ITMI20060477A1 - Metodo di misurazione di interazioni molecolari mediante rilevazione di luce riflessa da superfici - Google Patents
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Description
Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:
“METODO DI MISURAZIONE DI INTERAZIONI MOLECOLARI MEDIANTE RILEVAZIONE DI LUCE RIFLESSA DA SUPERFICI”
La presente invenzione riguarda un metodo semplice ed efficiente per la determinazione quantitativa di interazioni di ligandi con recettori adsorbiti sulla superficie di un materiale solido mediante misurazione diretta dell’intensità di luce riflessa.
Più in particolare, la presente invenzione si riferisce ad un metodo per la determinazione quantitativa di interazioni di ligandi con recettori nel quale si utilizzano superfici planari di materiali con indice di rifrazione compreso tra 1.320 e 1.340.
Nell’arte nota sono stati proposti numerosi metodi per determinare interazioni tra ligandi e recettori, cioè le affinità di legame (binding affinities) di sistemi reversìbili ligando-recettore, di interesse chimico, biochimico o biologico. Un elenco delle principali metodologie è riportato in Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, pagina 2785. Le metodologie note comprendono in genere l’immobilizzazione del recettore su una appropriata superficie piana e la misurazione, diretta o indiretta, delle variazioni di certe proprietà della superficie, ad esempio ottiche, dopo che i ligandi sono stati messi a contatto con la superficie. Dette variazioni sono indotte dalla formazione di coppie recettore-ligando.
Una classe di metodi richiede l’etichettatura (labelling) del ligando in soluzione, cioè la modifica covalente del ligando con specie fluorescenti, luminescenti o radioattive (si veda ad esempio la domanda di brevetto US 2004/0014060 Al). Tuttavia occorre notate che la modifica del ligando è un’operazione molto complessa e lunga, e difficilmente può essere impiegata in prove di screening dove viene usata una notevole varietà di ligandi. Inoltre il metodo richiede un’operazione aggiuntiva di allontanamento dal sistema, mediante lavaggio (washing out), dei ligandi liberi, cioè di quelli che non hanno interagito coi recettori e che interferiscono con la misurazione. Un ulteriore svantaggio di detto metodo è che l’interazione ligando-recettore può essere influenzata dalla modifica chimica del ligando in seguito al labelling.
Un’altra classe di metodi che simulano più efficacemente le interazioni recettore-ligando (ad esempio quelle che avvengono sulla superfìcie di una membrana cellulare) sfrutta direttamente le variazioni indotte su una superficie dalla formazione del legame nella coppia recettore-ligando, senza modificare il ligando con sostanze labelling. Un esempio di detto metodo usa il biosensore BIAcore, commercializzato da Pharmacia Biosensor AB (Uppsala, Sweden) descritto ad esempio nei brevetti USP 5.313.264, e USP 5.374.563. In questo biosensore, basato sul principio della Surface Plasmon Resonance (SPR) (si veda l’articolo Jiri Homola, Sinclair S. Yee, Gunter Gauglitz, Surface plasmon resonance sensors: review, Sensors and Actuators B, voi. 54 (1999), pages 3-15) un’onda ottica evanescente si accoppia con plasmoni superficiali di strati sottili (50 nm) di materiali conduttori quali argento o oro, e genera un fenomeno di risonanza a specifici angoli. Questo permette di determinare la variazione dell’indice di rifrazione dello strato di materiale adsorbito sul metallo, ad esempio una coppia ligando-ricettore. Da questa variazione si ricavano le costanti di legame tra Iigando e recettore.
Questo metodo, pur essendo molto usato in pratica, è piuttosto complesso e costoso e non è sempre accurato nella determinazione delle costanti di legame. Si veda ad esempio la pubblicazione “Use of surface plasmon resonance to probe thè equilibrium and dynamic aspects of interactions between biological macromolecules”, di Peter Schuck, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 1997, 26; pp. 541-66. Detto metodo, infatti, si basa su una rilevazione indiretta della massa adsorbita mediante l’effetto che essa ha sulla velocità di propagazione di un plasmone, che a sua volta determina l’angolo di accoppiamento di un fascio laser.
