KR101482624B1

KR101482624B1 - 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치 및 방법

Info

Publication number: KR101482624B1
Application number: KR20130055411A
Authority: KR
Inventors: 김연석; 정종수; 김병찬; 정현덕; 김진영
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2013-05-16
Filing date: 2013-05-16
Publication date: 2015-01-19
Also published as: KR20140135344A; US20140342467A1

Abstract

본 발명은 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치 및 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 수계 내 존재하는 표적 물질의 농도를 연속적으로 측정할 수 있도록 한 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치 및 방법에 관한 것이다.
즉, 본 발명은 표적 물질을 선택적으로 인지할 수 있는 리셉터와, 이 리셉터를 고정한 다공성 멤브레인과, 리셉터와 반응하는 표적물질의 형광신호 세기를 연속 측정하는 센싱 유닛 등이 조합된 모니터링 장치를 이용하여, 수계 내 존재하는 표적 물질의 농도를 연속적으로 용이하게 측정할 수 있고, 수질 관리를 위해 연속적인 모니터링이 필요한 다양한 유해물질의 연속 검출장치 및 방법으로 유용하게 활용될 수 있는 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치 및 방법을 제공하고자 한 것이다.

Description

수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치 및 방법{Continuous monitoring system and method for target water pollutants}

본 발명은 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치 및 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 수계 내 존재하는 표적 물질의 농도를 연속적으로 측정할 수 있도록 한 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치 및 방법에 관한 것이다.

상수, 하수, 하천 등과 같은 다양한 수계에 존재하는 유해물질의 농도를 엄격히 규제하고 관리하여 사람들에게 오염되지 않는 물을 공급하는 것은 공공보건에 있어서 매우 중요한 문제이며, 이를 위해서는 무엇보다도 이러한 유해물질들을 지속적으로 모니터링 하는 것이 필요하다.

수계에 존재하는 유해물질들을 측정하기 위한 방법으로 현재 주로 사용되고 있는 HPLC, CG/MS, AA 등과 같은 기기분석 방법들은 검출의 정확도와 민감도가 높은 반면, 고가의 장비와 전문적인 훈련을 받은 사용자가 필요하고, 유해물질이 함유된 샘플을 분석실로 가져와서 분석해야 하므로, 시간이 많이 소요되며 분석 비용이 높다는 단점이 있다.

이러한 단점을 보완하기 위한 방법으로 최근 항체나 효소, 압타머 등과 같은 바이오리셉터 기반, 또는 고분자 재료, 무기 나노입자 등과 같은 기능성 유/무기 소재 기반의 센서 등 휴대성과 간편성이 좋은 저비용의 검출 장치 및 방법들이 개발되고 있지만, 이러한 센서 타입의 검출 장치들은 대부분 높은 간편성과 편리성 대신 검출의 민감도가 높지 않다.

특히, 수계 내 유해물질의 모니터링에 있어서 또 하나의 중요한 문제 중 하나는 이러한 기기분석적인 방법이나 센서 기술을 이용한 방법 모두 유해물질의 연속적인 측정이 불가능하다는 점에 있다.

종래기술로서, 국내공개특허 공개번호 10-2010-0088932(2010.08.11)에는 다중 수질 모니터링 센서가 개시되어 있고, 국내등록특허 등록번호 10-0337943(2002.05.13)에는 멀티 채널 연속 수중 독성 탐지 장치 및 이를 이용한 수중독성 탐지 방법이 개시되어 있으며, 또한 국내공개특허 10-2012-0101927( 2012.09.17)에는 압타머 수식 발광폴리머 리포솜을 이용한 중금속 및 유해물질 검출 센서 칩 및 그 측정장치가 개시되어 있다.

그러나, 이러한 종래기술들은 특정 유해화학물질의 연속적인 측정 및 유해물질 농도 측정이 불가능한 단점이 있다.

또한, 실시간으로 수질의 상태를 검사하는 시스템인 TMS(Tele-monitoring System)으로는 pH, 탁도, 온도, 전도도 등과 같은 일부 항목들만 측정하고, 수질 오염의 중요한 인자인 유해물질 농도의 측정항목은 제외되어 있는 이유는, 이러한 유해물질의 농도를 연속적으로 측정을 하는 것이 기술적으로 매우 어렵기 때문이다.

현재, 간헐적으로 일정 시간 간격으로 채취한 샘플을 실험실로 이송하여 전처리 과정을 거친 후 분석을 수행하여 데이터를 축적하고, 수계 내 미생물 종도 마찬가지로 정기적으로 채취한 샘플을 실험실에서 배양법을 통해 검출이 이루어지고 있으며, 분석기간이 1~3일 정도 소요될 정도로 길다.

