KR101137420B1 - 새로운 질량 분석 신호 증폭 기술 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 새로운 방식의 질량 분석 신호 증폭 기술에 관한 것이다. 더 구체적으로 본 발명에서는 i) 표적 분자와 선택적으로 결합하도록 표면을 개질한 금 입자에 표적 분자의 존부를 알고자 하는 시료를 접촉시킨 다음, ii) 상기 금 입자와 표적 분자 사이에 결합 등 상호 작용이 일어나면, 상기 금 입자에 수식된 저분자 화합물이 질량 분석 신호를 발생하되, iii) 미량으로 존재하는 표적 분자라도 상기 저분자 화합물의 질량 신호를 대규모로 발생하게 함으로써 신호의 증폭이 일어나는 새로운 방식의 검출 방법과 이를 위한 분석 시스템, 그리고 증폭용 금 입자를 제공한다. 본 발명에 따르면, 시료의 전처리 없이 원하는 물질의 신호를 특이적으로 증폭할 수 있으므로 표적 분자를 간편하고 정밀하게 측정할 수 있는 장점이 있다.
질량 분석, 신호 증폭, 금 입자
Description
본 발명은 질량 분석에 의한 표적 분자의 검출에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 저분자량 유기 분자로 표면 수식된 금 입자를 이용하여 생분자 등의 표적 분자를 검출하는 새로운 신호 증폭 방법에 관한 것이다.
사회의 평균 수명이 늘어남과 더불어 출산율이 떨어지고 있기 때문에 인구 고령화가 진행하고 있고, 또 한편으로 비만 인구, 성인병 인구는 증가하고 있기 때문에 성인병, 만성 질환 등의 복잡한 질병을 정확하게 진단하고 효과적으로 예방?치료하는 것은 날로 더 중요해지고 있다. 질병 등의 진단에 중요한 단서가 되는 생체 분자, 즉 생체 표지(biomarker)는 대부분 체내 또는 시료 속에 아주 낮은 농도로 존재하기 때문에 초고감도(ultra-high sensitivity)의 검출 방법이 필요하다. 현재까지 알려진 많은 측정 방법들은 그 감도에서 뛰어난 결과를 보이고 있지만 대개 다음과 같은 측면에서 부족하거나 개선할 여지가 있다.
(1) 특정 질병, 특정 시료뿐만 아니라 일반적으로 쓰일 수 있는 생물학적 신호 증폭 방법으로 사용될 수 있는가?
(2) 전반적으로 실험 방법이 용이한가?
(3) 비선택적 흡착에 의해서 유발되는 거짓 신호 증폭을 제거하기가 용이한가?
(4) 수많은 실험을 수행하기에 비용적인 측면에서 문제가 없는가?
이러한 요소들은, 제한된 양의 시료로부터 정밀한 분석 결과를 얻고 나아가 정확한 진단을 내리는 데 있어서 중요한 요건이다. 따라서 이러한 의미에서 동시에 다양한 질환 표지 물질을 비교 분석할 수 있는 측정 방법을 개발하면 현존하는 ELISA 등의 분석 방법, 즉 한 번에 한 가지 표지 물질을 분석하여야 하는 진단 방법의 한계를 극복할 수 있게 될 것이다.
질량 분석법은 핵산, 단백질, 펩티드, 당 등의 생체 분자는 물론 일반적인 유기 분자의 질량과 신호 세기를 측정함으로써 분석 대상 표적 분자의 종류와 양을 정확하게 알려 줄 수 있는 방법이다. 질량 분석은 특정 작용기의 존재에 구애받지 않기 때문에 이론적으로 적용 가능한 분자의 범위가 넓고 질량 분석을 이용하면 종종 복잡한 시료 속의 여러 종류의 표적 분자들을 동시에 정확하게 분석할 수 있기 때문에, 예를 들어 다양한 질환 표지 물질을 동시에 분석?진단하는데 쓸 수 있다.
질량 분석은 시료의 이온화와 이온의 검출 방식에 따라 여러 종류가 있는데, 이러한 질량 분석법 중에서도 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화-비행시간(matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight, MALDI-TOF) 방법이 생체 시료의 질량 분석에 널리 쓰여 왔다. MALDI-TOF 방식의 질량 분석법은 많은 수의 시료를 빠르게 측정하여야 하는 초고속 진단을 위해 가장 적합한 질량 분석법으로 알려져 있다. 하지만 MALDI-TOF 방법으로 표적 분자 질량을 직접 측정하는 것은 민감도가 떨어져 적은 양의 생체 표지를 측정하기 힘들다는 한계가 있다. 또한 생체 표지의 존재 유무만이 아니라 그 양에 대한 정보까지 얻기 위해서는 현재 쓰이는 MALDI-TOF 방법만으로는 부족한 실정이다. 그러므로 이를 극복하기 위한 MALDI-TOF 고감도 정량법의 개발, 나아가서는 매트릭스 보조 방식이 아니더라도 미량 생분자를 정량적으로 분석할 수 있는 신호 증폭이 가능한 질량 분석 방법의 개발이 절대적으로 필요하다.
본 발명의 기술적 과제는 하나의 표적 분자가 수천 또는 수만 배로 증폭된 질량 분석 신호를 방출할 수 있는 시스템과 그 방법을 고안하는 것이다.