I problemi legati all’uso del metodo BIAcore per la determinazione delle costanti di legame (binding constante) dipendono in gran parte dalla complessità del metodo:
- il segnale misurato dipende dalle proprietà fisiche di ben cinque materiali tramite una dipendenza funzionale complessa che include parametri non noti a priori. I cinque materiali menzionati sono: supporto di vetro o materiali affini, strato sottile di conduttore deposto sul supporto, strato polimerico che consente la funzionalizzazione della superficie metallica, molecole che aderiscono per interazione e soluzione acquosa;
- la sensibilità e l’accuratezza della misura dipendono fortemente dallo spessore e dalla qualità superficiale dello strato di materiale conduttore che costituisce il sensore (si veda l’articolo “Optical properties and instrumentai performance of thin gold films near thè surface plasmon resonance” di H. Neff et al., Thin Solid Films, 2006, 496, pp. 688-697);
- le misure si basano sulla rilevazione deH’intensità luminosa a vari angoli, questo richiede una strumentazione capace di scansioni angolari ad elevata risoluzione ed è quindi costituita da parti in movimento ad alta precisione o da matrici di fotorivelatori di adeguata risoluzione spaziale (si veda l’articolo “Quantitative interpretation of thè response of surface plasmon resonance sensors to adsorbed films” di L.S. Jung et al. Lngmuir, 1998, 14, pp.
5636-5648).
Tali problemi si manifestano:
1) nella non coerenza tra i valori di costante di affinità determinati attraverso le cinetiche di adsorbimento e quelli ricavati all’equilibrio;
2) nell’impossibilità di stimare a priori l’ampiezza del segnale che si genera in seguito alla formazione sulla superficie di coppie recettore-ligando, dato che il segnale dipende da parametri non noti a priori.
Un ulteriore metodo recentemente proposto dagli inventori della presente domanda di brevetto è basato sull’uso di nanoparticelle di polimero idrofobico amorfo avente indice di rifrazione prossimo a quello dell’acqua e permette la rivelazione di interazioni ligando-recettore mediante la misura dell’intensità della luce diffusa (brevetto PCT/EP2005/009955 del 16.09.2005). Detto metodo supera i limiti già evidenziati evitando le operazioni di etichettatura dei ligandi e di lavaggio, e che potesse funzionare in condizioni di equilibrio termodinamico, evitando gli inconvenienti di metodi indiretti quali ad esempio il BIAcore. Detto metodo, tuttavia, presenta la importante limitazione di non consentire la misura di interazioni nelle quali i ligandi siano multivalenti in quanto tali ligandi possono dar luogo ad aggregazione delle particelle e pertanto produrre contributi all’intensità di luce diffusa non dovuti all’interazione ligando-recettore.
Era quindi sentita l’esigenza di avere a disposizione un metodo semplice per la determinazione di interazioni tra ligandi e recettori che sfruttasse direttamente le variazioni indotte dall’interazione ligando-recettore su una superficie, che presentasse i vantaggi del metodo descritto nel brevetto PCT/EP2005/009955 del 16.09.2005 ma che consentisse l’impiego del metodo anche nello studio di ligandi multivalenti, presentando, infatti, la maggior parte di ligandi di interesse biologico e farmacologico molteplici siti di legame. In particolare era sentita l’esigenza di un metodo ad alta sensibilità di rilevazione, che non necessitasse di numerosi strati di diversi materiali nella realizzazione del sensore, il cui segnale fosse rilevabile tramite strumentazione di semplice costruzione e quantitativamente interpretabile in base a parametri noti a priori, superando, in tal modo, gli inconvenienti della tecnica nota.
E stato ora inaspettatamente e sorprendentemente trovato che è possibile ovviare ai suddetti inconvenienti con un metodo ottico quantitativo che permette la determinazione delle affinità di legame (binding affìnities) di specie molecolari in equilibrio termodinamico mediante il metodo qui di seguito descritto.
