters, enzymes, metal particles, plastic particles, magnetic particles, etc. are used as the labeling materials for generating signals.
  • Sensors for detecting the fluorescence, luminescence, color development, electrochemistry, and magnetic fields generated therefrom are used as marker sensors.
  • the analyte contained in the sample is continuously introduced into the system through the fluid channel to react with the capture recognition component, and in the case of using the label sensor, the analyte in the sample is labeled. After reacting with the combined detection recognition component in advance, it is continuously introduced into the system through the fluid channel and reacts with the capture recognition component.
  • the sample analysis site is divided by a semi-permeable membrane 16 which can selectively permeate only the analyte 11 in the sample so that the capture recognition component 10 is fixed. It is characterized by forming a recognition reaction cell 17 on the surface side.
  • the recognition reaction cell 17 is a detection recognition component 13 combined with a labeling substance 14 of a size that cannot pass through the semi-permeable membrane 16 in the recognition reaction cell 17 when the labeling sensor 15 is used. It is characterized in that the trapped and recycled.
  • the detection recognition component 13 in the recognition reaction cell 17 is also characterized by having a reversible reaction characteristic in order to be continuously recycled together with the capture recognition component 10.
  • the sample analysis site is a sensor surface fixed capture element
  • the cells can be divided into semi-permeable membranes to form a recognition reaction cell (Fig. 1, d).
  • the analyte contained in the sample is small in size and diffused into the cell through the membrane, but the impurities in the sample are large in size. Can be filtered to prevent contamination of the sensor surface.
  • the installation of such a reaction cell is particularly applicable to the case of a labeling analysis system (Fig.
  • the present invention provides a method for real-time continuous detection of analyte using the real-time continuous detection device comprising the following steps. a) injecting a sample comprising an analyte into a sample analysis site through the sample inlet channel;
  • the signal generated from the analyte-capturing constituent conjugate in step c) is directly detected using a non-labeled sensor, Alternatively, the signal is measured by a label sensor via a label that generates a signal in proportion to the analyte-capture recognition component conjugate density.
  • the analyte included in the sample is introduced into the sample analysis site continuously through the sample inflow channel, and it is characterized in that it reacts with the capture recognition component.
  • the analyte in the sample reacts with the detection recognition component to which the label is bound in advance, and then continuously enters the sample analysis site through the sample inflow channel and reacts with the capture recognition component.
  • Continuous flow exposure type Continuous flow exposure type
  • the analyte in the sample is continuously introduced into the sample analysis site through the sample inlet channel and then reacted with the detection recognition component and the capture recognition component combined with the labeling substance in the recognition reaction cell. It is characterized by.
  • the detection recognition component since the detection recognition component is supplied after reacting with the analyte in advance in the case of the continuous flow exposure type, the detection recognition component has a high irreversible reaction characteristic with high binding stability, or in the case of the recognition reaction cell type, the detection recognition component is also continuous. It is characterized by having a reversible reaction characteristic to be recycled into.
  • the present invention in the case of using the recognition type Sal sensor, the energy transfer between the adjacent fluorescent substance (label material) and the fluorescent energy receptor is interrupted by the reaction of the capture recognition component and the analyte, and thus the fluorescence signal is generated.
  • the labeling agent enzymes known to be inhibited when the analyte immobilized on the enzyme molecule (labelling substance) are combined with the labeling substance can be used to perform the recognition reaction in the liquid phase without immobilizing the capture recognition component on the sensor. Characterized in that it can.
  • the present invention provides a method for screening reversible capture recognition components used in the real-time continuous detection device comprising the following steps.
  • step f) selecting a capture recognition component whose detection signal in step e) is lower than the detection signal in step c).
  • the senor may be a non-labeled sensor selected from a surface plasmon resonance sensor, a cantilever sensor, an optical waveguide sensor, an optical interference sensor, or a nanosensor.
  • the capture recognition component in the step a), is continuously injected by diluting it in a carrier solution, and in step f), the capture recognition in which the signal increased with time decreases. It is characterized by the choice of ingredients.
  • the capture recognition component is repeatedly injected with the washing solution, and in step f), the signal increases with time and returns to the initial baseline. And selecting a capture recognition component in which the signal pattern is repeated.
  • the real-time continuous detection method of the analyte using the same and the method for screening the reversible reaction capture recognition component used therein may have the following advantages.
  • This new concept of detection (or diagnostic) enables real-time monitoring of disease or symptoms, thus overcoming the limitations of disposable performance that can be discarded once used in nearly all existing immunoassay systems. Continuous monitoring of chronic diseases or high risk patients in the human body is possible. Furthermore In the current diagnosis system, it takes a long time to obtain a diagnosis result, and when there is a need to analyze patient condition detection data in the laboratory, there is a large difference in time between the time of examination and the result of the diagnosis, which makes it difficult to accurately diagnose or timely treat the disease. Many problems can be solved.
  • the real-time continuous detection device developed in the present invention and the detection method using the same as a new preventive medicine method of early diagnosis concept satisfy the change of the medical paradigm shifting from the hospital to the demand site, and high risk group such as chronic disease patients and the elderly It enables the development and practical use of continuous diagnostic equipment that allows patient monitoring at all times.
  • the decrease in fertility rate is accelerating entry into an aging society, and the westernization of dietary patterns has led to the spread of various chronic adult diseases, which helps to lead a healthy life through early diagnosis.
  • the continuous diagnosis method can be used as a basic source technology for measuring and diagnosing biometric information in real time by embedding the diagnosis system in a mobile phone, a hospital, a house, or wearing it in the body, especially in the coming U-healthcare era.
  • the real-time continuous detection device of the present invention and the detection method using the same, it can be used to analyze the metabolites, proteins, hormones, nucleic acids, cells, food test targets, environmental harmful substances or defense and defense measurement materials, etc.
  • the product group by sector is summarized as an example.
  • high-risk (chronic, elderly, critically ill) continuous diagnosis system products diabetes patient infection continuous diagnosis system products, cardiovascular recurrence continuous monitoring system products, cancer treatment patients recurrence continuous monitoring system products, and toilet seat health Monitoring system products.
  • it can be applied to artificial organ control such as artificial pancreas control system products.
  • Environmental industries include river water, coastal and marine pollution continuous monitoring system products.
  • As the biological and food industry it can be applied to the bioprocess continuous monitoring system products and the food production process continuous monitoring system products.
  • a change in analyte concentration can be measured in real time by continuously reusing a predetermined amount of reversible reaction capture recognition components.
  • the real-time continuous detection device of the present invention can be used to detect or analyze biological metabolites, proteins, hormones, nucleic acids, cells, food test substances, environmentally harmful substances or defense chemicals and defense materials, and thus, medical, public health, and defense. Applicable to the environment, food, veterinary and biotechnology industries.
  • FIG. 1 is a continuous flow exposure type unlabeled sensor for continuously measuring the concentration of analyte by continuously recycling the capture recognition component 10 in a sample analysis site according to the present invention
  • B continuous flow exposure type indicator sensor
  • C recognition cell type unlabeled sensors
  • D a schematic diagram showing a recognition reaction cell type label sensor.
  • Figure 2 is an illustration of the capture recognition component according to the present invention to analyze the adhesion and desorption reaction characteristics for the antibody (1B5) showing the reversible reactivity produced from the mouse hybridoma clone and the typical irreversible antibody (20E7) To the sensor surface It is a graph measured by a surface plasmon resonance sensor system in which an antigen, an analyte (alpha 2-macroglobulin is used as a model), and a comparison of a rate constant and an equilibrium equilibrium constant determined therefrom.
  • FIG. 3 is a graph comparing cyclic repeat measurement results for testing the feasibility of continuous measurement according to the difference in reaction properties of two antibodies 1B5 and 20E7 using the sensor system of FIG. 2.
  • Figure 4 is a result obtained by reacting the antigens immobilized on the sensor according to the concentration dilution by serial dilution to test the affinity for the antigen of the reversible anticoagulant antibody 1B5 using the sensor system of FIG.
  • FIG. 5 shows that 1B5 antibody, which is a reversible reactive antibody, can be used for medical clinical diagnosis, and then immobilized 1B5 antibody on the sensor surface and reacted with the fixed antibody according to the increase in concentration. This is a comparison of the results obtained using (A) phosphate buffer solution and (B) human serum.
  • FIG. 6 is a signal amplification obtained by additionally introducing a polymer between the gold colloid particles having a diameter of 30 nm as the labeling material 14 and the irreversible antibody 20E7 as the detection recognition component 13 to improve the analytical sensitivity of the sensor system of FIG. 5. The result is.
  • FIG. 8 illustrates the continuous plasmon resonance sensor system in which antibody 1B5 is immobilized on the sensor surface to illustrate the recycling of reversible anticoagulant antibody in continuous measurement mode. 2 repetitions (A) Concentration response obtained from sensor for standard changes and (b) Standard curve plotted with graph.
  • one of the key elements of sensor technology is the real-time continuous detection system (or real-time continuous detection system).
  • the sensor types can be largely classified into unlabeled and labeled sensors.
  • unlabeled sensors such as plasmon resonance sensors, cantilever sensors, or optical waveguide sensors.
  • a method of measuring surface plasmon resonance which is a charge density wavelength generated by light at a metal and dielectric medium interface, is typical. Since the surface plasmon resonance interacts in close proximity with the metal surface, the change of optical properties due to the recognition reaction in this region affects the incident angle of light causing the surface plasmon resonance (J. Homo la et al. , Sens. Actuators B, Vol. 54, Page 3-15, 1999). Therefore, the change in the incident angle of light that causes surface plasmon resonance by the reaction between the analyte and the recognition component on the sensor surface is measured as a signal.
  • the detection sensitivity component (13) combined with the labeling substance (14) was further introduced to increase the change in mass of the reaction reaction conjugate between the analyte (11) and the capture recognition component (10).
  • a signal amplification method can be used.
  • the irreversible antibody 20E7 was selected as the detection recognition component (13) to physically bind to the gold colloid particles having a diameter of 30 nm, and the binder was previously reacted with the standard solution of analyte and injected into the sensor. It was measured (see Example 7).
  • irreversible antibody 20E7 can react simultaneously with reversible antibody 1B5 for the analyte.
  • the signal amplification method was able to detect at least 0.001 ng / mL of the analyte, thereby improving the analysis sensitivity by about 100 times (FIG. 6).
  • the pattern of change in concentration may vary depending on the type of analyte or onset of symptoms. Continuous mode '(see Example 10). Similar to the response to exponential changes, the sensor showed similar analytical performance for arithmetic analyte concentration changes (FIG. 9). Furthermore, because of their sensitive and rapid response to small concentration changes, reversible antibody-based biosensors are expected to be widely applicable to the measurement of analytes that require very accurate analysis in the future.
  • alpha 2-macroglo as an analyte for illustrating continuous diagnosis.
  • Blin was selected and a continuous diagnostic technique was illustrated by producing a reversible antibody specific for this substance.
  • Macroglobulin can be used as a biomarker for the treatment and recurrence of three different diseases, especially nephrotic syndrome, early diagnosis of Alzheimer's disease, and clinical diagnosis of inflammatory reactions and complications after transplantation.
  • Nephrotic syndrome is a renal disease in which only 90% of children develop a disease in the urine, and protein is lost due to glomerular abnormalities in the kidney (Daniel A. Blaustein et al., Primary Care Update for OB / GYNS, Vol. 2, Page 204-206, 1995). Patients often develop swelling in their bodies or legs, and depending on the situation, they may develop kidney sclerosis, kidney failure, and cancer. The disease is diagnosed by a complete blood count (CBC), liver function tests, renal function tests, blood protein tests such as mark gloglobulin, and urine tests. When diagnosed with nephrotic syndrome, immunosuppressive agents (prednisone) or steroids are administered for 1-6 months for treatment.
  • prednisone immunosuppressive agents
  • steroids are administered for 1-6 months for treatment.
  • macroglobulin as a biomarker is the presence of Alzheimer's disease in about 60 to 70 people, and 50% of people over 85 years of age.
  • the London King's College research team Tests show two types of protein, complement factors, from patients with Alzheimer's disease
  • Acute and chronic human disease including the diseases illustrated above, generally progresses relatively slowly, either in hours or days, so the response time of sensors measuring disease marker biomarkers is usually required in minutes. This means that if the sensor response time is 10 times faster than the disease progression time, the disease progression will be a biomarker continuous diagnosis process. Since it is the governing rate step, the macroglobulin concentration response time of the sensor shown in FIGS. 8 and 9 (about 15 minutes; based on 95% of the final response) satisfies the continuous detection condition. The quicker sensor response time (e.g., seconds) has no effect on the performance of the analysis during continuous diagnostics, and it is the effect of shortening the measurement time for the sample taken in the case of a disposable sensor (e.g. blood glucose sensor) with a different concept. It just provides
  • phosphor is most often used as a signal source, and the capture recognition component (10) is fixed on the solid surface (I and D in FIG. 1) or liquid phase reaction is performed in the recognition reaction cell (17).
  • a fluorescent material which is a signal source, is absorbed when a certain energy receptor is present in close proximity and thus does not emit light (Shaw et al., J. Clin). Pathol, Vol. 30, Page 526-531, 1977).
  • recognition reactions such as antigen-antibody attachment can be designed to regulate energy transfer between the phosphor and the energy receptor, and the fluorescence signal can be detected using photodetectors (photodiodes, charge-coupled devices, photomultiplier tubes, etc.). do.
  • photodetectors photodiodes, charge-coupled devices, photomultiplier tubes, etc.
  • an enzyme may be used as a labeling substance.
  • the activity is inhibited when the capture recognition component (10) immobilized on the surface of the sensor is used (A and D in FIG. 1) or when the antibody is attached to the enzyme molecule.
  • liquid reaction can be performed in the recognition reaction cell (17). These enzymes are known to inhibit the activity of enzymes by binding to analytes (ie, antigens) and reacting with antibodies for immunoassays (Se-Hwan Paek et al., Biotechnology and bioengeering, Vol. 56, Page 221-231, 1997).
  • Signals from enzymes can vary from absorbance sensors (spectrophotometers), light-receiving sensors (photodiodes, charge-coupled devices, photomult ipl ier tubes, etc.), and electrochemical sensors (electrodes), depending on the chosen enzyme and substrate. Can be measured by means.
  • magnetic particles may be used as a label, and using the capture recognition component (10) fixed to the surface of the sensor (b) of FIG. 1), magnetic field measurement of the reaction between the analyte and the recognition component may be performed.
  • Magnetic field measurement sensors are typical of GMR / TMR and Hall devices. They are low power consumption, small size, light and integrated.
  • the concentration response time of the continuous diagnostic system exemplified is 10 minutes based on 95% of the final response. It is not applicable to the measurement of analyte whose concentration changes in seconds. Can be. It is particularly suitable for analytical subjects that require an alarm if the concentration exceeds a specified upper limit. Applicable areas include continuous diagnosis and disease control for diseases and conditions, continuous detection of biological terror agents, continuous monitoring of environmental pollution, and continuous monitoring of biological processes.
  • Mouse monoclonal antibodies (20E7, 3D1; irreversible reaction) and alpha 2-macroglobulin (a tetramacroulin) were supplied from Abifront Tier (Korea).