이러한 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명에서는 표면을 신호 발생용 저분자 화합물로 수식한 표적 분자 포획과 신호 증폭을 위한 금 입자와 이를 이용한 분석 시스템 및 상기 금 입자와 분석 시스템을 이용한 표적 분자 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 한 측면에서 상기 금 입자는 신호 발생부와 연결부, 포획자를 갖추고 있다. 상기 신호 발생부 상기 금 입자의 표면에 복수개가 연결되어 있으며, 상기 표면에서 자기 조립형 단일층(self assembled monolayer)을 이룬다. 상기 연결부의 한쪽 끝은 상기 금 입자의 표면에 결합하고 있으며, 이 연결부의 반대쪽 끝은 표적 분자에 특이적으로 결합하거나 특이적으로 반응을 일으키는 포획자에 연결되어 있다. 여기서 상기 신호 발생부는 상기 금 입자의 질량 분석 과정에서 상기 금 나노입자로부터 유리되어 표적 분자와 질량이 구별되는 크기의 유기 양이온을 복수로 생성하는 유기 분자이다.
본 발명의 한 실시 태양에서 상기 신호 발생부는 한쪽 말단부가 금-황(Au-S) 결합을 통하여 상기 금 입자 표면에 결합하고 있으며, 반대쪽 에테르 말단부; 및 상기 에테르 말단부에 연결되고 상기 금 입자의 표면에 결합한 알칸티올부를 함유 한다. 여기서 상기 에테르 말단부는 에틸렌글리콜 단위를 하나 이상 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 한 실시 태양에서 상기 금 입자는 레이저 탈착 이온화-비행시간 방식의 질량 분석에서 상기 신호 발생부 질량 신호를 발생한다.
본 발명의 다른 측면에서는 상기 금 입자 및 분석 대상 시료를 표면에 고정시킬 수 있는 표적 고정면을 포함하는 분석 시스템을 제공한다. 이때 상기 표적 고정면은 고상의 지지체를 갖추고 있어 상기 지지체 표면에 표적 분자의 존부(存否)를 분석할 시료를 공유결합 또는 비공유결합을 통하여 고정시킬 수 있는 것이 특징이다. 본 발명의 한 실시 태양에서 상기 표적 고정면은 금-황(Au-S) 결합을 통하여 상기 표적 고정면의 표면과 연결되며, 상기 표면에서 자기 조립형 단일층(self assembled monolayer)을 이루는 복수의 신호 발생부, 상기 표적 고정면 표면에 결합하고 있는 하나 이상의 연결부 및 상기 연결부에 결합하고 표적 분자를 공유결합 또는 비공유결합을 통하여 고정하는 포획자를 갖추고 있다. 이때 상기 신호 발생부는 상기 금 입자의 질량 분석 과정에서 상기 금 나노입자로부터 유리되어 표적 분자 및 상기 금 입자의 신호 발생부와 질량이 구별되는 크기의 유기 양이온을 복수로 생성하는 유기 분자이다.
본 발명의 또 다른 측면에서는 상기 금 입자를 이용하여 시료 내 표적 분자를 분석하는 방법을 제공한다. 이 방법은 표적 분자의 존부를 분석할 시료와 상기와 같은 금 입자에 상기 표적 분자와 결합하는 포획자가 고상 지지체 표면에 고정되어 있는 포획 고정면을 서로 접촉시켜 포획 혼합물을 생성하는 결합 단계, 상기 포획 혼합물에서 비특이적으로 결합한 금 입자를 제거하는 선별 단계와 상기 선별 단계를 마치고 포획 혼합물에 남은 금 입자를 질량 분석하는 단계를 포함한다. 이때 상기 질량 분석은 상기 포획 혼합물을 대상으로 한 무매트릭스 방식의 레이저 탈착 이온화 질량 분석이거나, 통상적인 MALDI-TOF 질량 분석일 수 있다. 또한 상기 선별 단계와 질량 분석 단계 사이에 포획 혼합물로부터 결합한 금 입자를 분리해내어 이 금 입자만을 질량 분석할 수도 있다.
본 발명의 질량 분석 신호 증폭 시스템과 그 방법을 이용하면, 전처리가 필요 없이 분석 대상 표적 분자의 질량 분석 신호를 특이적으로 증폭할 수 있으며, 다른 물질에 의한 간섭 없이 정량적인 측정이 가능하다.
본 발명에서 구현하고자 하는 핵심적인 기술은, 금 입자가 표적 분자(target molecule)와 선택적으로 결합하도록 표면을 개질한 후, 표적 분자와의 상호작용을 상기 금 입자에 수식된 저분자 화합물의 질량 분석을 통해 검출하는 것으로서, 하나의 표적 분자가 수많은 저분자 화합물을 통해 검출되는 형식의 새로운 신호 증폭 방법이다.
본 발명의 표적 분자 포획과 신호 증폭을 위한 금 입자는 그 표면이 유기 분자로 개질되어 저분자량 유기 분자로 수식된다. 이러한 개질된 금 입자는 신호 발생부, 연결부와 포획자를 갖추고 있다. 본 발명의 금 입자에서 포획자는 표적 분자와 특이적으로 결합하는 부분이며, 연결부는 상기 포획자에 한쪽 끝이 상기 포획자에 연결되어 있고, 반대쪽 끝은 상기 금 입자에 연결되어 있다. 한편 신호 발생 부는 유기 분자로서, 신호 증폭을 위하여 금 입자의 표면에 다수가 결합하고 있고, 질량 분석 과정에서 레이저 등에 의하여 금 입자로부터 유리되어 표적 분자와 구별되는 유기 양이온을 낳는다. 본 발명에서 상기 신호 발생부를 이루는 유기 분자는 자기 조립형 단일층(self assembled monolayer, SAM)을 형성한다. 자기 조립형 단일층을 이용하면 이하 설명하겠거니와, 매트릭스 형성을 생략하고도 질량 신호를 검출할 수 있다. 또한 SAM을 형성하면 생물학적 표지를 비드에 안정적으로 연결하기 쉬워진다.