Costituisce oggetto della presente invenzione un metodo per la determinazione della costante di legame di due specie molecolari interagenti utilizzando misurazioni di intensità di luce riflessa, comprendente le seguenti fasi:
a) addizione - ad una soluzione acquosa in contatto con una superficie planare liscia o rugosa di materiale solido trasparente costituito da un polimero idrofobico amorfo avente un indice di rifrazione compreso tra 1.3200 e 1.3400, preferibilmente tra 1.3300 e 1.3350 -di una successione di volumi noti di una soluzione acquosa di una miscela contenente da 1 nanogrammo/ml a 10 milligrammi/ml in concentrazione di molecole con la funzione di recettori, quali anticorpi o altri complessi proteici ovvero tensioattivi anfìfilici terminati con un recettore, eventualmente miscelate ad altre molecole (intercalanti) che non hanno funzione di recettore, misurando dopo ogni addizione l’intensità della luce riflessa dall’interfaccia tra la soluzione acquosa e il materiale solido suddetto e riportando il valore misurato all’ equilibrio su un diagramma in funzione della concentrazione di recettori progressivamente addizionati, fino al raggiungimento di un valore asintotico dell’ intensità di luce misurata;
b) addizione alla soluzione ottenuta nella fase a) di una successione di volumi noti di una soluzione acquosa di un ligando, misurando dopo ogni addizione l’intensità della luce riflessa dall’interfaccia tra la soluzione acquosa e il materiale polimerico e riportando il valore misurato all’equilibrio su un diagramma in funzione della concentrazione di ligandi [T0] progressivamente addizionati, fino al raggiungimento di un valore asintotico e interpolando (fitting) i dati di intensità di luce riflessa I in funzione delle aggiunte di ligando con la formula:
dove
I0rappresenta l’intensità di luce incidente sull’interfaccia,
c è un fattore che tiene conto della rugosità della superfìcie e vale 1 solo nel caso di superficie planare,
INè l’intensità di luce misurata dal rivelatore in assenza dell’interfaccia,
φ è l’angolo formato dalla direzione di polarizzazione della luce con il piano di incidenza,
R<1>e R<11>sono i coefficienti di riflessione ricavati dalle formule di Fresnel per uno strato sottile rispettivamente nel caso di polarizzazione perpendicolare e parallela al piano di incidenza e dipendono dalla quantità di ligando in contatto con i recettori adsorbiti sull’interfaccia secondo la formula di adsorbimento di Langmuir, da cui si ottiene la costante K di legame recettore-ligando.
La quantità di ligando legato al recettore in funzione delle aggiunte di ligando è espressa da una funzione nota come “isoterma di Langmuir” che dipende dalla concentrazione di recettori e dalla costante di affinità detta anche costante di legame. Per l'isoterma di Langmuir si veda ad esempio, Paul C. Hiemenez, “Principles of Colloid and Surface Chemestry”, Marcel Dekker, New York, 1997, pages 287-298.
L’ interpolazione dei dati di intensità riflessa viene effettuata inserendo il volume di ligando adsorbito nelle formule di Fresnel per la riflessione da strati sottili. Ne risulta una funzione dipendente dagli indici di rifrazione di acqua, materiale polimerico e materiale adsorbito, nonché dalla concentrazione superficiale di recettori e dalla costante di affinità. Poiché le altre grandezze in gioco sono generalmente già note o misurabili, dall’ interpolazione è possibile estrarre la costante di affinità.
Il metodo della presente invenzione è applicabile per qualsiasi angolo di incidenza e qualsiasi polarizzazione della luce.
Il rapporto tra la variazione dell’intensità di luce conseguente ai ricoprimenti molecolari e l’intensità di luce di fondo misurata prima della fase (a), può essere variato per migliorare la sensibilità del metodo sia modificando l’angolo di incidenza e/o l’angolo di raccolta della luce, sia variando la polarizzazione della luce incidente e/o misurando le variazioni di polarizzazione della luce rilevata.
In particolare, nel caso di angolo di incidenza della luce di 45°, di polarizzazione perpendicolare al piano di incidenza ( φ = 90°), di differenza Δn tra gli indici di rifrazione della soluzione e del substrato minore di 0.012 e di spessore dello strato molecolare di recettori adsorbiti e ligandi interagenti minore di 15 nanometri, l’intensità riflessa I dalla superficie planare liscia può essere espressa secondo la seguente formula (2) approssimata con un errore minore del 1% rispetto all’equazione completa (1):
dove
I0, [ T0], Δη sono come sopra definiti,
na, m, p sono rispettivamente l’indice di rifrazione, la massa molecolare e la densità del ligando,
V è il volume della soluzione acquosa,
A è l’area della superficie di materiale solido su cui avviene l’adsorbimento del recettore,
λ la lunghezza d’onda della luce incidente,
n0è l’indice di rifrazione della soluzione acquosa,
I l’intensità misurata prima dell’aggiunta di recettori (prima della fase (a)),
[S0] è la concentrazione molare di siti di legame recettore-ligando e K è la costante di affinità (detta anche costante di legame).