  • Bovine serum albumin, sodium acetate, sodium phosphate, sodium chloride, glycine, human serum (AB plasma), casein, gold nanoparticle (30 nm), anti Mouse goat antibody -horseradish peroxidase (HRP) polymer, and 3,3 ⁇ 5,5 ⁇ -tetramethylbenzidine (TMB) were purchased from Sigma (USA).
  • the total IgG antibody quantitative kit (mouse IgG core ELISA) was supplied from Coma Biotech (Korea). All other reagents were used for analytical grade.
  • hybridoma cells producing monoclonal antibodies is standard. It was carried out according to the law. Specifically, 6-week-old female BALB / c mice were immunized by injecting alpha 2-macroglobulin with an immunogen into the abdominal cavity and boosted three times at two-week intervals. On the third day after the third boost, the spleen cells obtained from the sacrifice of mice were subjected to cell fusion with a myeloma cell line (Sp2 / 0-Agl4), from which hybridoma cells were selected.
  • a myeloma cell line Sp2 / 0-Agl4
  • a total of 384 clones were prepared for the hybridoma cells, and the antibody-containing culture solution produced from each clone was used for the immunoreactivity test and determination of the amount of IgG antibody.
  • clone cultures were placed in 96-microplate wells fixed with alpha 2-macroglobulin (2.5 yg / mL) diluted with 10 mM phosphate buffer solution (including 140 mM NaCl; pH 7.4). I moved each one back. After washing, the anti-mouse goat antibody-HRP polymer (1 / 5,000) diluted with 0.5% casein containing 10 mM phosphate solution (casein-PBS) was reacted.
  • BIACORE CM5 purchased as a surface plasmon resonance sensor chip, activated the chip surface using 100 mM NHS and 400 mM EDC according to the protocol provided by the manufacturer.
  • BIACORE 2000 The operation of the surface plasmon resonance sensor system (BIACORE 2000; GE healthcare, Sweden) followed the BIACORE 2000 usage protocol provided by the manufacturer and selected phosphate buffered black human serum as the running buffer according to the test purpose.
  • BIACORE CM5 was purchased as a sensor chip to be installed in the sensor system, and serum albumin was attached to the fluid channel 1 as a control and the ligand was chemically fixed to the fluid channel 2.
  • the pure signal value was obtained by subtracting the noise value of channel 1 from the signal unit (RU) of channel 2 by maintaining the flow direction from channel 1 to channel 2. .
  • the temperature in the reaction cell was maintained at 25 ° C. in all examples.
  • Example 3 Reversible Reflex Antibody Screening Using Surface Plasmon Resonance Measurement System
  • bovine serum albumin was immobilized at 100 pg / mL in fluid channel 1 as described in Example 2 and A sensor chip was prepared in which alpha 2-macroglobulinol was fixed at a concentration of 100 ug / mL in a fluid channel. This After mounting the sensor chip prepared in the surface plasmon resonance measurement system, the equilibrium state was maintained by injecting 10 mM complete phosphate solution at a rate of 5 ⁇ using a sample carrier solution.
  • Example 1 seven hybridoma clones selected by antibody reactivity test and total IgG antibody amount determination were appropriately diluted with 10 mM complete phosphate solution (PBS, pH 7.4).
  • 10 mM complete phosphate solution PBS, pH 7.4
  • 35 IJL of each antibody sample was injected into the sensor chip mounted in the sensor system for 420 seconds to induce adhesion reaction, and then injected for 210 seconds with phosphate buffer solution. Induced.
  • 15 ⁇ L of a 10 mM glycine complete solution pH 1.5 was continuously injected for 180 seconds to regenerate the sensor surface.
  • Adhesion and desorption reaction patterns were analyzed using an editing program (BIAevaluation 2.0) provided by the manufacturer and the adhesion rate constant a), desorption rate constant and equilibrium adhesion constant (K A ) were calculated.
  • the table below shows the adhesion rate constants (k a ), desorption rate constants (k d ) and equilibrium adhesion constants (K A ) of the seven hybridoma clones tested.
  • the repetition reaction pattern of the reversible reaction 1B5 antibody was obtained and compared with the pattern of the irreversible reaction 20E7.
  • Antibody solution 100 ng / mL 1B5 or 20 ng / mL 20E7
  • 10 mM complete phosphate solution (17.5 uLol) was injected into the sensor chip for 210 seconds at 5 uL / min flow rate to induce adhesion reaction.
  • Desorption board for 110 seconds by injecting complete layer solution Induced response. Repeated six times for each antibody under these same attachment / desorption reaction conditions.
  • the 20E7 antibody which was expected to exhibit irreversible reaction characteristics, showed a relatively slow but sustained reaction response for a specified time after the antibody supply, and the desorption reaction was not completed when the phosphate buffer solution was supplied. Therefore, antigen-antibody reaction conjugates gradually accumulate in response to repeated attachment / detachment reactions, resulting in a stepwise increase in signal.
  • Example 5 Determination of the Lower Concentration of Reversible Reactive Antibodies
  • Example 3 the response of the surface plasmon resonance sensor to the concentration change of the reversible reaction 1B5 antibody was measured.
  • 1B5 antibody was ligated in concentrations ranging from 0.5 pg / mL to 0.5 ug / mL using 10 mM phosphate buffer. 17.5 of each diluted antibody solution was injected for 210 seconds at a flow rate of 5 ⁇ m to induce an adhesion reaction, and then a phosphate buffer solution was injected for 110 seconds to induce a desorption reaction. Under the same conditions, the solution was analyzed in the order of the high concentration solution from the low concentration antibody solution, and then in the reverse order, and subjected to one cycle test. Circulation After the hum was completed, the sensor surface was regenerated in the same manner as in Example 4.
  • the signal of the surface plasmon resonance sensor within the range of antibody concentration used was increased proportionally when the concentration of the antibody solution was increased in steps and decreased proportionally when the concentration was decreased in steps.
  • the antibody concentration range of pg / mL or less appeared to react with the antigen immobilized on the sensor chip, which is inferior in terms of affinity when compared to the irreversible antibody used in the existing immunoassay. Therefore, an immunoassay system equipped with an antibody having reaction properties such as 1B5 is expected to show excellent analyte sensitivity, and since the antibody exhibits reaction reaction from pg concentration unit to unit, it is widely used in future production of immune sensor. The measuring range is expected.
  • Example 6 Reversible Anticoagulant Antibody-Based Unlabeled Immune Sensor System
  • a continuous flow exposure type unlabeled sensor (A) of FIG. 1 for the measurement of alpha 2-macroglobulin using a reversible anticoagulant antibody BIACORE having a surface plasmon resonance sensor system (BIAC0RE 2000) and a reversible reactive antibody immobilized CM5 sensor chip was used.
  • the right serum albumin was fixed at a concentration of 100 ⁇ g / mL in the fluid channel 1
  • a sensor chip was prepared by fixing the reversible semicoagulant 1B5 antibody at a concentration of 10 ug / mL in the fluid channel 2.
  • macroglobulin an analyte that specifically reacts with the antibody immobilized on the sensor surface
  • 10 mM phosphate buffer solution to prepare a standard sample in the concentration range of 0-10 ng / mL.
  • Each standard sample 150 uL was injected into the sensor chip mounted in the sensor system for 900 seconds at a flow rate of 10 ⁇ L / min to induce an adhesion reaction, followed by injection of a complete phosphate solution for 120 seconds to induce desorption reaction.
  • the sensor surface was regenerated as in Example 4, The experiment was repeated under the same conditions described above using human serum as a diluent and sample carrier instead of the phosphate buffer solution.
  • Gold colloid (diameter: about 30 nm) suspensions were prepared by standard methods using sodium citrate as reducing agent (LJL Dykman, AA Lyakhov, VA Bogatyrev, SY Chchyogolev. Colloid, 60, 700, 1998). Specifically, 1,000 mL of tertiary deionized water was added to the glass flask, and 20 mL of 1% gold chloride solution (tetrachloroauric acid) was added thereto. It was boiled and the solution using a hot plate to aid banung, 0.2 ⁇ ⁇ ⁇ the filter was added to the 1% sodium citrate solution 40 mL was filtered using as a reducing agent to make the gold colloid. Sodium citrate Immediately after addition the solution turned from pale dark to red. After heating for 10 minutes, the reaction was stopped and slowly deformed at room temperature and stored for long periods.
  • sodium citrate sodium citrate
  • the prepared gold nanoparticle suspension (0.5 m carbonate complete solution (pH 9.6; 1 uL) was added to 1 mU and adjusted to pH 8.0.
  • 20E7 (see FIG. 2), an irreversible anticoagulant antibody, was prepared in 10 mM complete phosphate solution.
  • PB does not contain NaCl
  • PB did not contain NaCl
  • the concentration response of the analysis system employing the signal amplification step is an embodiment Compared to the concentration response of the unlabeled sensor system obtained in Fig. 6, it showed a significantly increased form, and in fact, the sensitivity of analysis was about 100 times improved from 0.1 ng / mL level (see Fig. 5b) to 0.001 ng / niL level. .
  • the signal amplification method exemplified in the present invention it is possible to measure analytes present in very low concentrations in a sample. Therefore, the continuous detection method using reversible antibodies can be widely applied to various analyte measurements.
  • the microfluidic flow rate was reduced to 1/10 of the previous experimental conditions to obtain the concentration response of the analysis system.
  • the same sensor chip as in Example 6 was used and the experiment was also performed under the same conditions except for the reduction of the flow rate.
  • Human serum was used as the sample carrier solution and the standard sample diluent solution, and the flow rate was maintained at 1 ⁇ .
  • a standard sample was prepared in the concentration range of 0-100 ng / mL, and a sample (15 U L) was injected into the sensor chip to induce adhesion reaction for 900 seconds, followed by injection of phosphate buffering solution to induce desorption reaction for 420 seconds. It was. Standard samples were analyzed in the form of circulation from low to high concentration and then back to low concentration. Operation of the analysis system and data editing were performed in the same manner as in Example 4, and after the analysis was completed, the sensor surface was regenerated as shown.
  • the reset mode in which the sample carrier solution (not including the analyte) is injected between each sample analysis is used to measure the reaction of the reversible reaction antibody in the present embodiment.
  • Sample continuous analysis mode was used to illustrate.
  • the sensor chip was prepared in Example 6, and the macroglobulin was diluted with human serum to prepare a standard sample ranging from 0.01 to 10,000 ng / mL.
  • a standard sample was sequentially injected into the sensor chip at a flow rate of 1 ⁇ , and the concentration response from the sensor was continuously measured for two iterations of the cycle change in which the analyte concentration increased and decreased tenfold stepwise every 900 seconds. Obtained.
  • sample injection was performed using the sample carrier solution supply passage rather than through the inlet.
  • a predetermined analyte concentrate or diluent was added to the previous residual sample solution to prevent boiling or air from entering the standard sample, and then adjusted to the standard concentration of the next sample. All.
  • the spilled samples were collected by a preparative device, and each fraction was analyzed by the sandwich enzyme immunoassay using the microwell plate as an immobilization parent to confirm the analyte concentration of the standard sample.
  • the assay was performed by adding 3D1 monoclonal antibody (1 yg / mL; 100 yL) irreversible to alpha 2-macroglobulin diluted with 10 mM complete phosphate solution (including 140 mM NaCl; P H 7.4). Fixed. After washing, 200 iL of 0. casein-containing 10 mM complete phosphate solution (casein-PBS) was added to block the unwell fixed remaining surface.
  • the concentration of each standard sample calculated and set in advance for continuous measurement was collected, and there was a difference within 10% between the calculated value and the analysis result. It was used for graphing.
  • the sensor response to an increase or decrease in the concentration of analyte in a standard sample injected into the sensor at a given microfluidic flow rate (1 mL / min) is equilibrium within 15 minutes. Reached and exhibited high reproducibility in two replicate cycles (A of FIG. 8; tested at a concentration range of 0.01-100 ng / mL).
  • the concentration change pattern (exponential black or arithmetic) of concentration at the time of onset or symptom expression may be different so that the sensor responds to the arithmetic concentration change that increases or decreases by 2 times or less. Measurements were made in continuous mode as in 9. In this experiment, an optimal condition was ultimately considered in diagnosing pediatric kidney cancer in which alpha 2-macroglobulin selected as a model analyte can be used as a biomarker.
  • the standard sample was prepared by diluting the analyte with casein -PBS to minimize the amount of serum samples, and the concentration range was determined to be in the range of 1-20 ng / mL to maintain the optimal analytical performance. Each standard sample was injected into the sensor chip at 1800 second intervals and the flow rate was adjusted to 1 ⁇ .
  • the sensor's response to the continuous concentration change at the arithmetic level showed rapid response time and continuous measurement reproducibility as well as for the exponential change.
  • the reversible reaction antibody-based biosensor which is sensitive and rapid to small concentration changes, requires very accurate analysis in the future. It is expected to be widely applicable to the measurement of analytes.
  • the clinically effective concentration range of alpha 2-macroglobulin ranges from 3 to 10 mg / mL, which requires 1.44 mL per day (based on l iiL / min injection rate) when serum samples are used for continuous measurements.
  • a change in analyte concentration can be measured in real time by continuously recycling a predetermined amount of reversible reaction components.
  • recyclable antibodies that react rapidly and reversibly according to the concentration of analyte can significantly simplify components and manufacturing methods compared to conventional disposable diagnostic chips.
  • real-time monitoring of the disease or condition is possible, thereby enabling continuous monitoring of patients with chronic diseases or high risk.
  • artificial organ controllers, continuous detection systems for biological terror agents, continuous detection systems for common infectious pathogens, continuous monitoring system for environmental pollutants, continuous monitoring system products for biological processes, continuous monitoring system products for food production processes, etc. Can be applied.

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Abstract

본 발명은 시료 유입 채널, 시료 분석 사이트 및 시료 배출 채널을 포함하는 실시간 검출장치에 있어서, 상기 시료 분석 사이트는 가역반응성 포획 인식성분 및 시료내의 분석물질-포획인식성분 결합체로부터 발생된 신호를 탐지하는 센서를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출장치에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 일정량의 가역반응성 포획 인식성분을 연속적으로 재활용하여 분석물질 농도 변화를 실시간 측정할 수 있다. 본 발명의 실시간 연속 검출장치는 생명체 대사물질, 단백질, 호르몬, 핵산, 세포, 식품검사대상 물질, 환경 유해물질 또는 국방 화생방 측정물질 등을 검출 또는 분석하는데 활용이 가능하므로 의료, 공중보건, 국방, 환경, 식품, 수의, 생명공학 산업에 응용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
실시간 연속 검출장치
【기술분야】
본 발명은 실시간 연속 검출장치에 관한 것으로， 더욱 구체적으로 시료 유입 채널， 시료 분석 사이트 및 시료 배출 채널을 포함하는 실시간 검출장치에 있어서， 상기 시료 분석 사이트는 가역반응성 포획 인식성분 및 시료내의 분석물 질-포획인식성분 결합체로부터 발생된 신호를 탐지하는 센서를 포함하는 것을 특 징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출장치에 관한 것이다.