본 발명의 금 입자는 포획자의 수보다 훨씬 더 많은 수의 신호 발생부를 포함하므로, 미량 시료 또는 흔적 시료 속에 존재하는 단 하나의 표적 분자가 하나의 금 입자에 포획된 경우에도, 질량 분석 과정에서 상기 금 입자로부터 발생하는 다수의 신호 발생부 분자 또는 그 조각(fragment)에 의하여 증폭되는 2차 질량 신호를 검출함으로써 분석의 민감도를 높인 것이 특징이다.
도 1은 본 발명의 일부 실시 태양을 예로 들어 이러한 원리를 도식화한 그림으로서, 신호 발생부를 질량 표지(mass tag)로 삼은 신호의 증폭 방식을 나타낸다. 도 1a는 표적 분자 포획과 신호 증폭을 위한 본 발명의 금 입자를 이용하여 표적 분자를 검출하는 하나의 태양이다. 도 1a의 가장 왼쪽 모식도는 표적 분자를 고정화할 수 있는 표면을 가지는 고상 지지체를 나타낸다. 이 고상 지지체에 표적 분자(속이 빈 동그라미)를 고정하는 전처리를 한 다음(1a 왼쪽에서 두 번째 모식도), 여기에 여러 종류의 본 발명에 따른 금 입자를 가해 준다(왼쪽에서 세 번째 모식도). 본 발명의 금 입자는 도 1에서 굽이치는 술 모양의 돌기를 갖춘 색칠하지 않 은 큰 공으로 나타내었다. 이 모식도에서 방사상으로 공에 붙어 있는 돌기는 신호 발생부를 나타내고, 색칠한 반달 모양 또는 V자 모양 부분은 포획자를, 포획자와 색칠하지 않은 큰 공을 잇는 부분은 연결부이다. 상기 금 입자들 중 표적 분자에 특이적으로 결합하는 것만이 선별되어 남게 된다(도 1a 왼쪽으로부터 4번째 모식도). 이어서 이 선별된 금 입자는 질량 분석 과정에서 이온화 레이저 등에 의하여 금 입자로부터 떨어져 나오게 되어(왼쪽으로부터 5번째 모식도), 질량 분석 신호를 발한다(도 1a의 마지막 모식도).
한편 본 발명의 다른 실시 태양인 도 1b에서는 도 1a와 같은 표적 분자의 고정화 전처리를 거치지 않는다. 도 1b에서는 상기 금 입자와 고상 지지체, 그리고 고정되지 않은 표적 분자 시료를 혼합하여 배양하며, 전처리는 필요 없다(도 1b의 가장 왼쪽 모식도). 표적 분자와 기타 분자를 포함하는 시료를 가해주고 선별하면 상기 금 입자, 표적 분자, 지지체가 결합한 것만이 남게 된다(왼쪽으로부터 두 번째 모식도). 이후 이 금 입자-표적 분자-지지체는 도 1a에서와 같은 절차를 거쳐 질량 분석 신호를 발하게 된다.
본 발명의 금 입자는 그 크기에 특별한 제한이 없으며 용도에 맞게 적절한 크기를 선택할 수 있다. 즉 나노미터 규모의 나노입자일 수도 있고, 마이크로미터 규모의 마이크로입자일 수도 있다. 예를 들어 나노입자인 경우는 세포 표면과 같이 미세한 표면 구조를 가지는 대상의 구조를 구분하고자 할 때 유리할 수 있고, 마이크로입자인 경우 콜로이드 상태에서의 안정성이 높고, 표면 개질이 쉬운 장점이 있으며, 한 입자 당 표면에 연결할 수 있는 신호 발생부 수가 늘어나게 되어 신 호 증폭이 더욱 뚜렷하다는 이점이 있다.
본 발명에서 상기 금 입자로 분석하는 표적 분자와 그 특이적 포획을 위한 포획자에는 특별한 제한이 없다. 특이적인 상호작용, 예를 들어 수소 결합으로 포획하거나, 고도로 선택적인 화학 반응에 의하여 포획할 수 있는 표적 분자와 포획자라면 어느 것이나 본 발명의 적용 대상이 된다. 따라서 이러한 조건을 만족하는 모든 유기 분자, 무기 분자, 생분자, 거대분자는 표적 분자가 될 수 있다. 예를 들어 비오틴(biotin)과 아비딘(avidin)나 소형 리간드와 그 단백질 수용체의 경우처럼 소형 유기 분자를 표적 분자로 삼고, 포획자는 그에 특이적으로 결합하는 단백질일 수 있다. 물론 표적 분자를 단백질로, 포획자를 소형 유기 분자로 하는 구성도 가능하다. 혹은 크라운 에테르(crown ether) 또는 크립탄드(cryptand)와 그에 특이적으로 결합하는 양이온처럼 표적 분자가 무기 이온이고, 포획자가 유기 분자로 구성될 수도 있다. 또한 효소와 그 비가역적 억제제(irreversible inhibitor)의 경우(예를 들어, 사린 등의 유기인 화합물과 아세틸콜린에스테르 분해효소(acetylcholinesterase))처럼 포획자와 표적 분자 사이에 특이적 화학 반응이 일어나 공유 결합을 통하여 서로 연결되도록 구성할 수도 있다.
