KR101365051B1

KR101365051B1 - 소고기 월령 판별용 ｓｐｒ 키트 및 이를 이용한 소고기 월령 판별 방법

Info

Publication number: KR101365051B1
Application number: KR1020110123858A
Authority: KR
Inventors: 장익순; 최종순; 양경은; 이동기; 박현규; 함철호
Original assignee: (주)미코바이오메드; 한국기초과학지원연구원
Priority date: 2011-11-24
Filing date: 2011-11-24
Publication date: 2014-02-26
Also published as: KR20130057888A; WO2013077693A1

Abstract

본 발명은 소고기 월령 판별용 SPR 키트 및 이를 이용한 소고기 월령 판별 방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 항 p21 항체 및 PBS 시료 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 소고기 월령 판별용 SPR 키트 및 소고기 월령 판별 대상 시료를 PBS 버퍼에 넣고 균질화 시키고 이를 항 p21항체가 부착된 금속 박막과 접촉 시킨 후 SPR법에 의해 시료내 p21의 농도를 측정하는 소고기 월령 판별 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 소고기 월령 판별용 SPR 키트 또는 소고기 월령 판별 방법을 제공한다. 본 발명의 소고기 월령 판별용 SPR 키트를 사용하는 경우, p21의 농도를 측정하여 30개월 미만의 소고기를 효과적으로 선별해낼 수 있어 소고기의 월령을 판별하는 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

소고기 월령 판별용 ＳＰＲ 키트 및 이를 이용한 소고기 월령 판별 방법{SPR Kit for discriminating cow-meat specific age and method for discriminating cow-meat specific age}

본 발명은 소고기 월령 판별용 SPR 키트 및 이를 이용한 소고기 월령 판별 방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 항 p21 항체 및 PBS 시료 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 소고기 월령 판별용 SPR 키트 및 소고기 월령 판별 대상 시료를 PBS 버퍼에 넣고 균질화 시키고 이를 항 p21항체가 부착된 금속 박막과 접촉 시킨 후 SPR법에 의해 시료내 p21의 농도를 측정하는 소고기 월령 판별 방법에 관한 것이다.

소고기의 수입 개방에 따라 막대한 양의 수입산 소고기가 캐나다, 미국 등으로부터 수입되고 있다. 그러나, 캐나다, 미국 등의 북미산 소고기에는 광우병 발병율이 높은 30개월령 이상의 소고기가 많이 포함되어 있어 국민들의 불안감이 상당히 크다. 광우병에 걸린 소의 95%가 30개월령 이상인 것으로 알려져 있다. 따라서, 30개월령 미만인 소고기를 선별하여 수입하여야 하는데, 소의 월령을 판별하기가 쉽지 않다.

현재 통용되고 있는 소의 월령 판별 방법으로는 1) 소의 출생증명서, 2) 도축한 소의 척추 뼈의 골화(骨化) 상태를 판정하는 방법, 3) 치아감별법 등 3가지가 있다. 상기 방법 중 소의 출생증명서를 보고 소의 월령을 판별 하는 방법이 가장 정확하지만, 미국의 소는 주로 방목하여 키우기 때문에 미국 소의 출생 월령 확인율은 20%로 매우 낮다. 또한, 도축한 소의 척추를 이분할하여 척추 뼈의 골화 상태를 보고 판정하는 방법, 즉 뼈의 노화 정도를 보고 추측하는 방법은 육안 식별방법으로는 아직까지 가장 신빙성이 있지만, 이 방법도 판정단계에서 대략 15% 정도의 오차가 발생한다. 또한, 치아감별법은 사육조건에 따라 변이가 커서 정확하지 않다는 것이 과학적 정설이며, 특히 사료급여 조건이 인간의 통제를 받지 않는 자연 방목 소의 경우는 더 부정확하다.

상기한 바와 같이, 소의 출생증명서에 의한 것을 제외하고는 도축된 소고기 상태에서 실제의 월령을 판별할 수 있는 과학적인 방법은 전무한 상태이다. 현재 소고기의 원산지, 등급, 숙성도 등의 판별 방법에 관하여는 다양하게 연구되어 있어 한우 및 수입 소고기의 원산지, 등급, 숙성도 등의 판별이 가능하지만, 한우 및 수입 소고기 모두에서 월령을 판별하는 방법에 관한 연구는 전무한 상태이다. 또한, 소고기의 월령을 판정하기에는 수입 물량의 방대한 양에 비해 실제적인 검사 역시 많은 시간과 비용이 소모되는 문제점이 있다.

