KR100958198B1 - 실시간 연속 검출장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 시료 유입 채널, 시료 분석 사이트 및 시료 배출 채널을 포함하는 실시간 검출장치에 있어서, 상기 시료 분석 사이트는 가역반응성 포획 인식성분 및 시료내의 분석물질-포획인식성분 결합체로부터 발생된 신호를 탐지하는 센서를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출장치에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 일정량의 가역반응성 포획 인식성분을 연속적으로 재활용하여 분석물질 농도 변화를 실시간 측정할 수 있다. 본 발명의 실시간 연속 검출장치는 생명체 대사물질, 단백질, 호르몬, 핵산, 세포, 식품검사대상 물질, 환경 유해물질 또는 국방 화생방 측정물질 등을 검출 또는 분석하는데 활용이 가능하므로 의료, 공중보건, 국방, 환경, 식품, 수의, 생명공학 산업에 응용될 수 있다.
단일클론 항체, 가역반응 특성, 항체 연속적 재활용, 비표지 센서, 표지 센서, 신호증폭, 연속측정, 측정범위, 센서 응답시간

Description

실시간 연속 검출장치 {Real-time detection devices by continuous monitoring}
본 발명은 실시간 연속 검출장치에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 시료 유입 채널, 시료 분석 사이트 및 시료 배출 채널을 포함하는 실시간 검출장치에 있어서, 상기 시료 분석 사이트는 가역반응성 포획 인식성분 및 시료내의 분석물질-포획인식성분 결합체로부터 발생된 신호를 탐지하는 센서를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출장치에 관한 것이다.
보건의료분야 뿐만 아니라 식품, 환경, 수의, 국방과 같은 다양한 분야에서 구조가 복잡한 유기물질 특히 단백질, 호르몬, 핵산, 세포 등의 탐지에 항원-항체 부착과 핵산접합과 같은 독특한 인식반응을 이용한 분석방법이 사용된다. 이것은 생체 인식반응의 높은 특이성과 친화력 그리고 분석원리의 보편성에 기인하며, 이를 응용하여 다양한 형태의 분석시스템이 개발되어왔다.
그 예로서, 면역분석시스템의 개발동향을 보면 microtiter plate를 고정화모 체로 사용하는 고상면역분석(예: enzyme-linked immunosorbent immunoassays; ELISA) 방법의 개발로 다양한 진단 및 분석분야에 응용하는 계기가 되었으며 (Irina Ionescu-Matiu 등, J Virol Methods, Vol. 6(1), Page 41-52, 1983; Christopher Heeschen 등, Clinical chemistry, Vol. 45(10), Page 1789-1796 , 1999), 세공성 membrane 기반의 무시약 속성 진단키트의 출시는 가정 등 장소에 제한 없이 면역분석을 가능하게 하였다 (R. Chen 등, 1987, Clin. Chem. Vol. 33, Page 1521-1525; M.P.A. Laitinen, 1996, Biosens. Bioelectron., Vol. 11, 1207-1214; S. C. Lou 등, 1993, Clin. Chem., Vol. 39, 619-624; S. H. Paek 등, Methods Vol. 22, Page 53-60, 2000; S. H. Paek 등, BioChip J. Vol. 1, Page 1-16 , 2007).
다른 한편으로는 병원 임상시험실 등 전문기관에서 정밀검사에 사용하는 자동화 진단기기가 보급되었으며, 핵산서열을 결정하거나 단백질의 발현정도를 정량적으로 분석할 수 있는 바이오센서 어레이칩 그리고 나아가서는 미세자동분석을 위해 시료의 전처리 등 순차적 연속공정을 수행하는 랩온어칩의 개발이 활발히 연구되고 있다 (Kyeong-Sik Shin 등, Analytical Chimica Acta Vol. 573-574, Page 164-171, 2006). 실용화 예로서, CombiMatrix 사(미국)의 지노믹스 연구용 Custom Array, Nanosphere 사(미국)의 단일핵산변이(SNP) 측정 용 Verigene ID platform, AffyMetrix 사(미국)의 GeneChip System, Integrated NanoTechnologies 사(미국) 현장분석용 BioDetect Test Card 등이 소개되었다.
최근, 나노기술과 생명공학 기술이 융합된 나노 바이오센서 기술이 21세기의 첨단 기술로서 새롭게 각광받고 있으며 이에 관련된 원천기술을 확보하고자 국내를 포함하여 전 세계적으로 연구가 활발히 진행되고 있다. 여러 기관에서 바이오센서의 초고감도 기술개발에 집중하고 있지만 그 기술수준이 아직 초보단계인 나노센서 개념 (Yi Cui 등, Science, Vol. 293, Page 1289-1292, 2001; Jong-in Hahm 등, Nano lett., Vol. 4, Page 51-54, 2004) 및 진동형 캔틸레버 기반 면역분석 (Y Arntz 등, Nanotechnology, Vol. 14, Page 86-90, 2003) 등이 보고된 바 있다.
이와 같은 대부분의 기존 분석시스템에 사용되는 항체를 비롯한 인식성분들은 분석물질-인식성분 결합 후 그 결합체를 분리하기 위해 세척과정이 필수적이다. 이때 형성된 결합체의 유실을 최소화하기 위해 탈착속도가 매우 느린 인식성분을 사용하여야 하므로 한 번 결합한 분석물질이 인식성분으로부터 해리되지 않아 대부분 센서를 연속적으로 사용하지 못하고 1회용으로만 사용한다. 최근 들어 글루코오스 모니터링에 있어 무침습 센싱 방법에 대한 연구가 매우 활발하며 (Ronald T. Kurnik 등, Sensors and Actuators B: Chemical, Vol. 60, Page 19-26, 1999), 특히 병원 중환자의 질병에 관련된 지표물질에 대한 연속적인 측정에 대한 요구가 커지고 있으나 기술적 문제로 요구를 충족시키지 못하고 있다. 하지만, 분석물질-인식성분 간 반응을 가역적으로 운용할 수 있을 경우 다양한 질환에 대해 실시간 연속 모니터링이 가능하게 된다.
분석물질에 대한 연속측정이 가능할 경우, 미래에는 인체에 착용하거나 체내 이식이 가능한 바이오센서가 개발될 수 있다. 이러한 센서를 이용하면 생체정보를 연속적으로 측정하고 진단함으로서 질환발생 확률이 상대적으로 높은 고위험군 (만 성질환자, 노인 등) 환자에 대해 감염병이나 성인병 등 호발질환을 조기에 관리 내지 감시하는 것이 가능하게 된다. 따라서 이러한 분석도구는 유비쿼터스 컴퓨팅 환경을 기반으로 ‘언제’, ‘어디서나’ 의료서비스를 제공하는 헬스케어 환경을 의미하는 U-헬스케어 시대에서 미래 예방의학을 위한 필수도구가 될 것으로 판단된다 (Anthony PF Turner, Nature Biotechnology, Vol. 15, Page 421-421, 1997). U-헬스케어가 실현되면 질병 후에 대응하는 ‘병원/치료 중심’의 기존 패러다임에서 탈피하게 될 뿐만 아니라 만성질환자와 노인 등이 장기입원을 하지 않아도 된다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 분석물질의 실시간 검출장치에 가역반응성 포획 인식성분을 도입하고 이를 연속적으로 재활용하는 경우 반응에 참여하는 분석물질의 농도에 따라 실시간으로 신호를 발생시키고 측정함으로써 분석물질에 대한 연속측정이 가능할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 가역반응성 포획 인식성분이 도입되어 이를 연속적으로 재활용할 수 있는 분석물질의 실시간 연속 검출장치를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 실시간 연속 검출장치를 이용한 분석물질의 실시간 연속 검출방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 실시간 연속 검출장치에 사용되는 가역반응성 포획 인식성분의 선별방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 시료 유입 채널, 시료 분석 사이트 및 시료 배출 채널을 포함하는 실시간 검출장치에 있어서, 상기 시료 분석 사이트는 가역반응성 포획 인식성분(10) 및 시료내의 분석물질(11)-포획인식성분(10) 결합체로부터 발생된 신호를 탐지하는 센서를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출장치를 제공한다(도 1의 가 참조).
본 발명에서, 상기 ‘분석물질’이란 시료 분석 사이트에 포함되어 있는 센서를 사용하여 검출하고자 하는 목적으로 센서 표면으로 주입시키는 물질을 의미하며, ‘포획인식성분’이란 상기 센서의 센서칩 상에 고정화되어 있으면서 분석물질과 특이적으로 결합 가능한 물질을 의미한다.
예를 들어, 분석물질이 항원 또는 리간드인 경우 포획인식성분은 각각 그 항원에 대한 항체 또는 그 리간드에 대한 수용체이며, 역으로 분석물질이 항원에 대한 항체 또는 리간드에 대한 수용체인 경우 포획인식성분은 각각 그 항원 또는 리간드이다.
본 발명에서, 상기 가역반응성 포획 인식성분은 탈착 및 부착 속도가 모두 빠른 반응 역학 특성을 가지며 또한 고친화력을 갖는 인식성분(예: 항체)을 말하는데, 높은 부착 및 탈착 속도상수 값을 지닌 포획 인식성분을 이용하면 연속적으로 사용하여도 높은 분석 민감도를 유지할 수 있다. 여기서 ‘친화력’은 평형부착상수로서 표시할 수 있는데, 평형부착상수(KA)는 부착속도상수(ka)/탈착속도상수(kd)로 정의된다. 본 발명에서는 가역반응특성과 고친화력을 동시에 지닌 항체를 사용함에 따라 ‘고감도 실시간 연속검출’이 가능하게 된다.
만약 가역반응특성만을 위하여 친화력이 1×106 L/mol 이하인 인식성분을 이용하게 된다면, 검출장치의 측정민감도가 μmol/L 수준으로 매우 낮아서 대부분의 질병이나 증세의 징후를 나타내는 바이오마커 분석물질의 검출에는 적용하기 어려운 문제점이 있다. 이것은 인식성분의 친화력이 낮을수록 측정 가능한 분석물질의 농도범위가 높아지기 때문이다. 예컨대, 가역반응성 인식성분(예: 항체)의 부착속도상수를 낮추거나 일정하게 유지하되 탈착속도상수를 너무 높힌 성분을 사용한다면 친화력이 1x106 L/mol 이하로 낮아지게 된다. 따라서, 본 발명에서와 같이 고친화력의 가역반응성 인식성분을 얻기 위해서는 특별한 선별방법이 도입되어야 한다. 예를 들어, 고정된 항원과 인식성분이 결합 후 중성 완충용액으로 세척 시 잔존 활성이 인식성분 농도 대비 낮은 값을 지닌 인식성분을 1차 선별하고 이것에 대해 다시 항원이 고정된 센서(예: 표면 플라즈몬 공명 센서)를 이용한 부착속도상수 및 탈착속도상수를 측정하여 2차 선별을 실시함으로서 고친화력의 가역반응성 인식성분을 효과적으로 생산할 수 있다.