생분자의 경우, 특이적인 결합(specific binding) 특성을 나타내는 다양한 예가 있으므로, 본 발명의 표적 분자로서 좋은 한 가지 예가 된다. 생분자 중에서는 모든 생분자, 예를 들어 단백질, 펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 탄수화물-단백질 접합체(carbohydrate-protein conjugate), 지질-단백질 접합체가 그 대상이 될 수 있다.
본 발명의 신호 발생부는 자리 조립형 단일층을 형성하는, 거대분자가 아닌 유기 분자이다. 자기 조립형 단일층(SAM)을 형성하는 분자는 다양한 길이와 화학 물질로 제작할 수 있으므로 다양한 생물학적 표적에 대하여 질량 값을 달리하는 여러 가지 SAM 형성 분자를 만들어 구별할 수 있다. 이렇게 본 발명에서 신호 증폭 용도로 사용되는 SAM 분자를 증폭 질량 표지(amplifying mass tag) 또는 이를 줄여 AM-질량표지로 일컫기로 한다.
본 발명의 한 실시 태양에서 상기 신호 발생부는 한쪽 말단부가 알칸티올(alkanethiol) 부위로서 금-황(Au-S) 결합을 통하여 상기 금 입자 표면에 결합하고 있으며, 그 반대쪽에 에테르 말단부를 갖추고 있다. 본 발명의 더 구체적인 태양에서 이 에테르 말단부는 하나 이상의 에틸렌글리콜 반복 단위를 가지는 것이 바람직하다. 에틸렌글리콜 반복 단위로 이루어진 에테르 말단부는 비특이적인 단백질 흡착을 억제할 수 있다. 이러한 에틸렌글리콜 반복 단위를 가지는 AM-질량표지 분자의 예를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 것을 포함한 본 발명에 따른 AM-질량표지는 MALDI-TOF 질량 분석 등의 레이저 탈착 이온화 방식의 질량 분석시 특히 금 입자로부터 쉽게 떨어져 나와 질량 분석 신호를 발생한다.
도 1과 도 2에 나타낸 것처럼 본 발명에서는 표적 분자마다 서로 다른 포획자와 서로 다른 AM-질량표지를 채택한 금 입자를 대응시킬 수 있다. 이러한 복수의 금 입자를 이용하여 여러가지 표적 분자를 동시에 멀티플렉스(multiplex) 분석할 수도 있다. 질량 분석은 미세한 질량 차이도 쉽게 분석할 수 있으므로 멀티플렉스 분석에 적합하다.
본 발명의 다른 측면에서는 이러한 금 입자를 포함하는 표적 분자 분석 시스템을 제공한다. 이러한 분석 시스템은 상기의 금 입자와 분석 대상 시료를 표면에 고정시킬 수 있는 표적 고정면을 포함하여 이루어진다. 이때 상기 표적 고정면은 고상의 지지체를 갖추고 있어 상기 지지체 표면에 표적 분자의 존부(存否)를 분석할 시료를 공유결합 또는 비공유결합을 통하여 고정시킬 수 있는 것을 특징이다. 이러한 표적 분자 분석 시스템은 도 1a와 같이 표적 고정면에 시료를 고정화하는 전처리를 하여 이용할 수도 있고, 도 1b와 같이 전처리 없이 이용할 수도 있다. 본 발명의 분석 시스템에서 표적 고정면은 고상의 지지체 위에 표적 분자를 고정하는 수단을 갖추고 있는데, 이를 위하여 지지체 표면을 개질할 수도 있다. 표적 분자의 고정 수단은 특이적인 것이 바람직하지만, 본 발명에 따른 금 입자의 포획자가 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 이상, 반드시 특이적인 것일 필요는 없다. 표적 고정면의 지지체 표면에 표적 분자를 고정하는 방식은 표적 분자와 표면, 혹은 개질 표면 사이에 공유결합을 형성하거나, 비공유결합(예를 들어, 수소결합 등 분자간 힘을 이용한 결합)을 이용하여 고정하는 방식 어느 쪽이든 무방하다.
본 발명의 분석 시스템에서 상기 표적 고정면은 지지체의 소재로 통상적인 재료, 즉 유리, 실리콘, 금속, 반도체 또는 플라스틱을 사용할 수 있고, 어느 특정 실시 태양에서는 상기 표적 고정면이 표적 분자를 포함하여 소정의 생체 시료로부터 얻은 기타 생분자가 고정된 바이오칩일 수 있다. 예를 들어 특정 상태의 세포로부터 얻은 세포 용해액(cell lysate) 시료 속 단백질들을 비특이적인 공유결합 형성을 통하여 표면에 고정한 바이오칩일 수 있다.