따라서, 시간과 비용을 줄일 수 있으면서 도축된 이후의 소고기의 월령을 판별할 수 있는 과학적인 방법에 대한 연구의 필요성이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 본 발명자들은 도축된 이후의 소고기의 월령을 필드에서 간편히 판별할 수 있는 방법에 대해 연구하던 중, p21 단백질이 30개월 미만의 소고기 근육조직에서는 높게 발현됨을 확인하였고, 이를 SPR 키트화 함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 항 p21 항체 및 PBS 시료 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 소고기 월령 판별용 SPR 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 (a)소고기 월령 판별 대상 시료를 PBS 버퍼에 넣고 균질화 시키는 단계; (b)상기 균질화된 시료를 항 p21항체가 부착된 금속 박막과 접촉 시키는 단계; 및 (c)SPR법에 의해 시료내 p21의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 소고기 월령 판별 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항 p21 항체 및 PBS 시료 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 소고기 월령 판별용 SPR 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 (a)소고기 월령 판별 대상 시료를 PBS 버퍼에 넣고 균질화 시키는 단계; (b)상기 균질화된 시료를 항 p21항체가 부착된 금속 박막과 접촉 시키는 단계; 및 (c)SPR법에 의해 시료내 p21의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 소고기 월령 판별 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 항 p21 항체 및 PBS(Phosphate Buffered Saline) 시료 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 소고기 월령 판별용 SPR(Surface Plasmon Resonance) 키트를 제공한다.

표면 플라즈몬이란 주로 금, 은 등과 같은 귀금속 박막 표면에 존재하는 자유전자의 집단적인 진동을 지칭한다.(간단하게 자유전자의 진동) 외부에서 특정한 파장을 갖는 빛이 금속 박막에 입사되었을 때 빛이 가진 대부분의 에너지가 금속 표면에 존재하는 자유전자로 전달되어, 표면 자유전자의 진동이 발생되는 현상을 플라즈몬 공명 현상이라 한다. 이 경우, 외부에서 볼 때 반사된 빛의 세기가 거의 제로(零)에 가깝다.

표면 플라즈몬 공명 현상은 일반적으로 프리즘을 사용하여 일으킬 수 있다. 도 4과 같이 금속 박막칩을 반원통 프리즘에 올려놓고, 입사각도 변화에 따른 반사광 세기를 측정하면 도 5와 같이 입사각도에 대한 반사광 세기 스펙트럼을 얻을 수 있다. 도 5에서 반사광세기가 최소가 될 때의 입사각을 표면 플라즈몬 공명각(줄여서 공명각)이라 한다. 금속박막 표면에 분자가 흡착되면 이 공명각이 증가하게 되는데, 이를 이용하여 금속박막 표면에 흡착된 분자의 양을 분석할 수 있다.

이를 활용하여 시료에 존재하는 목적 물질의 양을 측정할 수 있으며 이는 키트(SPR 키트)의 형태로 제공될 수 있다.

일반적으로 SPR 키트에는 항체, 링커분자, 금속박막 및 시료의 처리 및/또는 반응을 위한 버퍼가 포함된다.

항체는 목적 물질, 예를 들어 항원을 검출하기 위한 목적으로 사용되며, 목적 물질의 종류에 따라서 다양하게 사용될 수 있다. 본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 키메릭 항체 등일 수 있으며, 본 발명의 SPR 키트는 p21을 검출하기 위한 것이므로 바람직하게는 항-p21 항체일 수 있다.

p21은 cyclin-dependent kinase inhibitor 1 (또는 CDK-interacting protein 1)으로 알려져 있는 단백질로, cyclin-CDK2 또는 CDK4 복합체에 결합하여 이의 작용을 저해하는 활성을 가져 G1 단계에서의 cell cycle 진행의 조절자 역할을 하는 단백질이다. 본 발명에서 p21은 소에서 30개월 전후의 발현 변화가 크게 나타나는 특징이 있으며, 본 발명의 p21은 바람직하게는 소 p21로 Genbank Accession No.가 NM_001098958인 것일 수 있다.