따라서 수질 오염에 대한 빠른 대처가 어렵고 결과적으로 유해물질의 분석 결과는 사후 관리적인 측면의 용도에만 제한적으로 사용되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 점을 감안하여 안출한 것으로서, 표적 물질을 선택적으로 인지할 수 있는 리셉터와, 이 리셉터를 고정한 다공성 멤브레인과, 리셉터와 반응하는 표적물질의 형광신호 세기를 연속 측정하는 센싱 유닛을 이용하여, 수계 내 존재하는 표적 물질의 농도를 연속적으로 측정할 수 있도록 한 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치 및 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치는: 중공 컬럼관내에 장착되는 다공성의 멤브레인과; 다공성 멤브레인에 고정되어 수계 내 유해성 표적물질과 반응하는 리셉터와; 리셉터와 표적물질 간의 반응에 의해 생성 및 축적되는 신호를 연속적으로 측정하는 센싱 유닛과; 중공 컬럼관의 입구에 튜브를 매개로 연결되는 수계 샘플 용액이 저장된 저장용기; 를 포함하여 구성된 것을 특징으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 방법은: 표적물질 선택적 DNA 리셉터와, 이와 상보적으로 결합하는 상보적 DNA를 결합하여 이중 나선 DNA로 이루어진 리셉터 복합체를 만드는 단계와; 상기 리셉터 복합체를 다공성 멤브레인에 고정화시키는 단계와; 상기 리셉터 복합체가 고정된 다공성 멤브레인에 표적 물질이 포함된 용액을 연속적으로 통과시킨 후, 멤브레인 표면에서 리셉터와 표적물질 간의 반응에 의하여 발생하는 형광 신호를 연속적으로 측정하는 단계와; 연속적으로 측정된 형광신호의 변화량을 분석하여 유입되는 샘플 용액 내의 표적 물질의 순간 농도를 검출하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 과제 해결 수단을 통하여, 본 발명은 다음과 같은 효과를 제공한다.

본 발명에 따르면, 표적 물질을 선택적으로 인지할 수 있는 리셉터와, 이 리셉터를 고정한 다공성 멤브레인과, 리셉터와 반응하는 표적물질의 형광신호 세기를 연속 측정하는 센싱 유닛 등이 조합된 모니터링 장치를 이용하여, 수계 내 존재하는 표적 물질의 농도를 연속적으로 용이하게 측정할 수 있다.

또한, 본 발명의 수계 표적 물질 연속 모니터링 장치 및 방법은 수질 관리를 위해 연속적인 모니터링이 필요한 다양한 유해물질의 연속 검출장치 및 방법으로 유용하게 활용될 수 있다.

아울러, 환경 문제는 전 세계적으로 점점 더 중요한 이슈로 떠오르고 있고 국내 물 관리 기준도 계속해서 강화되는 추세이므로, 기존의 고가, 고비용의 기기분석장치나 전기화학분석 기반 등의 측정 장치와 보완적으로 활용할 수 있는 기대효과를 얻을 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치 및 방법을 나타낸 모식도,
도 2는 본 발명에 따른 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치 및 방법을 이용하여 측정된 형광 신호 및 표적물질 농도를 보여주는 그래프.
도 3은 본 발명에 따른 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치 및 방법을 이용하여, 일정 농도와 용량의 수은 이온 용액을 유속을 다르게 하여 리셉터가 고정화된 멤브레인을 통과시킨 후 얻어진 멤브레인의 형광이미지,
도 4a 및 도 4b는 본 발명에 따른 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치 및 방법을 이용하여, 일정 농도의 수은 이온 용액을 일정한 유속으로 리셉터가 고정화된 멤브레인을 통과시켰을 때 시간에 따른 멤브레인의 형광이미지 및 픽셀밀도 그래프.
도 5a 및 도 5b는 본 발명에 따른 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치 및 방법을 이용하여, 서로 다른 농도의 수은 이온 용액과 물을 일정한 유속으로 일정 시간 동안 리셉터가 고정화된 멤브레인을 통과시켰을 때 시간에 따른 멤브레인의 형광이미지 및 픽셀밀도 그래프.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명은 수계 내 유해성 표적물질에 선택적으로 결합하는 리셉터가 고정되어 있는 다공성 멤브레인을 포함하는 센싱 유닛 및 이를 이용한 표적물질 연속 모니터링 방법을 제공하고자 한 것이다.

본 발명의 수계 내 표적물질 모니터링 장치는 일반적으로 단일 측정이 이루어지는 센서 타입의 측정 장치와 달리, 표적 물질을 인지할 수 있는 리셉터를 다공성의 멤브레인에 연속적으로 통과시키면서 리셉터와 표적물질 간의 반응에 의해 생성 및 축적되는 신호를 연속적으로 측정하고, 그 측정 결과를 바탕으로 멤브레인을 통과하는 수계 샘플 내의 표적 물질의 농도를 실시간으로 측정하고자 한 것이다.