【배경기술】
보건의료분야 뿐만 아니라 식품， 환경， 수의， 국방과 같은 다양한 분야에 서 구조가 복잡한 유기물질 특히 단백질， 호르몬， 핵산， 세포 등의 탐지에 항원- 항체 부착과 핵산접합과 같은 독특한 인식반웅을 이용한 분석방법이 사용된다. 이것은 생체 인식반응의 높은 특이성과 친화력 그리고 분석원리의 보편성에 기인 하며， 이를 응용하여 다양한 형태의 분석시스템이 개발되어왔다 .
그 예로서， 면역분석시스템의 개발동향을 보면 microtiter plate를 고정 화모체로 사용하는 고상면역분석 (예: enzyme-linked immunosorbent immunoassays; ELISA) 방법의 개발로 다양한 진단 및 분석분야에 응용하는 계기 가 되었으며 (Irina Ionescu-Mat iu 등， J Virol Methods , Vol . 6(1)， Page 41-52, 1983； Christopher Heeschen 등， Clinical chemistry, Vol . 45(10), Page 1789-1796 , 1999)， 세공성 membrane 기반의 무시약 속성 진단키트의 출시는 가 정 등 장소에 제한 없이 면역분석을 가능하게 하였다 (R. Chen 등， 1987， Clin. Chem. Vol. 33， Page 1521-1525； M.P.A. Laitinen, 1996， Biosens. Bioelectron. , Vol. 11, 1207-1214； S. C. Lou 등， 1993, Clin. Chem. , Vol. 39， 619-624； S. H. Paek 등, Methods Vol. 22， Page 53-60, 2000； S. H. Paek 등， BioChip J. Vol. 1， Page 1-16 , 2007) .
다른 한편으로는 병원 임상시험실 등 전문기관에서 정밀검사에 사용하는 자동화 진단기기가 보급되었으며， 핵산서열을 결정하거나 단백질의 발현정도를 정량적으로 분석할 수 있는 바이오센서 어레이칩 그리고 나아가서는 미세자동분 석을 위해 시료의 전처리 등 순차적 연속공정을 수행하는 랩온어칩의 개발이 활 발히 연구되고 있다 (Kyeong-Sik Shin 등， Analytical Chimica Acta Vol . 573-574, Page 164-171, 2006). 실용화 예로서， CombiMatrix 사 (미국)의 지노믹 스 연구용 Custom Array, Nanosphere 사 (미국)의 단일핵산변이 (SNP) 측정 용 Verigene ID platform, Af fyMetrix 사 (미국)의 GeneChip System, Integrated NanoTechnologies 사 (미국) 현장분석용 BioDetect Test Card등이 소개되었다. 최근， 나노기술과 생명공학 기술이 융합된 나노 바이오센서 기술이 21세 기의 첨단 기술로서 새롭게 각광받고 있으며 이에 관련된 원천기술을 확보하고자 국내를 포함하여 전 세계적으로 연구가 활발히 진행되고 있다. 여러 기관에서 바 이오센서의 초고감도 기술개발에 집중하고 있지만 그 기술수준이 아직 초보단계 인 나노센서 개념 (Yi Cui 등, Science, Vol. 293, Page 1289-1292, 2001； Jong- in Hahm 등， Nano lett. , Vol. 4， Page 51-54， 2004) 및 진동형 캔틸레버 기반 면역분석 (Y Arntz 등, Nanotechnology, Vol. 14， Page 86-90, 2003) 등이 보고된 바 있다.
이와 같은 대부분의 기존 분석시스템에 사용되는 항체를 비롯한 인식성분 들은 분석물질-인식성분 결합 후 그 결합체를 분리하기 위해 세척과정이 필수적 이다. 이때 형성된 결합체의 유실을 최소화하기 위해 탈착속도가 매우 느린 인 식성분올 사용하여야 하므로 한 번 결합한 분석물질이 인식성분으로부터 해리되 지 않아 대부분 센서를 연속적으로 사용하지 못하고 1회용으로만 사용한다. 최근 들어 글루코오스 모니터링에 있어 무침습 센싱 방법에 대한 연구가 매우 활발하 며 (Ronald T. Kurnik 등， Sensors and Actuators B: Chemical , Vol . 60, Page 19-26, 1999)， 특히 병원 중환자의 질병에 관련된 지표물질에 대한 연속적인 측 정에 대한 요구가 커지고 있으나 기술적 문제로 요구를 충족시키지 못하고 있다. 하지만， 분석물질-인식성분 간 반응을 가역적으로 운용할 수 있을 경우 다양한 질환에 대해 실시간 연속 모니터링이 가능하게 된다.
분석물질에 대한 연속측정이 가능할 경우， 미래에는 인체에 착용하거나 체내 이식이 가능한 바이오센서가 개발될 수 있다. 이러한 센서를 이용하면 생체 정보를 연속적으로 측정하고 진단함으로서 질환발생 확률이 상대적으로 높은 고 위험군 (만성질환자， 노인 등) 환자에 대해 감염병이나 성인병 등 호발질환을 조 기에 관리 내지 감시하는 것이 가능하게 된다. 따라서 이러한 분석도구는 유비쿼 터스 컴퓨팅 환경을 기반으로 '언제' , '어디서나' 의료서비스를 제공하는 헬 스케어 환경을 의미하는 U-헬스케어 시대에서 미래 예방의학을 위한 필수도구가 될 것으로 판단된다 (Anthony PF Turner , Nature Biotechnology, Vol. 15， Page 421-421, 1997) . U-헬스케어가 실현되면 질병 후에 대응하는 '병원 /치료 중심 ' 의 기존 패러다임에서 탈피하게 될 뿐만 아니라 만성질환자와 노인 등이 장기입 원을 하지 않아도 된다.
이에， 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예 의 연구노력한 결과, 분석물질의 실시간 검출장치에 가역반응성 포획 인식성분을 도입하고 이를 연속적으로 재활용하는 경우 반웅에 참여하는 분석물질의 농도에 따라 실시간으로 신호를 발생시키고 측정함으로써 분석물질에 대한 연속측정이 가능할 수 있음을 확인하고， 본 발명을 완성하게 되었다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
따라서， 본 발명의 주된 목적은 가역반응성 포획 인식성분이 도입되어 이 를 연속적으로 재활용할 수 있는 분석물질의 실시간 연속 검출장치를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 실시간 연속 검출장치를 이용한 분석물질의 실시간 연속 검출방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 실시간 연속 검출장치에 사용되는 가 역반응성 포획 인식성분의 선별방법을 제공하는 데 있다.
【기술적 해결방법】
본 발명의 한 양태에 따르면， 본 발명은 시료 유입 채널， 시료 분석 사이 트 및 시료 배출 채널을 포함하는 실시간 검출장치에 있어서， 상기 시료 분석 사 이트는 가역반응성 포획 인식성분 (10) 및 시료내의 분석물질 (11)-포획인식성분 (10) 결합체로부터 발생된 신호를 탐지하는 센서를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출장치를 제공한다 (도 1의 가 참조).
본 발명에서, 상기 '분석물질' 이란 시료 분석 사이트에 포함되어 있는 센서를 사용하여 검출하고자 하는 목적으로 센서 표면으로 주입시키는 물질을 의 미하며, '포획인식성분' 이란 상기 센서의 센서칩 상에 고정화되어 있으면서 분 석물질과 특이적으로 결합 가능한 물질을 의미한다.
예를 들어， 분석물질이 항원 또는 리간드인 경우 포획인식성분은 각각 그 항원에 대한 항체 또는 그 리간드에 대한 수용체이며， 역으로 분석물질이 항원에 대한 항체 또는 리간드에 대한 수용체인 경우 포획인식성분은 각각 그 항원 또는 리간드이다.
본 발명에서， 상기 가역반웅성 포획 인식성분은 탈착 및 부착 속도가 모 두 빠른 반응 역학 특성을 가지며 또한 고친화력을 갖는 인식성분 (예: 항체)올 말하는데, 높은 부착 및 탈착 속도상수 값을 지닌 포획 인식성분을 이용하면 연 속적으로 사용하여도 높은 분석 민감도를 유지할 수 있다. 여기서 '친화력' 은 평형부착상수로서 표시할 수 있는데， 평형부착상수 (KA)는 부착속도상수 (ka)/탈착 속도상수 (kd)로 정의된다. 본 발명에서는 가역반응특성과 고친화력을 동시에 지 닌 항체를 사용함에 따라 '고감도 실시간 연속검출' 이 가능하게 된다.
만약 가역반응특성만을 위하여 친화력이 lxlO6 L/mol 이하인 인식성분을 이용하게 된다면， 검출장치의 측정민감도가 μηιοΙ/L수준으로 매우 낮아서 대부분 의 질병이나 증세의 징후를 나타내는 바이오마커 분석물질의 검출에는 적용하기 어려운 문제점이 있다. 이것은 인식성분의 친화력이 낮을수록 측정 가능한 분석 물질의 농도범위가 높아지기 때문이다. 예컨대， 가역반응성 인식성분 (예: 항체) 의 부착속도상수를 낮추거나 일정하게 유지하되 탈착속도상수를 너무 높힌 성분 을 사용한다면 친화력이 lxlO6 L/mol 이하로 낮아지게 된다. 따라서， 본 발명에 서와 같이 고친화력의 가역반응성 인식성분을 얻기 위해서는 특별한 선별방법이 도입되어야 한다. 예를 들어， 고정된 항원과 인식성분이 결합 후 중성 완충용액 으로 세척 시 잔존 활성이 인식성분 농도 대비 낮은 값을 지닌 인식성분을 1차 선별하고 (실시예 1 참조)， 이것에 대해 다시 항원이 고정된 센서 (예: 표면 플 라즈몬 공명 센서)를 이용한 부착속도상수 및 탈착속도상수를 측정하여 2차 선별 을 실시함으로서 (실시예 3 참조) 고친화력의 가역반웅성 인식성분을 효과적으로 생산할 수 있다.
따라서 상기 가역반응성 포획 인식성분이 본 발명의 목적에 부합하기 위 해서는， 빠른 반웅 역학 특성을 갖고 또한 평형부착상수가 IX 107 L/mol 이상의 고친화력을 유지하는 것이 좋으며， 바람직하게는 IX 108 L/mol 내지 IX 1012 L/mol, 더욱 바람직하게는 IX 109 L/mol 내지 IX 1012 L/n l의 고친화력을 유지하 는 것이 적당하다.
본 발명의 실시간 연속 검출장치에서， 상기 가역반웅성 포획 인식성분은 바람직하게는 시료 내 분석물질과 반응 시 부착속도상수 0 는 IX 105 L-mof'-sec"1 내지 IX 108 L-mol^-sec"1, 그리고 탈착속도상수 0 는 1Χ 1( 3 sec"1 내지 lxKT1 sec"1 범위의 가역반웅 특성을 가지며 동시에 두 속도상수의 비율 이 1 108 L/mol 이상의 평형부착상수 (KA)를 가지는 것을 특징으로 한다.
이와 같은 특징을 지닌 포획 인식성분을 연속 검출장치에 사용하면 두 부 착 및 탈착 속도상수가 모두 높으므로 검출장치의 웅답시간이 빨라 분석물질의 실시간 검출이 가능하게 될 뿐만 아니라 평형부착상수가 또한 높으므로 고도의 측정민감도를 제공하는 장점이 있다. 그러나 범위를 벗어날 경우 특히， 탈착속도 상수가 더 낮을 경우 포획 인식성분과 결합된 분석물질의 해리가 어려워 연속측 정 시 매우 긴 응답시간이 초래되거나 흑은 해리를 가속시키기 위해 가혹조건
(예: 산성 pH)의 사용이 불가피하여 실시간 검출이 원천적으로 불가능하게 된다. 또한 부착 및 탈착 속도상수가 주어진 범위에 있더라도 평형부착상수가 설정된 범위보다 더 낮을 경우 위에서 지적한 바와 같이 분석민감도가 낮아지게 되어 실 질적인 웅용이 극히 제한된다.
상기 가역반응성 포획인식성분에서， 특정 분석물질에 대한 전형적인 인식 성분으로서 단일클론 항체는 일반적으로 분석물질에 대해 동물을 면역화 시키는 하이브리도마 방법 (Kohler. G 등， Nature, Vol. 256, Page 495-497, 1975) , 유전 자 재조합 방법 (HP Fell 등， PNAS, Vol. 86， Page 8507-8511, 1989)， phage display 방법 (Nicholas A. Watkins 등， Vox Sanguinis, Vol. 78， Page 72-79, 2000) 등을 통해 생산될 수 있지만 가역반웅성 항체를 선별하기 위해서는 특별한 과정이 요구된다. 항체선별 방법으로 널리 사용되고 있는 고상면역분석에서는 반웅 후 잔존하는 과잉성분을 제거하기 위해 세척공정을 사용하므로 세척 시 반 웅결합체가 쉽게 해리되는 가역반웅성 항체의 경우에는 선별이 어렵다. 본 발명 에서는 이러한 문제를 해결하기 위해 일례로서， 반웅 및 세척 시 실시간 반웅결 합을 추적할 수 있는 표면 플라즈몬 공명 센서와 같은 비표지 센서가 장착된 선 별시스템을 사용하였다.
상기 분석물질을 센서표면에 고정시킨 후 생산된 항체를 운반용액에 희석 하여 연속적으로 주입한 후 동일한 운반용액으로 세척하면 표면에서의 항원 -항체 간 부착 및 탈착반웅에 의해 형성되고 해리되는 결합체의 밀도가 센서로부터 실 시간으로 측정된다.
본 발명의 구체적인 일례에서는， 상기 가역반응성 포획 인식성분을 선별 하기 위하여 표면 플라즈몬 공명 센서 기반의 선별시스템을 이용하였다. 적절히 희석된 일정 농도의 항체용액을 시스템 내로 주입하면 결합반응에 의해 신호가 시간에 따라 증가하는데 세척 시 즉， 항체농도 '0' 에서 결합체 밀도의 변화는 각 항체의 가역반응 특성에 따라 변화된다 (도 2 참조). 기존 대부분의 면역분석 에서는 세척공정을 겪는 동안 탈착되지 않는 비가역성 항체 (도 2， 20E7)가 쉽게 탈착되는 가역성 항체 (1B5) 보다 절대적으로 선호되었다. 이것은 세척 후 고상 에 잔존한 항원 -항체 결합체로부터 분석물질 농도에 비례한 신호를 발생시킬 수 있기 때문인데, 이와 같은 분석시스템에서는 항체를 재활용하기 어렵고 연속측정 이 원천적으로 불가능하다. 그러나 시료 내 분석물질 농도와 역학적 평형상태로 부착과 탈착이 신속한 가역반응성 항체 (1B5)를 사용하면 항체를 연속적으로 재활 용할 수 있고 따라서 분석물질의 연속 모니터링이 가능하게 된다.