Essendo gli altri parametri noti, nel senso che sono misurabili o già noti, dall’adeguamento (fitting) dell’equazione (2) ai valori misurati di intensità riflessa, si ricava la concentrazione [S0] di recettori adsorbiti sulla superficie e la costante di affinità K per l’interazione ligando-recettore.
Il polimero idrofobico amorfo può essere, ad esempio, un perfluoropolimero. La superficie polimerica può essere liscia o presentare rugosità di tipo regolare o irregolare. I film polimerici impiegabili in detto metodo di misurazione hanno preferibilmente uno spessore di 1 micron o superiore. La rugosità della superficie del polimero può introdurre una componente di luce diffusa che tuttavia non va a svantaggio del presente metodo, essendo anch’essa proporzionale ai ricoprimenti molecolari della superficie, in maniera analoga alla luce riflessa. In questo caso è possibile misurare l’intensità della luce anche in una direzione diversa da quella della riflessione geometrica.
Quali molecole o complessi molecolari con la funzione di recettori vengono utilizzati quelli che generano un monostrato adsorbito sulla superficie solida. Tale adsorbimento può essere dovuto alle interazioni di tipo idrofobico tra le molecole di recettori e la superficie solida.
Come detto, si possono utilizzare dei tensioattivi come recettori, ad esempio quelli non ionici anfìfilici che generano un monostrato (self assembled monolayer) sulla superfìcie solida. L’ottenimento di detto monostrato può essere verificato effettuando la fase (a) del presente metodo e osservando il raggiungimento di un valore asintotico di detto diagramma.
Le molecole di recettori, come detto, possono essere utilizzate in miscela con molecole intercalanti che non hanno funzione di recettore. In genere queste ultime possono essere scelte tra tensioattivi e proteine. Inoltre le molecole utilizzate come intercalanti non devono avere interazioni specifiche, cioè non devono formare un legame con il ligando da analizzare. L’assenza di tale interazione può essere verificata effettuando la fase (a) del metodo secondo l’invenzione con l’impiego delle sole molecole intercalanti e facendo seguire la fase (b) verificando che non vi siano variazioni di intensità della luce riflessa.
I tensioattivi, sia recanti siti recettori sia come intercalanti, possono essere scelti tra tensioattivi non ionici, ad esempio glicolipidi, ossietileni o ossipropileni; oppure tra tensioattivi ionici: per esempio anionici, sodio bis-2 etilesil-solfosuccinato (AOT), sodio bis-2-etilesil-solfosuccinato oppure cationici quali didodecil-dimetilammonio bromuro (DDAB).
Fra i tensioattivi non ionici impiegabili nella presente invenzione si possono citare ad esempio:
a) composti non ionici aventi struttura
CH3-(CH2)n-(OCH2CH2)mOH
in cui 6<n<18 e 3<m<12
ad esempio il composto commerciale Brj 56 (Fluka, cas. No. 9004-95-9), dove n=15 e m è distribuito attorno al valore m=10;
b) alchil glicosidi con la seguente struttura
RO-(CH2)n-CH3
in cui 6<n<12 e R = residuo del glucosio o maltosio,
ad esempio il composto commerciale n-dodecil-beta-D-maltoside della Aldrich.
I tensioattivi non ionici anfifilici terminati con un recettore vengono preparati per reazione dei sopra descritti tensioattivi con recettori secondo processi noti nell’arte.
La coppia recettore-ligando è definita come una coppia di molecole, ad esempio proteine, acidi nucleici, glicoproteine, carboidrati, ormoni, aventi una affinità capace di stabilire un legame più o meno stabile. In particolare si possono citare anticorpo/antigene, enzima/inibitore, carboidrato/carboidrato, proteina/DNA, DNA/DNA, peptide/peptide.
Nelle fasi a) e b) del metodo secondo l’invenzione le misurazioni delle intensità di luce riflessa vengono effettuate fino al raggiungimento delle condizioni di equilibrio termodinamico, cioè rilevando l’intensità di luce riflessa con intervalli regolari di tempo, in genere di 0,5-5 minuti, fino al raggiungimento di un valore costante. È stato trovato che il tempo necessario per raggiunge rapidamente l’equilibrio termodinamico dipende dal tipo di coppia recettore-lingando utilizzata. Pertanto le misure effettuate possono permettere di stimare le cinetiche di adsorbimento-desorbimento.