따라서 상기 가역반응성 포획 인식성분이 본 발명의 목적에 부합하기 위해서는, 빠른 반응 역학 특성을 갖고 또한 평형부착상수가 1×106 L/mol 이상의 고친화력을 유지하는 것이 좋으며, 바람직하게는 1×106 L/mol 내지 1×1012 L/mol, 더욱 바람직하게는 1×107 L/mol 내지 1×1011 L/mol의 고친화력을 유지하는 것이 적당하다.
본 발명의 실시간 연속 검출장치에서, 상기 가역반응성 포획 인식성분은 바람직하게는 시료 내 분석물질과 반응 시 부착속도상수(k a )는 1×104 L·mol-1·sec-1 내지 1×107 L·mol-1·sec-1, 그리고 탈착속도상수(k d )는 1×10-5 sec-1 내지 1×10-2 sec-1 범위의 가역반응 특성을 가지며 동시에 두 속도상수의 비율(k a /k d )이 1×106 L/mol 이상의 평형부착상수(KA)를 가지는 것을 특징으로 한다.
이와 같은 특징을 지닌 포획 인식성분을 연속 검출장치에 사용하면 두 부착 및 탈착 속도상수가 모두 높으므로 검출장치의 응답시간이 빨라 분석물질의 실시간 검출이 가능하게 될 뿐만 아니라 평형부착상수가 또한 높으므로 고도의 측정민감도를 제공하는 장점이 있다. 그러나 범위를 벗어날 경우 특히, 탈착속도상수가 더 낮을 경우 포획 인식성분과 결합된 분석물질의 해리가 어려워 연속측정 시 매우 긴 응답시간이 초래되거나 혹은 해리를 가속시키기 위해 가혹조건(예: 산성 pH)의 사용이 불가피하여 실시간 검출이 원천적으로 불가능하게 된다. 또한 부착 및 탈착 속도상수가 주어진 범위에 있더라도 평형부착상수가 설정된 범위보다 더 낮을 경우 위에서 지적한 바와 같이 분석민감도가 낮아지게 되어 실질적인 응용이 극히 제한된다.
상기 가역반응성 포획인식성분에서, 특정 분석물질에 대한 전형적인 인식성분으로서 단일클론 항체는 일반적으로 분석물질에 대해 동물을 면역화 시키는 하이브리도마 방법(Kohler. G 등, Nature, Vol. 256, Page 495-497, 1975), 유전자 재조합 방법(HP Fell 등, PNAS, Vol. 86, Page 8507-8511, 1989), phage display 방법(Nicholas A. Watkins 등, Vox Sanguinis, Vol. 78, Page 72-79, 2000) 등을 통해 생산될 수 있지만 가역반응성 항체를 선별하기 위해서는 특별한 과정이 요구된다. 항체선별 방법으로 널리 사용되고 있는 고상면역분석에서는 반응 후 잔존하는 과잉성분을 제거하기 위해 세척공정을 사용하므로 세척 시 반응결합체가 쉽게 해리되는 가역반응성 항체의 경우에는 선별이 어렵다. 본 발명에서는 이러한 문제를 해결하기 위해 일례로서, 반응 및 세척 시 실시간 반응결합을 추적할 수 있는 표면 플라즈몬 공명 센서와 같은 비표지 센서가 장착된 선별시스템을 사용하였다.
상기 분석물질을 센서표면에 고정시킨 후 생산된 항체를 운반용액에 희석하여 연속적으로 주입한 후 동일한 운반용액으로 세척하면 표면에서의 항원-항체 간 부착 및 탈착반응에 의해 형성되고 해리되는 결합체의 밀도가 센서로부터 실시간으로 측정된다.
본 발명의 구체적인 일례에서는, 상기 가역반응성 포획 인식성분을 선별하기 위하여 표면 플라즈몬 공명 센서 기반의 선별시스템을 이용하였다. 적절히 희석된 일정 농도의 항체용액을 시스템 내로 주입하면 결합반응에 의해 신호가 시간에 따라 증가하는데 세척 시 즉, 항체농도 ‘0’에서 결합체 밀도의 변화는 각 항체의 가역반응 특성에 따라 변화된다(도 2 참조). 기존 대부분의 면역분석에서는 세척공정을 겪는 동안 탈착되지 않는 비가역성 항체(도 2, 20E7)가 쉽게 탈착되는 가역성 항체(1B5) 보다 절대적으로 선호되었다. 이것은 세척 후 고상에 잔존한 항원-항체 결합체로부터 분석물질 농도에 비례한 신호를 발생시킬 수 있기 때문인데, 이와 같은 분석시스템에서는 항체를 재활용하기 어렵고 연속측정이 원천적으로 불가능하다. 그러나 시료 내 분석물질 농도와 역학적 평형상태로 부착과 탈착이 신속한 가역반응성 항체(1B5)를 사용하면 항체를 연속적으로 재활용할 수 있고 따라서 분석물질의 연속 모니터링이 가능하게 된다.
또한, 면역분석 시 항체 반응특성의 차이에 따른 연속측정 실현 가능성 여부는 순환 반복하여 측정해 보면 더 확연해진다(도 3 참조). 비가역 반응특성을 나타내는 항체(도 3, 20E7; k a = 1.10×104 L·mol-1·sec-1, k d = 1.80×10-7 sec-1)의 경우, 항체공급 후 정해진 시간 동안 고정된 항원과 지속적인 부착반응을 나타내고 세척 시에는 탈착이 완료되지 못하므로 순환반복에 따라 항원-항체 반응 결합체는 점차 누적되어 증가하는 패턴을 나타낸다. 반면에, 가역반응 특성을 보이는 항체(1B5; k a = 4.13×106 L·mol-1·sec-1, k d = 3.61×10-3 sec-1)의 경우, 항체공급 후 신호가 급격히 증가하여 부착반응 평형에 도달하고 또한 세척 시 즉시 탈착되어 신호가 초기 기준선으로 되돌아오는데 이와 같은 부착/탈착 가역반응 형태는 순환반복 시에도 높은 재현성을 나타낸다.
가역반응성을 나타내는 항체는 항원-항체 결합체의 탈착속도가 빨라 친화력(평형부착상수, KA) 감소에 의한 분석민감도 저하가 우려될 수 있지만 부착 및 탈착 속도가 모두 빠르면 친화력에는 영향을 주지 않는다. 실제로, 평형부착상수(KA) = 부착속도상수(k a )/탈착속도상수(k d ) 이므로 위에서 설명한 방법에 따라 적절한 반응역학 특성 즉, 높은 부착 및 탈착 속도상수 값을 지닌 항체를 선별하면 높은 분석민감도를 유지할 수 있다. 따라서 높은 민감도를 유지하기 위해서는 일반적으로 KA > 1×109 L·mol-1 조건의 항체가 필요하므로, 가역반응성 항체는 k a > 1×104 L?mol-1·sec-1 및 k d > 1×10-5 sec-1 특성을 지닌 항체로 정의될 수 있고 바람직하게는, k a > 1×105 L·mol-1·sec-1 및 k d > 1×10-4 sec-1 특성이 선호된다.
한편, 가역반응성 항체의 친화력을 시험하는 다른 방법으로, 항체를 표준농도로 연속 희석하여 표면 플라즈몬 공명 센서 상에 고정된 항원과 반응시켜 신호감지가 가능한 최저 항체농도를 결정하여 보면 항체 친화력의 예측이 가능하다 (도 4 참조). 특히, 가역 항체 1B5가 pg/mL 농도범위 이하에서도 항원과 반응하는 것으로 측정되었는데, 이 결과는 기존의 비가역성 항체의 경우와 비교하여도 매우 높은 친화력을 나타낸 것이다. 더욱이 도 4의 결과로부터 사용된 가역 항체는 비교적 광범위한 농도범위에서 고정된 항원과 다른 평형상태로 반응하는 것으로 미루어 바이오센서 제작에 매우 적합한 것을 알 수 있다.
본 발명의 실시간 연속 검출장치에서, 상기 가역반응성 포획 인식성분(10)은 시료 내 분석물질(11)인 생명체 대사물질, 단백질, 호르몬, 핵산, 세포, 식품검사대상 물질, 환경 유해물질 또는 국방 화생방 측정물질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 수용체, 핵산, 효소, 압타머, 펩타이드 또는 분자인쇄 인공막인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시간 연속 검출장치에서, 상기 센서는 분석물질(11)-포획 인식성분(10) 결합체로부터 발생된 신호를 직접 탐지하는 비표지 센서(12) (도 1의 가) 참조), 또는 분석물질(11)-포획 인식성분(10) 결합체 밀도에 비례하여 신호를 발생시키는 표지물질(14)을 경유하여 탐지하는 표지 센서(15)인 것을 특징으로 한다(도1의 나).
본 발명에서, 상기 비표지 센서는 분석물질-포획 인식성분 결합체에 비례하 여 변화하는 센서 상의 질량, 진동자의 저항, 전하분포 변화에 의한 표면 왜곡, 에너지 전달 등을 신호로서 측정한다. 센서표면의 결합체 질량 변화에 따라 광 굴절각 차이를 나타내는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance; SPR) 센서 (Robert Karlsson 등, Journal of Immunological Methods, Vol. 145, Page 229-240, 1990), 진동자의 저항이나 전하분포를 감지하는 캔틸레버(cantilever) 센서 (Hans-Jurgen Butt, Journal of Colloid and Interface Science, Vol. 180, Page 251-260, 1996), 광도파로(evanescent) 센서 (R. G. Eenink 등, Analytica Chimica Acta, Vol. 238, Page 317-321, 1990), 나아가 나노차원의 선 혹은 간격을 이용한 나노센서 (Fengli Qu 등, Biosensors and Bioelectronics, Vol. 22, Page 1749-1755, 2007) 등이 비표지 센서로 사용될 수 있다.
또한, 상기 표지 센서는 분석물질-포획 인식성분 결합체에 비례하여 신호를 발생시키기 위해 표지물질이 표지된 탐지 인식성분을 추가로 반응시킨 후 표지물질로부터의 신호를 측정한다. 여기서 탐지 인식성분이 반응하는 분석물질 분자 상의 자리는 포획 인식성분이 반응하는 부위와 달라서 두 성분은 분석물질과 동시에 반응할 수 있다. 신호를 발생시키는 표지물질로는 형광체, 발광체, 효소, 금속입자, 플라스틱 입자, 자성입자 등이 사용되며 이로부터 발생되는 형광, 발광, 발색, 전기화학, 자기장 등을 탐지하는 센서가 표지 센서로 사용될 수 있다.