또한, 면역분석 시 항체 반응특성의 차이에 따른 연속측정 실현 가능성 여부는 순환 반복하여 측정해 보면 더 확연해진다 (도 3 참조). 비가역 반옹특성 을 나타내는 항체 (도 3， 20E7; ka = 1.10X 104 L-mol^-sec"1, kd = 1.80X 10"7 sec— 의 경우， 항체공급 후 정해진 시간 동안 고정된 항원과 지속적인 부착반응 을 나타내고 세척 시에는 탈착이 완료되지 못하므로 순환반복에 따라 항원 -항체 반응 결합체는 점차 누적되어 증가하는 패턴을 나타낸다. 반면에， 가역반응 특 성을 보이는 항체 (1B5; ka = 4.13X 106 L-mol^-sec"1, kd = 3.61X10"3 sec 1)의 경 우, 항체공급 후 신호가 급격히 증가하여 부착반웅 평형에 도달하고 또한 세척 시 즉시 탈착되어 신호가 초기 기준선으로 되돌아오는데' 이와 같은 부착 /탈착 가 역반웅 형태는 순환반복 시에도 높은 재현성을 나타낸다.
가역반응성을 나타내는 항체는 항원 -항체 결합체의 탈착속도가 빨라 친화 력 (평형부착상수， KA) 감소에 의한 분석민감도 저하가 우려될 수 있지만 부착 및 탈착 속도가 모두 빠르면 친화력에는 영향을 주지 않는다. 실제로， 평형부착상 수 (KA) = 부착속도상수 (^)/탈착속도상수 이므로 위에서 설명한 방법에 따라 적절한 반응역학 특성 즉， 높은 부착 및 탈착 속도상수 값을 지닌 항체를 선별하 면 높은 분석민감도를 유지할 수 있다. 따라서 높은 민감도를 유지하기 위해서 는 일반적으로 KA > 1X108 L-mol"1 조건의 항체가 필요하므로, 고친화력의 가역반 웅성 항체는 ka > IX 105 L-mor'-sec"1 및 ^ > 1X10— 3 sec"1 특성을 지닌 항체로 정의될 수 있다.
한편， 가역반웅성 항체의 친화력을 시험하는 다른 방법으로， 항체를 표준 농도로 연속 희석하여 표면 플라즈몬 공명 센서 상에 고정된 항원과 반웅시켜 신 호감지가 가능한 최저 항체농도를 결정하여 보면 항체 친화력의 예측이 가능하다 (도 4 참조). 특히 , 가역 항체 1B5가 pg/mL 농도범위 이하에서도 항원과 반응하 는 것으로 측정되었는데， 이 결과는 기존의 비가역성 항체의 경우와 비교하여도 매우 높은 친화력을 나타낸 것이다. 더욱이 도 4의 결과로부터 사용된 가역 항 체는 비교적 광범위한 농도범위에서 고정된 항원과 다른 평형상태로 반웅하는 것 으로 미루어 바이오센서 제작에 매우 적합한 것을 알 수 있다.
본 발명의 실시간 연속 검출장치에서， 상기 가역반웅성 포획 인식성분 (10)은 시료 내 분석물질 (11)인 생명체 대사물질， 단백질， 호르몬， 핵산， 세포, 식품검사대상 물질， 환경 유해물질 또는 국방 화생방 측정물질과 특이적으로 결 합할 수 있는 항체， 수용체， 핵산, 효소， 압타머 , 펩타이드 또는 분자인쇄 인공 막인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시간 연속 검출장치에서， 상기 센서는 분석물질 (11)-포획 인 식성분 (10) 결합체로부터 발생된 신호를 직접 탐지하는 비표지 센서 (12) (도 1의 가) 참조)， 또는 분석물질 (11)-포획 인식성분 (10) 결합체 밀도에 비례하여 신호 를 발생시키는 표지물질 (14)을 경유하여 탐지하는 표지 센서 (15)인 것을 특징으 로 한다 (도 1의 나) .
본 발명에서， 상기 비표지 센서는 분석물질 -포획 인식성분 결합체에 비례 하여 변화하는 센서 상의 질량， 진동자의 저항， 전하분포 변화에 의한 표면 왜 곡， 에너지 전달 등을 신호로서 측정한다. 센서표면의 결합체 질량 변화에 따라 광 굴절각 차이를 나타내는 표면 플라즈몬 공명 (surface plasmon resonance; SPR) 센서 (Robert Karlsson 등， Journal of Immunological Methods, Vol . 145, Page 229-240, 1990)， 진동자의 저항이나 전하분포를 감지하는 캔틸레버 (cantilever) 센서 ( Hans- Jur gen Butt , Journal of Colloid and Interface Science, Vol. 180, Page 251-260, 1996) , 광도파로 (evanescent ) 센서 (R. G. Eenink 등， Analytica Chimica Acta, Vol. 238, Page 317-321, 1990), 나아가 나 노차원의 선 혹은 간격을 이용한 나노센서 (Fengli Qu 등, Biosensors and Bioelectronics, Vol. 22， Page 1749-1755, 2007) 등이 비표지 센서로 사용될 수 있다.
또한, 상기 표지 센서는 분석물질 -포획 인식성분 결합체에 비례하여 신호 를 발생시키기 위해 표지물질이 표지된 탐지 인식성분을 추가로 반응시킨 후 표 지물질로부터의 신호를 측정한다. 본 발명에서， 상기 '탐지 인식성분' 이란 표 지물질이 물리적 혹은 화학적으로 결합되어 있으며 분석물질과 특이적으로 반웅 가능한 물질을 의미한다. 여기서 탐지 인식성분이 반웅하는 분석물질 분자 상의 자리는 포획 인식성분이 반응하는 부위와 달라서 두 성분은 분석물질과 동시에 반웅할 수 있다. 신호를 발생시키는 표지물질로는 형광체, 발광체， 효소， 금속 입자, 플라스틱 입자， 자성입자 등이 사용되며 이로부터 발생되는 형광, 발광， 발색， 전기화학， 자기장 등을 탐지하는 센서가 표지 센서로 사용될 수 있다. 다시 말해， 상기 비표지 센서를 이용하는 경우에는 시료에 포함된 분석물 질은 유체채널을 통해 연속적으로 시스템 내로 유입되어 포획 인식성분과 반웅하 고， 표지 센서를 이용하는 경우에는 시료 내의 분석물질은 표지물질이 결합된 탐 지 인식성분과 사전에 반응한 후 유체채널을 통해 연속적으로 시스템 내로 유입 되어 포획 인식성분과 반응한다. 본 발명의 실시간 연속 검출장치에서， 상기 시료 분석 사이트는 시료 내 분석물질 (11)만 선택적으로 투과시킬 수 있는 반투과성 막 (16)에 의해 구획이 나 누어져 포획 인식성분 (10)이 고정된 센서표면 쪽에 인식반응 셀 (17)을 형성하는 것을 특징으로 한다.
상기 인식반응 셀 (17)은ᅳ 표지 센서 (15)를 이용하는 경우 상기 인식반응 샐 (17) 내에 반투과성 막 (16)을 통과할 수 없는 크기의 표지물질 (14)과 결합된 탐지 인식성분 (13)을 가두어 두고 재활용하는 것을 특징으로 한다.
또한， 상기 인식반응 샐 (17) 내의 탐지 인식성분 (13)도 포획 인식성분 (10)과 함께 연속적으로 재활용되기 위해 가역 반응특성을 갖는 것올 특징으로 한다.
구체적으로, 상기 시료 분석 사이트는 포획 인식성분이 고정된 센서표면 쪽을 반투과성 막으로 구획을 나누어 인식반웅 셀을 형성시킬 수 있는데 (도 1의 다， 라)， 시료에 포함된 분석물질은 크기가 작아 이 막을 통하여 셀 내로 확산전 달 되지만 시료 내 크기가 큰 불순물은 여과되어 센서표면의 오염을 방지할 수 있다. 이와 같은 인식반웅 셀의 설치는 특히 표지방식의 분석시스템의 경우 (도
1의 라) 크기가 큰 표지물질과 결합된 탐지 인식성분을 셀 내에 가두어 재활용하 는 효과도 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 상기 실시간 연속 검출장치를 이용한 분석물질의 실시간 연속 검출방법을 제공한다. a) 분석물질을 포함하는 시료를 상기 시료 유입 채널을 통해 시료 분석 사이트내로 주입시키는 단계;
b) 상기 분석물질을 시료 분석 사이트내의 가역반응성 포획 인식성분 (10) 과 결합시키는 단계;
c) 상기 분석물질과 포획 인식성분의 결합에 의해 발생되는 신호를 센서 에 의해 탐지하는 단계;
d) 시료의 계속적 유입이나 세척액의 유입에 의해 상기 분석물질과 포획 인식성분의 결합이 탈착되어 분석물질이 상기 시료 배출 채널을 통해 배출되는 단계; 및
e) 상기 탈착된 포획 인식성분을 연속적으로 재활용하여 상기 b) 내지 d) 단계를 반복함으로써 시료내 분석물질의 농도 변화를 실시간으로 측정하는 단계. 본 발명의 실시간 연속 검출방법에서， 상기 c)단계에서 분석물질ᅳ포획 인 식성분 결합체로부터 발생된 신호를 비표지 센서를 이용하여 직접 탐지하거나, 혹은 분석물질 -포획 인식성분 결합체 밀도에 비례하여 신호를 발생시키는 표지물 질을 경유하여 표지 센서를 통해 신호를 측정하는 것을 특징으로 한다 .
본 발명에서， 상기 비표지 센서를 이용하는 경우 시료에 포함된 분석물질 은 시료 유입 채널을 통해 연속적으로 시료 분석 사이트 내로 유입되어 포획 인 식성분과 반웅하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서， 상기 표지 센서를 이용하는 경우 시료 내의 분석물질이 표 지물질이 결합된 탐지 인식성분과 사전에 반웅한 후 시료 유입 채널을 통해 연속 적으로 시료 분석 사이트 내로 유입되어 포획 인식성분과 반응하거나 (연속흐름 노출 타입)， 시료 내의 분석물질이 시료 유입 채널을 통해 연속적으로 시료 분석 사이트 내로 유입된 후 인식반응 셀 내의 표지물질과 결합된 탐지 인식성분 및 포획 인식성분과 반웅하는 (인식반응 샐 타입) 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 상기 탐지 인식성분은 연속흐름 노출 타입의 경우 분석물질 과 미리 반응되어 공급되므로 결합 안정성이 높은 비가역 반응특성을 갖거나, 인 식반웅 셀 타입의 경우 포획 인식성분과 함께 탐지 인식성분도 연속적으로 재활 용되기 위해 가역 반웅특성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서， 인식반응 샐 타입 표지 센서를 이용하는 경우 근접해 있던 형광물질 (표지물질)과 형광에너지 수용체 간의 에너지 전달이 포획 인식성분과 분석물질의 반웅에 의해 방해되어 형광신호가 발생하는 원리를 이용하거나， 효소 분자 (표지물질) 상에 고정된 분석물질과 인식성분이 결합하면 활성이 억제되는 것으로 알려진 효소들을 표지물질을 이용하여 포획 인식성분을 센서 상에 고정시 키지 않고 인식반응을 액상에서 수행할 수 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 상기 실시간 연속 검출장치에 사용되는 가역반응성 포획 인식성분의 선별방법을 제공 한다.
a) 포획 인식성분을 준비하는 단계;
b) 상기 포획 인식성분을 센서표면에 고정된 분석물질과 결합시키는 단 계;
c) 상기 포획 인식성분과 분석물질의 결합에 의해 발생되는 신호를 센서 에 의해 탐지하는 단계;
d) 세척액의 유입에 의해 상기 포획 인식성분과 분석물질의 결합을 탈착 시키는 단계;
e) 상기 탈착되고 남은 포획 인식성분과 분석물질의 결합에 의해 발생되 는 신호를 센서에 의해 탐지하는 단계 ; 및
f) 상기 e)단계에서의 탐지 신호가 상기 c)단계에서의 탐지신호보다 낮아 지는 포획 인식성분을 선택하는 단계.
본 발명의 가역반웅성 포획 인식성분의 선별방법에서, 상기 센서는 표면 플라즈몬 공명 센서， 캔틸레버 센서， 광도파로 센서 , 광간섭 센서 , 또는 나노센 서에서 선택된 비표지 센서인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 가역반웅성 포획 인식성분의 선별방법에서， 상기 포획 인식성 분은 센서표면에 고정된 분석물질과 반응 시 부착속도상수 (ka)는 IX 105 L-ηιοΓ1· sec—1 내지 IX 108 L-mol^-sec"1, 그리고 탈착속도상수 (k 는 lxiO—3 sec"1 내지 lx ΚΓ1 sec"1 범위의 가역반웅 특성을 가지며 동시에 평형부착상수 (KA = ka/kd)가 lx 108 L/mol 이상의 고친화력을 가지는 것을 선택하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 가역반웅성 포획 인식성분의 선별방법에서, 상기 a) 단계에서 상기 포획 인식성분은 운반용액에 희석하여 연속적으로 주입되고， 상기 f) 단계 에서 시간에 따라 증가하던 신호가 감소하는 포획 인식성분을 선택하는 것을 특 징으로 한다.
본 발명의 가용반웅성 포획 인식성분의 선별방법에서， 상기 a) 단계에서 상기 포획 인식성분은 세척액과 순환 반복되어 주입되고， 상기 f) 단계에서 시간 에 따라 신호가 증가되었다가 초기 기준선으로 되돌아오는 신호패턴이 반복되는 포획 인식성분을 선택하는 것을 특징으로 한다. 이상에서 설명하는 본 발명에 따른 분석물질의 실시간 검출장치， 이를 이 용한 분석물질의 실시간 연속 검출방법 및 이에 사용되는 가역반웅성 포획 인식 성분의 선별방법을 이용하는 경우 다음과 같은 장점을 가질 수 있다.
바이오센서나 바이오칩의 제작에 있어서， 본 발명에서와 같이 분석물질의 농도에 따라 신속하게 가역적으로 반응하는 항체를 재활용하면 기존의 1회용 진 단 칩에 비해 구성부품 및 제작방법이 획기적으로 단순화된다. 이것은 기존 장 치 또는 시스템에서 시약 공급 및 제거를 위해 요구되었던 다수의 밸브와 펌프가 최소화되어 실제로 신체에 착용이 가능한 소형의 미세유체흐름 방식의 연속진단 시스템의 구현이 가능하다.
이와 같은 새로운 개념의 검출방법 (또는 진단방식)은 질병이나 증세에 대 한 실시간 모니터링을 가능하게 하므로 현존하는 거의 모든 면역분석시스템들이 안고 있는 한번 사용한 후 폐기하는 1회용 성능의 한계를 극복할 수 있고 인체의 만성질병 혹은 고위험군 환자에 대한 연속적인 감시가 가능하게 된다. 더욱이 현재의 진단체계에서 진단결과를 얻기 위해 시간이 오래 걸리고 또한 환자상태 감지 데이터를 실험실에서 분석할 필요가 있을 경우 진찰시점과 진료결과가 나오 는 시간의 차이가 많아서 정확한 질병진단이나 적시 치료에 어려움이 많은 문제 점을 해결할 수 있다.