링커분자는 SPR 측정을 위하여 금속 박막에 항체를 결합시키기 위한 목적으로 사용된다. 본 발명에서 링커분자는 항-p21 항체를 금속박막에 부착시키기 위한 것이라면 제한없이 사용이 가능하여, 예를 들어, Protein G (Cys-Protein G), SAM(self assembled monolayer)이 사용될 수 있다.

금속박막은 SPR 측정에 사용가능한 것이라면 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 금박막, 은박막, 구리박막, 백금박막, 알루미늄 박막일 수 있다.

시료의 처리 및/또는 반응을 위한 버퍼는 PBS가 바람직하며, 이는 p21의 SPR 측정방법에 따른 검출을 위해서 필수적으로 필요하다. PBS(phosphated buffered saline) buffer는 당업계에 공지된 통상의 조성 (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na₂HPO₄ 10 mM, KH₂PO₄ 2 mM) 또는 이의 용인가능한 오차(상하오차 각각 5% 내) 범위내의 buffer 조성물을 나타낸다.

본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료" 또는 "시료"는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있으며, 바람직하게는 조직, 보다 바람직하게는 근육조직일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물로부터 수득될 수 있으며, 가장 바람직하게는 소로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 키트는 미리 제조된 형태로 제공될 수 있으며, 예를 들어, 항-p21 항체 및 이와 결합된 링커분자가 코팅된 금속박막 및 PBS 시료 버퍼를 포함할 수 있다.

PBS 시료버퍼는 측정의 대상이 되는 시료를 균질화 등을 통해 측정가능한 시료화할 수 있으며, 이를 상기 항-p21 항체 및 이와 결합된 링커분자가 코팅된 금속박막이 장착된 SPR 기기에서 간편하게 측정하여 소고기 월령 판별을 할 수 있다.

아울러, 본 발명의 키트는 참조(reference)를 위하여 30개월령 미만의 소고기 조직(특히 근육조직)을 PBS를 첨가하여 균질화시킨 것을 포함할 수 있다. 기준월령의 소고기 근육조직과 시료의 p21 함량을 비교하여 소고기 월령 판별을 할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 각 SPR 측정 단계마다 사용되는 세척버퍼 (washing buffer)를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게 세척버퍼는 1x PBS일 수 있다.

아울러, 본 발명의 키트는 SPR 기기를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 SPR 기기는 소형화된 기기일 수 있다. SPR 기기는 예를 들어 도 6에서와 같은 측정부를 비롯하여, 시료 전처리 및 로딩부, 시료 이송 채널이 형성되어 있는 시료 이송부, 소고기 월령 판단을 위해 항체가 고정화 되어 있는 SPR 센서부를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 항체는 항 p21항체가 사용되었고, 링커분자는 Cys3-Protein G, SAM(self assembled monolayer), 금속박막으로는 금박막으로써 골드 칩이 사용되었다.

소고기 근육조직에서 소고기 특이적 월령 판별용 마커인 p21 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 p21 단백질을 검출하여 소고기의 월령을 판별할 수 있는데 (대한민국특허 제10-1047455호 참조) SPR에 적용시키기 위해서는 시료의 전처리가 필요하다.

본 발명에서 SPR 측정에 적용시키기 위해 PBS 버퍼를 이용해 전처리를 하였다. 본 발명에서 사용한 PBS 버퍼는 1x PBS 버퍼로 1L 증류수에 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na₂HPO₄, 0.24 g KH₂PO₄를 첨가하고, HCl로 pH를 7.4로 조절한 것을 사용하였고, 추가로 상용의 단백질 저해제 혼합액 (protease inhibitor cocktail)을 첨가한 것을 사용하였다. 전처리는 소 조직, 특히 근육 조직이 포함된 조직에 5배 내지 20배(w/w)의 PBS 버퍼를 첨가하여 homogenator를 이용해 조직을 곱게 갈고, 0 내지 5℃에서 10분 내지 30분간 incubation 시킨 후 4℃, 원심분리하여 상층액만 따내서 일정량의 단백질 함량을 가지도록 각 시료를 표준화(normalized)한 것을 사용할 수 있다. 상기에서 incubation은 생략될 수 있고, 원심분리 대신 필터링 등을 통해 시료를 전처리할 수 있다.