다시 말해, 상기 비표지 센서를 이용하는 경우에는 시료에 포함된 분석물질은 유체채널을 통해 연속적으로 시스템 내로 유입되어 포획 인식성분과 반응하고, 표지 센서를 이용하는 경우에는 시료 내의 분석물질은 표지물질이 중합된 탐지 인 식성분과 사전에 반응한 후 유체채널을 통해 연속적으로 시스템 내로 유입되어 포획 인식성분과 반응한다.
본 발명의 실시간 연속 검출장치에서, 상기 시료 분석 사이트는 시료 내 분석물질(11)만 선택적으로 투과시킬 수 있는 반투과성 막(16)에 의해 구획이 나누어져 포획 인식성분(10)이 고정된 센서표면 쪽에 인식반응 셀(17)을 형성하는 것을 특징으로 한다.
상기 인식반응 셀(17)은, 표지 센서(15)를 이용하는 경우 상기 인식반응 셀(17) 내에 반투과성 막(16)을 통과할 수 없는 크기의 표지물질(14)과 중합된 탐지 인식성분(13)을 가두어 두고 재활용하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 인식반응 셀(17) 내의 탐지 인식성분(13)도 포획 인식성분(10)과 함께 연속적으로 재활용되기 위해 가역 반응특성을 갖는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 상기 시료 분석 사이트는 포획 인식성분이 고정된 센서표면 쪽을 반투과성 막으로 구획을 나누어 인식반응 셀을 형성시킬 수 있는데(도 1의 다, 라), 시료에 포함된 분석물질은 크기가 작아 이 막을 통하여 셀 내로 확산전달 되지만 시료 내 크기가 큰 불순물은 여과되어 센서표면의 오염을 방지할 수 있다. 이와 같은 인식반응 셀의 설치는 특히 표지방식의 분석시스템의 경우(도 1의 라) 크기가 큰 표지물질과 중합된 탐지 인식성분을 셀 내에 가두어 재활용하는 효과도 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 상기 실시간 연속 검출장치를 이용한 분석물질의 실시간 연속 검출방법을 제공한다.
a) 분석물질을 포함하는 시료를 상기 시료 유입 채널을 통해 시료 분석 사이트내로 주입시키는 단계;
b) 상기 분석물질을 시료 분석 사이트내의 가역반응성 포획 인식성분(10)과 결합시키는 단계;
c) 상기 분석물질과 포획 인식성분의 결합에 의해 발생되는 신호를 센서에 의해 탐지하는 단계;
d) 시료의 계속적 유입이나 세척액의 유입에 의해 상기 분석물질과 포획 인식성분의 결합이 탈착되어 분석물질이 상기 시료 배출 채널을 통해 배출되는 단계; 및
e) 상기 탈착된 포획 인식성분을 연속적으로 재활용하여 상기 b) 내지 d) 단계를 반복함으로써 시료내 분석물질의 농도 변화를 실시간으로 측정하는 단계.
본 발명의 실시간 연속 검출방법에서, 상기 c)단계에서 분석물질-포획 인식성분 결합체로부터 발생된 신호를 비표지 센서를 이용하여 직접 탐지하거나, 혹은 분석물질-포획 인식성분 결합체 밀도에 비례하여 신호를 발생시키는 표지물질을 경유하여 표지 센서를 통해 신호를 측정하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 상기 비표지 센서를 이용하는 경우 시료에 포함된 분석물질은 시료 유입 채널을 통해 연속적으로 시료 분석 사이트 내로 유입되어 포획 인식성분과 반응하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 상기 표지 센서를 이용하는 경우 시료 내의 분석물질이 표지물질이 중합된 탐지 인식성분과 사전에 반응한 후 시료 유입 채널을 통해 연속적으로 시료 분석 사이트 내로 유입되어 포획 인식성분과 반응하거나 (연속흐름 노출 타입), 시료 내의 분석물질이 시료 유입 채널을 통해 연속적으로 시료 분석 사이트 내로 유입된 후 인식반응 셀 내의 표지물질과 중합된 탐지 인식성분 및 포획 인식성분과 반응하는 (인식반응 셀 타입) 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 상기 탐지 인식성분은 연속흐름 노출 타입의 경우 분석물질과 미리 반응되어 공급되므로 결합 안정성이 높은 비가역 반응특성을 갖거나, 인식반응 셀 타입의 경우 포획 인식성분과 함께 탐지 인식성분도 연속적으로 재활용되기 위해 가역 반응특성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 인식반응 셀 타입 표지 센서를 이용하는 경우 근접해 있던 형광물질(표지물질)과 형광에너지 수용체 간의 에너지 전달이 포획 인식성분과 분석물질의 반응에 의해 방해되어 형광신호가 발생하는 원리를 이용하거나, 효소분자(표지물질) 상에 고정된 분석물질과 인식성분이 결합하면 활성이 억제되는 것으로 알려진 효소들을 표지물질을 이용하여 포획 인식성분을 센서 상에 고정시키지 않고 인식반응을 액상에서 수행할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 상기 실시간 연속 검출장치에 사용되는 가역반응성 포획 인식성분의 선별방법을 제공한다.
a) 포획 인식성분을 준비하는 단계;
b) 상기 포획 인식성분을 센서표면에 고정된 분석물질과 결합시키는 단계;
c) 상기 포획 인식성분과 분석물질의 결합에 의해 발생되는 신호를 센서에 의해 탐지하는 단계;
d) 세척액의 유입에 의해 상기 포획 인식성분과 분석물질의 결합을 탈착시키는 단계;
e) 상기 탈착되고 남은 포획 인식성분과 분석물질의 결합에 의해 발생되는 신호를 센서에 의해 탐지하는 단계; 및
f) 상기 e)단계에서의 탐지 신호가 상기 c)단계에서의 탐지신호보다 낮아지는 포획 인식성분을 선택하는 단계.
본 발명의 가역반응성 포획 인식성분의 선별방법에서, 상기 a) 단계에서 상기 포획 인식성분은 운반용액에 희석하여 연속적으로 주입되고, 상기 f) 단계에서 시간에 따라 증가하던 신호가 감소하는 포획 인식성분을 선택하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 가용반응성 포획 인식성분의 선별방법에서, 상기 a) 단계에서 상기 포획 인식성분은 세척액과 순환 반복되어 주입되고, 상기 f) 단계에서 시간에 따라 신호가 증가되었다가 초기 기준선으로 되돌아오는 신호패턴이 반복되는 포획 인식성분을 선택하는 것을 특징으로 한다.
이상에서 설명하는 본 발명에 따른 분석물질의 실시간 검출장치, 이를 이용한 분석물질의 실시간 연속 검출방법 및 이에 사용되는 가역반응성 포획 인식성분 의 선별방법을 이용하는 경우 다음과 같은 장점을 가질 수 있다.
바이오센서나 바이오칩의 제작에 있어서, 본 발명에서와 같이 분석물질의 농도에 따라 신속하게 가역적으로 반응하는 항체를 재활용하면 기존의 1회용 진단 칩에 비해 구성부품 및 제작방법이 획기적으로 단순화된다. 이것은 기존 장치 또는 시스템에서 시약 공급 및 제거를 위해 요구되었던 다수의 밸브와 펌프가 최소화되어 실제로 신체에 착용이 가능한 소형의 미세유체흐름 방식의 연속진단 시스템의 구현이 가능하다.
이와 같은 새로운 개념의 검출방법(또는 진단방식)은 질병이나 증세에 대한 실시간 모니터링을 가능하게 하므로 현존하는 거의 모든 면역분석시스템들이 안고 있는 한번 사용한 후 폐기하는 1회용 성능의 한계를 극복할 수 있고 인체의 만성질병 혹은 고위험군 환자에 대한 연속적인 감시가 가능하게 된다. 더욱이 현재의 진단체계에서 진단결과를 얻기 위해 시간이 오래 걸리고 또한 환자상태 감지 데이터를 실험실에서 분석할 필요가 있을 경우 진찰시점과 진료결과가 나오는 시간의 차이가 많아서 정확한 질병진단이나 적시 치료에 어려움이 많은 문제점을 해결할 수 있다.
따라서, 본 발명에서 개발된 실시간 연속 검출 장치 및 이를 이용한 검출방법은 조기진단 개념의 새로운 예방의학 기법으로서 병원에서 수요현장 중심으로 이동하는 진료 패러다임의 변화를 충족시키며 만성질환자 및 노인과 같은 고위험군 환자감시가 상시 가능한 연속진단기기의 개발과 실용화를 가능하게 한다. 특히, 평균수명이 연장됨과 동시에 출산율의 감소로 고령화 사회로의 진입이 가속화 되고 있고 이와 더불어 식생활 패턴의 서구화로 각종 만성 성인병 질환이 널리 퍼져있어 조기진단을 통해 건강한 삶을 영위하는 데 도움을 준다. 연속진단 방법은 특히 향후 도래할 U-헬스케어 시대에서 진단시스템을 휴대폰, 병원, 주택 등에 내장하거나 신체에 착용하여 생체정보를 실시간으로 측정하고 진단하기 위한 기반 원천기술로 활용될 수 있다.
또한 본 발명의 실시간 연속검출장치 및 이를 이용한 검출방법은, 생명체 대사물질, 단백질, 호르몬, 핵산, 세포, 식품검사대상 물질, 환경 유해물질 또는 국방 화생방 측정물질 등을 분석하는데 활용될 수 있는데, 산업분야 별 제품군을 예시로서 정리하면 다음과 같다. 의료진단 산업으로는, 고위험군(만성질환자, 노인, 중환자) 연속진단시스템 제품, 당뇨환자 감염 연속진단시스템 제품, 심혈관 환자 재발 연속감시시스템 제품, 암 치료 환자 재발 연속감시시스템 제품, 그리고 좌변기 건강모니터링 시스템 제품 등을 들 수 있다. 인공장기 산업으로는, 인공췌장 제어시스템 제품 등 인공장기 제어 등에 적용할 수 있다. 공공보건 및 국방 산업으로는, 생물테러작용제 연속탐지시스템 제품 그리고 조류독감 및 사스 바이러스와 같은 인수공통 감염 병원체의 연속탐지시스템 제품 등에 응용될 수 있다. 환경 산업으로는, 강물, 연안, 해양 오염 연속감시시스템 제품 등을 들 수 있다. 생물 및 식품 산업으로는, 생물공정 연속모니터링시스템 제품과 식품 생산공정 연속모니터링시스템 제품 등에 적용될 수 있다.
이하, 본 발명의 가역반응성 포획 인식성분을 이용한 실시간 연속검출장치를 보다 구체적으로 설명한다.