Il metodo della presente invenzione permette di rilevare fino a 3 microgrammi di materia adsorbita per millilitro, corrispondenti ad un limite di sensibilità sulla massa adsorbita per superfìcie di 0,04 nanogrammi/mm<2>che è nell’ordine delle tecniche più sensibili dell’arte nota. La misura della riflessione da un’area planare di 1 mm<2>permette di rilevare quantità di 3 nanogrammi di materia adsorbita senza limiti intrinseci di concentrazione minima in soluzione.
E sorprendente e inaspettato che la riflessione della luce sia risultata efficace per individuare e misurare direttamente, mediante misure di intensità di luce riflessa, le interazioni tra recettori e ligandi secondo il metodo della presente invenzione. Infatti la tipica riflettività della superficie di un solido è enormemente più grande di quella di un singolo strato molecolare. Invece l’impiego di un materiale a basso indice di rifrazione che supporta una molteplicità di recettori permette di utilizzare il fenomeno della riflessione della luce nella misurazione dell’interazione ligando-recettore.
Seguono alcuni esempi a scopo illustrativo ma non limitativo della presente invenzione.
ESEMPI
Esempio 1
Misura della costante di legame fra la proteina Bovine Serum Albumin coniugata con biotina (BSA biotinilata. ligando) e Avidina ( recettore )
Fase a)
Un prisma retto di un copolimero del TFE contenente il 60% in moli di perfluorordiossolo TTD, avente lato 3 cm e superficie liscia lavorata meccanicamente tramite lappatura, è stato immerso in 1,5 millilitri di acqua.
Un fascio di luce proveniente da un laser He-Ne da 5 milliWatt viene fatto incidere normalmente sulla faccia retta del prisma non a contatto con la soluzione acquosa. La riflessione avviene all’interfaccia tra il lato maggiore del prisma e la soluzione acquosa posta a contatto con esso. Il fascio riflesso esce dal secondo lato minore del prisma e viene rilevato da un fotodiodo amplificato che converte l’intensità di luce riflessa in un segnale elettrico.
All’acqua viene aggiunta una soluzione acquosa 0,02 millimolare di proteina Avidina (commercializzata da Aldrich, cas. No. 1405-69-2), in porzioni di 4 microlitri ciascuna, per un totale di 20 microlitri. La soluzione viene tenuta costantemente sotto agitazione.
Dopo ogni aggiunta è stata misurata per 2 minuti l’intensità della luce riflessa dalla faccia del prisma. I valori di intensità misurati (quadrati in figura) vengono diagrammati in funzione della concentrazione ottenuta di Avidina espressa in mg/ml, ottenendo la curva qui di seguito riportata.
La progressiva ricopertura della faccia immersa nella soluzione da parte della proteina aggiunta è osservabile dalla variazione dell’intensità della luce misurata dal fotodiodo.
La ricopertura completa è chiaramente rivelata dal raggiungimento di un valore asintotico dell’intensità della luce misurata.
Fase b)
Alla soluzione ottenuta in (a), in cui è immerso il prisma, dopo il raggiungimento del valore asintotico, viene aggiunta una soluzione acquosa 5 micromolare di Bovine Serum Albumin coniugata con biotina (commercializzata da Pierce, prod. No. 29130), a porzioni di 20 microlitri ciascuna. La soluzione viene tenuta costantemente sotto agitazione. Dopo ogni aggiunta viene misurata l’intensità della luce riflessa come nella fase (a).
I valori di intensità misurati (pallini in figura) vengono diagrammati in funzione della concentrazione ottenuta di proteine e aggiunti alla curva diagrammata nella fase (a).
La formazione dei legami BSA-biotina-Avidina è rivelata dall’ aumento dell’intensità della luce misurata fino al raggiungimento di un valore asintotico che indica saturazione dei siti di legame dell’Avidina con la biotina.
Adeguando (fitting) ai dati di intensità di luce riflessa in funzione delle aggiunte di BSA-biotina la formula di adsorbimento di Langmuir si ottiene la costante di legame recettore-ligando. La costante di legame ottenuta è 2,6 x 10<9>litri x moli<-1>.