따라서， 본 발명에서 개발된 실시간 연속 검출 장치 및 이를 이용한 검출 방법은 조기진단 개념의 새로운 예방의학 기법으로서 병원에서 수요현장 중심으 로 이동하는 진료 패러다임의 변화를 충족시키며 만성질환자 및 노인과 같은 고 위험군 환자감시가 상시 가능한 연속진단기기의 개발과 실용화를 가능하게 한다. 특히， 평균수명이 연장됨과 동시에 출산율의 감소로 고령화 사회로의 진입이 가 속화 되고 있고 이와 더불어 식생활 패턴의 서구화로 각종 만성 성인병 질환이 널리 퍼져있어 조기진단을 통해 건강한 삶올 영위하는 데 도움을 준다. 연속진 단 방법은 특히 향후 도래할 U-헬스케어 시대에서 진단시스템을 휴대폰, 병원, 주택 등에 내장하거나 신체에 착용하여 생체정보를 실시간으로 측정하고 진단하 기 위한 기반 원천기술로 활용될 수 있다.
또한 본 발명의 실시간 연속검출장치 및 이를 이용한 검출방법은， 생명체 대사물질， 단백질， 호르몬， 핵산， 세포， 식품검사대상 물질， 환경 유해물질 또는 국방 화생방 측정물질 등을 분석하는데 활용될 수 있는데， 산업분야 별 제품군을 예시로서 정리하면 다음과 같다. 의료진단 산업으로는， 고위험군 (만성질환자， 노인， 중환자) 연속진단시스템 제품， 당뇨환자 감염 연속진단시스템 제품， 심혈 관 환자 재발 연속감시시스템 제품, 암 치료 환자 재발 연속감시시스템 제품， 그 리고 좌변기 건강모니터링 시스템 제품 둥을 들 수 있다. 인공장기 산업으로는， 인공췌장 제어시스템 제품 등 인공장기 제어 등에 적용할 수 있다. 공공보건 및 국방 산업으로는， 생물테러작용제 연속탐지시스템 제품 그리고 조류독감 및 사스 바이러스와 같은 인수공통 감염 병원체의 연속탐지시스템 제품 등에 웅용될 수 있다. 환경 산업으로는， 강물， 연안， 해양 오염 연속감시시스템 제품 등을 들 수 있다. 생물 및 식품 산업으로는, 생물공정 연속모니터링시스템 제품과 식품 생산공정 연속모니터링시스템 제품 등에 적용될 수 있다.
【유리한 효과】
본 발명에 따르면， 일정량의 가역반웅성 포획 인식성분을 연속적으로 재 활용하여 분석물질 농도 변화를 실시간 측정할 수 있다. 본 발명의 실시간 연속 검출장치는 생명체 대사물질， 단백질， 호르몬， 핵산, 세포， 식품검사대상 물질， 환경 유해물질 또는 국방 화생방 측정물질 등을 검출 또는 분석하는데 활용이 가 능하므로 의료， 공중보건， 국방， 환경， 식품， 수의， 생명공학 산업에 응용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 본 발명에 따른 시료 분석 사이트 내에서 포획 인식성분 (10)을 연 속적으로 재활용하여 분석물질의 농도 변화를 측정하는 (가)연속흐름 노출 타입 비표지 센서; (나)연속흐름 노출 타입 표지 센서; (다)인식반응 셀 타입 비표지 센서 ; 및 (라)인식반응 셀 타입 표지 센서를 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 포획 인식성분의 예시로서 생쥐 하이브리도마 클 론으로부터 생산된 가역반응성을 나타내는 항체 (1B5)와 전형적인 비가역반응성을 보이는 항체 (20E7)에 대한 부착 및 탈착 반응특성을 분석하기 위해 센서표면에 항원 즉， 분석물질 (알파 2-마크로글로블린을 모델로 이용)이 고정된 표면 플라즈 몬 공명 센서시스템을 통해 측정한 그래프 및 이로부터 결정된 속도상수와 부착 평형상수의 비교이다.
도 3은 도 2의 센서시스템을 이용하여 두 항체 (1B5 및 20E7)의 반웅특성 차이에 따른 연속측정 실현 가능성 여부를 시험하기 위한 순환 반복측정 결과를 비교한 그래프이다.
도 4는 도 2의 센서시스템을 이용하여 가역반웅성 항체인 1B5의 항원에 대한 친화력을 시험하기 위해 항체를 연속 희석하여 농도 증감에 따라 센서 상에 고정된 항원과 반웅시켜 얻은 결과이다.
도 5는 가역반응성 항체인 1B5가 의료임상용 진단에 이용될 수 있는지를 평가하기 위해 1B5 항체를 센서표면에 고정시킨 후 항원 즉， 분석물질을 농도 증 가에 따라 고정된 항체와 반웅시켰고 시료운반용액으로 (가)인산완충용액 및 (나)인간혈청을 이용하여 얻은 결과의 비교이다.
도 6은 도 5의 센서시스템의 분석민감도를 향상시키기 위해 표지물질 (14) 로 직경이 30 nm인 금 콜로이드 입자와 탐지 인식성분 (13)으로 비가역 항체 20E7 간 중합체를 추가로 도입하여 얻은 신호증폭 결과이다.
도 7은 도 5의 센서시스템을 이용하여 시료 사용 양올 최소화시키기 위해 센서 칩 내로의 미세유체 흐름속도를 선행 실험조건의 1/10로 감속한 조건 하에 서 분석물질 농도의 증감에 따른 센서의 응답 결과이다.
도 8은 가역반웅성 항체의 재활용을 예시하기 위해 센서표면에 항체 1B5 가 고정된 표면 플라즈몬 공명 센서시스템을 연속측정 모드로 운용하여 분석물질 (알파 2-마크로글로블린) 농도가 연속적으로 10배 씩 증가하고 감소하는 2회 반복 적인 변화에 대해 센서로부터 구한 (가)농도웅답 결과 및 (나)그래프로 도식한 표준곡선이다.
도 9는 도 8의 센서시스템을 이용하여 분석물질 농도가 2배씩 혹은 그 이 하로 증가하고 감소하는 산술적인 농도변화에 대한 센서의 농도웅답 결과이다.
<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명〉
10： 포획인식성분
11： 분석물질
12: 비표지 센서
13： 탐지인식성분
14： 표지물질
15： 표지 센서
16： 반투과성 막
17： 인식반응 샐
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하, 본 발명의 가역반응성 포획 인식성분을 이용한 실시간 연속검출장 치를 보다 구체적으로 설명한다.
1) 비표지 센서를 이용한실시간 연속검출장치 구축 예시
실시간 연속검출 장치 (또는 실시간 연속검출시스템)를 구현하는데 가역반 응성 인식성분 외에 핵심 요소 중 하나가 센서 기술이다. 상기에서 설명한 바와 같이 센서 종류는 크게 비표지 센서와 표지 센서로 나눌 수 있는데， 연속진단시 스템 구축 시 플라즈몬 공명센서, 캔틸레버 센서， 혹은 광도파로 센서와 같은 비 표지 센서를 이용하는 것이 이론적으로 단순화 한다 .
연속검출장치의 구성은 매우 다양하지만， 본 발명의 유용성을 쉽게 설명 하기 위해 플라즈몬 공명 센서 칩 상에 가역반응성 항체 (1B5)를 고정시켜 제작한 비표지 센서 기반 연속검출장치를 도 1을 참조하여 예로서 설명하면 다음과 같 다.
비표지 센서로서 금속과 유전매체 계면에서 빛에 의해 발생하는 전하밀도 파장인 표면 플라즈몬 공명을 측정하는 방법이 대표적이다. 이러한 표면 플라즈 몬 공명은 금속표면과 매우 근접하여 상호작용 하므로， 이 영역에서의 인식반웅 등에 의한 광학 특성의 변화는 표면 플라즈몬 공명올 야기하는 빛의 입사각에 영 향을 주게 된다 (J. Homo la 등， Sens. Actuators B, Vol. 54， Page 3-15, 1999). 따라서 센서표면에서의 분석물질과 인식성분 간 반응에 의해 표면 플라즈몬 공명 을 일으키는 빛의 입사각 변화를 신호로서 측정한다.
표면 플라즈몬 공명 센서 (12) 상에 가역반웅성 항체 (1B5; (10))를 고정시 켜 구성한 연속검출장치 (도 1의 가)에 인산완층용액으로 희석하여 각기 다른 농 도의 분석물질 (알파 2-마크로글로블린)이 포함되도록 제조한 표준용액들을 10 y 17분 미세유체 흐름속도로 순차적으로 주입하면 농도에 비례한 웅답신호가 센서 로부터 발생된다 (실시예 6 참조). 각 표준용액은 신호를 매번 기준선으로 되돌 린 후 주입하였고， 주어진 조건 하에서 측정민감도는 0.1 ng/mL 수준 이하로 민 감하였을 뿐만 아니라 농도응답 시간은 최종 웅답수준의 95%를 기준으로 640초 정도로 매우 신속하였다 (도 5의 가). 분석특이도를 시험하기 위해 같은 농도 범위의 분석물질을 의료임상 시료인 인간혈청으로 회석하여 제조한 후 동일한 실 험을 반복한 결과 거의 유사한 농도웅답이 얻어졌으므로 (도 5， 나)， 구축된 연 속검출장치는 의료임상용 진단에 이용될 수 있다.
또한 분석민감도를 향상시키는 방법으로， 표지물질 (14)과 결합된 탐지 인 식성분 (13)을 추가로 도입하여 분석물질 (11)과 포획 인식성분 (10) 간 인식반웅 결합체의 질량변화를 증가시키는 신호증폭 방법이 이용될 수 있다. 탐지 인식성 분 (13)으로 비가역 항체 20E7을 선택하여 직경이 30 nm인 금 콜로이드 입자와 물 리적으로 결합하였고, 이 결합체를 분석물질 표준용액과 미리 반웅시킨 후 센서 내로 주입하여 센서의 농도웅답을 측정하였다 (실시예 7 참조). 참고로， 비가역 항체 20E7은 분석물질에 대해 가역 항체 1B5과 동시에 반웅할 수 있다. 그 결과 신호증폭 방법을 이용하면 최소 0.001 ng/mL의 분석물질 탐지가 가능하였고 따라 서 분석민감도가 약 100배 향상되는 것으로 나타났다 (도 6).
의료임상 시료의 경우 특히 그 사용 양을 최소화시키는 것이 필요하므로 미세유체 흐름속도를 선행 실험조건의 1/10 (즉, 1 μ! 분 또는 1.44 mL/일)로 감속을 시도하였고 동일한 조건하에서 분석물질 농도의 증감에 따른 센서의 웅답 을 측정하였다 (실시예 8 참조). 센서의 농도웅답을 측정한 결과 분석민감도 (0.1 ng/mL)와 웅답시간 (640초， 최종응답의 95% 기준)은 미세유체 흐름속도와 관 계없이 일정하게 유지되는 것으로 나타났다 (도 7의 가). 또한, 미세유체 흐름 속도 변화에 따른 센서의 농도웅답 패턴에도 큰 변화가 없어서 유체흐름속도가 10배 다른 조건에서 구한 두 농도웅답곡선은 거의 일치하는 것으로 나타났다 (도 7의 나). 부가하여, 분석물질의 농도 증가 시 측정한 농도웅답과 농도 감소 시 측정한 농도응답 간에도 차이가 없었다. 도 5 내지 도 7에서 나타낸 바와 같이， 가역반응성 항체가 고정된 센서칩 을 이용하여 분석물질 농도 변화에 대한 SPR 센서의 웅답을 구하기 위해 농도변 화 시 마다 매번 초기조건 즉 분석물질이 부재한 상태로 원위치 시킨 후 측정을 시작하는 '리셋모드' 를 사용하였다.
가역반웅성 항체의 재활용을 예시하기 위해 '연속모드' 를 사용하였는 데， 분석물질 농도가 15분마다 계단식으로 10배 씩 증가하고 감소하는 2회 반복 적인 변화에 대해 (0.01 - 100 ng/mL 범위) 센서로부터 농도웅답을 연속적으로 구하였다 (실시예 9 참조). 주어진 미세유체 흐름속도 (1 μΐ 분)로 센서 내로 주입되는 분석물질의 변화된 농도에서 센서응답은 15분 이내에 평형상태에 도달 하였고 2회 반복 시 높은 재현성을 나타내었다 (도 8의 가). 이와 같은 연속측 정 방식으로 측정한 센서의 농도웅답을 도식한 표준곡선 (도 8의 나)은 '리셋모 드' 로 측정한 곡선과 다소 차이가 있는 것으로 나타났는데 이것은 센서시스템의 운영방식의 차이에 기인한 것으로 판단된다.
분석물질의 종류에 따라 발병 혹은 증세발현 시 농도의 증감변화 패턴 (지 수적 흑은 산술적)이 다를 수 있으므로 2배씩 흑은 그 이하로 증가하고 감소하는 산술적인 농도변화에 대한 센서의 농도웅답을 '연속모드' 로 측정하였다 (실시 예 10 참조). 지수적인 변화에 대한 응답과 마찬가지로 센서는 산술적인 분석물 질 농도 변화에 대해서도 유사한 분석성능을 나타내었다 (도 9). 더욱이 작은 농도변화에 대해서도 민감하고 신속하게 반응하는 것으로 미루어 가역반웅성 항 체 기반의 바이오센서는 향후 매우 정확한 분석을 요구하는 분석물질의 측정에 광범위하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명에서는 연속진단을 예시하기 위한 분석물질로서 알파 2-마크로글로 블린을 선택하였고， 이 물질에 대해 특이한 가역반응성 항체를 생산하여 연속진 단 기법을 예시하였다. 마크로글로블린은 세 종류의 다른 질병 특히 신증후군의 치료 및 재발 확인， 알쓰하이머 조기진단， 그리고 인공장기 이식 후 염증반응과 합병증의 임상진단에 바이오마커로 이용될 수 있다.
또한， 신증후군은 약 90%가 소아에게만 발생하는 질병으로 소변에 단백질 이 섞여 나오는 신장질환으로 신장의 사구체 이상에 의해 단백질이 유실된다 (Daniel A. Blaustein 등， Primary Care Update for OB/GYNS, Vol. 2, Page 204-206, 1995). 환자들은 몸이나 다리에 부종이 생겨 찾아오는 경우가 대부분 이고 상황에 따라 신장경화증， 신부전증， 암 등으로 발전하는 경우도 있다. 이 질병의 진단은 CBC (complete blood count), 간기능 검사， 신장기능 검사 마크 로글로블린 등 혈단백 검사， 소변검사 등에 의해 실시된다. 신증후군으로 진단 시， 치료를 위해 면역억제제 (prednisone) 또는 스테로이드제를 1-6개월간 투여 하는데 이 기간 동안 소변검사나 혈액검사를 지속적으로 실시하여 변화를 관찰함 으로서 치료효과를 판단한다. 면밀한 관찰을 위해 정기적으로 병원을 방문하여 혈액 및 소변 검사를 실시하여야 하는데 특히 신증후군 환자의 90¾가 표현력이 약한 소아이므로 증세변화 등 신체이상에 대한 지속적이고 철저한 검사 및 관찰 이 필요하다. 따라서 소아의 신증후군 치료효과 및 재발 확인을 위한 미래 기술 로서 마크로글로블린 등 혈단백에 대한 연속탐지 기법의 개발은 매우 유용할 것 으로 예측된다.