1) 비표지 센서를 이용한 실시간 연속검출장치 구축 예시
실시간 연속검출 장치(또는 실시간 연속검출시스템)를 구현하는데 가역반응성 인식성분 외에 핵심 요소 중 하나가 센서 기술이다. 상기에서 설명한 바와 같이 센서 종류는 크게 비표지 센서와 표지 센서로 나눌 수 있는데, 연속진단시스템 구축 시 플라즈몬 공명센서, 캔틸레버 센서, 혹은 광도파로 센서와 같은 비표지 센서를 이용하는 것이 이론적으로 단순화 한다.
연속검출장치의 구성은 매우 다양하지만, 본 발명의 유용성을 쉽게 설명하기 위해 플라즈몬 공명 센서 칩 상에 가역반응성 항체(1B5)를 고정시켜 제작한 비표지 센서 기반 연속검출장치를 도 1을 참조하여 예로서 설명하면 다음과 같다.
비표지 센서로서 금속과 유전매체 계면에서 빛에 의해 발생하는 전하밀도파장인 표면 플라즈몬 공명을 측정하는 방법이 대표적이다. 이러한 표면 플라즈몬 공명은 금속표면과 매우 근접하여 상호작용 하므로, 이 영역에서의 인식반응 등에 의한 광학 특성의 변화는 표면 플라즈몬 공명을 야기하는 빛의 입사각에 영향을 주게 된다(J. Homola 등, Sens. Actuators B, Vol. 54, Page 3-15, 1999). 따라서 센서표면에서의 분석물질과 인식성분 간 반응에 의해 표면 플라즈몬 공명을 일으키는 빛의 입사각 변화를 신호로서 측정한다.
표면 플라즈몬 공명 센서(12) 상에 가역반응성 항체(1B5; (10))를 고정시켜 구성한 연속검출장치(도 1의 가)에 인산완충용액으로 희석하여 각기 다른 농도의 분석물질(알파2-마크로글로블린)이 포함되도록 제조한 표준용액들을 10 μL/분 미세유체 흐름속도로 순차적으로 주입하면 농도에 비례한 응답신호가 센서로부터 발생된다 (실시예 6 참조). 각 표준용액은 신호를 매번 기준선으로 되돌린 후 주입하였고, 주어진 조건 하에서 측정민감도는 0.1 ng/mL 수준 이하로 민감하였을 뿐만 아니라 농도응답 시간은 최종 응답수준의 95%를 기준으로 640초 정도로 매우 신속하였다 (도 5의 가). 분석특이도를 시험하기 위해 같은 농도 범위의 분석물질을 의료임상 시료인 인간혈청으로 희석하여 제조한 후 동일한 실험을 반복한 결과 거의 유사한 농도응답이 얻어졌으므로 (도 5, 나), 구축된 연속검출장치는 의료임상용 진단에 이용될 수 있다.
또한 분석민감도를 향상시키는 방법으로, 표지물질(14)과 중합된 탐지 인식성분(13)을 추가로 도입하여 분석물질(11)과 포획 인식성분(10) 간 인식반응 결합체의 질량변화를 증가시키는 신호증폭 방법이 이용될 수 있다. 탐지 인식성분(13)으로 비가역 항체 20E7을 선택하여 직경이 30 nm인 금 콜로이드 입자와 중합하였고, 이 중합체를 분석물질 표준용액과 미리 반응시킨 후 센서 내로 주입하여 센서의 농도응답을 측정하였다 (실시예 7 참조). 참고로, 비가역 항체 20E7은 분석물질에 대해 가역 항체 1B5과 동시에 반응할 수 있다. 그 결과 신호증폭 방법을 이용하면 최소 0.001 ng/mL의 분석물질 탐지가 가능하였고 따라서 분석민감도가 약 100배 향상되는 것으로 나타났다 (도 6).
의료임상 시료의 경우 특히 그 사용 양을 최소화시키는 것이 필요하므로 미세유체 흐름속도를 선행 실험조건의 1/10 (즉, 1 μL/분 또는 1.44 mL/일)로 감속 을 시도하였고 동일한 조건하에서 분석물질 농도의 증감에 따른 센서의 응답을 측정하였다 (실시예 8 참조). 센서의 농도응답을 측정한 결과 분석민감도(0.1 ng/mL)와 응답시간(640초, 최종응답의 95% 기준)은 미세유체 흐름속도와 관계없이 일정하게 유지되는 것으로 나타났다 (도 7의 가). 또한, 미세유체 흐름속도 변화에 따른 센서의 농도응답 패턴에도 큰 변화가 없어서 유체흐름속도가 10배 다른 조건에서 구한 두 농도응답곡선은 거의 일치하는 것으로 나타났다 (도 7의 나). 부가하여, 분석물질의 농도 증가 시 측정한 농도응답과 농도 감소 시 측정한 농도응답 간에도 차이가 없었다.
도 5 내지 도 7에서 나타낸 바와 같이, 가역반응성 항체가 고정된 센서칩을 이용하여 분석물질 농도 변화에 대한 SPR 센서의 응답을 구하기 위해 농도변화 시 마다 매번 초기조건 즉 분석물질이 부재한 상태로 원위치 시킨 후 측정을 시작하는 ‘리셋모드’를 사용하였다.
가역반응성 항체의 재활용을 예시하기 위해 ‘연속모드’를 사용하였는데, 분석물질 농도가 15분마다 계단식으로 10배 씩 증가하고 감소하는 2회 반복적인 변화에 대해 (0.01 - 100 ng/mL 범위) 센서로부터 농도응답을 연속적으로 구하였다 (실시예 9 참조). 주어진 미세유체 흐름속도(1 μL/분)로 센서 내로 주입되는 분석물질의 변화된 농도에서 센서응답은 15분 이내에 평형상태에 도달하였고 2회 반복 시 높은 재현성을 나타내었다 (도 8의 가). 이와 같은 연속측정 방식으로 측정한 센서의 농도응답을 도식한 표준곡선 (도 8의 나)은 ‘리셋모드’로 측정한 곡선과 다소 차이가 있는 것으로 나타났는데 이것은 센서시스템의 운영방식의 차이에 기인한 것으로 판단된다.
분석물질의 종류에 따라 발병 혹은 증세발현 시 농도의 증감변화 패턴(지수적 혹은 산술적)이 다를 수 있으므로 2배씩 혹은 그 이하로 증가하고 감소하는 산술적인 농도변화에 대한 센서의 농도응답을 ‘연속모드’로 측정하였다 (실시예 10 참조). 지수적인 변화에 대한 응답과 마찬가지로 센서는 산술적인 분석물질 농도 변화에 대해서도 유사한 분석성능을 나타내었다 (도 9). 더욱이 작은 농도변화에 대해서도 민감하고 신속하게 반응하는 것으로 미루어 가역반응성 항체 기반의 바이오센서는 향후 매우 정확한 분석을 요구하는 분석물질의 측정에 광범위하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명에서는 연속진단을 예시하기 위한 분석물질로서 알파2-마크로글로블린을 선택하였고, 이 물질에 대해 특이한 가역반응성 항체를 생산하여 연속진단 기법을 예시하였다. 마크로글로블린은 세 종류의 다른 질병 특히 신증후군의 치료 및 재발 확인, 알쯔하이머 조기진단, 그리고 인공장기 이식 후 염증반응과 합병증의 임상진단에 바이오마커로 이용될 수 있다.
또한, 신증후군은 약 90%가 소아에게만 발생하는 질병으로 소변에 단백질이 섞여 나오는 신장질환으로 신장의 사구체 이상에 의해 단백질이 유실된다 (Daniel A. Blaustein 등, Primary Care Update for OB/GYNS, Vol. 2, Page 204-206, 1995). 환자들은 몸이나 다리에 부종이 생겨 찾아오는 경우가 대부분이고 상황에 따라 신장경화증, 신부전증, 암 등으로 발전하는 경우도 있다. 이 질병의 진단은 CBC (complete blood count), 간기능 검사, 신장기능 검사, 마크로글로블린 등 혈 단백 검사, 소변검사 등에 의해 실시된다. 신증후군으로 진단 시, 치료를 위해 면역억제제 (prednisone) 또는 스테로이드제를 1-6개월간 투여하는데 이 기간 동안 소변검사나 혈액검사를 지속적으로 실시하여 변화를 관찰함으로서 치료효과를 판단한다. 면밀한 관찰을 위해 정기적으로 병원을 방문하여 혈액 및 소변 검사를 실시하여야 하는데 특히 신증후군 환자의 90%가 표현력이 약한 소아이므로 증세변화 등 신체이상에 대한 지속적이고 철저한 검사 및 관찰이 필요하다. 따라서 소아의 신증후군 치료효과 및 재발 확인을 위한 미래 기술로서 마크로글로블린 등 혈단백에 대한 연속탐지 기법의 개발은 매우 유용할 것으로 예측된다.
마크로글로블린의 바이오마커로의 활용에 대한 다른 가능성으로, 알쯔하이머는 60-70명 당 1명꼴로 발생되고 85세 이상은 50%가 앓고 있는 노인성질환으로 조기진단을 통한 예방이 절실하다. 2006년에 런던 킹스컬리지 연구팀이 혈액검사를 통해 알쯔하이머 질환에 걸린 환자로부터 두 종류의 단백질 즉, 보체인자-H의 전구체와 알파2-마크로글로블린 농도가 증가된 것을 발견했으며 이러한 단백질 농도차이의 규명을 통해 조기진단 가능성을 제시하였다 (A. Hye 등, Brain, Vol. 129, Page 3042-3050, 2006). 이러한 목적으로 마크로글로블린의 연속탐지에 의해 알쯔하이머 질환을 조기진단하면 증상발현 후 병원을 방문하는 것보다 질환예방 및 치료가 조기에 이루어져 질환의 진행을 훨씬 완화시켜 삶의 질 향상에 크게 기여할 것으로 기대된다.
마크로글로블린을 바이오마커로의 활용에 대한 또 다른 가능성으로, 인공장기의 이식에 따른 염증반응이나 합병증 유발은 알려진 사실이었으나 그 진단지표에 대한 연구결과가 많지 않았다. 2005년 미국의 듀크대학교 의학센터에서 심장수술에 심폐기를 사용 후 알파2-마크로글로블린 농도가 50% 증가된 연구결과를 제시하였는데 (Eric A. Williams 등, J Thorac Cardiovasc Surg, Vol. 129, Page 1098-1103, 2005) 이것은 전신적인 염증반응의 한 지표로서 마크로글로블린 농도변화가 이용될 수 있음을 나타낸다. 따라서 인공장기 이식 후 예후관찰 시 염증반응 발현 바이오마커를 연속탐지 할 수 있을 경우 정기적인 병원방문 혹은 합병증 증상발현 후 조치보다 인공장기 교체나 합병증 치료가 조기에 이루어질 수 있다는 장점이 크다.