즉, 본 발명의 일비교예에서는 상기 SPR 키트가 소 개월별 p21농도를 측정할 수 있는지 여부를 알아보기 위하여 골드칩을 SPR 키트에 고정하였다. 골드칩 위에 항 p21항체를 고정하기 위하여 Cys3-Protein G를 고정화 하고 골드표면의 비특이적 흡착을 없애기 위하여 BSA를 이용하여 처리 하였다. 그 후, 항 p21항체를 Cys3-Protein G 위에 고정시키고 20개월, 35개월, 47개월 소 시료를 주입하여 SPR의 RU변화를 비교하였다. 또한, 가장 중요한 변별력이 필요한 28개월, 35개월 소 시료를 주입하여 비교 분석하였다. 그 결과 개월별 소 시료는 분별력이 없었다. 이유로 정제되지 않은 소 시료 안에는 다양한 종류의 단백질들을 포함하고 있기 때문이었다.

이에 비해서, 본 발명의 일실시예에서는 상기 SPR 키트가 소 개월별 p21농도를 측정할 수 있는지 여부를 알아보기 위하여 골드칩을 SPR 키트에 고정하고 PBS 버퍼로 준비한 27개월, 31개월 소 시료를 각 채널에 주입하고 SPR의 RU 변화를 비교, 분석 하였다. 그 결과, 도 3에서 보듯이, 30개월이 안되는 소 시료는 p21의 농도가 증가하는 분별력을 확인 하였다.

또한, 본 발명은 (a)소고기 월령 판별 대상 시료를 PBS 버퍼에 넣고 균질화 시키는 단계; (b)상기 균질화된 시료를 항 p21항체가 부착된 금속 박막과 접촉 시키는 단계; 및 (c)SPR법에 의해 시료내 p21의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 소고기 월령 판별 방법을 제공한다.

본 발명의 방법을 단계별로 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

(a)단계는 소고기 월령 판별 대상 시료를 PBS 버퍼에 넣고 균질화 시키는 단계이다.

본 발명에서 SPR 측정에 적용시키기 위해 PBS 버퍼를 이용해 전처리를 하였다. 전처리는 소 조직, 특히 근육 조직이 포함된 조직에 5배 내지 20배(w/w)의 PBS 버퍼를 첨가하여 homogenator를 이용해 조직을 곱게 갈고, 고형물을 제거한 것을 사용할 수 있다.

보다 구체적으로 전처리는 소 조직, 특히 근육 조직이 포함된 조직에 5배 내지 20배(w/w)의 PBS 버퍼를 첨가하여 homogenator를 이용해 조직을 곱게 갈고, 0 내지 5℃에서 10분 내지 30분간 incubation 시킨 후 원심분리하여 상층액만 따내는 등 고형물을 제거한 것을 사용할 수 있다. 고형물의 제거는 공지된 다른 방법, 예를 들어, 필터처리 등에 의해서 수행될 수도 있다.

본 발명에서 시료의 준비는 일정량의 단백질 함량을 가지도록 각 시료를 표준화(normalized)한 것을 사용할 수 있으나, 유사한 부위 (조직)에 대해서 거의 동일한 질량의 시료를 대상으로 전처리함으로써 표준화 과정을 생략할 수도 있으며, 이는 본 발명의 p21을 SPR 방법에 적용시킴으로써 필드에서 간단하게 월령 판별을 할 수 있게 해 준다.

(b)단계는 (a)단계에서 균질화된 시료를 항 p21항체가 부착된 금속박막과 접촉 시키는 단계이다. SPR 분석을 위해서, 금속박막에 부착된 항체에 marker가 되는 시료 내 단백질이 결합되도록 해야 한다. 이 때 금속박막은 바람직하게는 금, 은등과 같은 귀금속 박막일 수 있으며, 더 바람직하게는 골드칩 일 수 있다. 금속박막에의 항체의 부착은 링커 분자에 의해서 매개된다. 시료와 항체와의 반응은 반응 버퍼 내에서 이루어지는데 본 발명의 일비교예에서와 같이 Tris 버퍼를 이용한 경우는 시료간의 분별력이 없는 결과가 나온 반면, 본 발명의 일실시예에서와 같이 PBS버퍼를 이용한 경우는 시료간의 분별력이 있는 결과를 얻었다.