마크로글로블린의 바이오마커로의 활용에 대한 다른 가능성으로， 알쓰하 이머는 60-70명 당 1명꼴로 발생되고 85세 이상은 50%가 앓고 있는 노인성질환으 로 조기진단을 통한 예방이 절실하다. 2006년에 런던 킹스컬리지 연구팀이 혈액 검사를 통해 알쓰하이머 질환에 걸린 환자로부터 두 종류의 단백질 즉， 보체인자
-H의 전구체와 알파 2-마크로글로블린 농도가 증가된 것을 발견했으며 이러한 단 백질 농도차이의 규명을 통해 조기진단 가능성을 제시하였다 (A. Hye 등， Brain, Vol. 129, Page 3042-3050, 2006). 이러한 목적으로 마크로글로블린의 연속탐지 에 의해 알쓰하이머 질환을 조기진단하면 증상발현 후 병원을 방문하는 것보다 질환예방 및 치료가 조기에 이루어져 질환의 진행올 훨씬 완화시켜 삶의 질 향상 에 크게 기여할 것으로 기대된다.
마크로글로블린을 바이오마커로의 활용에 대한 또 다른 가능성으로， 인공 장기의 이식에 따른 염증반웅이나 합병증 유발은 알려진 사실이었으나 그 진단지 표에 대한 연구결과가 많지 않았다. 2005년 미국의 듀크대학교 의학센터에서 심 장수술에 심폐기를 사용 후 알파 2-마크로글로블린 농도가 50%증가된 연구결과를 제시하였는데 (Eric A. Williams 등, J Thorac Cardiovasc Surg, Vol . 129, Page 1098-1103, 2005) 이것은 전신적인 염증반응의 한 지표로서 마크로글로블린 농도 변화가 이용될 수 있음을 나타낸다. 따라서 인공장기 이식 후 예후관찰 시 염증 반웅 발현 바이오마커를 연속탐지 할 수 있을 경우 정기적인 병원방문 혹은 합병 증 증상발현 후 조치보다 인공장기 교체나 합병증 치료가 조기에 이루어질 수 있 다는 장점이 크다. 위에서 예시한 질병들을 포함하여 급ᅳ만성 인체질환은 일반적으로 시간 혹 은 일 단위로 비교적 느리게 진행되므로 질환지표 바이오마커를 측정하는 센서의 웅답시간으로 보통 분 단위가 요구된다. 이것은 질병 진행시간과 비교하여 센서 의 웅답시간이 10배 정도 더 빠르다면 질병진행이 바이오마커 연속진단 공정을 지배하는 율속단계가 되므로， 도 8 및 9에서 나타낸 센서의 마크로글로블린 농도 응답시간 (약 15분; 최종응답의 95% 기준)은 연속탐지 조건을 만족시킨다. 더 신 속한 센서 웅답시간 (예: 초 단위)은 연속진단 시 분석성능에 전혀 영향을 주지 않으며 단지 개념이 다른 1회용 센서 (예: 혈당센서)의 경우 채취한 시료에 대한 측정시간을 단축시키는 효과를 제공할 뿐이다.
2) 표지 센서를 이용한 진단시스템 구축 가능성 예시
표지 센서의 예로서， 형광체를 신호발생원으로 사용하는 예가 가장 많은 데 포획 인식성분 (10)을 고체표면에서 고정시키거나 (도 1의 나 및 라) 혹은 인식 반웅 셀 (17) 내에서 액상반응을 통해 탐지가 가능한데， 이때 신호발생원인 형광 물질 (donor)로부터 방사된 빛은 어떤 에너지 수용체 (acceptor)가 매우 근접하여 존재할 경우 흡수되어 빛이 외부로 방사되지 않는 원리를 이용한다 (Shaw 등， J. Clin. Pathol, Vol. 30， Page 526-531 , 1977). 그 응용으로， 항원 -항체 부착과 같은 인식반웅이 형광물질과 에너지 수용체 간 에너지 전달올 조절하도록 설계할 수 있고 형광신호는 수광소자 (포토다이오드， charge-coupled device, photomultiplier tube 등)를 이용하여 탐지된다.
표지 센서의 다른 예로서 효소를 표지물질로 사용할 수 있는데 , 센서표면 에 고정된 포획 인식성분 (10)을 이용하거나 (도 1의 나 및 라) 혹은 효소분자 상 에 항체가 부착하면 활성이 억제되는 것으로 알려진 몇 종류의 효소들을 이용하 면 인식반웅 셀 (17) 내에서 액상반웅 수행이 가능하다. 이러한 효소들을 면역분 석에 이용하기 위해 분석물질 (즉， 항원)과 결합시켜 항체와 반응시키면 그 효소 의 활성이 억제되는 것으로 알려져 있다 (Se-Hwan Paek 등， Biotechnology and bioengeering, Vol . 56, Page 221-231, 1997). 효소로부터의 신호는 선택된 효 소와 기질에 따라 흡광도 측정센서 (스펙트로포토미터)， 수광 센서 (포토다이오드, charge-coupled device, photomult ipl ier tube 등 수광소자)， 전기화학 센서 (전 극) 등 다양한 수단에 의해 측정될 수 있다.
표지 센서의 다른 예로서 자성입자를 표지물질로 이용할 수 있는데， 센서 표면에 고정된 포획 인식성분 (10)을 이용하면 (도 1의 나 및 라) 분석물질과 인식 성분 간 반응에 대한 자기장 측정이 가능하다 (A. Perrin 등, Journal of Immunological Methods, Vol. 224, Page 77-87， 1999) . 자기장 측정 센서로는 GMR/TMR 및 Hall 소자가 대표적이며 소비 전력이 적고 크기도 작으며 가벼우면서 집적화가 가능하다.
이상에서 설명된 바와 같이， 가역반응성 항체와 센서기술을 결합하여 연 속진단시스템을 구축하면 분석민감도의 희생 없이 항체를 연속적으로 재활용하여 분석물질을 실시간으로 측정할 수 있다. 예시된 연속진단시스템의 농도응답시간 은 최종웅답의 95%를 기준하여 10분대로서 농도가 초 단위로 변화하는 분석물질 측정에는 적용할 수 없으며 분 단위보다 상대적으로 느리게 변화하는 분석물질 측정에 적용할 수 있다. 특히 그 농도가 정해진 상한을 초과할 경우 경보발령을 요구하는 분석대상에 적합하다. 그 적용 가능한 분야로서， 질병이나 증세에 대 한 연속진단 및 인공장기 제어， 생물테러작용제 연속탐지， 환경오염 연속감시， 그리고 생물공정 연속모니터링 분야 등이 있다.
【발명의 실시를 위한 구체적인 내용】 이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로， 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실험재료
본 발명의 실시예를 위해 사용된 재료 및 구입처는 다음과 같다. 표면 플 라즈몬 공명 센서 칩 (BIACORE CM5; 구성성분: 유리모체 , 30 nm 두께의 금 박막， 100 nm 두께의 dextran 증)， amine coupling 키트 (100 mM N-hydr oxysucc i n i m i de (NHS), 400 mM N-ethyl-N' -(dimethylaminopropyl )carbodi imide) (EDO , 1M ethanol amine hydrochloride, pH 8.5 포함), 40% 글리세롤 (glycerol )은 GE healthcare 사 (스웨덴)로부터 구입되었다. 생쥐 단일클론 항체 (20E7, 3D1; 비가 역 반웅성)와 알파 2-마크로글로블린 ( a2-macroglobulin, tetramer)은 에이비프론 티어 사 (한국)로부터 공급되었다. 우 혈장 지질단백질 (bovine serum albumin), sodium acetate, sodium phosphate, sodium chloride, glycine, 인간 AB형 혈청 (human serum, AB plasma) , 카제인 (casein) , 금 나노입자 (gold nanopart icle, 30nm), 항 생쥐 염소 항체 -horseradish peroxidase (HRP) 중합체， 그리고 3,3\5,5\-tetramethylbenzidine(TMB)는 Sigma 사 (미국)로부터 구입되었다. 총 IgG 항체 정량키트 (mouse IgG core ELISA)는 코마바이오텍 사 (한국)로부터 공급 되었다. 그 외 모든 시약들은 분석용 급으로 사용되었다.
실시예 1. 생쥐 단일클론 가역반응성 항체 생산
단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제작은 통상적안 표준방 법에 따라 실시하였다. 구체적으로, 생후 6주된 암컷 BALB/c 생쥐의 복강에 알 파 2-마크로글로블린을 면역원으로 주사하여 면역시킨 후 2주 간격으로 3회 부스 팅하였다. 3차 부스팅 후 3일째에 생쥐를 희생시켜 비장을 적출하여 얻은 비장 세포를 마이앨로마 (myeloma) 세포주 (Sp2/0-Agl4)와의 세포융합을 실시하였고， 이 로부터 하이브리도마 세포를 선별하였다.
하이브리도마 세포는 총 384종류의 클론이 제작되었고 각 클론으로부터 생산된 항체 함유 배양액올 이용하여 면역원에 대한 반응성 시험과 총 IgG 항체 량 결정을 수행하였다. 면역원과의 항체반응성 시험을 위해, 10 mM 인산완충용 액 (140 mM NaCl 포함; pH 7.4)으로 희석된 알파 2-마크로글로블린 (2.5 yg/mL)이 고정된 96-마이크로플레이트 웰 내에 클론 배양액들을 각각 옮겨 반웅시켰다. 세척 후， 0.5%카제인 함유 10 mM 인산완층용액 (카제인 -PBS)으로 희석된 항 생쥐 염소항체 -HRP 중합체 (1/5,000)를 반응시켰다. 다시 세척 후， HRP 기질용액 (3% 과산화수소 (10 uL)와 10 mg/mL TMB(100 uL; dimethyl sulfoxide 용매에 희석) 가 함유된 0.05 M 아세테이트 완층용액， pH 5.1(10 mL))을 각 웰에 가하여 효소 반웅을 수행한 후 15분에 2 M 황산을 첨가하여 정지시켰다. 각 웰에서 발생된 발 색신호는 마이크로플레이트 판독기기 (VERSAmaxTM, Molecular Devices 사， 미국) 를 이용하여 450 nm 흡광도에서 측정되었다. 또한， 총 IgG 항체량을 결정하기 위해 mouse IgG core EL ISA 키트를 사용하여 제조사로부터 제공된 과정에 따라 분석하였다.
두 분석결과로부터, 항체반응성 시험 시 흡광도 2.0 이하 (하위 50%) 그 리고 총 IgG 항체량 0.1 ug/mL 이상 (상위 15%)의 조건을 동시에 만족하는 하이 브리도마 클론 7종류를 선별하였다. 실시예 2. 센서 칩 표면 활성화 및 리간드 고정화
표면 플라즈몬 공명 센서 칩으로 구입된 BIACORE CM5는 제조사로부터 제 공된 프로토콜에 따라 100 mM NHS와 400 mM EDC를 이용하여 칩 표면을 활성화시 켰다. 칩 표면에 고정될 리간드 (항원 혹은 항체)의 양은 제조사 프로토콜 안내 에 따라 계산하여 결정하였고 10 mM sodium acetate (pH 4.0) 완충용액을 이용하 여 리간드를 일정 농도로 희석한 후 센서 칩 내로 주입하여 (유속 = 5 μ!7분) 고정화를 실시하였다. 20분 후 1 M ethanol amine hydrochloride (pH 8.5) 용액 을 6분간 주입하여 센서 잔여표면을 불활성화시켰다.
표면 플라즈몬 공명 센서시스템 (BIACORE 2000； GE healthcare 사, 스웨 덴)의 운영은 제조사로부터 제공된 BIACORE 2000 사용 프로토콜을 따랐고， 시료 운반용액 (running buffer)으로 인산완충용액 흑은 인간혈청을 시험목적에 따라 선택하여 사용하였다ᅳ 센서시스템 내에 장착될 센서 칩으로 BIACORE CM5를 구입 하여 이 칩의 1번 유체채널에는 대조군으로 우 혈청 알부민을 부착시켰고 2번 유 체채널에는 리간드를 화학적으로 고정시켰다. 모든 실시예에서 동일하게 유체흐 름 방향을 1번 채널에서 2번 채널로 유지하여 2번 채널의 신호 값 (resonance unit; RU)에서 1번 채널의 잡음 값을 빼주는 방식으로 순수 신호 값을 구하였다. 반웅 샐 내의 온도는 모든 실시예에서 동일하게 25°C 로 유지하였다. 실시예 3. 표면 플라즈몬 공명 측정시스템을 이용한 가역반웅성 항체 스크리닝 가역반응성 항체 스크리닝을 목적으로， 실시예 2에서 설명한 바와 같이 1 번 유체채널에 100 pg/mL 농도로 우 혈청 알부민을 고정시켰고 2번 유체채널에 100 ug/mL 농도로 알파 2-마크로글로블린올 고정시킨 센서 칩을 제조하였다. 이 와 같이 준비한 센서 칩을 표면 플라즈몬 공명 측정시스템에 장착한 후， 10 mM 인산완층용액을 시료운반용액으로 이용하여 5 μΐ 분 속도로 주입하여 평형상태 를 유지하였다. 실시예 1에서 항체반응성 시험과 총 IgG 항체량 결정을 통해 선 별된 하이브리도마 클론 7종류를 10 mM 인산완층용액 (PBS, pH 7.4)으로 각각 적 절히 희석하였다. 제조사에서 제공한 분석 프로그램 (BIACOREoperation 2000)에 따라 각 항체시료 35 IJL을 센서시스템 내에 장착된 센서 칩 내로 420초 동안 주 입하여 부착반웅을 유도한 후 인산완충용액으로 210초 동안 주입하여 탈착반웅을 유도하였다. 동일 종 항체에 대한 분석이 완료된 후에는 10 mM glycine 완층용 액 (pH 1.5) 15 uL를 180초간 일정하게 주입하여 센서표면을 재생시켰다. 부착 및 탈착 반웅패턴은 제조사로부터 제공된 편집 프로그램 (BIAevaluation 2.0)을 이용하여 분석하였고 부착속도상수 a)와 탈착속도상수 그리고 평형부착상수 (KA)를 계산하였다. 하기 표는 시험된 하이브리도마 클론 7종류의 부착속도상수 (ka)와 탈착속도상수 (kd) 및 평형부착상수 (KA)를 나타낸 것이다.
[표 1] 2차 선별된 하이브리도마 클론의 반응특성 .