위에서 예시한 질병들을 포함하여 급·만성 인체질환은 일반적으로 시간 혹은 일 단위로 비교적 느리게 진행되므로 질환지표 바이오마커를 측정하는 센서의 응답시간으로 보통 분 단위가 요구된다. 이것은 질병 진행시간과 비교하여 센서의 응답시간이 10배 정도 더 빠르다면 질병진행이 바이오마커 연속진단 공정을 지배하는 율속단계가 되므로, 도 8 및 9에서 나타낸 센서의 마크로글로블린 농도응답시간(약 15분; 최종응답의 95% 기준)은 연속탐지 조건을 만족시킨다. 더 신속한 센서 응답시간(예: 초 단위)은 연속진단 시 분석성능에 전혀 영향을 주지 않으며 단지 개념이 다른 1회용 센서(예: 혈당센서)의 경우 채취한 시료에 대한 측정시간을 단축시키는 효과를 제공할 뿐이다.
2) 표지 센서를 이용한 진단시스템 구축 가능성 예시
표지 센서의 예로서, 형광체를 신호발생원으로 사용하는 예가 가장 많은데 포획 인식성분(10)을 고체표면에서 고정시키거나(도 1의 나 및 라) 혹은 인식반응 셀(17) 내에서 액상반응을 통해 탐지가 가능한데, 이때 신호발생원인 형광물질(donor)로부터 방사된 빛은 어떤 에너지 수용체(acceptor)가 매우 근접하여 존재할 경우 흡수되어 빛이 외부로 방사되지 않는 원리를 이용한다(Shaw 등, J. Clin. Pathol, Vol. 30, Page 526-531, 1977). 그 응용으로, 항원-항체 부착과 같은 인식반응이 형광물질과 에너지 수용체 간 에너지 전달을 조절하도록 설계할 수 있고 형광신호는 수광소자(포토다이오드, charge-coupled device, photomultiplier tube 등)를 이용하여 탐지된다.
표지 센서의 다른 예로서 효소를 표지물질로 사용할 수 있는데, 센서표면에 고정된 포획 인식성분(10)을 이용하거나(도 1의 나 및 라) 혹은 효소분자 상에 항체가 부착하면 활성이 억제되는 것으로 알려진 몇 종류의 효소들을 이용하면 인식반응 셀(17) 내에서 액상반응 수행이 가능하다. 이러한 효소들을 면역분석에 이용하기 위해 분석물질 (즉, 항원)과 중합시켜 항체와 반응시키면 그 효소의 활성이 억제되는 것으로 알려져 있다(Se-Hwan Paek 등, Biotechnology and bioengeering, Vol. 56, Page 221-231, 1997). 효소로부터의 신호는 선택된 효소와 기질에 따라 흡광도 측정센서(스펙트로포토미터), 수광 센서(포토다이오드, charge-coupled device, photomultiplier tube 등 수광소자), 전기화학 센서(전극) 등 다양한 수단에 의해 측정될 수 있다.
표지 센서의 다른 예로서 자성입자를 표지물질로 이용할 수 있는데, 센서표 면에 고정된 포획 인식성분(10)을 이용하면(도 1의 나 및 라) 분석물질과 인식성분 간 반응에 대한 자기장 측정이 가능하다(A. Perrin 등, Journal of Immunological Methods, Vol. 224, Page 77-87, 1999). 자기장 측정 센서로는 GMR/TMR 및 Hall 소자가 대표적이며 소비 전력이 적고 크기도 작으며 가벼우면서 집적화가 가능하다.
이상에서 설명된 바와 같이, 가역반응성 항체와 센서기술을 결합하여 연속진단시스템을 구축하면 분석민감도의 희생 없이 항체를 연속적으로 재활용하여 분석물질을 실시간으로 측정할 수 있다. 예시된 연속진단시스템의 농도응답시간은 최종응답의 95%를 기준하여 10분대로서 농도가 초 단위로 변화하는 분석물질 측정에는 적용할 수 없으며 분 단위보다 상대적으로 느리게 변화하는 분석물질 측정에 적용할 수 있다. 특히 그 농도가 정해진 상한을 초과할 경우 경보발령을 요구하는 분석대상에 적합하다. 그 적용 가능한 분야로서, 질병이나 증세에 대한 연속진단 및 인공장기 제어, 생물테러작용제 연속탐지, 환경오염 연속감시, 그리고 생물공정 연속모니터링 분야 등이 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실험재료
본 발명의 실시예를 위해 사용된 재료 및 구입처는 다음과 같다. 표면 플라즈몬 공명 센서 칩 (BIACORE CM5; 구성성분: 유리모체, 30 nm 두께의 금 박막, 100 nm 두께의 dextran 층), amine coupling 키트 (100 mM N-hydroxysuccinimide (NHS), 400 mM N-ethyl-N’-(dimethylaminopropyl)carbodiimide) (EDC), 1M ethanolamine hydrochloride, pH 8.5 포함), 40% 글리세롤(glycerol)은 GE healthcare 사(스웨덴)로부터 구입되었다. 생쥐 단일클론 항체(20E7, 3D1; 비가역 반응성)와 알파2-마크로글로블린(α2-macroglobulin, tetramer)은 에이비프론티어 사(한국)로부터 공급되었다. 우 혈장 지질단백질 (bovine serum albumin), sodium acetate, sodium phosphate, sodium chloride, glycine, 인간 AB형 혈청 (human serum, AB plasma), 카제인 (casein), 금 나노입자 (gold nanoparticle, 30nm), 항 생쥐 염소 항체-horseradish peroxidase (HRP) 중합체, 그리고 3,3`,5,5`-tetramethylbenzidine(TMB)는 Sigma 사(미국)로부터 구입되었다. 총 IgG 항체 정량키트 (mouse IgG core ELISA)는 코마바이오텍 사(한국)로부터 공급되었다. 그 외 모든 시약들은 분석용 급으로 사용되었다.
실시예 1. 생쥐 단일클론 가역반응성 항체 생산
단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제작은 통상적인 표준방법에 따라 실시하였다. 구체적으로, 생후 6주된 암컷 BALB/c 생쥐의 복강에 알파2-마크 로글로블린을 면역원으로 주사하여 면역시킨 후 2주 간격으로 3회 부스팅하였다. 3차 부스팅 후 3일째에 생쥐를 희생시켜 비장을 적출하여 얻은 비장세포를 마이앨로마(myeloma) 세포주(Sp2/0-Ag14)와의 세포융합을 실시하였고, 이로부터 하이브리도마 세포를 선별하였다.
하이브리도마 세포는 총 384종류의 클론이 제작되었고 각 클론으로부터 생산된 항체 함유 배양액을 이용하여 면역원에 대한 반응성 시험과 총 IgG 항체량 결정을 수행하였다. 면역원과의 항체반응성 시험을 위해, 10 mM 인산완충용액 (140 mM NaCl 포함; pH 7.4)으로 희석된 알파2-마크로글로블린(2.5 μg/mL)이 고정된 96-마이크로플레이트 웰 내에 클론 배양액들을 각각 옮겨 반응시켰다. 세척 후, 0.5% 카제인 함유 10 mM 인산완충용액(카제인-PBS)으로 희석된 항 생쥐 염소항체-HRP 중합체(1/5,000)를 반응시켰다. 다시 세척 후, HRP 기질용액(3% 과산화수소(10 μL)와 10 mg/mL TMB(100 μL; dimethyl sulfoxide 용매에 희석)가 함유된 0.05 M 아세테이트 완충용액, pH 5.1(10 mL))을 각 웰에 가하여 효소반응을 수행한 후 15분에 2 M 황산을 첨가하여 정지시켰다. 각 웰에서 발생된 발색신호는 마이크로플레이트 판독기기(VERSAmaxTM, Molecular Devices 사, 미국)를 이용하여 450 nm 흡광도에서 측정되었다. 또한, 총 IgG 항체량을 결정하기 위해 mouse IgG core ELISA 키트를 사용하여 제조사로부터 제공된 과정에 따라 분석하였다.
두 분석결과로부터, 항체반응성 시험 시 흡광도 2.0 이하 (하위 50%) 그리고 총 IgG 항체량 0.1 μg/mL 이상(상위 15%)의 조건을 동시에 만족하는 하이브리도마 클론 7종류를 선별하였다.
실시예 2. 센서 칩 표면 활성화 및 리간드 고정화
표면 플라즈몬 공명 센서 칩으로 구입된 BIACORE CM5는 제조사로부터 제공된 프로토콜에 따라 100 mM NHS와 400 mM EDC를 이용하여 칩 표면을 활성화시켰다. 칩 표면에 고정될 리간드(항원 혹은 항체)의 양은 제조사 프로토콜 안내에 따라 계산하여 결정하였고 10 mM sodium acetate (pH 4.0) 완충용액을 이용하여 리간드를 일정 농도로 희석한 후 센서 칩 내로 주입하여 (유속 = 5 μL/분) 고정화를 실시하였다. 20분 후 1 M ethanolamine hydrochloride (pH 8.5) 용액을 6분간 주입하여 센서 잔여표면을 불활성화시켰다.
표면 플라즈몬 공명 센서시스템(BIACORE 2000; GE healthcare 사, 스웨덴)의 운영은 제조사로부터 제공된 BIACORE 2000 사용 프로토콜을 따랐고, 시료운반용액(running buffer)으로 인산완충용액 혹은 인간혈청을 시험목적에 따라 선택하여 사용하였다. 센서시스템 내에 장착될 센서 칩으로 BIACORE CM5를 구입하여 이 칩의 1번 유체채널에는 대조군으로 우 혈청 알부민을 부착시켰고 2번 유체채널에는 리간드를 화학적으로 고정시켰다. 모든 실시예에서 동일하게 유체흐름 방향을 1번 채널에서 2번 채널로 유지하여 2번 채널의 신호 값(resonance unit; RU)에서 1번 채널의 잡음 값을 빼주는 방식으로 순수 신호 값을 구하였다. 반응 셀 내의 온도는 모든 실시예에서 동일하게 25℃ 로 유지하였다.
실시예 3. 표면 플라즈몬 공명 측정시스템을 이용한 가역반응성 항체 스크리닝
가역반응성 항체 스크리닝을 목적으로, 실시예 2에서 설명한 바와 같이 1번 유체채널에 100 μg/mL 농도로 우 혈청 알부민을 고정시켰고 2번 유체채널에 100 μg/mL 농도로 알파2-마크로글로블린을 고정시킨 센서 칩을 제조하였다. 이와 같이 준비한 센서 칩을 표면 플라즈몬 공명 측정시스템에 장착한 후, 10 mM 인산완충용액을 시료운반용액으로 이용하여 5 μL/분 속도로 주입하여 평형상태를 유지하였다. 실시예 1에서 항체반응성 시험과 총 IgG 항체량 결정을 통해 선별된 하이브리도마 클론 7종류를 10 mM 인산완충용액(PBS, pH 7.4)으로 각각 적절히 희석하였다. 제조사에서 제공한 분석 프로그램(BIACOREoperation 2000)에 따라 각 항체시료 35 μL을 센서시스템 내에 장착된 센서 칩 내로 420초 동안 주입하여 부착반응을 유도한 후 인산완충용액으로 210초 동안 주입하여 탈착반응을 유도하였다. 동일 종 항체에 대한 분석이 완료된 후에는 10 mM glycine 완충용액 (pH 1.5) 15 μL를 180초간 일정하게 주입하여 센서표면을 재생시켰다. 부착 및 탈착 반응패턴은 제조사로부터 제공된 편집 프로그램(BIAevaluation 2.0)을 이용하여 분석하였고 부착속도상수(k a )와 탈착속도상수(k d ) 그리고 평형부착상수(KA)를 계산하였다.