(c)단계는 (b)단계에서 상기 균질화된 시료가 접촉한 항 p21 항체가 부착된 금속박막을 반원통 프리즘에 올려놓고, 입사각도 변화에 따른 반사광 세기를 측정하여 입사각도에 대한 반사광 세기 스펙트럼을 얻었다. 금속박막 표면에 분자가 흡착되면 공명각이 증가하게 되는데, 이를 이용하여 금속박막 표면에 흡착된 분자의양, 즉 p21의 농도를 측정하였다.

따라서, 본 발명은 소고기 월령 판별용 SPR 키트 또는 소고기 월령 판별 방법을 제공한다. 본 발명의 소고기 월령 판별용 SPR 키트를 사용하는 경우, p21의 농도를 측정하여 30개월 미만의 소고기를 효과적으로 선별해낼 수 있어 소고기의 월령을 판별하는 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 실시예 1의 실험군의 RU변화 결과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1의 대조군의 RU변화 결과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 2의 RU변화 결과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 4 및 도 5는 표면 플라즈몬 공명 현상의 분석원리를 나타낸 것이다.
도 6은 회전거울을 이용한 레이저 광원의 변조를 나타낸 것이다.
도 7은 초소형 SPR 바이오칩 분석시스템 상용화 제품을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예는 본 발명을 실시하기 위하여 제시된 하나의 예시일 뿐이며, 하기의 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

< 비교예 1>

Tris buffer를 이용한 p21 SPR 키트 개발

골드칩을 피라나 용액(황산:과산화수소=3:1)을 이용하여 깨끗하게 처리 후 3차 증류수를 이용하여 닦아내고, 질소가스를 이용하여 건조 후 카트리지를 이용하여 SPR 장비에 고정하였다. 1X PBS를 이용하여 장비 안정화를 한 후 Cys3-Protein G를 주입하여 칩 표면에 고정한 후 1X PBS를 이용하여 세척했다. BSA를 이용하여 노출되어 남아있는 골드 칩 표면을 막고, Tris buffer를 이용하여 기준 신호를 잡았다. Antibody를 이용하여 Cys3-Protein G위에 고정한 후 1X PBS를 이용하여 세척하였다. 20개월, 35개월, 47개월 소 시료를 각 채널에 주입하고 SPR의 RU 변화를 측정하여 데이터를 비교, 분석 하였다.

상기에서 소시료는 연령별로 시료를 채취하여 -70℃에서 보관후 사용하였다. 시료의 준비를 위해서, 소 조직 0.1g에 1M Tris-HCl(pH 8.0) 1ml 넣고 homogenator를 이용해 조직을 곱게 갈아주고, ice에서 20분간 incubation 시켰다. 이를 4℃, 13,000rpm에서 20분 동안 원심분리 한 후 상층액만 따내서 단백질 농도를 측정하여 각 샘플의 최종 농도를 1μg/μl로 맞춘 것을 사용하였다.

그 결과, 도 1에서 보듯이 35개월이 넘어가는 소 시료와 30개월이 안되는 소 시료의 분별력이 없었다.

<비교예 2>

Tris buffer 를 이용한 p21 SPR 키트 개발

골드칩을 피라나 용액(황산:과산화수소=3:1)을 이용하여 깨끗하게 처리 후 3차 증류수를 이용하여 닦아내고, 질소가스를 이용하여 건조 후 카트리지를 이용하여 SPR 장비에 고정하였다. 1X PBS를 이용하여 장비 안정화를 한 후 Cys3-Protein G를 주입하여 칩 표면에 고정한 후 1X PBS를 이용하여 세척했다. BSA를 이용하여 노출되어 남아있는 골드 칩 표면을 막고, 1X PBS로 세척 하였다. Antibody를 이용하여 Cys3-Protein G위에 고정한 후 1X PBS를 이용하여 세척하였다. 28개월, 35개월 소 시료를 각 채널에 주입하고 SPR의 RU 변화를 측정하여 데이터를 비교, 분석 하였다.