본 발명의 한 실시 태양에서, 상기 표적 고정면은 상기 금 입자와 유사하게 저분자량 유기 분자의 자기 조립형 단일층과 포획자를 갖출 수 있다. 즉 상기 표적 고정면은 금-황(Au-S) 결합을 통하여 상기 표적 고정면의 표면과 연결되며, 상기 표면에서 자기 조립형 단일층(self assembled monolayer)을 이루는 복수의 신호 발생부, 상기 표적 고정면 표면에 결합하고 있는 하나 이상의 연결부; 및 상기 연결부에 결합하고 표적 분자를 공유결합 또는 비공유결합을 통하여 고정하는 포획자를 갖출 수 있다. 이때 상기 신호 발생부는 상기 금 입자의 질량 분석 과정에서 상기 금 나노입자로부터 유리되어 표적 분자 및 상기 금 입자의 신호 발생부와 질량이 구별되는 크기의 유기 양이온을 복수로 생성하는 유기 분자(AM-질량표지)인 것이 특징이다. 본 발명의 더 구체적인 태양에서는 상기 금 입자와 상기 표적 고정면은 알칸티올부와 에틸렌글리콜 반복 단위를 갖춘 신호 발생부의 단일층을 갖추고 있되, 서로 다른 신호발생부 분자, 즉 AM 분자를 채택하고 있으며, 포획자로는 동일한 표적 분자에 대하여 특이적으로 결합하는 서로 다른 항체를 사용한다.
본 발명의 또 다른 측면에서는 이러한 표적 고정면과 금 입자를 이용하여 시료 속 표적 분자를 분석하는 방법을 제공한다. 상기 도 1a와 같이 시료의 전처리를 수반하는 방법은 다음과 같은 단계를 포함하여 이루어진다.
(i) 시료를 고상의 지지체에 접촉시켜 시료 속 물질(표적 분자 혹은 기타 물질)을 상기 고상의 지체 표면 위에 고정시킨 표적 고정면을 얻는 단계;
(ii) 본 발명의 금 입자에 연결된 포획자가 표적 분자와 특이적으로 결합하는 조건 하에서, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 금 입자와 상기 표적 고 정면을 접촉시켜 포획 혼합물을 생성하는 단계;
(iii) 상기 포획 혼합물에서 비특이적으로 결합한 금 입자를 제거하는 선별 단계 및
(iv) 상기 (iii) 단계를 마치고 포획 혼합물에 남은 금 입자를 질량 분석하는 단계.
시료를 표적 고정면에 고정하지 않고 금 입자와 시료를 표적 고정면과 동시에 배양하여 결합시키는 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다.
(i) 시료와 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 금 입자에 상기 표적 분자와 결합하는 포획자가 고상 지지체 표면에 고정되어 있는 포획 고정면을 서로 접촉시켜 포획 혼합물을 생성하는 단계;
(ii) 상기 포획 혼합물에서 비특이적으로 결합한 금 입자를 제거하는 선별 단계 및
(iii) 상기 (ii) 단계를 마치고 포획 혼합물에 남은 금 입자를 질량 분석하는 단계.
본 발명의 표적 분자 질량 분석은 신호의 증폭을 이용하기 때문에 민감도가 높을 뿐 아니라, 질량 분석기에서 잡히는 신호 발생부의 2차 신호 세기를 통하여 표적 분자의 정량도 할 수 있는 유리한 특징이 있다. 정량 분석을 위해서는 양을 알고 있는 내부 표준 물질(internal standard)과 그에 대응하는 금 입자를 사용하는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 표적 분자 분석 방법은 시료를 통하여 금 입자와 표적 고정면이 연결되어 있는 상태인 포획 혼합물, 특히 비특이적으로 표적 고정면에 결합하고 있던 금 입자를 제거하는 선별을 거친 포획 혼합물을 다른 처리 과정 없이 그대로 사용할 수 있는 이점이 있다. 본 발명의 신호 발생부, 즉 AM-질량표지는 레이저 탈착 이온화를 통하여 포획 혼합물로부터 곧바로 분리되어 질량 분석 신호를 발생하는 양이온을 낳는다. 통상적인 레이저 탈착 이온화 질량 분석에서는 매트릭스 형성 물질과 시료를 혼합하여 매트릭스를 형성한 다음, 이 매트릭스에 레이저를 조사하여 분석 대상 물질을 탈착, 이온화하는 방식인 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(MALDI)를 사용한다. 그러나 본 발명의 분석 방법에서는 이러한 매트릭스를 형성할 필요 없이, 선별을 마친 포획 혼합물을 곧바로 레이저 탈착 이온화 질량 분석기에 투입할 수 있기 때문에 불필요한 과정을 생략할 수 있다. 앞서 본 발명의 금 입자가 멀티플렉스 분석을 뒷받침한다고 설명하였거니와, 최소한의 선별 과정을 거친 다음 더 이상의 시료 처리 없이 바로 질량 분석이 가능하므로, 본 발명의 분석 방법은 또한 고속 분석(high-throughput assay)에 적합하다. 한편 본 발명의 분석 방법에서 포획 혼합물을 통상적인 MALDI-TOF 방식으로 분석하는 것, 즉 질량 분석에 앞서 포획 혼합물에 매트릭스를 형성하는 단계를 추가하는 것도 당연히 가능하다.
본 발명의 분석 방법에서 질량 분석 방식은 특별히 국한되지 않으며, 질량 분석 장치 내에서 금 입자로부터 신호 발생부를 유리할 수 있는 모든 질량 분석 방법을 사용할 수 있다. 그 중에서 레이저 탈착 이온화 질량 분석은 앞서 본 바와 같이 본 발명의 금 입자로부터 질량 분석 신호를 쉽게 발생시킬 수 있고, 특히 생 분자 시료의 이온화에 적합한 방식이다. 레이저 탈착 이온화 질량 분석 중 가장 흔한 것은 MALDI-TOF 방식이다. 시판되는 질량 분석 장치는 대개 MALDI 이온화와 TOF 이온 검출 방식을 결합하지만, 굳이 TOF 검출 방식에 국한될 필요는 없다. 또한 선별을 마친 포획 혼합물로부터 특이적으로 결합한 금 입자 또는 결합한 금 입자-시료만을 분리하여 내는 단계를 질량 분석 단계 전에 추가할 수도 있다. 이렇게 금 입자만을 분리한 경우는 레이저 탈착 이온화 방식이 아닌 다른 이온화 방식의 질량 분석 장치에도 본 발명을 적용할 수 있게 된다.