Esempio 2
È stato ripetuto l’esempio 1 ma usando, in sostituzione del prisma, un film sottile dello stesso copolimero impiegato nell’esempio 1, avente uno spessore di 17 micrometri. Detto film è stato montato in una cornice quadrata di plexiglas avente la funzione di sostegno con lato esterno di lunghezza 1,4 cm e lato interno di 0,4 cm.
Su tale film è fatto incidere un fascio di luce laser come nell’esempio 1 con angolo di 45° sulla superficie del film. Un fotodiodo amplificato, disposto ad angolo retto con la direzione della luce uscente dal laser, converte l’intensità di luce in un segnale elettrico.
Vengono poi ripetute tutte le operazioni descritte nell’esempio 1 ottenendo una costante di legame di 3,7x10<9>litri x moli<-1>.
Claims (8)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la determinazione della costante di legame di due specie molecolari interagenti utilizzando misurazioni di intensità di luce riflessa, comprendente le seguenti fasi: a) addizione - ad una soluzione acquosa in contatto con una superficie planare liscia o rugosa di materiale solido trasparente costituito da un polimero idrofobico amorfo avente un indice di rifrazione compreso tra 1.3200 e 1.3400, preferibilmente tra 1.3300 e 1.3350 -di una successione di volumi noti di una soluzione acquosa di una miscela contenente da 1 ng/ml a 10 mg/ml in concentrazione di molecole con la funzione di recettori, quali anticorpi o altri complessi proteici ovvero tensioattivi anfifilici terminati con un recettore, eventualmente miscelate ad altre molecole (intercalanti) che non hanno funzione di recettore, misurando dopo ogni addizione l’intensità della luce riflessa dall’interfaccia tra la soluzione acquosa e il materiale solido suddetto e riportando il valore misurato all’equilibrio su un diagramma in funzione della concentrazione di recettori progressivamente addizionati, fino al raggiungimento di un valore asintotico; b) addizione alla soluzione ottenuta nella fase a) di una successione di volumi noti di una soluzione acquosa di un ligando, misurando dopo ogni addizione l’intensità della luce riflessa dall’interfaccia tra la soluzione acquosa e il materiale solido e riportando il valore misurato all’equilibrio su un diagramma in funzione della concentrazione di recettori progressivamente addizionati, fino al raggiungimento di un valore asintotico, e interpolando (fitting) i dati di intensità di luce riflessa in funzione delle aggiunte di ligando con la formula di adsorbimento di Langmuir per ottenere la costante di legame recettore-ligando.
- 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui i tensioattivi non ionici anfifilici o ionici sono tensioattivi che generano un monostrato (self assembled monolayer) sulle particelle di polimero.
- 3. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2 in cui i tensioattivi non ionici sono scelti tra: a) composti non ionici aventi struttura CH3-(CH2)n-(OCH2CH2)mOH in cui 6<n<18 e 3<m<12 b) alchil glicosidi con la seguente struttura RO-(CH2)n-CH3 in cui 6<n<12 e R = residuo del glucosio o maltosio.
- 4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3 in cui la coppia recettore-ligando è scelta tra proteine, acidi nucleici, glicoproteine, carboidrati, ormoni.
- 5. Metodo secondo la rivendicazione 4 in cui la coppia di molecole recettore-ligando è scelta tra anticorpo/antigene, enzima/inibitore, carboidrato/carboidrato, proteina/DNA, DNA/DNA, peptide/peptide.
- 6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5 in cui la superficie del materiale presenta rugosità di tipo regolare oppure irregolare con dimensioni caratteristiche delle profondità e delle estensioni delle rugosità superficiali comprese tra i 10 nm e i 3 mm e l’intensità della luce emessa dalla superficie in presenza dell’ interazione recettore-ligando viene misurata non solo nella direzione della riflessione geometrica ma anche in una direzione diversa da quella della riflessione geometrica.
- 7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5 in cui l’angolo di incidenza e la polarizzazione della luce incidente sono selezionate al fine di ottimizzare il rapporto tra il segnale di luce riflessa in presenza dell’interazione recettore-ligando e il rumore di fondo dovuto a riflessione e diffusione di luce.
- 8. Metodo secondo la rivendicazione 7 in cui la luce riflessa è filtrata tramite un polarizzatore la cui orientazione è scelta in modo da ottimizzare il rapporto tra il segnale di luce di riflessa in presenza dell’ interazione recettoreligando e il rumore di fondo dovuto a riflessione e diffusione di luce.
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