JP2009530600A - 平坦な表面によって反射する光の測定により分子相互作用を測定するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
− 測定される信号は、先験的に公知ではないパラメーターを含む複雑な関数的依存性を通じ、五つの異なる材料の物理的特性に依存する。挙げられる五つの材料は、ガラス支持体または類似の生成品、支持体に堆積した導体の薄い層、金属性表面を官能基化させることができる重合体層、相互作用によって付着する分子および水溶液である;
− 測定の感度および正確さは、センサーを形成する導体層の厚さおよび表面品質に強く依存する(H.Neffらによる刊行物「Optical properties and instrumental performances of thin gold films near the surface plasmon resonance」、Thin solid films、2006、496、688〜697ページを参照されたい);
− 測定は、さまざまな角度における光強度の検出に基づき、これは、高い分解能での角度走査の能力がある装置を必要とし、したがって、高い精度の可動部分または好適な空間分解能の光検出器マトリクスから成り立つ(L.S.Jungらによる論文「Quantitative interpretation of the response of surface plasmon resonance sensors to adsorbed films」、Langmuir、1998、14、5636〜5648ページを参照されたい)。
前記問題から以下が生起される:
− 結合反応速度論を通して決定される親和性定数値と熱力学的平衡で得られるものとが不一致となる;
− 信号がこれまで公知でなかったパラメーターに依存するため、リガンド/レセプター対が表面に形成されるときに発生する信号の強度を予測することができない。
a)疎水性アモルファスポリマーから構成され、屈折率が1.3200〜1.3500、好ましくは1.3300〜1.3350である透明な固体材料の平らまたは粗い平坦な表面を、レセプターまたは試薬の機能を持つ分子、例えば抗体、他のタンパク質性もしくはペプチド性複合体、核酸、脂質あるいはレセプターもしくは試薬で終結された両親媒性の界面活性剤またはブロックポリマーを1ナノグラム/ml〜10ミリグラム/mlの濃度で含有し、場合により、レセプター機能を有さない他の分子(スペーサー)に混合される混合物の水溶液または非水溶液に接触させ、場合により、水溶液と前記固体材料との間の界面から反射する光強度を追加ごとに測定し、時間の関数または次第に追加されるレセプター濃度の関数として、測定した値を図表に報告し、場合により、前記分子の他の水溶液または非水溶液に表面を接触させることにより、この手順を繰り返す工程と;
b)一連の公知である体積のリガンド水溶液を工程(a)で得られた溶液に追加し、水溶液と重合体材料との間の界面から反射する光強度を追加ごとに測定し、時間の関数または次第に追加されるリガンド濃度[T0]の関数として、測定した値を関係する図表に報告し、反射光強度データIをリガンド追加の関数として式:
でフィットさせ、ここで、
I0は、表面に入射する光の強度を表し、
cは、表面粗さを考慮した因数であり、粗さのない表面の場合にのみ1に等しい値を有し、
INは、界面がないときに検出器によって測定される光強度であり、
φは、入射平面での光偏光の方向によって形成される角度であり、
R⊥およびR‖は、入射平面にそれぞれ垂直および平行に偏光する場合に薄い層についてフレネル式から導かれる反射係数であり、界面に吸着されたレセプターとあらゆる瞬間において接触しているリガンドの量に依存する、
工程とを含む方法である。前記フィットから、表面上のレセプターと相互作用するリガンドの濃度[TL]と、場合により、ラングミュア吸収式によってレセプター−リガンド結合のK定数とを得る。
ここで、
I0、[TL]、Δnは、先に定義したとおりであり、
[TR]は、表面に付着したレセプターの濃度であり、
mRとmLは、それぞれレセプターおよびリガンドの分子量であり、
ρRとρLは、それぞれレセプターおよびリガンドの密度を表し、
Vは、水溶液の体積であり、
Aは、レセプターとリガンドとの相互作用が生じる固体材料表面の面積であり、
λは、入射する光の波長であり、
Naは、アボガドロ数であり、
n0は、水溶液の屈折率であり、および
Ibは、レセプターを追加する前(工程(a)の前)に測定した強度である。
ここで、
[T0]は、先に定義したとおりであり、
[S0]は、リガンド−レセプター結合部位のモル濃度であり、および
Kは、親和性定数(結合定数とも言われる)である。
実施例1
ビオチンと共役したタンパク質ウシ血清アルブミン(ビオチン化BSA、リガンド)とアビジン(レセプター)との間の結合定数の測定。
ラップ仕上げによって機械的に加工された一辺1cmの平滑表面を有する、60モル%のパーフルオロジオキソールTTDを含有するTFEコポリマーの直角プリズムを1.5ミリリットルの水に浸漬する。
プリズムを浸漬する工程(a)で得た溶液に対し、漸近値に到達したところで、ビオチンと共役したウシ血清アルブミン(Pierceによって市販されており、製造番号は29130)の5マイクロモル水溶液を10マイクロリットルずつ追加する。溶液は、常に攪拌下に維持する。各追加後、工程(a)のように反射光強度を測定する。
薄い膜による、アビジン(レセプター)と、ビオチンと共役したウシ血清アルブミン(ビオチン化BSA、リガンド)との間の結合定数の測定。
吸光係数が高い溶液中における、アビジン(レセプター)と、ビオチンと共役したウシ血清Abumin(ビオチン化BSA、リガンド)との間の相互作用の検出。
抗マウスIgG抗体との相互作用による流動セル内でのマウスIgG抗体の検出。