보통의 MALDI-TOF 질량 분석은 수 피코몰(picomole)의 검출 한계를 가지고 있지만, 본 발명에서 제시하는 신호 증폭 방식의 분석 방법을 이용하면 10-15 몰(attomole) 이하의 흔적 시료도 검출해 낼 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명에 대해 보다 상세히 설명하고자 한다. 아래 실시예, 합성예 등은 본 발명을 예시로써 상세하게 설명하기 위한 것이며, 어떠한 경우라도 본 발명의 범위를 제한하기 위한 의도가 아니다.
<실시예 1> AM 분자의 합성
제1단계 : AM-질량표지 합성
긴 알킬기를 가지는 장쇄 티올(Long chain thiol)에 다양한 길이의 에틸렌글리콜(ethylene glycol) 반복 단위를 부분을 결합하여 도 2에 나타낸 것과 같이 다양한 질량값을 가지는 AM-질량표지를 합성하였다.
<실시예 2> 포획자를 갖춘 금 입자의 제조
본 발명에 따른 한 구체적 태양에서 포획자를 갖춘 금 입자를 제조하였다. 이 입자는 AM-질량표지로 이루어지는 자기 조립형 단일층 속에 연결부와 포획자가 포함된 구조이다. 표 1에 나타낸 것과 같이 네 종류의 금 입자를 준비하였다.
| 표적 분자 | 포획자 | |
| 금 입자 1 | 글루타티온(glutathione, GSH) | 글루타티온-S-전달 효소 (glutathione-S-transferase, GST) |
| 금 입자 2 | 비오틴(biotin) | 뉴트라비딘(neutravidin) |
| 금 입자 3 | 알파 페토단백질 (a-fetoprotein, AFP) |
AFP-특이적 다중클론항체 |
| 금 입자 4 | 아디포넥틴(adiponectin) | 아디포넥틴-특이적 단일클론항체 1 |
| 금 입자 5 | 미오글로빈 |
AFP의 다중 클론 항체로는 영국 Abcam 사의 ab8201, 단일 클론 항체로는 ab3980을 사용하였다. 아디포넥틴의 다중 클론 항체로는 미국 R & D Systems사의 MAB1065, 단일 클론 항체로는 MAB10651을 사용하였다.
상기 금 입자들의 신호 발생부는 도 2에 나타낸 AM-질량표지 1을 금 입자에 황-금 결합을 통하여 연결시켰고, 연결부는 도 2에 나타낸 AM-질량표지 2를 역시 황-금 결합을 통하여 입자 표면에 연결시켰다. 포획자 단백질을 연결부에 결합시키기 전에 AM-질량표지 1의 자기 조립형 단일층(SAM)이 형성된 모습을 나타낸 것이 도 3인데, 완성된 금 입자는 연결부 역할을 하는 AM-질량표지 2의 카르복시기 말단과 포획자 단백질의 아미노기를 펩티드 결합으로 연결하게 된다.
제1단계 : 금 입자 표면에 자기 조립형 단일층(SAM) 형성
① 평균 지름 2 의 금 입자(gold bead, 한국 노마디엔社) 1 mg을 무수 에탄올(absolute ethanol)로 씻어준 후 2분 정도 원심분리한 후, 그 상등액을 제거한다. 이러한 과정을 3회 반복한다.
② 상기 금 입자 현탁액을 5분 동안 초음파 처리(sonication)한 다음 무수 에탄올로 씻어주고 2분 동안 원심분리한 후, 그 상등액을 제거한다. 이러한 과정을 3회 반복한다.
③ 도 2에 나타낸 AM-질량표지 1(신호 발생부 역할)의 1 mM 무수 에탄올 용액과 AM-질량표지 2(연결부 역할)의 1 mM 무수 에탄올 용액을 부피비로 1:99의 비율로 섞어 준다.
④ 상기 ②의 금 입자에 상기 ①의 혼합 용액 1 mL를 섞어 준 후 회전기(rotator)를 이용하여 암실에서 하루 동안(약 12시간 이상) 반응시켜 준다.
⑤ 상기 반응 혼합물을 5분 정도 원심분리시킨 후, 그 상등액을 제거한다.
⑥ 무수 에탄올(absolute ethanol) 1 mL를 섞어 준 후 3분 정도 원심분리한 후, 그 상등액을 제거한다. 이 과정을 5회 반복한다. 이후, 그 결과물을 무수 에탄올에 넣어 -20℃에서 보관한다.
도 4는 금 입자 표면에 AM-질량표지 1의 자기 조립형 단일층(SAM) 형성을 확인하기 위한 MALDI-TOF 질량 스펙트럼이다. 도 4의 질량 분석은 아래 실시예 8에 기재한대로 DHB를 매트릭스로 이용하여 실시하였다. 도 4의 질량 분석에서 (s-EG3-OH)2+Na+로 표시한 가장 강한 피크(m/z = 694.183)는 AM-질량표지 1의 알칸티올 부위가 이황화물(disulfide, S-S 결합)을 형성한 분자에 나트륨 이온이 결합한 이온종이다. 도 4에서는 그밖에 AM-질량표지 2와 1의 결합 이온도 볼 수 있으며, 질량 스펙트럼은 금 입자의 표면에 AM-질량표지 1이 주화학종인 SAM이 형성되었다는 결론에 잘 부합한다.