이때, 리셉터와 표적물질 간의 반응에 의하여 생성되는 신호는 수계 샘플 중의 표적물질의 누적된 양에 따라 지속적으로 증가 또는 감소하며, 이러한 신호의 변화 정도는 각 시각에서 샘플 내에 존재하는 표적 물질의 농도와 상관관계를 가진다.

여기서, 첨부한 도 1을 참조로 본 발명에 따른 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치에 대한 구성을 살펴보면 다음과 같다.

본 발명의 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치는 일정 직경의 중공 컬럼관(10)내에 장착되는 다공성의 멤브레인(12)과, 이 다공성 멤브레인(12)에 고정되어 수계 내 표적물질과 반응하는 리셉터(14)와, 리셉터(14)와 표적물질 간의 반응에 의해 생성 및 축적되는 신호를 연속적으로 측정하는 센싱 유닛(16)을 포함하여 구성된다.

또한, 상기 리셉터(14)가 고정된 멤브레인(12)이 내장된 중공 컬럼관(10)의 입구는 수계 샘플이 저장된 저장용기(18)와 튜브를 매개로 연결된다.

또한, 도 1에는 미도시되었지만 본 발명의 모니터링 장치는 상기 저장용기(16)내의 샘플 용액을 중공 컬럼관(10)내의 멤브레인(12)을 향하여 일정량으로 공급하는 유량조절 펌프를 포함한다.

이때, 상기 센싱 유닛(16)은 리셉터(14)와 표적물질 간의 반응에 의해 생성 및 축적되는 형광신호, 전기화학적신호, 전기적신호, 색변화와 같은 광학적 신호 등을 검출할 수 있는 모든 종류의 센서를 포함한다.

상기 다공성 멤브레인(12)은 실리카, 셀룰로오즈, 고분자, 메탈폼 등을 재단하여 사용하는 것이 바람직하지만, 리셉터를 고정시키는 동시에 샘플용액을 통과시킬 수 있는 모든 종류의 소재를 사용할 수 있으며, 하기의 실시예에서는 멤브레인을 실라카 재질의 다공성 멤브레인으로 사용하였다.

상기 리셉터(14)는 기능성 DNA, 압타머, 항체, 효소 등의 생체 물질과, 기능성 고분자, 무기소재 등의 유무기 소재 등 수계 내 특정 표적 물질을 선택적으로 인지할 수 있는 모든 종류의 리셉터를 포함한다.

이렇게 상기 리셉터는 표적 물질을 선택적으로 인지할 수 있는 어떠한 종류의 것도 사용 가능하지만, 본 발명의 실시예에서는 수질 관리의 주요 지표중 하나인 수은 이온을 모델 표적 물질로 선정함에 따라, 수은 이온과 선택적으로 결합할 수 있는 기능성 단일사슬 DNA를 모델 리셉터로 선정하여 설명함을 밝혀둔다.

좀 더 상세하게는, 본 발명에 사용된 수은 이온과 선택적으로 결합할 수 있는 기능성 단일사슬 DNA 즉, 수은 이온 선택적 단일사슬 DNA는 DNA 염기서열 중 티민(thymine)이 많은 T-rich ssDNA 구성되어 있으며, 이 기능성 단일사슬 DNA는 많은 선행 연구들을 통해서 수은 이온에 대해 매우 높은 선택성을 갖고 있는 것이 확인되고 있다(Angew. Chem. Int. Ed. 46 (2007) 4093?4096; Chem. Soc. Rev. 40 (2011) 5855-5866).

하기에서 설명하는 바와 같이, 상기 리셉터(14)는 표적물질 선택적 DNA 리셉터와, 이와 상보적으로 결합할 수 있는 DNA(complementary)를 결합하여 이중 나선 DNA로 이루어진 리셉터 복합체(도 1에 이중 나선 DNA로 도시됨)로 사용하는 것이 바람직하다.

여기서, 본 발명에 따른 따른 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치의 제조예 및 이를 이용한 표적물질 연속 모니터링 방법을 설명하면 다음과 같다.

a) 먼저, 표적물질 선택적 DNA 리셉터와, 이와 상보적으로 결합할 수 있는 DNA(complementary)를 결합하여 이중 나선 DNA로 이루어진 리셉터 복합체를 만드는 단계가 선행된다.

b) 이어서, 상기 리셉터의 고정화를 위해 실리카 멤브레인의 표면 기능화 단계가 진행된 후, c) 상기 리셉터 복합체를 다공성 멤브레인에 고정화시키는 단계가 진행된다.

d) 다음으로, 표적 물질이 포함된 용액을 연속적으로 멤브레인을 통과시킨 후, 멤브레인 표면에서 리셉터와 표적물질 간의 반응에 의하여 발생하는 형광 신호를 연속적으로 측정하는 단계와, e) 연속적으로 측정된 형광신호의 변화량을 분석하여 유입되는 샘플 용액 내의 표적 물질의 순간 농도를 검출하는 단계가 순차 진행된다.