マウスIgG抗体を5マイクロモルの濃度で含有する水溶液を20マイクロリットル/分でセル内に流動させる。流動中、水溶液とパーフルオロポリマーとの間の界面から反射する光の強度を2分間の間隔で測定する。漸近値に到達するまでに測定した強度値(図4内の塗りつぶしの点)を時間の関数として図表に報告する。
ヤギで作製した抗マウスIgG抗体を5マイクロモルの濃度で含有する水溶液を20マイクロリットル/分でセル内において流動させる。反射光の強度を工程(a)のように検出し、値を時間の関数として図表に報告する(図4内の塗りつぶしの四角形)。20分後、工程(a)の終結時に測定した値に対し、100%近い反射光強度の上昇が得られる。
ヒトIgG抗体と抗マウスIgG抗体との間に特定の相互作用がないことを検出するためのコントロール実験。
実施例4の工程(a)に記載する手順を、マウスIgG抗体の代わりにヒトIgG抗体を使用して繰り返す。実施例4の工程(a)のように反射光強度を検出し、値を時間の関数として図表に報告する(図4内の白抜きの点)。
その後、実施例4の工程(b)に記載する手順を、ヤギで作製した抗マウスIgG抗体を使用して同様に繰り返す。実施例4の工程(b)のように反射光の強度を測定し、値を時間の関数として図表に報告する(図4内の白抜きの点)。20分後、反射光の強度は、工程(a)の終結時に測定した値と比較して約20%増加する。得られた上昇は、実施例4の工程(b)の終結時に得られたものよりもはるかに低く、これは、工程(a)中に表面に吸着された抗マウスIgG抗体とヒトIgG抗体との間の不特定な相互作用に起因する。
ビオチンと共役し、アビジンで固定化された抗ヒトIgG抗体との相互作用によるヒトIgG抗体の検出。
Claims (11)
- 反射光の強度の測定を使用することにより、二つの相互作用する分子種の結合定数および/または溶液中のリガンドの濃度を決定するための方法であって、:
a)疎水性アモルファスポリマーから構成され、屈折率が1.3200〜1.3500、好ましくは1.3300〜1.3350である透明な固体材料の平らまたは粗い平坦な表面を、レセプターまたは試薬の機能を持つ分子、例えば抗体、他のタンパク質性もしくはペプチド性複合体、核酸、脂質あるいはレセプターもしくは試薬で終結された両親媒性の界面活性剤またはブロックポリマーを1ナノグラム/ml〜10ミリグラム/mlの濃度で含有し、場合によりレセプター機能を有さない他の分子(スペーサー)に混合される、混合物の水溶液または非水溶液に接触させ、場合により、水溶液と前記固体材料との間の界面から反射する光強度を追加ごとに測定し、時間の関数または次第に追加されるレセプター濃度の関数として、測定した値を図表に報告し、場合により、前記分子の他の水溶液または非水溶液に表面を接触させることにより、この手順を繰り返す工程と;
b)一連の公知である体積のリガンド水溶液を工程(a)で得られた溶液に追加し、水溶液と重合体材料との間の界面から反射する光強度を追加ごとに測定し、時間の関数または次第に追加されるリガンド濃度[T0]の関数として、測定した値を図表に報告し、反射光強度データIをリガンド追加の関数として、薄い膜の反射に関するフレネル式でフィットさせて付着した質量を得るとともに、吸着に関するラングミュア式でフィットさせて平衡時のリガンド−レセプター親和性定数を得る工程と
を含む方法。 - 両親媒性の非イオン性またはイオン性界面活性剤が、重合体表面上に単分子層(自己組織化した単分子層)を生起させる界面活性剤である、請求項1記載の方法。
- リガンド−レセプター対が、タンパク質、核酸、糖タンパク質、炭水化物、ホルモンから選択される、請求項1〜2のいずれか1項記載の方法。
- 分子のリガンド−レセプター対が、抗体/抗原、酵素/インヒビター、炭水化物/炭水化物、タンパク質/DNA、DNA/DNA、ペプチド/ペプチドから選択される、請求項3記載の方法。
- レセプターが、公知の技術による方法、例えば化学的方法または電磁波照射もしくはプラズマ処理方法を通じ、固定化および/または化学的に修飾される、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 固体材料の表面に接触し、レセプターおよび/またはリガンドの機能を有する分子または分子的複合体を含有する溶液が、場合により、透明または混濁および/もしくは吸収性である、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 固体材料の表面が、表面粗さの深さおよび幅として10ナノメートル〜3ミリメートルという特徴的なサイズを有する、規則的もしくは不規則な粗さを呈し、リガンド−レセプター相互作用の存在下に表面から放出される光の強度が、幾何学的な反射の方向のみならず、幾何学的な反射と異なる方向でも測定される、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- リガンド−レセプター相互作用の存在下における反射光の信号と、光の反射および分散によるバックグラウンドノイズとの比率が最適化されるように、入射する光の入射角度および偏光が選ばれる、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。
- リガンド−レセプター相互作用の存在下における反射光の信号と光の反射および分散によるバックグラウンドノイズとの比率が最適化されるように、配向が選択される偏光子によって反射光がフィルタリングされる、請求項8記載の方法。
- 重合体アモルファス材料の表面が、流動なしで測定を行うためのセルに組み込まれ、または流動セルに組み込まれ、または浸漬プルーブに組み込まれる、請求項1〜9のいずれか1項記載の方法。
- 重合体材料の表面が、異なるレセプターを吸着または固定化する、より小さい面積に分割される、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
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