제2단계 : 금 입자에 포획자 결합
상기 표 1에 나타낸 5 종류의 포획자 단백질을 펩티드 결합 형성을 통하여 제1단계에서 얻은 금 입자 표면에 연결된 AM-질량표지 2의 COOH 말단에 결합시켰다.
① 1% AM-질량표지 2 / 99% AM-질량표지 1 단일층을 형성한 금 입자를 PCR 튜브로 옮겨 원심분리시킨 후, 그 상등액을 제거한다.
② 염화메틸렌(Methylene chloride) 100 μL를 섞어 준 후 원심분리한 후(5000×g, 5분), 그 상등액을 제거한다. 이 과정을 3회 반복한다.
③ N-하이드로숙신이미드(NHS) 용액(염화메틸렌 속 5 mg/mL) 50 μL를 상기 원심분리한 금 입자에 섞어 준 후 3분 동안 반응시킨다.
④ 여기에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 용액(염화메틸렌 속 20 mg/mL) 20 μL를 섞어 준 후 상온에서 2시간 동안 반응시킨다.
⑤ 원심분리기를 돌려(5000×g, 5분) 그 상등액을 제거한다.
⑥ 상기 금 입자에 100 μL의 염화메틸렌을 섞어 준 후 원심분리기를 돌려(5000×g, 5분) 그 상등액을 제거한다. 이 과정을 5회 반복한다.
⑦ 연결부에 연결할 포획자 단백질의 10 μL PBS 용액을 각 50 μL씩 상기 입자에 가하여 섞어준 후 상온에서 1시간 동안 반응시킨다. 포획자 단백질은 각각GST와 미오글로빈(미국 시그마-알드리치社), 뉴트라비딘(미국 Pierce Biotech社), AFP-특이적 단일클론항체와 다중클론항체(영국 Abcam社), 아디포넥틴-특이적 단일클론항체 1(미국 R&D systems社)였다.
⑧ 원심분리기를 돌려(5000×g, 5분) 그 상등액을 제거한다.
⑨ 금 입자에 PBS를 섞어 준 후 원심분리기를 돌려(5000×g, 5분) 그 상등액을 제거하는 과정을 2회 반복한 후, 튜브에 옮겨 준다.
⑩ 무수 에탄올에 넣어 완성된 금 입자를 -20℃에서 사용 전까지 보관한다.
<실시예 3> 포획 분자가 미리 고정되어 있는 표적 고정면의 준비
비오틴 또는 글루타티온 표적 분자가 화학 결합으로 고정되어 있는 표적 고정면을 제조하였다.
글루타티온 표적 분자가 포획되어 있는 표적 고정면의 제조
① 실리콘 웨이퍼 표면에 티타늄(100Å을 진공 적층한 다음 금(900Å을 적층하여 금 도금판을 제작하였다. 이 금 도금판을 적당한 크기, 예컨대 가로×세로가 5×5 mm인 크기로 자른다.
② AM-질량표지 1의 1 mM 무수 에탄올 용액과 도 2의 AM-질량표지 3의 1 mM 무수 에탄올 용액을 원하는 부피 비율(약 90:10부터 99.9999999:0.0000001까지)로 섞어 준다.
③ ② 단계에서 만든 에탄올 용액 속에 상기 금 도금판을 담근 후, 암실에서 하루 동안 반응시켜 자기 조립형 단일층(SAM)을 형성한다.
④ 이렇게 얻은 SAM 금판에 무수 에탄올을 뿌려 씻어준 후 질소(N2) 기체로 건조시킨다.
⑤ DMSO와 PBS를 1:1(v/v)로 섞은 용액을 이용하여 50 mM N-숙신이미딜 3-말레이미도프로피오네이트(N-succinimidyl 3-maleimidopropinate) 용액을 만든다.
⑥ SAM 금판에 10 μL의 50 mM N-숙신이미딜 3-말레이미도프로피오네이트(N-succinimidyl 3-maleimidopropinate) 용액을 올려 놓고 상온에서 4시간 동안 반응시켜 말레이미드 SAM 금판을 제조한다.
⑦ DMSO/PBS(1:1) 용액을 이용하여 말레이미드 SAM 금판을 가볍게 씻어준다.
⑧ 무수 에탄올을 뿌려 씻어준 후 N2 기체로 건조시킨다.
⑨ 말레이미드 SAM 금판에 10 μL의 50 mM 글루타티온(PBS 용액)을 올려 놓고 상온에서 2시간 동안 반응시켜 GSH SAM 금판을 제조한다.
⑩ 반응시킨 GSH SAM 금판을 PBS에 가볍게 씻어준다.
⑪ 무수 에탄올을 뿌려 씻어준 후 N2 기체로 건조시킨다.