시험된 하이브리도마 클론 7종류 중 두 클론이 가역반응성을 나타냈고 그 중 1B5 클론으로부터 생산된 항체가 본 발명의 목적에 적합한 것으로 나타났으며 전형적인 비가역반응성을 보이는 항체인 20E7과 반응특성을 비교하였다 (도 2). 부착반응 시 1B5 항체는 20E7 보다 평형상태에 현저하게 빨리 도달하였으며, 탈착반응 시에 1B5 항체는 초기 값에 가깝게 떨어지는 형태의 그래프를 나타낸 반면, 20E7은 거의 탈착되지 않는 형태의 그래프를 나타내었다. 이와 같은 특성차이로부터, 세척이 요구되는 기존 1회성 면역분석에서 세척 시에도 탈착되지 않는 비가역반응성 20E7 항체가 선호되었던 반면에 항체의 농도에 따라 역학적 평형반응에 의해 신속하게 부착과 탈착이 신속한 1B5는 항체의 재활용을 통한 연속측정에 이용될 수 있다. 따라서 본 발명에서의 기반 소재인 가역반응성 항체의 존재를 제시하였고 기존 항체들과의 그 본질적인 특성 차이를 1차 증명하였다. 참고사항으로, 1B5 항체와 20E7 항체는 모두 알파2-마크로글로블린에 대해 특이 반응성을 나타내며 이 항원분자 상의 다른 에피토프(epitope)에 부착하고 동일한 항원분자와 동시에 반응할 수 있다.
실시예 4. 가역반응성 항체의 부착/탈착 반복반응 패턴 비교
실시예 3에서 제조한 센서 칩을 이용하여 동일한 실험조건에서 가역반응성 1B5 항체의 부착/탈착 반복반응 패턴을 구하였고 이를 비가역반응성 20E7의 패턴과 비교하였다. 10 mM 인산완충용액으로 희석한 항체용액(100 ng/mL 1B5 또는 20 ng/mL 20E7) 17.5 μL을 5 μL/분 유속으로 210초 동안 센서 칩 내로 주입하여 부착반응을 유도하였고, 그 후 인산완충용액을 주입하여 110초 동안 탈착반응을 유도하였다. 이와 같은 동일한 부착/탈착 반응 조건 하에서 각 항체에 대해 6회 반복하였다. 각 항체 별로 분석을 완료 후 10 mM glycine (pH 1.5) 완충용액 15 μL을 180초간 일정하게 주입하여 센서표면을 재생시켰다. BIACore 2000 측정시스템의 운영과 데이터 편집은 실시예 2에서 설명한 바와 같았다.
분석결과, 도 3에서는 가역반응 특성을 보일 것으로 예측되었던 1B5 항체는 항체공급 후 불과 1분 이내에 신호가 증가하여 고정된 항원과의 부착반응 평형상태에 도달하였고 또한 인산완충용액 공급 시 즉시 탈착되어 신호가 초기값으로 되돌아 왔다. 이와 같은 부착/탈착 가역반응 패턴은 6회 반복 시 높은 재현성을 나타내었다. 비가역반응 특성을 나타낼 것으로 예측되었던 20E7 항체는 항체공급 후 정해진 시간 동안 상대적으로 느리지만 지속적인 부착반응을 나타내었고 인산완충용액 공급 시 탈착반응이 완료되지 못하였다. 따라서 항원-항체 반응 결합체는 부착/탈착 반복반응에 따라 점차 누적되어서 신호가 계단식으로 증가하는 패턴을 나타내었다.
실시예 5. 가역반응성 항체의 반응하한농도 결정
실시예 3에서 제조한 센서 칩 및 동일한 실험방법을 이용하여 가역반응성 1B5 항체의 농도변화에 대한 표면 플라즈몬 공명 센서의 응답을 측정하였다. 1B5 항체를 10 mM 인산완충용액을 이용하여 0.5 pg/mL에서 0.5 μg/mL 범위의 농도로 희석하였다. 희석된 각 항체용액 17.5 μL를 5 μL/분 유속으로 210초 동안 주입하여 부착반응을 유도하였고 그 후 인산완충용액을 110초 동안 주입하여 탈착반응을 유도하였다. 동일한 조건 하에서 저농도 항체용액으로부터 고농도 용액 순으로 분석하였고 다시 역순으로 분석하여 1회 순환 시험하였다. 순환 시험이 완료된 후, 실시예 4에서와 같은 방법으로 센서 표면을 재생시켰다.
도 4에서, 사용된 항체농도 범위 내에서 표면 플라즈몬 공명 센서의 신호는 항체용액 농도가 단계적으로 증가 시 비례하여 증가하였고 농도가 단계적으로 감소 시 비례하여 감소하였다. 특히, 항체 농도범위가 pg/mL 이하에서도 센서 칩에 고정된 항원과 반응하는 것으로 나타났는데 이는 기존 면역분석에 사용되는 비가역반응성 항체와 비교하였을 때 친화력 면에서 뒤지지 않는 결과이다. 따라서 1B5와 같은 반응특성을 지닌 항체를 탑재한 면역분석시스템은 우수한 분석민감도를 나타낼 것으로 예측되고, 또한 그 항체가 pg 농도단위에서 μg 단위까지 반응성을 나타내므로 추후 면역센서 제작에 이용 시 넓은 측정범위가 예상된다.
실시예 6. 가역반응성 항체 기반 비표지 면역센서시스템 구축
가역반응성 항체를 이용한 알파2-마크로글로블린 측정용 연속흐름 노출타입 비표지 센서(도 1의 가) 시스템을 구축하고자, 표면 플라즈몬 공명 센서시스템(BIACORE 2000)과 가역반응성 항체가 고정된 BIACORE CM5 센서 칩을 이용하였다. 실시예 2에서 설명한 바와 같이 1번 유체채널에 우 혈청 알부민을 100 μg/mL 농도로 고정시켰고 2번 유체채널에 가역반응성 1B5 항체를 10 μg/mL 농도로 고정시켜 센서 칩을 제조하였다. 이와 같이 센서 표면에 고정된 항체와 특이하게 반응하는 분석물질인 마크로글로블린을 10 mM 인산완충용액으로 희석하여 0 - 10 ng/mL 농도범위의 표준시료를 제조하였다. 각 표준시료(150 μL)를 10 μL/분 유속으로 900초 동안 센서시스템 내에 장착된 센서 칩 내로 주입하여 부착반응을 유도한 후 인산완충용액을 120초 동안 주입하여 탈착반응을 유도하였다. 각 시료에 대한 분석이 완료된 후 실시예 4에서와 같이 센서 표면을 재생시켰고, 인산완충용액 대신에 인간혈청을 희석용액 및 시료운반용액으로 사용하여 위에서 설명한 동일한 조건 하에서 실험을 반복하였다.
표면 플라즈몬 공명 센서를 이용하여 면역분석 분야 최초로 가역반응성 항체 기반의 분석시스템을 구축하였으며 이 분석시스템은 채택된 분석물질 농도 0.1 - 10 ng/mL 범위에서 농도응답을 나타내었고 측정민감도를 대표하는 탐지하한농도는 0.1 ng/mL 이하인 것으로 나타났다 (도 5의 가). 이 시스템의 분석특이성을 시험하기 위해 의료임상 시험조건에 가까운 인간혈청을 시료운반용액 및 표준시료 희석용액으로 사용하여 측정한 결과 (도 5의 나) 인산완충용액을 사용한 경우(가)와 매우 유사한 농도응답을 나타내었다. 이로부터 가역반응성 항체인 1B5 기반의 센서시스템은 측정민감도와 특이성 측면에서 매우 우수하였으며 더욱이 실제 의료임상 시험에도 적용될 수 있는 것으로 보인다.
실시예 7. 금 나노입자 표지된 탐지항체를 이용한 신호증폭
실시예 7.1. 탐지항체-금 나노입자 중합체 제조
금 콜로이드(직경: 약 30 nm) 현탁액을 구연산나트륨(sodium citrate)을 환원제로 이용하는 표준방법에 의해 제조하였다 (L.A. Dykman, A.A. Lyakhov, V.A. Bogatyrev, S.Y. Chchyogolev. Colloid, 60, 700, 1998). 구체적으로는, 유리 플라스크에 3차 탈이온수 1,000 mL을 넣은 후 여기에 1% 염화금 용액(tetrachloroauric acid) 20 mL을 첨가하였다. 반응을 돕기 위해 핫플레이트를 사용하여 용액을 끓였 고, 금 콜로이드를 만들기 위해 환원제로써 0.2 μm filter를 사용하여 여과한 1% 구연산나트륨 용액 40 mL을 첨가하였다. 구연산나트륨 첨가 직후 용액은 옅은 흑색에서 적색으로 변화하였다. 10분간 가열한 후 반응을 중지시켰고 상온에서 서서히 냉각 시킨 후 냉장 보관하면서 추후 실험에 사용하였다.
제조된 금 나노입자 현탁액(1 mL)에 0.5 M 카보네이트 완충용액(pH 9.6; 1 μL)를 넣어 pH 8.0 정도로 조절하였다. 이 용액에 비가역반응성 항체인 20E7(도 2 참조)을 10 mM 인산완충용액(PB; NaCl 포함하지 않음)으로 150 μg/mL 농도(100 μL)로 희석하여 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 5% 카제인이 포함된 PB(카제인-PB; 122 μL)를 첨가하였고 실온에서 다시 1시간 동안 반응시켰다. 이 혼합물을 16,000 rpm에서 30분간 원심분리한 후 상등액은 버리고 침전물에 카제인-PB(400 μL)를 넣어 용해시켰다. 다시 16,000 rpm에서 30분간 원심분리한 후 상등액을 버리고 금 입자 기준으로 20배가 농축되도록 카제인-PB(50 μL)를 넣어 용해시켰다.