특히, 상기 a)단계에서 사용되는 DNA중 표적물질 선택적 리셉터 DNA는 형광 억제물질(acceptor)로, 리셉터 DNA와 상보적인 DNA는 양쪽에 형광물질(donor)과 기능기(functional group)로 표지된 DNA를 사용한다.

여기서, 본 발명에 따른 따른 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치의 제조예 및 이를 이용한 표적물질 연속 모니터링 방법을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

(1) 표적물질 선택적 이중나선 DNA 리셉터 복합체 제조

리셉터의 제조 단계로서, 표적물질 선택적 DNA 리셉터와, 이와 상보적으로 결합할 수 있는 DNA(complementary)를 결합하여 이중 나선 DNA로 이루어진 리셉터 복합체를 만든다.

표적물질을 선택적으로 인지할 수 있는 표적물질 선택적 DNA 리셉터로서 단일 사슬의 기능성 DNA 또는 압타머(aptamer)를 사용하는 바, 이 단일사슬 DNA 리셉터의 한쪽 끝에는 형광신호를 억제할 수 있는 억제물질을 표지한다.

또한, 표적물질 선택적 DNA 리셉터와 상보적으로 결합할 수 있는 DNA는 단일사슬 DNA 리셉터와 상보적인 염기서열을 가진 DNA를 사용한다.

이때, 상기 단일사슬 DNA 리셉터(이하, DNA 리셉터로 혼용 기재함)와 상보적인 염기서열을 갖는 DNA(이하, 상보적 DNA로 혼용 기재함)는 그 양쪽 끝에 각각 형광을 낼 수 있는 형광물질과 멤브레인에 고정화하기 위한 아민기가 기능화된 것을 사용한다.

다음으로, 두 개의 서로 상보적인 단일 사슬 DNA 즉, 단일사슬 DNA 리셉터와 이와 상보적인 염기서열을 갖는 DNA를 결합하여 이중 나선 DNA를 만들기 위하여, NaCl이 포함된 인산염 버퍼에 리셉터 DNA와 상보적 DNA를 넣은 후, 35~42℃에서 5시간 이상 반응시킨다.

이와 같이 이중 나선 DNA 리셉터 즉, 리셉터 복합체가 만들어지면, 상보적 DNA 끝에 표지된 형광물질에서 발산되는 형광은 하기와 같이 형광신호의 측정이 원활하게 이루어질 수 있도록 리셉터 DNA 끝에 표지된 억제물질(quencher)에 의해 일단 그 외부 발산이 억제된다.

최종적으로, 상기 리셉터 DNA와 상보적 DNA의 결합이 잘 이루어 졌는지 확인하기 위하여, 결합 반응 전과 후의 형광 세기를 측정하여 비교해 보는 것이 바람직하다.

(2) 멤브레인 표면 기능화 및 리셉터 복합체 고정화

상기 DNA 리셉터를 고정화할 수 있고, 용액의 통과가 쉬운 다공성의 멤브레인 소재로서, 실리카나 셀룰로오즈, 고분자, 메탈폼 등의 다양한 소재가 사용될 수 있으며, 멤브레인의 소재에 따라 리셉터의 고정화 방법이 달라질 수 있다.

여기서는 멤브레인 소재들 중 실리카 멤브레인을 선정하여, 그 위에 DNA 리셉터를 고정화하는 방법을 살펴보기로 한다.

상기 리셉터 복합체 즉, 이중 나선 DNA 리셉터를 실리카 멤브레인 표면에 고정화하기 위해서는 먼저 멤브레인 표면을 화학적으로 기능화하여야 한다.

이를 위해, 첫 번째로 실리카 멤브레인은 아미노실란 물질로 기능화한다.

이때, 아민기가 기능화된 DNA 리셉터의 고정화를 위해 아민 처리된 멤브레인 표면을 다시 양쪽에 카르복실기가 있는 화학물질로 기능화하고, 다시 커플링 물질을 처리한 후, 아민기가 있는 DNA 리셉터 복합체를 처리하여 고정화한다.

또한, 끝이 카르복시산으로 기능화된 DNA 리셉터를 고정화할 경우, 아미노실란 처리된 멤브레인의 표면을 커플링 물질로 활성화한 후, 바로 리셉터를 주입하여 고정화시킨다.

마지막으로 리셉터가 고정화되지 않은 멤브레인 표면은 블락킹 용액을 처리하여 비특이적 흡착을 최소화할 수 있도록 한다.

이와 같이, 고정화 과정이 완료된 후에는 증류수를 이용하여 멤브레인 표면에 남아있는 화학물질들을 완전히 제거하고, 멤브레인 표면에 DNA 리셉터를 고정화하는 방법을 최적화하기 위해 형광물질이 표지된 상보적인 DNA만을 멤브레인 표면에 고정화한 후, 멤브레인 표면에서 나타나는 형광신호의 세기를 측정한다.