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시험된 하이브리도마 클론 7종류 중 두 클론 (1B5 및 1F8)이 고친화력의 가역반웅성을 나타냈고 그 중 1B5 클론으로부터 생산된 항체가 1 X109 L/mol 보 다 높은 고친화력을 나타냈으므로 본 발명의 목적에 적합한 것으로 선정하여， 전 형적인 비가역반웅성을 보이는 항체인 20E7과 반응특성을 비교하였다 (도 2). 부착반웅 시 1B5 항체는 20E7 보다 평형상태에 현저하게 빨리 도달하였으며， 탈 착반응 시에 1B5 항체는 초기 값에 가깝게 떨어지는 형태의 그래프를 나타낸 반 면， 20E7은 거의 탈착되지 않는 형태의 그래프를 나타내었다. 이와 같은 특성차 이로부터， 세척이 요구되는 기존 1회성 면역분석에서 세척 시에도 탈착되지 않는 비가역반웅성 20E7 항체가 선호되었던 반면에 항체의 농도에 따라 역학적 평형반 웅에 의해 신속하게 부착과 탈착이 신속한 1B5는 항체의 재활용을 통한 연속측정 에 이용될 수 있다. 따라서 본 발명에서의 기반 소재인 가역반응성 항체의 존재 를 제시하였고 기존 항체들과의 그 본질적인 특성 차이를 1차 증명하였다. 참고 사항으로, 1B5 항체와 20E7 항체는 모두 알파 2-마크로글로블린에 대해 특이 반응 성을 나타내며 이 항원분자 상의 다른 에피토프 (epitope)에 부착하고 동일한 항 원분자와 동시에 반응할 수 있다. 실시예 4. 가역반웅성 항체의 부착 /탈착반복반웅 패턴 비교
실시예 3에서 제조한 센서 칩을 이용하여 동일한 실험조건에서 가역반웅 성 1B5 항체의 부착 /탈착 반복반응 패턴을 구하였고 이를 비가역반웅성 20E7의 패턴과 비교하였다. 10 mM 인산완층용액으로 회석한 항체용액 (100 ng/mL 1B5 또 는 20 ng/mL 20E7) 17.5 uL올 5 uL/분 유속으로 210초 동안 센서 칩 내로 주입 하여 부착반웅을 유도하였고， 그 후 인산완층용액을 주입하여 110초 동안 탈착반 응을 유도하였다. 이와 같은 동일한 부착 /탈착 반응 조건 하에서 각 항체에 대 해 6회 반복하였다. 각 항체 별로 분석을 완료 후 10 mM glycine (pH 1.5) 완층 용액 15 UL을 180초간 일정하게 주입하여 센서표면을 재생시켰다. BIACore 2000 측정시스템의 운영과 데이터 편집은 실시예 2에서 설명한 바와 같았다. 분석결과， 도 3에서는 가역반웅 특성을 보일 것으로 예측되었던 1B5 항체 는 항체공급 후 불과 1분 이내에 신호가 증가하여 고정된 항원과의 부착반웅 평 형상태에 도달하였고 또한 인산완층용액 공급 시 즉시 탈착되어 신호가 초기값으 로 되돌아 왔다. 이와 같은 부착 /탈착 가역반응 패턴은 6회 반복 시 높은 재현 성을 나타내었다. 비가역반응 특성을 나타낼 것으로 예측되었던 20E7 항체는 항 체공급 후 정해진 시간 동안 상대적으로 느리지만 지속적인 부착반웅을 나타내었 고 인산완충용액 공급 시 탈착반응이 완료되지 못하였다. 따라서 항원 -항체 반 웅 결합체는 부착 /탈착 반복반웅에 따라 점차 누적되어서 신호가 계단식으로 증 가하는 패턴을 나타내었다. 실시예 5. 가역반응성 항체의 반웅하한농도 결정
실시예 3에서 제조한 센서 칩 및 동일한 실험방법을 이용하여 가역반웅성 1B5 항체의 농도변화에 대한 표면 플라즈몬 공명 센서의 응답을 측정하였다. 1B5 항체를 10 mM 인산완충용액을 이용하여 0.5 pg/mL에서 0.5 ug/mL 범위의 농 도로 회석하였다. 희석된 각 항체용액 17.5 를 5 μ 분 유속으로 210초 동 안 주입하여 부착반응을 유도하였고 그 후 인산완충용액을 110초 동안 주입하여 탈착반응을 유도하였다. 동일한 조건 하에서 저농도 항체용액으로부터 고농도 용액 순으로 분석하였고 다시 역순으로 분석하여 1회 순환 시험하였다. 순환 시 험이 완료된 후， 실시예 4에서와 같은 방법으로 센서 표면을 재생시켰다.
도 4에서， 사용된 항체농도 범위 내에서 표면 플라즈몬 공명 센서의 신호 는 항체용액 농도가 단계적으로 증가 시 비례하여 증가하였고 농도가 단계적으로 감소 시 비례하여 감소하였다. 특히， 항체 농도범위가 pg/mL 이하에서도 센서 칩에 고정된 항원과 반웅하는 것으로 나타났는데 이는 기존 면역분석에 사용되는 비가역반웅성 항체와 비교하였을 때 친화력 면에서 뒤지지 않는 결과이다. 따라 서 1B5와 같은 반웅특성을 지닌 항체를 탑재한 면역분석시스템은 우수한 분석민 감도를 나타낼 것으로 예측되고， 또한 그 항체가 pg 농도단위에서 단위까지 반웅성을 나타내므로 추후 면역센서 제작에 이용 시 넓은 측정범위가 예상된다. 실시예 6. 가역반웅성 항체 기반 비표지 면역센서시스템 구축
가역반웅성 항체를 이용한 알파 2-마크로글로블린 측정용 연속흐름 노출타 입 비표지 센서 (도 1의 가) 시스템을 구축하고자, 표면 플라즈몬 공명 센서시스 템 (BIAC0RE 2000)과 가역반응성 항체가 고정된 BIACORE CM5 센서 칩을 이용하였 다. 실시예 2에서 설명한 바와 같이 1번 유체채널에 우 혈청 알부민을 100 μ g/mL 농도로 고정시켰고 2번 유체채널에 가역반웅성 1B5 항체를 10 ug/mL 농도 로 고정시켜 센서 칩을 제조하였다. 이와 같이 센서 표면에 고정된 항체와 특이 하게 반웅하는 분석물질인 마크로글로블린을 10 mM 인산완충용액으로 회석하여 0 - 10 ng/mL 농도범위의 표준시료를 제조하였다. 각 표준시료 (150 uL)를 10 μ L/분 유속으로 900초 동안 센서시스템 내에 장착된 센서 칩 내로 주입하여 부착 반응을 유도한 후 인산완층용액을 120초 동안 주입하여 탈착반웅을 유도하였다. 각 시료에 대한 분석이 완료된 후 실시예 4에서와 같이 센서 표면을 재생시켰고， 인산완층용액 대신에 인간혈청을 희석용액 및 시료운반용액으로 사용하여 위에서 설명한 동일한 조건 하에서 실험을 반복하였다.
표면 플라즈몬 공명 센서를 이용하여 면역분석 분야 최초로 가역반웅성 항체 기반의 분석시스템을 구축하였으며 이 분석시스템은 채택된 분석물질 농도
0.1 - 10 ng/mL 범위에서 농도응답을 나타내었고 측정민감도를 대표하는 탐지하 한농도는 0.1 ng/mL 이하인 것으로 나타났다 (도 5의 가). 이 시스템의 분석특 이성을 시험하기 위해 의료임상 시험조건에 가까운 인간혈청을 시료운반용액 및 표준시료 희석용액으로 사용하여 측정한 결과 (도 5의 나) 인산완층용액을 사용 한 경우 (가)와 매우 유사한 농도웅답을 나타내었다. 이로부터 가역반웅성 항체 인 1B5 기반의 센서시스템은 측정민감도와 특이성 측면에서 매우 우수하였으며 더욱이 실제 의료임상 시험에도 적용될 수 있는 것으로 보인다. 실시예 그 금 나노입자표지된 탐지항체를 이용한신호증폭
실시예 7.1. 탐지항체-금 나노입자중합체 제조
금 콜로이드 (직경: 약 30 nm) 현탁액을 구연산나트륨 (sodium citrate)을 환원제로 이용하는 표준방법에 의해 제조하였다 (LJL Dykman, A. A. Lyakhov, V.A. Bogatyrev, S.Y. Chchyogolev. Colloid, 60， 700， 1998). 구체적으로는, 유 리 플라스크에 3차 탈이온수 1,000 mL을 넣은 후 여기에 1% 염화금 용액 (tetrachloroauric acid) 20 mL을 첨가하였다. 반웅을 돕기 위해 핫플레이트를 사용하여 용액을 끓였고， 금 콜로이드를 만들기 위해 환원제로써 0.2 μηι filter 를 사용하여 여과한 1% 구연산나트륨 용액 40 mL을 첨가하였다. 구연산나트륨 첨가 직후 용액은 옅은 혹색에서 적색으로 변화하였다. 10분간 가열한 후 반웅 을 중지시켰고 상온에서 서서히 넁각 시킨 후 넁장 보관하면서 추후 실험에 사용 하였다.
제조된 금 나노입자 현탁액 (1 mU에 0.5 M 카보네이트 완층용액 (pH 9.6； 1 uL)를 넣어 pH 8.0 정도로 조절하였다. 이 용액에 비가역반웅성 항체인 20E7(도 2 참조)을 10 mM 인산완층용액 (PB; NaCl 포함하지 않음)으로 150 ug/mL 농도 (100 yL)로 희석하여 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 반웅시킨 후 5% 카 제인이 포함된 PB (카제인 -PB; 122 μί)를 첨가하였고 실온에서 다시 1시간 동안 반웅시켰다. 이 흔합물을 16,000 rpm에서 30분간 원심분리한 후 상등액은 버리 고 침전물에 카제인 -ΡΒ(400 μί)를 넣어 용해시켰다. 다시 16,000 rpm에서 30분 간 원심분리한 후 상등액을 버리고 금 입자 기준으로 20배가 농축되도록 카제인 -PB(50 uL)를 넣어 용해시켰다. 실시예 Ί .2. 신호증폭 채택 시 분석시스템의 농도웅답
분석물질인 알파 2-마크로글로블린을 인간혈청으로 회석하여 0 - 10 ng/mL 농도범위의 표준시료를 제조하였고， 각 시료는 센서시스템에 장착된 센서 칩 내 로 주입되기 전에 실시예 7.1에서 제조한 탐지항체-금 나노입자 증합체 10 ng/mL 과 실온에서 10분간 반웅시켰다. 이 반웅 흔합물 (150 yL)을 실시예 6에서 제조 한 센서 칩 내로 10 μΐ 분 속도로 900초 동안 주입하여 부착반웅을 유도한 후 인간혈청을 동일한 유속으로 120초 동안 주입하여 탈착반웅을 유도하였다. 각 시료에 대한 분석이 완료된 후 실시예 4에서와 같이 센서 표면을 재생시켰다. 도 5에서， 상기 신호증폭 단계를 채택한 분석시스템의 농도웅답은 실시예 6에서 구한 비표지 센서시스템의 농도웅답과 비교하여 현저히 증가된 형태를 나 타냈으며 실제로 분석민감도는 0.1 ng/mL 수준 (도 5의 나 참조)에서 0.001 ng/niL 수준으로 약 100배 향상된 것으로 나타났다. 본 발명에서 예시한 신호증폭 방법 을 이용하면 시료 내에 매우 낮은 농도로 존재하는 분석물질도 측정이 가능하므 로 가역반응성 항체를 이용한 연속탐지 방법은 다양한 분석물질 측정에 널리 적 용될 수 있다. 실시예 8. 유속 감소 시 분석시스템의 농도웅답 패턴
의료임상 시료의 경우 특히 그 사용 양을 최소화시키는 것이 필요하므로 미세유체 흐름속도를 선행 실험조건의 1/10로 감속하여 분석시스템의 농도웅답을 구하였다. 실시예 6에서와 동일한 센서 칩을 이용하였고 유속의 감소를 제외하 고는 동일한 조건 하에서 실험을 또한 수행하였다. 시료운반용액과 표준시료 희 석용액으로 인간혈청을 사용하였고 유속은 1 μΐ 분으로 유지하였다. 표준시료 는 0 - 100 ng/mL 농도범위로 준비하였고, 시료 (15 UL)를 센서 칩 내로 주입하 여 900초 동안 부착반웅을 유도한 후 인산완충요액을 주입하여 420초 동안 탈착 반웅올 유도하였다. 표준시료를 저농도에서 고농도의 순으로 분석한 후 다시 저 농도로 돌아가는 순환형태로 분석하였다. 분석시스템의 운영과 데이터 편집은 실시예 4에서와 동일하게 수행하였고 분석이 완료된 후에는 제시한 바와 같이 센 서표면을 재생시켰다.
도 1에서， 분석물질 농도의 증감에 따른 센서의 응답은 분석물질 농도에 비례하였으며 (도 7의 가) 그 웅답패턴을 유속이 10배 빠른 조건에서 얻은 결과 (도 5의 나)와 비교해 보면， 분석민감도는 약 0.1 ng/mL 그리고 웅답시간은 640 초 (최종웅답의 95% 기준)로 일정하게 유지되는 것으로 나타났다. 또한， 농도웅 답을 그래프로 작성하여 비교해 보면 (도 7의 나) 시험된 유속 범위에서 현저한 차이가 나타나지 않았고 분석물질의 농도 증가 시 그리고 농도 감소 시 측정한 농도웅답 간에도 차이가 없었다. 특이사항으로， 유속이 상대적으로 빠를 때 (10 yL/분) 고농도 표준시료 분석 시 나타났던 과잉응답 현상 (도 5， 분석물질 농도 = 10 ng/mL에서의 웅답 참조)이 유속 감소 시 (1 μΐ7분) 현저히 완화된 것으로 나타났다 (도 7， 분석물질 농도 = 10 ng/mL 혹은 그 이상에서의 웅답 참조). 실시예 9. 지수적인 농도변화에 대한 연속측정
상기 실시예들에서는 가역반웅성 항체의 부착 및 탈착 반웅을 측정하기 위해 각 시료 분석 간에 시료운반용액 (분석물질 미포함)이 주입되는 리셋모드를 사용한 반면에， 본 실시예에서는 가역반웅성 항체의 재활용을 예시하기 위해 시 료 연속분석모드를 사용하였다. 센서 칩은 실시예 6에서 제조한 것을 사용하였 고 마크로글로블린을 인간혈청으로 희석하여 0.01 - 10,000 ng/mL 범위의 표준시 료를 준비하였다. 표준시료를 순차적으로 1 μΐ 분의 유속으로 센서 칩 내로 주 입하였고， 분석물질 농도가 900초마다 계단식으로 10배 씩 증가하고 감소하는 순 환변화 2회 반복에 대해 센서로부터의 농도웅답을 연속적으로 구하였다. 센서시 스템의 연속모드로의 운영은 센서시스템 제조사에서 설정한 리셋 분석공정과는 달리 시료주입은 제공된 주입구를 통하지 않고 시료운반용액 공급통로를 이용하 여 수행되었다. 시료 연속공급 시， 표준시료 주입 간 끓기거나 공기가 들어가지 않도록 이전 잔여 시료용액에 미리 정한 분석물질 농축액 혹은 희석액을 첨가하 여 다음 시료의 표준농도로 조정하였고 농도가 균일하도록 지속적으로 흔합하였 다.