실시예 7.2. 신호증폭 채택 시 분석시스템의 농도응답
분석물질인 알파2-마크로글로블린을 인간혈청으로 희석하여 0 - 10 ng/mL 농도범위의 표준시료를 제조하였고, 각 시료는 센서시스템에 장착된 센서 칩 내로 주입되기 전에 실시예 7.1에서 제조한 탐지항체-금 나노입자 중합체 10 ng/mL과 실온에서 10분간 반응시켰다. 이 반응 혼합물(150 μL)을 실시예 6에서 제조한 센서 칩 내로 10 μL/분 속도로 900초 동안 주입하여 부착반응을 유도한 후 인간혈청을 동일한 유속으로 120초 동안 주입하여 탈착반응을 유도하였다. 각 시료에 대한 분석이 완료된 후 실시예 4에서와 같이 센서 표면을 재생시켰다.
도 5에서, 상기 신호증폭 단계를 채택한 분석시스템의 농도응답은 실시예 6에서 구한 비표지 센서시스템의 농도응답과 비교하여 현저히 증가된 형태를 나타냈으며 실제로 분석민감도는 0.1 ng/mL 수준(도 5의 나 참조)에서 0.001 ng/mL 수준으로 약 100배 향상된 것으로 나타났다. 본 발명에서 예시한 신호증폭 방법을 이용하면 시료 내에 매우 낮은 농도로 존재하는 분석물질도 측정이 가능하므로 가역반응성 항체를 이용한 연속탐지 방법은 다양한 분석물질 측정에 널리 적용될 수 있다.
실시예 8. 유속 감소 시 분석시스템의 농도응답 패턴
의료임상 시료의 경우 특히 그 사용 양을 최소화시키는 것이 필요하므로 미세유체 흐름속도를 선행 실험조건의 1/10로 감속하여 분석시스템의 농도응답을 구하였다. 실시예 6에서와 동일한 센서 칩을 이용하였고 유속의 감소를 제외하고는 동일한 조건 하에서 실험을 또한 수행하였다. 시료운반용액과 표준시료 희석용액으로 인간혈청을 사용하였고 유속은 1 μL/분으로 유지하였다. 표준시료는 0 - 100 ng/mL 농도범위로 준비하였고, 시료(15 μL)를 센서 칩 내로 주입하여 900초 동안 부착반응을 유도한 후 인산완충요액을 주입하여 420초 동안 탈착반응을 유도하였다. 표준시료를 저농도에서 고농도의 순으로 분석한 후 다시 저농도로 돌아가는 순환형태로 분석하였다. 분석시스템의 운영과 데이터 편집은 실시예 4에서와 동일하게 수행하였고 분석이 완료된 후에는 제시한 바와 같이 센서표면을 재생시켰다.
도 1에서, 분석물질 농도의 증감에 따른 센서의 응답은 분석물질 농도에 비례하였으며 (도 7의 가) 그 응답패턴을 유속이 10배 빠른 조건에서 얻은 결과(도 5의 나)와 비교해 보면, 분석민감도는 약 0.1 ng/mL 그리고 응답시간은 640초(최종응답의 95% 기준)로 일정하게 유지되는 것으로 나타났다. 또한, 농도응답을 그래프로 작성하여 비교해 보면 (도 7의 나) 시험된 유속 범위에서 현저한 차이가 나타나지 않았고 분석물질의 농도 증가 시 그리고 농도 감소 시 측정한 농도응답 간에도 차이가 없었다. 특이사항으로, 유속이 상대적으로 빠를 때 (10 μL/분) 고농도 표준시료 분석 시 나타났던 과잉응답 현상(도 5, 분석물질 농도 = 10 ng/mL에서의 응답 참조)이 유속 감소 시 (1 μL/분) 현저히 완화된 것으로 나타났다 (도 7, 분석물질 농도 = 10 ng/mL 혹은 그 이상에서의 응답 참조).
실시예 9. 지수적인 농도변화에 대한 연속측정
상기 실시예들에서는 가역반응성 항체의 부착 및 탈착 반응을 측정하기 위해 각 시료 분석 간에 시료운반용액(분석물질 미포함)이 주입되는 리셋모드를 사용한 반면에, 본 실시예에서는 가역반응성 항체의 재활용을 예시하기 위해 시료 연속분석모드를 사용하였다. 센서 칩은 실시예 6에서 제조한 것을 사용하였고 마크로글로블린을 인간혈청으로 희석하여 0.01 - 10,000 ng/mL 범위의 표준시료를 준비하였다. 표준시료를 순차적으로 1 μL/분의 유속으로 센서 칩 내로 주입하였고, 분석 물질 농도가 900초마다 계단식으로 10배 씩 증가하고 감소하는 순환변화 2회 반복에 대해 센서로부터의 농도응답을 연속적으로 구하였다. 센서시스템의 연속모드로의 운영은 센서시스템 제조사에서 설정한 리셋 분석공정과는 달리 시료주입은 제공된 주입구를 통하지 않고 시료운반용액 공급통로를 이용하여 수행되었다. 시료 연속공급 시, 표준시료 주입 간 끓기거나 공기가 들어가지 않도록 이전 잔여 시료용액에 미리 정한 분석물질 농축액 혹은 희석액을 첨가하여 다음 시료의 표준농도로 조정하였고 농도가 균일하도록 지속적으로 혼합하였다.
분석 후 유출된 시료는 분취장치로 수집하였고 각 분획은 마이크로 웰 플레이트를 고정화모체로 이용하는 샌드위치 효소면역분석에 의해 표준시료의 분석물질 농도를 확인하였다. 분석방법은 10 mM 인산완충용액(140 mM NaCl 포함; pH 7.4)으로 희석된 알파2-마크로글로블린에 대해 비가역반응성인 3D1 단일클론항체(1 μg/mL; 100 μL)를 각 마이크로 웰 내에 가하여 고정시켰다. 세척 후, 0.5% 카제인 함유 10 mM 인산완충용액(카제인-PBS)를 200 μL 넣어 고정되지 않은 웰 잔여표면을 블로킹하였다. 다시 세척 후 분취장치에 의해 시간별로 수집된 분획용액(30 μL)에 0.5% 카제인 및 0.1% 트윈 함유 10 mM 인산완충용액(카제인-트윈-PBS; 70 μL)을 추가로 주입하여 전체 시료(100 μL)를 항체가 고정된 웰에 넣어 반응시켰다. 세척 후, 알파2-마크로글로블린에 대해 비가역반응성을 가지는 20E7 단일클론항체에 HRP가 결합된 20E7-HRP 중합체(1 μg/mL; 100 μL)를 카제인-트윈-PBS로 희석하여 웰에 주입하여 반응시켰다. 다시 세척 후, HRP 기질용액(실시예 1 참조)을 각 웰에 가하여 효소반응을 수행한 후 15분에 2 M 황산을 첨가하여 정지시켰다. 각 웰에서 발생된 발색신호는 마이크로플레이트 판독기기(VERSAmaxTM, Molecular Devices 사, 미국)를 이용하여 450 nm 흡광도에서 측정되었다.
연속측정을 위해 미리 계산하여 설정한 각 표준시료의 농도를 연속측정 후 수집하여 위에서와 같이 면역분석을 통해 실제 농도를 확인한 결과, 계산 값과 분석결과 간에 10% 이내의 차이가 있었으므로 계산 값을 그래프 작성에 이용하였다. 주어진 미세유체 흐름속도(1 mL/분)로 센서 내로 주입되는 표준시료 내 분석물질 농도의 증가 혹은 감소에 대한 센서응답은 공히 15분 이내에 평형상태에 도달하였고 2회 반복 순환 시 높은 재현성을 나타내었다 (도 8의 가; 0.01 - 100 ng/mL 농도범위에서 시험한 결과). 이와 같은 연속측정 방식으로 측정한 센서의 농도응답을 도식한 표준곡선(도 8의 나)은 리셋모드로 측정한 곡선과 약간의 차이가 발생하였는데 이것은 센서시스템의 운영차이에 의한 것으로 판단된다. 이와 같은 결과로부터 분석물질 농도의 변화에 대한 연속측정이 실제로 가능한 것으로 나타났으며 임상시험에 대한 응용가능성도 제시하였다.
실시예 10. 산술적인 농도변화에 대한 연속측정: 소아신장암 마커의 임상농도 범위에 대한 적용
분석물질의 종류에 따라 발병 혹은 증세발현 시 농도의 증감변화 패턴(지수적 혹은 산술적)이 다를 수 있으므로 2배씩 혹은 그 이하로 증가하고 감소하는 산술적인 농도변화에 대한 센서의 농도응답을 실시예 9에서와 같이 연속모드로 측정하였다. 본 실험에서는 모델 분석물질로 선택한 알파2-마크로글로블린을 바이오마 커로 사용할 수 있는 소아신장암 진단을 궁극적으로 염두에 둔 최적조건을 사용하였다. 즉, 혈청시료 사용량을 최소화할 수 있도록 분석물질을 카제인-PBS로 희석하여 표준시료를 제조하였고 그 농도범위는 분석성능이 최적상태로 유지될 수 있는 1 - 20 ng/mL 범위로 결정하였다. 각 표준시료를 1800초 간격으로 센서 칩 내로 주입하였고 유속은 1 μL/분으로 조절하였다.
도 9에서는, 산술적 수준의 연속적인 농도변화에 대한 센서의 응답은 지수적인 변화에 대해서와 마찬가지로 신속한 응답시간과 연속측정 재현성을 나타내었다. 더욱이 작은 농도변화에 대해서도 민감하고 신속하게 반응하는 것으로 미루어 가역반응성 항체 기반의 바이오센서는 향후 매우 정확한 분석을 요구하는 분석물질의 측정에 광범위하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다. 특히, 알파2-매크로글로블린의 임상적으로 유효한 농도변화 범위는 3 - 10 mg/mL로서 혈청시료를 그대로 연속측정에 사용할 경우 하루에 1.44 mL(1 μL/분 주입속도 기준)가 소요된다. 따라서 이 시료량을 최소화하는 것이 필요하므로 본 실시예에서는 106배 낮은 농도범위로 희석하여 실제 임상테스트 시 1.44 nL/일 정도의 극소량의 혈청 소모를 가능하게 하였다. 더욱이 이 분석조건 하에서 분석물질 농도변화에 대한 신호변화 폭의 증가 즉, 분석정확도도 향상시킬 수 있었다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 일정량의 가역반응성 인식성분을 연속적으로 재활용하여 분석물질 농도 변화를 실시간 측정할 수 있다. 이는 분석물질의 농도에 따라 신속하게 가역적으로 반응하는 항체를 재활용하면 기존의 1회용 진단 칩에 비해 구성부품 및 제작방법이 획기적으로 단순화할 수 있음을 의미한다. 또한, 질병이나 증세에 대한 실시간 모니터링을 가능하게 하므로 만성질병 혹은 고위험군 환자에 대한 연속적인 감시가 가능하게 된다. 이 뿐만 아니라, 인공장기 제어장치, 생물테러작용제 연속탐지시스템 제품, 인수공통 감염 병원체의 연속탐지시스템 제품, 환경오염원 연속감시시스템 제품, 생물공정 연속모니터링시스템 제품, 식품 생산공정 연속모니터링시스템 제품 등에 적용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 시료 분석 사이트 내에서 포획 인식성분(10)을 연속적으로 재활용하여 분석물질의 농도 변화를 측정하는 (가)연속흐름 노출 타입 비표지 센서; (나)연속흐름 노출 타입 표지 센서; (다)인식반응 셀 타입 비표지 센서; 및 (라)인식반응 셀 타입 표지 센서를 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 포획 인식성분의 예시로서 생쥐 하이브리도마 클론으로부터 생산된 가역반응성을 나타내는 항체(1B5)와 전형적인 비가역반응성을 보이는 항체(20E7)에 대한 부착 및 탈착 반응특성을 분석하기 위해 센서표면에 항원 즉, 분석물질(알파2-마크로글로블린을 모델로 이용)이 고정된 표면 플라즈몬 공명 센서시스템을 통해 측정한 그래프 및 이로부터 결정된 속도상수와 부착평형상수의 비교이다.