(3) 수계 샘플의 연속 주입 및 신호 측정

먼저, 도 1에 도시된 바와 같이 상기 리셉터(14)가 고정화된 멤브레인(12)이 내장된 중공 컬럼관(10)의 입구에 튜브를 연결하고, 튜브의 한쪽 끝을 표적 물질이 포함된 수계 용액이 담겨있는 저장용기(18)에 담근다.

이어서, 펌프를 이용하여 일정한 농도의 표적물질 용액을 연속적으로 주입하거나 서로 다른 농도의 표적물질 용액 또는 표적물질이 존재하지 않는 물을 순차적으로 주입하면서 멤브레인 표면에서 발현되는 형광세기를 센싱 유닛(16)을 이용하여 측정한다.

이때, 상기 수계 용액의 유속은 일정하게 유지되어야 하며, 최적의 유속 값은 멤브레인의 상태와 표적 물질의 물리화학적 특성, 리셉터의 종류에 따라 다를 수 있으므로 각각의 시스템에서 다르게 구해져야 한다.

만일, 유속이 너무 빠르면 표적 물질이 멤브레인을 통과할 때 표면의 리셉터와 반응 할 수 있는 시간이 충분하지 않아 얻어지는 신호의 값이 낮아질 수 있고, 유속이 너무 느리면 표적 물질과 리셉터와의 반응은 잘 이루어지지만 많은 양의 샘플의 측정이 어렵고 축적되는 신호의 증가가 느리게 나타난다는 문제가 생길 수 있으므로, 멤브레인의 상태와 표적 물질의 물리화학적 특성, 리셉터의 종류에 따라 수계 용액의 유속을 일정하게 조절하도록 한다.

(4) 축적된 신호로부터 샘플 내의 표적물질의 순간 농도를 실시간으로 분석하는 방법

위와 같이, 표적물질을 포함하는 수계용액이 멤브레인을 통과할 때, 멤브레인에 고정된 상보적 DNA(도 1에 F로 표시됨)와 이중나선 구조로 결합되어 있던 리셉터 DNA(도 1에 Q로 표시됨)가 표적물질과 결합되어 상보적 DNA로부터 분리되고, 표적물질과 같이 멤브레인을 통과하게 된다.

이때, 상기 상보적 DNA 끝의 형광 물질의 형광 발현을 억제하고 있던 억제물질이 리셉터 DNA와 표적 물질이 결합된 복합체와 함께 분리되어 유실되므로, 상보적 DNA 말단의 형광물질 발현이 회복되어 멤브레인 표면에서 형광신호가 증가하게 된다.

따라서, 첨부한 도 2에서 보듯이, 상기 형광신호의 증가는 멤브레인을 통과하는 표적물질의 양에 비례하여 축적되어 증가하게 되고, 샘플 용액에 있는 표적물질의 농도가 높을수록 형광신호의 증가속도가 높아지게 된다.

물론, 용액 샘플에 표적 물질이 없는 경우 형광신호의 증가는 나타나지 않는다.

이러한 형광신호의 세기는 일정 시간 간격으로 연속적으로 측정되며, 표적물질의 농도를 모르는 실제 샘플의 연속적인 모니터링을 수행하고자 할 때, 멤브레인을 통과하는 순간의 샘플내 표적물질 농도는 축적되는 형광 누적신호의 변화속도의 함수로 표시할 수 있다.

이때, 상기 형광신호의 세기가 포화되면, 멤브레인 및 리셉터를 교체한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하겠는 바, 하기의 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예

수은 이온 용액과 선택적으로 결합할 수 있는 DNA 리셉터가 고정화되어 있는 다공성의 멤브레인을 제작하기 위해 다음과 같은 방법이 사용되었다.

먼저, 수은 이온 특이적 DNA 리셉터(R-DNA)는 3' 말단에 형광억제 물질을 표지하였고, 리셉터와 상보적 염기서열을 가진 DNA(C-DNA)는 5' 과 3'말단에 각각 형광물질과 아민기를 표지하였다(㈜제노텍).

이들의 염기서열은 다음과 같다.

R-DNA: 5'-TTCTTTCTTCCCTTGTTTGTT-Dabcyl-3',

C-DNA: 5'-FAM-AAGAAAGAAGGGAACAAACAA-C7-NH2-3'.

이 두 DNA를 결합(hybridization)하기 위해 2 uM의 R-DNA와 C-DNA를 각각 50 ul씩 1 M의 NaCl 이 포함된 인산염 버퍼 용액(PBS, pH 7.4) 400 ul에 넣어준 후, 35~42℃에서 5시간 이상 혼합하였다.

혼합하기 전과 후의 용액의 형광신호 값은 각각 842.3와 4.2로 대부분의 R-DNA와 C-DNA가 결합하였음을 확인하였고, 이때 형광신호의 세기는 형광분광기(LS50B, PerkinElmer)를 이용하여 분석하였다.