그 결과, 도 2에서 보듯이 28개월 소 시료와 35개월 소 시료의 분별력이 없었다.

상기 비교예 1, 2에서 분별력이 없는 결과가 나온 원인에는 정제 되지 않은 혼합물에서 한 종에 의한 결합을 확인하고자 한 것, 혼합된 단백질들의 비특이적 반응, 그리고 Buffer 선정의 오류가 있다.

<실시예 1>

PBS buffer를 이용한 p21 SPR 키트 개발

시료의 전처리를 PBS 버퍼로 사용한 것을 제외하고는 상기 비교예 1과 동일하게 하여 실험을 수행하였다. PBS 버퍼를 이용한 시료의 준비는 다음과 같이 수행하였다: cow 조직 0.1g에 1x PBS 1ml 넣고 homogenator를 이용해 조직을 곱게 갈아준다음 ice에서 20분간 incubation 시켰다. 이를 4℃, 13,000rpm에서 20분 동안 원심분리 한 후 상층액만 따내서 단백질 농도를 측정하여 각 샘플의 최종 농도를 1μg/μl로 맞추어서 사용하였다.

그 결과, 30개월이 안되는 소 시료는 p21의 농도가 30개월이 경과된 소 시료에 비해 증가되어 있는 것을 측정할 수 있었다.

<실시예 2>

PEG COOH SAM로 고정한 p21 SPR 키트 개발

PEG COOH SAM[HS-(CH₂)₁₁-(OCH₂CH₂)₆-OCH-COOH]을 에탄올에 녹여 1mM 용액을 준비하였다. 상기 비교예 1에서와 같이 세척한 골드 칩을 준비한 SAM 용액에 12시간 이상 담근 후 SAM으로 표면 처리 된 골드 칩을 3차 증류수를 이용하여 세척하고 질소가스를 이용하여 건조 후 카트리지를 이용 SPR 장비에 고정하였다. 1X PBS를 이용하여 장비 안정화를 한 후 3차 증류수에 각각 녹인 0.4M EDC(N-Ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) 용액과 0.1M NHS(N-Hydroxysuccinimide) 용액을 1:1로 혼합하여 주입하였다. 1X PBS를 이용하여 세척 후 10mM sodium acetate (pH 5) 용액을 이용하여 희석한 Antibody 용액을 주입하여 고정화 하였다. 1X PBS를 이용하여 세척 후 3차 증류수에 녹인 1M ethanolamine 용액을 이용하여 골드 표면 위에 남아있는 NHS 부분을 치환 하였다. 1X PBS를 이용하여 세척한 후 27개월, 31개월 소 시료 (상기 실시예 1과 동일하게 준비)를 각 채널에 주입하고 SPR의 RU 변화를 비교, 분석 하였다.

그 결과, 도 3에서 보듯이, 30개월이 안되는 소 시료는 p21의 농도가 증가하는 분별력을 확인 하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 소고기 월령 판별용 SPR 키트 또는 소고기 월령 판별 방법을 제공한다. 본 발명의 소고기 월령 판별용 SPR 키트를 사용하는 경우, p21의 농도를 측정하여 30개월 미만의 소고기를 효과적으로 선별해낼 수 있어 소고기의 월령을 판별할 수 있으므로 산업상 이용가능성이 높다.

Claims

SPR 키트에 있어서, 항-p21 항체 및 시료 균질화용 PBS 시료 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 소고기 월령 판별용 SPR 키트.
항-p21 항체 및 이와 결합된 링커분자가 코팅된 금속박막 및 시료 균질화용 PBS 시료 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 소고기 월령 판별용 SPR 키트.
제1항 또는 제2항에 있어서, PBS를 첨가하여 균질화시킨 30개월령 미만의 소고기 근육조직을 추가로 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 소고기 월령 판별용 SPR 키트.
(a)소고기 월령 판별 대상 시료를 시료 균질화용 PBS 버퍼에 넣고 균질화 시키는 단계;
(b)상기 균질화된 시료를 항 p21항체가 부착된 금속 박막과 접촉 시키는 단계; 및
(c)SPR법에 의해 시료내 p21의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 소고기 월령 판별 방법.