도 3은 도 2의 센서시스템을 이용하여 두 항체(1B5 및 20E7)의 반응특성 차이에 따른 연속측정 실현 가능성 여부를 시험하기 위한 순환 반복측정 결과를 비교한 그래프이다.
도 4는 도 2의 센서시스템을 이용하여 가역반응성 항체인 1B5의 항원에 대한 친화력을 시험하기 위해 항체를 연속 희석하여 농도 증감에 따라 센서 상에 고정된 항원과 반응시켜 얻은 결과이다.
도 5는 가역반응성 항체인 1B5가 의료임상용 진단에 이용될 수 있는지를 평가하기 위해 1B5 항체를 센서표면에 고정시킨 후 항원 즉, 분석물질을 농도 증가에 따라 고정된 항체와 반응시켰고 시료운반용액으로 (가)인산완충용액 및 (나)인간혈 청을 이용하여 얻은 결과의 비교이다.
도 6은 도 5의 센서시스템의 분석민감도를 향상시키기 위해 표지물질(14)로 직경이 30 nm인 금 콜로이드 입자와 탐지 인식성분(13)으로 비가역 항체 20E7 간 중합체를 추가로 도입하여 얻은 신호증폭 결과이다.
도 7은 도 5의 센서시스템을 이용하여 시료 사용 양을 최소화시키기 위해 센서 칩 내로의 미세유체 흐름속도를 선행 실험조건의 1/10로 감속한 조건 하에서 분석물질 농도의 증감에 따른 센서의 응답 결과이다.
도 8은 가역반응성 항체의 재활용을 예시하기 위해 센서표면에 항체 1B5가 고정된 표면 플라즈몬 공명 센서시스템을 연속측정 모드로 운용하여 분석물질(알파2-마크로글로블린) 농도가 연속적으로 10배 씩 증가하고 감소하는 2회 반복적인 변화에 대해 센서로부터 구한 (가)농도응답 결과 및 (나)그래프로 도식한 표준곡선이다.
도 9는 도 8의 센서시스템을 이용하여 분석물질 농도가 2배씩 혹은 그 이하로 증가하고 감소하는 산술적인 농도변화에 대한 센서의 농도응답 결과이다.
<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>
10: 포획인식성분
11: 분석물질
12: 비표지 센서
13: 탐지인식성분
14: 표지물질
15: 표지 센서
16: 반투과성 막
17: 인식반응 셀

Claims (18)

  1. 시료 유입 채널, 시료 분석 사이트 및 시료 배출 채널을 포함하는 실시간 검출장치에 있어서, 상기 시료 분석 사이트는 가역반응성 포획 인식성분 및 시료내의 분석물질-포획인식성분 결합체로부터 발생된 신호를 탐지하는 센서를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출장치.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 가역반응성 포획 인식성분은 시료 내 분석물질과 반응 시 부착속도상수(k a )는 1×104 L·mol-1·sec-1 내지 1×107 L·mol-1·sec-1, 그리고 탈착속도상수(k d )는 1×10-5 sec-1 내지 1×10-2 sec-1 범위의 가역반응 특성을 가지며 동시에 평형부착상수(K A = k a /k d )가 1×106 L/mol 이상의 고친화력을 가지는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 가역반응성 포획 인식성분은 시료 내 분석물질인 생명체 대사물질, 단백질, 호르몬, 핵산, 세포, 식품검사대상 물질, 환경 유해물질 또는 국방 화생방 측정물질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 수용체, 핵산, 효소, 압타머, 펩타이드 또는 분자인쇄 인공막인 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속검출 장치.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 센서는 분석물질-포획 인식성분 결합체로부터 발생된 신호를 직접 탐지하는 비표지 센서, 또는 분석물질-포획 인식성분 결합체 밀도에 비례하여 신호를 발생시키는 표지물질을 경유하여 탐지하는 표지 센서인 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출장치.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 비표지 센서는 표면 플라즈몬 공명 센서, 캔틸레버 센서, 광도파로 센서, 광간섭 센서, 또는 나노센서인 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출장치.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 표지 센서는 표지물질로 형광체, 발광체, 효소, 금속입자, 플라스틱 입자, 자성입자, 또는 나노입자를 사용하는 형광, 발광, 발색, 전기화학, 또는 자기장 탐지센서인 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출장치.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 시료 분석 사이트는 시료내 분석물질만 선택적으로 투과시킬 수 있는 반투과성 막에 의해 구획이 나누어져 포획 인식성분이 고정된 센서표면쪽에 인식반응 셀을 형성하는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출장치.
  8. 제 7항에 있어서, 표지 센서를 이용하는 경우, 상기 인식반응 셀 내에 반투과성 막을 통과할 수 없는 크기의 표지물질과 중합된 탐지 인식성분을 가두어 두고 재활용하는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출장치.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 인식반응 셀 내의 탐지 인식성분도 포획 인식성분과 함께 연속적으로 재활용되기 위해 가역 반응특성을 갖는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출장치.
  10. 하기 단계들을 포함하는, 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 실시간 연속 검출장치를 이용한 분석물질의 실시간 연속 검출방법:
    a) 분석물질을 포함하는 시료를 상기 시료 유입 채널을 통해 시료 분석 사이 트내로 주입시키는 단계;
    b) 상기 분석물질을 시료 분석 사이트내의 가역반응성 포획 인식성분과 결합시키는 단계;
    c) 상기 분석물질과 포획 인식성분의 결합에 의해 발생되는 신호를 센서에 의해 탐지하는 단계;
    d) 시료의 계속적 유입이나 세척액의 유입에 의해 상기 분석물질과 포획 인식성분의 결합이 탈착되어 분석물질이 상기 시료 배출 채널을 통해 배출되는 단계; 및
    e) 상기 탈착된 포획 인식성분을 연속적으로 재활용하여 상기 b) 내지 d) 단계를 반복함으로써 시료내 분석물질의 농도 변화를 실시간으로 측정하는 단계.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 c)단계에서 분석물질-포획 인식성분 결합체로부터 발생된 신호를 비표지 센서를 이용하여 직접 탐지하거나, 혹은 분석물질-포획 인식성분 결합체 밀도에 비례하여 신호를 발생시키는 표지물질을 경유하여 표지 센서를 통해 신호를 측정하는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 비표지 센서를 이용하는 경우 시료에 포함된 분석물질은 시료 유입 채널을 통해 연속적으로 시료 분석 사이트 내로 유입되어 포획 인 식성분과 반응하는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출방법.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 표지 센서를 이용하는 경우 시료 내의 분석물질이 표지물질이 중합된 탐지 인식성분과 사전에 반응한 후 시료 유입 채널을 통해 연속적으로 시료 분석 사이트 내로 유입되어 포획 인식성분과 반응하거나 (연속흐름 노출 타입), 시료 내의 분석물질이 시료 유입 채널을 통해 연속적으로 시료 분석 사이트 내로 유입된 후 인식반응 셀 내의 표지물질과 중합된 탐지 인식성분 및 포획 인식성분과 반응하는 (인식반응 셀 타입) 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 탐지 인식성분은 연속흐름 노출 타입의 경우 분석물질과 미리 반응되어 공급되므로 비가역 반응특성을 갖거나, 인식반응 셀 타입의 경우 포획 인식성분과 함께 탐지 인식성분도 연속적으로 재활용되기 위해 가역 반응특성을 갖는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출방법.
  15. 제 13항에 있어서, 인식반응 셀 타입 표지 센서를 이용하는 경우 근접해 있 던 형광물질(표지물질)과 형광에너지 수용체 간의 에너지 전달이 포획 인식성분과 분석물질의 반응에 의해 방해되어 형광신호가 발생하는 원리를 이용하거나, 효소분자(표지물질) 상에 고정된 분석물질과 인식성분이 결합하면 활성이 억제되는 것으로 알려진 효소들을 표지물질을 이용하여 포획 인식성분을 센서 상에 고정시키지 않고 인식반응을 액상에서 수행할 수 있는 것을 특징으로 하는 분석물질의 실시간 연속 검출방법.
  16. 하기 단계들을 포함하는, 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 실시간 연속 검출장치에 사용되는 가역반응성 포획 인식성분의 선별방법:
    a) 포획 인식성분을 준비하는 단계;
    b) 상기 포획 인식성분을 센서표면에 고정된 분석물질과 결합시키는 단계;
    c) 상기 포획 인식성분과 분석물질의 결합에 의해 발생되는 신호를 센서에 의해 탐지하는 단계;
    d) 세척액의 유입에 의해 상기 포획 인식성분과 분석물질의 결합을 탈착시키는 단계;
    e) 상기 탈착되고 남은 포획 인식성분과 분석물질의 결합에 의해 발생되는 신호를 센서에 의해 탐지하는 단계; 및
    f) 상기 e)단계에서의 탐지 신호가 상기 c)단계에서의 탐지신호보다 낮아지는 포획 인식성분을 선택하는 단계.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 a) 단계에서 상기 포획 인식성분은 운반용액에 희석하여 연속적으로 주입되고, 상기 f) 단계에서 시간에 따라 증가하던 신호가 감소하는 포획 인식성분을 선택하는 것을 특징으로 하는 가역반응성 포획 인식성분의 선별방법.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 a) 단계에서 상기 포획 인식성분은 세척액과 순환 반복되어 주입되고, 상기 f) 단계에서 시간에 따라 신호가 증가되었다가 초기 기준선으로 되돌아오는 신호패턴이 반복되는 포획 인식성분을 선택하는 것을 특징으로 하는 가역반응성 포획 인식성분의 선별방법.
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