R/C-dsDNA 리셉터 복합체를 고정화하기 위한 멤브레인으로 "Invitrogen" 사에서 제공하는 플라스미드 DNA 정제 키트(PureLink Quick Plasmid Miniprep kit)에 포함되어 있는 컬럼 유닛(Quick plasmid mini column)을 이용하였고, 이 유닛은 750 ul 볼륨의 컬럼과 실리카 멤브레인으로 구성되어 있다.

아민기로 기능화되어 있는 DNA를 표면에 고정화하기 위해 먼저 실리카 멤브레인에 1~5 % 아미노실란(APTES, (3-Aminopropyl)triethoxysilane in anhydrous toluene)을 떨어뜨리고 24시간 이상 동안 처리하였다.

또한, 멤브레인을 펌프를 이용하여 무수 톨루엔과 증류수, 에탄올, 증류수 순으로 두 차례 씻어주어 멤브레인에 흡착되어 있는 아미노실란 물질을 제거하였다.

이어서, 커플링 물질(Sulfo-NHS and EDC)을 넣고 1~2 시간 동안 반응시킨 후, 원심분리를 통해 커플링 물질을 제거하였다.

다음으로, 멤브레인 표면을 카르복시기로 기능화하기 위해 카르복시기를 양쪽에 가지고 있는 1~5 % 숙신산(Succinic acid) 용액을 처리하고, 24시간 이상 동안 반응시켰다.

연이어, 증류수로 다시 멤브레인을 세척한 후 다시 커플링 물질(Sulfo-NHS and EDC)을 넣고 1~2시간 동안 반응시켰다.

마지막으로 아민기가 표지되어 있는 R/C-dsDNA 리셉터 복합체 (또는 C-DNA) 1uM, 100 ul를 주입하고 2시간 이상 반응하였고, DNA와 반응하고 남아있는 멤브레인 표면의 활성화되어 있는 카르복시기는 에탄올아민 용액(0.1 M)을 이용하여 블라킹 처리하였으며, 멤브레인은 최종적으로 증류수로 세척하였다.

한편, DNA 리셉터의 고정화 방법의 효율을 확인하기 위해 형광이 억제되어 있지 않은 C-DNA를 멤브레인에 동일한 방법으로 고정화하였다.

C-DNA를 고정 처리한 후 원심분리를 통해 멤브레인을 통과한 용액의 형광세기를 형광분광기를 이용하여 측정한 결과, 멤브레인에 주입한 C-DNA 용액 원액의 형광세기의 37.5 %에 해당하는 결과를 얻어 대략적으로 주입된 C-DNA의 60 % 가량이 멤브레인 표면에 고정화되었다는 것을 질량 보정을 통해 간접적으로 확인할 수 있었다.

보다 직접적으로 멤브레인 표면에 리셉터 DNA가 고정화된 것을 확인하기 위하여, C증류수만으로 처리된 멤브레인과 표면의 형광세기를 비교하였다.

우선, 컬럼 유닛에서 멤브레인을 회수한 후 자외선 조사기(ECX-F20.M, VILBER LOURMAT) 위에 올려놓고 디지털 카메라(Canon G12, ISD sensitivity: 100)를 이용하여 멤브레인의 형광 이미지를 얻었다.

얻어진 형광 이미지는 이미지 분석 프로그램(ImageJ)을 이용하여 형광세기를 분석하였는 바, 증류수만로 처리된 멤브레인의 형광세기는 25.8로 기본 값을 나타냈고, C-DNA(1 uM, 100 ul)를 고정화시킨 멤브레인의 형광세기는 160.5의 높은 값을 나타내어 리셉터 DNA가 멤브레인 표면에 잘 고정화된 것을 확인할 수 있었다.

실험예 1

상기의 실시예와 같이 리셉터가 고정화된 다공성 멤브레인을 이용하여 연속적인 수은 이온 모니터링 실험을 수행하기에 앞서 수은 이온의 연속적인 멤브레인 통과가 실제 형광신호를 효과적으로 생성할 수 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

실시예에서와 같은 방법으로 리셉터 복합체를 실리카 멤브레인에 고정화한 후, 각각 증류수, 100 ppm 수은 이온 용액 500 ul, 1 ppm 수은 이온 용액 500 ul를 컬럼에 넣어주며 멤브레인을 통과시킨 경우들과; 1 ppm의 수은 이온 용액 50 ml를 1, 5, 10, 50 ml/min 으로 각각 유속을 달리하여 멤브레인을 통과시킨 경우에 대하여 멤브레인 표면에서 발산되는 형광세기를 측정하여 비교하였다.