분석 후 유출된 시료는 분취장치로 수집하였고 각 분획은 마이크로 웰 플 레이트를 고정화모체로 이용하는 샌드위치 효소면역분석에 의해 표준시료의 분석 물질 농도를 확인하였다. 분석방법은 10 mM 인산완층용액 (140 mM NaCl 포함; PH 7.4)으로 희석된 알파 2-마크로글로블린에 대해 비가역반웅성인 3D1 단일클론항체 (1 yg/mL; 100 yL)를 각 마이크로 웰 내에 가하여 고정시켰다. 세척 후, 0· 카제인 함유 10 mM 인산완층용액 (카제인 -PBS)를 200 iL 넣어 고정되지 않은 웰 잔여표면을 블로킹하였다. 다시 세척 후 분취장치에 의해 시간별로 수집된 분획 용액 (30 uL)에 0.5% 카제인 및 0.1¾> 트윈 함유 10 mM 인산완층용액 (카제인 -트원 -PBS; 70 iiL)을 추가로 주입하여 전체 시료 (100 iiL)를 항체가 고정된 웰에 넣 어 반응시켰다. 세척 후, 알파 2-마크로글로블린에 대해 비가역반웅성을 가지는 20E7 단일클론항체에 HRP가 결합된 20E7-HRP 중합체 (1 ug/mL; 100 iiL)를 카제 인-트윈— PBS로 희석하여 웰에 주입하여 반웅시켰다. 다시 세척 후， HRP 기질용 액 (실시예 1 참조)올 각 웰에 가하여 효소반웅을 수행한 후 15분에 2 M 황산올 첨가하여 정지시켰다. 각 웰에서 발생된 발색신호는 마이크로플레이트 판독기기 (VERSAmaxTM, Molecular Devices 사， 미국)를 이용하여 450 nm 흡광도에서 측정 되었다.
연속측정을 위해 미리 계산하여 설정한 각 표준시료의 농도를 연속측정 후 수집하여 위에서와 같이 면역분석을 통해 실제 농도를 확인한 결과， 계산 값 과 분석결과 간에 10% 이내의 차이가 있었으므로 계산 값을 그래프 작성에 이용 하였다. 주어진 미세유체 흐름속도 (1 mL/분)로 센서 내로 주입되는 표준시료 내 분석물질 농도의 증가 혹은 감소에 대한 센서응답은 공히 15분 이내에 평형상태 에 도달하였고 2회 반복 순환 시 높은 재현성을 나타내었다 (도 8의 가; 0.01 - 100 ng/mL 농도범위에서 시험한 결과). 이와 같은 연속측정 방식으로 측정한 센 서의 농도응답을 도식한 표준곡선 (도 8의 나)은 리셋모드로 측정한 곡선과 약간 의 차이가 발생하였는데 이것은 센서시스템의 운영차이에 의한 것으로 판단된다. 이와 같은 결과로부터 분석물질 농도의 변화에 대한 연속측정이 실제로 가능한 것으로 나타났으며 임상시험에 대한 응용가능성도 제시하였다. 실시예 10. 산술적인 농도변화에 대한 연속측정: 소아신장암 마커의 임상농도 범위에 대한 적용
분석물질의 종류에 따라 발병 혹은 증세발현 시 농도의 증감변화 패턴 (지 수적 흑은 산술적)이 다를 수 있으므로 2배씩 혹은 그 이하로 증가하고 감소하는 산술적인 농도변화에 대한 센서의 농도응답을 실시예 9에서와 같이 연속모드로 측정하였다. 본 실험에서는 모델 분석물질로 선택한 알파 2-마크로글로블린을 바 이오마커로 사용할 수 있는 소아신장암 진단을 궁극적으로 염두에 둔 최적조건을 사용하였다. 즉， 혈청시료 사용량을 최소화할 수 있도록 분석물질을 카제인 -PBS 로 희석하여 표준시료를 제조하였고 그 농도범위는 분석성능이 최적상태로 유지 될 수 있는 1 - 20 ng/mL 범위로 결정하였다. 각 표준시료를 1800초 간격으로 센서 칩 내로 주입하였고 유속은 1 μΐ 분으로 조절하였다.
도 9에서는, 산술적 수준의 연속적인 농도변화에 대한 센서의 웅답은 지 수적인 변화에 대해서와 마찬가지로 신속한 응답시간과 연속측정 재현성을 나타 내었다. 더욱이 작은 농도변화에 대해서도 민감하고 신속하게 반웅하는 것으로 미루어 가역반웅성 항체 기반의 바이오센서는 향후 매우 정확한 분석을 요구하는 분석물질의 측정에 광범위하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다. 특히， 알파 2- 매크로글로블린의 임상적으로 유효한 농도변화 범위는 3 ― 10 mg/mL로서 혈청시 료를 그대로 연속측정에 사용할 경우 하루에 1.44 mL(l iiL/분 주입속도 기준)가 소요된다. 따라서 이 시료량을 최소화하는 것이 필요하므로 본 실시예에서는 106배 낮은 농도범위로 희석하여 실제 임상테스트 시 1.44 nL/일 정도의 극소량 의 혈청 소모를 가능하게 하였다. 더욱이 이 분석조건 하에서 분석물질 농도변 화에 대한 신호변화 폭의 증가즉， 분석정확도도 향상시킬 수 있었다.
【산업상 이용가능성】
이상 설명한 바와 같이， 본 발명에 따르면 일정량의 가역반웅성 인식성분 을 연속적으로 재활용하여 분석물질 농도 변화를 실시간 측정할 수 있다. 이는 분석물질의 농도에 따라 신속하게 가역적으로 반웅하는 항체를 재활용하면 기존 의 1회용 진단 칩에 비해 구성부품 및 제작방법이 획기적으로 단순화할 수 있음 을 의미한다. 또한, 질병이나 증세에 대한 실시간 모니터링을 가능하게 하므로 만성질병 혹은 고위험군 환자에 대한 연속적인 감시가 가능하게 된다. 이 뿐만 아니라， 인공장기 제어장치， 생물테러작용제 연속탐지시스템 제품, 인수공통 감 염 병원체의 연속탐지시스템 제품， 환경오염원 연속감시시스템 제품, 생물공정 연속모니터링시스템 제품， 식품 생산공정 연속모니터링시스템 제품 등에 적용될 수 있다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
시료 유입 채널， 시료 분석 사이트 및 시료 배출 채널을 포함하는 실시간 검출장치에 있어서， 상기 시료 분석 사이트는 가역반웅성 포획 인식성분 및 시료 내의 분석물질-포획인식성분 결합체로부터 발생된 신호를 탐지하는 센서를 포함 하는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출장치.
【청구항 2]
제 1항에 있어서, 상기 가역반응성 포획 인식성분은 시료 내 분석물질과 반웅 시 부착속도상수 O 는 1 105
Figure imgf000043_0001
내지 1 108 L-mor'-sec"1, 그리고 탈착속도상수으는 1X10—3 sec—1 내지 1ΧΚΓ1 sec-1 범위의 가역반웅 특성을 가 지며 동시에 평형부착상수 0 =
Figure imgf000043_0002
1X108 L/mol 이상의 고친화력을 가지는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출장치.
【청구항 3]
제 1항에 있어서， 상기 가역반응성 포획 인식성분은 시료 내 분석물질인 생명체 대사물질， 단백질， 호르몬， 핵산， 세포， 식품검사대상 물질， 환경 유해물 질 또는 국방 화생방 측정물질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체， 수용체， 핵 산， 효소， 압타머， 펩타이드 또는 분자인쇄 인공막인 것을 특징으로 하는 분석물 질의 '실시간 연속검출 장치 .
【청구항 4] 제 1항에 있어서, 상기 센서는 분석물질 -포획 인식성분 결합체로부터 발 생된 신호를 직접 탐지하는 비표지 센서, 또는 분석물질 -포획 인식성분 결합체 밀도에 비례하여 신호를 발생시키는 표지물질을 경유하여 탐지하는 표지 센서인 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출장치.
【청구항 5】
제 4항에 있어서， 상기 비표지 센서는 표면 플라즈몬 공명 센서， 캔틸레 버 센서， 광도파로 센서， 광간섭 센서， 또는 나노센서인 것을 특징으로 하는 분 석물질의 실시간 연속 검출장치.
【청구항 6]
제 4항에 있어서, 상기 표지 센서는 표지물질로 형광체， 발광체， 효소， 금속입자， 플라스틱 입자， 자성입자， 또는 나노입자를 사용하는 형광， 발광， 발 색， 전기화학, 또는 자기장 탐지센서인 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출장치 .
【청구항 7]
제 1항에 있어서， 상기 시료 분석 사이트는 시료내 분석물질만 선택적으 로 투과시킬 수 있는 반투과성 막에 의해 구획이 나누어져 포획 인식성분이 고정 된 센서 표면쪽에 인식반웅 샐을 형성하는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시 간 연속 검출장치 .
【청구항 8]
제 7항에 있어서， 표지 센서를 이용하는 경우， 상기 인식반응 셀 내에 반 투과성 막을 통과할 수 없는 크기의 표지물질과 결합된 탐지 인식성분을 가두어 두고 재활용하는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출장치.
【청구항 9】
제 8항에 있어서， 상기 인식반웅 셀 내의 탐지 인식성분도 포획 인식성분 과 함께 연속적으로 재활용되기 위해 가역 반웅특성을 갖는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출장치.
【청구항 10】
하기 단계들을 포함하는, 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 실시 간 연속 검출장치를 이용한 분석물질의 실시간 연속 검출방법:
a) 분석물질을 포함하는 시료를 상기 시료 유입 채널을 통해 시료 분석 사이트내로 주입시키는 단계;
b) 상기 분석물질을 시료 분석 사이트내의 가역반웅성 포획 인식성분과 결합시키는 단계;
c) 상기 분석물질과 포획 인식성분의 결합에 의해 발생되는 신호를 센서 에 의해 탐지하는 단계 ;
d) 시료의 계속적 유입이나 세척액의 유입에 의해 상기 분석물질과 포획 인식성분의 결합이 탈착되어 분석물질이 상기 시료 배출 채널을 통해 배출되는 단계; 및 e) 상기 탈착된 포획 인식성분을 연속적으로 재활용하여 상기 b) 내지 d) 단계를 반복함으로써 시료내 분석물질의 농도 변화를 실시간으로 측정하는 단계.
【청구항 11】
제 10항에 있어서， 상기 c)단계에서 분석물질 -포획 인식성분 결합체로부 터 발생된 신호를 비표지 센서를 이용하여 직접 탐지하거나， 혹은 분석물질 -포획 인식성분 결합체 밀도에 비례하여 신호를 발생시키는 표지물질을 경유하여 표지 센서를 통해 신호를 측정하는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출 방법.
【청구항 12]
제 11항에 있어서， 상기 비표지 센서를 이용하는 경우 시료에 포함된 분 석물질은 시료 유입 채널을 통해 연속적으로 시료 분석 사이트 내로 유입되어 포 획 인식성분과 반웅하는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출방법.
【청구항 13]
제 11항에 있어서， 상기 표지 센서를 이용하는 경우 시료 내의 분석물질 이 표지물질이 결합된 탐지 인식성분과 사전에 반응한 후 시료 유입 채널을 통해 연속적으로 시료 분석 사이트 내로 유입되어 포획 인식성분과 반웅하거나 (연속 흐름 노출 타입)， 시료 내의 분석물질이 시료 유입 채널을 통해 연속적으로 시료 분석 사이트 내로 유입된 후 인식반응 샐 내의 표지물질과 결합된 탐지 인식성분 및 포획 인식성분과 반웅하는 (인식반웅 셀 타입) 것을 특징으로 하는 분석물질 의 실시간 연속 검출방법.
【청구항 14]
제 13항에 있어서, 상기 탐지 인식성분은 연속흐름 노출 타입의 경우 분 석물질과 미리 반웅되어 공급되므로 결합 안정성이 높은 비가역 반웅특성을 갖거 나, 인식반웅 샐 타입의 경우 포획 인식성분과 함께 탐지 인식성분도 연속적으로 재활용되기 위해 가역 반응특성을 갖는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출방법 .
【청구항 15]
제 13항에 있어서， 인식반웅 샐 타입 표지 센서를 이용하는 경우 근접해 있던 형광물질 (표지물질)과 형광에너지 수용체 간의 에너지 전달이 포획 인식성 분과 분석물질의 반웅에 의해 방해되어 형광신호가 발생하는 원리를 이용하거나， 효소분자 (표지물질) 상에 고정된 분석물질과 인식성분이 결합하면 활성이 억제되 는 것으로 알려진 효소들을 표지물질을 이용하여 포획 인식성분을 센서 상에 고 정시키지 않고 인식반웅을 액상에서 수행할 수 있는 것을 특징으로 하는 분석물 질의 실시간 연속 검출방법.
【청구항 16]
하기 단계들을 포함하는， 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 실시 간 연속 검출장치에 사용되는 가역반응성 포획 인식성분의 선별방법:
a) 포획 인식성분을 준비하는 단계; b) 상기 포획 인식성분을 센서표면에 고정된 분석물질과 결합시키는 단 계;
c) 상기 포획 인식성분과 분석물질의 결합에 의해 발생되는 신호를 센서 에 의해 탐지하는 단계 ;
d) 세척액의 유입에 의해 상기 포획 인식성분과 분석물질의 결합을 탈착 시키는 단계;
e) 상기 탈착되고 남은 포획 인식성분과 분석물질의 결합에 의해 발생되 는 신호를 센서에 의해 탐지하는 단계 ; 및
f) 상기 e)단계에서의 탐지 신호가 상기 c)단계에서의 탐지신호보다 낮아 지는 포획 인식성분을 선택하는 단계.
【청구항 17]
제 16항에 있어서， 상기 센서는 표면 플라즈몬 공명 센서， 캔틸레버 센 서， 광도파로 센서， 광간섭 센서, 또는 나노센서에서 선택된 비표지 센서인 것을 특징으로 하는 가역반웅성 포획 인식성분의 선별방법.
【청구항 18】
제 16항에 있어서， 상기 포획 인식성분은 센서표면에 고정된 분석물질과 반웅 시 부착속도상수 (ka)는 ixio5 L-mof'-sec"1 내지 1 108 L-mof'-sec"1, 그리고 탈착속도상수 (k 는 1Χ ΚΓ3 sec"1 내지 1Χ ΚΓ1 sec"1 범위의 가역반웅 특성을 가 지며 동시에 평형부착상수 (KA = ka/kd)가 1X108 L/mol 이상의 고친화력을 가지는 것을 선택하는 것을 특징으로 하는 가역반웅성 포획 인식성분의 선별방법.
【청구항 19]
제 16항에 있어서， 상기 a) 단계에서 상기 포획 인식성분은 운반용액에 희석하여 연속적으로 주입되고， 상기 f) 단계에서 시간에 따라 증가하던 신호가 감소하는 포획 인식성분을 선택하는 것을 특징으로 하는 가역반웅성 포획 인식성 분의 선별방법.
【청구항 20】
제 16항에 있어서, 상기 a) 단계에서 상기 포획 인식성분은 세척액과 순 환 반복되어 주입되고， 상기 f) 단계에서 시간에 따라 신호가 증가되었다가 초기 기준선으로 되돌아오는 신호패턴이 반복되는 포획 인식성분을 선택하는 것올 특 징으로 하는 가역반응성 포획 인식성분의 선별방법.
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