그 결과, 도 3의 좌측에서 첫번재 및 세번째 이미지에서 보듯이 증류수와 1 ppm 수은 이온 용액 500 ul를 통과시킨 경우 매우 약한 형광 이미지를 얻었고, 두번째 이미지에서 보듯이 100 ppm 수은 이온 용액 500 ul의 경우에는 강한 형광 이미지를 얻었다.

또한, 도 3의 좌측에서 네번째 내지 일곱번째 이미지에서 보듯이, 1 ppm의 수은 이온 용액 50 ml를 유속을 증가시키며 통과시킨 경우에는 유속이 1, 5, 10, 50 ml/min 순으로 증가함에 따라 형광 이미지의 강도가 약하게 나타남을 알 수 있었으며, 이는 용액 속에 포함된 수은 이온의 이동 속도가 너무 빨라 멤브레인 표면의 수은 이온 리셉터와 충분히 반응할 시간이 없기 때문일 것으로 추정된다.

또한, 1 ml/min 으로 흘려준 경우, 결과적으로 동일 양의 수은 이온(50 ug)이 멤브레인 표면의 수은 이온 리셉터와 반응하여 강한 형광 이미지를 얻었던 100 ppm, 0.5 ml 수은 이온 용액이 통과된 멤브레인의 형광세기와 비교하여, 95 % 정도의 형광세기를 보여주어, 1 ml/min 의 느린 유속에서는 샘플 용액을 멤브레인을 통과시켜 주는 경우에도 표적물질과 리셉터가 반응할 수 있는 시간이 충분한 것으로 추정된다.

실험예 2

일정 농도의 수은 이온 용액이 일정한 유속으로 멤브레인을 통과할 경우, 형광 신호가 멤브레인을 통과하는 수은 이온 용액의 양(또는 시간)에 비례하여 선형적으로 증가하는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

상기한 실시예에서와 같은 방법으로 리셉터 복합체를 실리카 멤브레인에 고정화한 후, 1 ppm의 수은 이온 용액을 5 ml/min의 유속으로 각각 1, 5, 10, 30 분 동안 멤브레인을 통과시킨 후 멤브레인 표면의 형광세기를 분석하였다.

그 결과, 도 4a 및 도 4b에서와 같이 멤브레인을 통과한 수은 이온 용액의 양(또는 시간)에 비례하여 형광의 세기가 선형적으로 증가하는 것을 확인하였으며, 펌프의 유량이 동일할 경우 그래프의 시간에 따른 형광신호 증가의 기울기와 샘플의 수은 이온 농도는 비례적 상관관계를 가질 것으로 예측할 수 있다.

위에서 얻어진 결과들을 바탕으로 신호축적기반의 다공성 멤브레인 유닛을 이용한 수은 이온의 연속적인 모니터링 가능성을 확인하기 위해 리셉터 복합체를 실리카 멤브레인에 고정화한 후, 멤브레인에 서로 다른 농도의 수은 이온 용액과 증류수를 순차적으로 통과시켰을 때, 멤브레인 표면의 형광신호 세기의 변화를 분석하였다.

유속은 5 ml/min으로 고정하였고, 각각의 샘플을 증류수, 0.5 ppm 수은 이온 용액, 증류수, 1 ppm 수은 이온 용액, 증류수, 0.5 ppm 수은 이온 용액, 증류수 순으로 순차적으로 멤브레인을 통과시켰다.

그 결과, 도 5 a 및 도 5b에서와 같이 증류수를 통과시켰을 때에는 형광신호의 변화가 매우 미약하였고, 수은 이온 용액을 통과시켰을 경우에는 형광이미지의 강도가 증가하였고, 또한, 형광세기의 증가 속도는 샘플의 수은 이온의 농도에 비례하였다.

이와 같이, 멤브레인을 통과하는 순간의 수계 샘플의 수은 이온 농도는 축적되어지는 형광 신호의 증가 속도의 함수로 표시할 수 있어, 형광세기 누적 값의 연속적인 측정과 형광세기 변화속도의 분석을 통해 역으로 각 시간에서의 샘플의 수은 이온 농도를 추적하여 모니터링할 수 있음을 확인할 수 있었다.

10 : 컬럼관
12 : 멤브레인
14 : 리셉터
16 : 센싱 유닛
18 : 저장용기

Claims

중공 컬럼관(10)내에 장착되는 다공성의 멤브레인(12)과;
상기 다공성 멤브레인(12)에 상보적 DNA 결합으로 고정되어 수계 내 유해성 표적물질과 반응하는 다수의 리셉터(14)와;
상기 다수의 리셉터(14)와 표적물질 간의 반응에 의해 생성 및 축적되는 신호를 연속적으로 측정하는 센싱 유닛(16);을 포함하여 구성되고, 상기 리셉터(14)가 부착된 상기 멤브레인(12)은 교체가 가능하며,상기 센싱 유닛으로부터 시계열적으로 상기 누적 신호를 측정하여 상기 표적물질의 농도를 검출하는 것을 특징으로 하는 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치.
청구항 1에 있어서,
상기 중공 컬럼관(10)의 입구는 수계 샘플이 저장된 저장용기(18)와 튜브를 매개로 연결되는 것을 특징으로 하는 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치.
청구항 1에 있어서,
상기 중공 컬럼관(10)내의 멤브레인(12)을 향하여 샘플 용액을 일정량으로 공급하는 유량조절 펌프를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치.
청구항 1에 있어서,
상기 센싱 유닛(16)은 리셉터(14)와 표적물질 간의 반응에 의해 생성 및 축적되는 형광신호, 전기화학적신호, 전기적신호, 색변화와 같은 광학적 신호 중 선택된 하나의 신호를 검출하는 것으로 채택되는 것을 특징으로 하는 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치.
청구항 1에 있어서,
상기 다공성 멤브레인(12)은 실리카, 셀룰로오즈, 고분자, 메탈폼 중에서 선택된 재료를 재단하여 채택된 것임을 특징으로 하는 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치.
청구항 1에 있어서,
상기 리셉터(14)는 기능성 DNA, 압타머, 항체, 효소를 포함하는 생체 물질과, 기능성 고분자, 무기소재, 유무기 소재 중 수계 내 특정 표적 물질을 선택적으로 인지할 수 있는 것으로 채택된 것을 특징으로 하는 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치.
청구항 1에 있어서,
상기 리셉터는 수질 관리의 주요 지표중 하나인 수은 이온을 표적물질로 선정하는 경우, 수은 이온과 선택적으로 결합할 수 있는 기능성 단일사슬 DNA로 채택된 것을 특징으로 하는 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치.
청구항 1에 있어서,
상기 리셉터는 단일사슬 DNA 리셉터와, 단일사슬 DNA 리셉터와 상보적인 염기서열을 갖는 상보적 DNA를 이중 나선 구조로 결합시킨 리셉터 복합체로 채택된 것을 특징으로 하는 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치.
청구항 8에 있어서,
상기 상보적 DNA의 양쪽 끝에는 각각 형광을 낼 수 있는 형광물질과 멤브레인에 고정화하기 위한 아민기가 기능화된 것을 특징으로 하는 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치.
청구항 8에 있어서,
상기 단일사슬 DNA 리셉터의 한쪽 끝에는 형광신호를 억제할 수 있는 억제물질을 표지되는 것을 특징으로 하는 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 장치.
표적물질 선택적 DNA 리셉터와, 이와 상보적으로 결합하는 상보적 DNA를 결합하여 이중 나선 DNA로 이루어진 리셉터 복합체를 만드는 단계와;
상기 리셉터 복합체를 교체가 가능한 다공성 멤브레인에 상보적 DNA 결합으로 고정화시키는 단계와;
상기 리셉터 복합체가 고정된 다공성 멤브레인에 표적 물질이 포함된 용액을 연속적으로 통과시킨 후, 멤브레인 표면에서 리셉터와 표적물질 간의 반응에 의하여 누적되어 발생하는 형광 신호를 시계열적으로 연속 측정하는 단계와;
연속적으로 측정된 형광신호의 변화량을 분석하여 유입되는 샘플 용액 내의 표적 물질의 순간 농도를 검출하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 방법.
청구항 11에 있어서,
상기 리셉터 복합체를 다공성 멤브레인에 고정화시키기 전에 멤브레인 표면을 화학적으로 기능화시키는 것을 특징으로 하는 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 방법.
청구항 11에 있어서,
상기 리셉터 복합체가 고정화되지 않은 멤브레인 표면에는 블락킹 용액으로 처리되는 것을 특징으로 하는 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 방법.
청구항 11에 있어서,
상기 리셉터 복합체와 표적물질 간의 반응 전까지, 리셉터 복합체의 상보적 DNA의 끝에 표지된 형광물질에서 발산되는 형광은 리셉터 DNA의 끝에 표지된 억제물질에 의해 외부 발산이 억제되는 것을 특징으로 하는 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 방법.
청구항 11에 있어서,
상기 다공성 멤브레인에 표적 물질이 포함된 용액을 연속적으로 통과시킬 때, 표적물질이 리셉터 DNA와 결합되는 동시에 표적물질의 흐름력에 의하여 리셉터 DNA가 상보적 DNA로부터 분리되어, 상보적 DNA 끝의 형광 물질의 형광 발현이 이루어지는 것을 특징으로 하는 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 방법.
청구항 11에 있어서,
상기 형광 신호를 연속적으로 측정하는 단계에 있어서,
상보적 DNA의 형광 물질의 형광 발현에 따른 형광신호는 멤브레인을 통과하는 표적물질의 양에 비례하여 축적되어 증가하고, 표적물질의 농도가 높을수록 형광신호의 증가속도가 높아지는 것을 특징으로 하는 수계 내 표적 유해물질 연속 모니터링 방법.
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