도 5에 나타낸 질량 스펙트럼은 차례대로, 상기 ④ 단계를 마친 SAM 금판(1% NH2 SAM 금판), 말레이미드 SAM 금판(1% 말레이미드 SAM 금판)과 GSH SAM 금판의 MALDI-TOF 분석 결과로서 상기 금판 표면에 SAM이 형성되었다는 것을 보여준다. ④ 단계를 마친 SAM 금판에서는 도 4와 마찬가지로 AM-질량표지 1 두 분자 사이의 이황화물인 (s-EG3-OH)2+Na+ 이온을 볼 수 있다. 1% 말레이미드 SAM 금판에서는 AM-질량표지 1과 말레이미드가 AM-질량표지 3에 연결된 분자 사이의 이황화물인 이온종 (s-EG3-OH)-(s-EG5-maleimide)+Na+을 볼 수 있다. 1% GSH SAM 금판에서는 최종적으로 비오틴 표적 분자가 연결된 AM-질량표지 3과 AM-질량표지 1 사이의 이황화물인 (s-EG3-OH)-(s-EG5-GSH)+Na+을 볼 수 있다.
비오틴 표적 분자가 포획되어 있는 표적 고정면의 제조
상기 N-숙신이미딜 3-말레이미도프로피오네이트 대신 50 mM 술포숙신이미딜-6-(비오틴아미도)헥산노에이트(sulfosuccinimdyl-6-(biotinamido) hexanoate) PBS 용액을 10 μL 사용한 것 외에는 글루타티온 표적 분자 고정면과 같은 방법으로 제조하였다.
<실시예 4> 표적 분자가 고정된 표적 고정면의 질량 분석
실시예 2에서 제조한 GST 포획자를 갖춘 금 입자(표 1의 금 입자 1)로 실시예 3에서 제조한 GSH 표적 분자가 고정된 표적 고정면을, 뉴트라비딘 포획자를 갖춘 금 입자(표 1의 금 입자 2)로 비오틴 표적 고정면을 분석하였다. 1 mg의 뉴트라비딘 또는 GST 금 입자를 100 μL의 PBS 속에 현탁한 다음, 이 현탁액 10 μL를 비오틴 또는 GSH 표적 고정면에 가하였다. 5분 뒤 표적 고정면을 PBS와 증류수로 세척한 다음, 질소를 흘려 건조하고 질량 분석하였다.
도 6은 이러한 질량 분석 결과를 나타내는 질량 스펙트럼이다. 도 6(a)와 6(c)는 비오틴 표적 고정면을 분석한 실험이고, 도 6(b)와 6(d)는 글루타티온(GSH) 표적 고정면을 분석한 실험이다. 도 6의 질량 스펙트럼에서 그래프 안 백분율은 전체 표적 고정면에서 표적 분자의 고정 밀도를 나타내는데, 이러한 고정 밀도는 상기 실시예 3에서 표적 고정면의 제조시 표적 분자가 연결될 AM-질량표지 3과 AM-질량표지 1의 비율을 조절하는 단계(즉 실시예 3의 ② 단계)에서 질량표지들 사이의 혼합 비율을 조절함으로써 정할 수 있는 값이다.
도 6(a)는 뉴트라비딘 포획자를 갖춘 금 입자를 사용하지 않고 유리된 뉴트라비딘을 직접 비오틴 표적 고정면에 결합시킨 다음, 이를 통상의 MALDI-TOF 분석한 질량 스펙트럼이다. 뉴트라비딘 단백질의 질량 신호(14.6 kDa)를 비오틴 고정 밀도 1%인 경우에서는 관측할 수 있지만, 그 이하에서는 관측이 어렵다. 따라서 본 발명에 따른 금 입자를 사용하지 않는 직접 단백질 분석에서는 표적 분자 고정 밀도가 1% 수준이 관측 하한값임을 볼 수 있다. 도 6(c)의 실험에서는 본 발명에 따른 금 입자(표 1의 금 입자 2)를 이용하여, 무매트릭스 방식의 레이저 탈착 이온화-TOF 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 7(c)의 실험에서는 10-6%의 낮은 고정 밀도에서도 금 입자 표면에서 유래한 AM-질량표지 1 이황화물의 피크인 693.2 신호를 관측할 수 있어서 신호 증폭 효과가 극히 우수함을 뚜렷이 볼 수 있다.
글루타티온(GSH) 표적 고정면의 분석 결과도 이와 유사하다. 도 6(b)는 글루타티온 표적 고정면을 글루타티온-S-전달효소 단백질(GST, 27.0 kDa)로 직접 MALDI-TOF 분석한 결과이다. 5% 이상의 표면에 GSH 표적 분자가 고정된 경우에만 GST 질량 신호가 관측됨을 볼 수 있다. 본 발명의 금 입자(표 1의 입자 1)를 이용한 무매트릭스 방식으로 질량 분석한 6(d)에서는 10-4% 수준의 고정 밀도에서도 본 발명에 따른 신호 발생부의 2차 신호(693.2, 도 6(c)와 동일하게 AM-질량표지 1의 이황화물)를 볼 수 있다.
<실시예 5> 신호 발생의 특이성: 비특이적 신호 발생 여부
실시예 4와 도 6을 통하여 본 발명의 원리를 하나의 구체적 예를 들어 입증하였다. 본 발명자들은 도 6의 m/z=693.2 신호가 표적 분자와 포획자가 비특이적으로 결합하였기 때문이거나 포획자와 표적 분자의 결합에 무관하게 표적 고정면이나 금 입자로부터 신호 발생부가 떨어져 나왔기 때문에 관측된 것이 아니라는 점을 분명히 하기 위하여 다음과 같은 대조군 실험을 수행하였다.
도 7(a)는 양성 대조군 실험으로서, 실시예 3에서 제조한 비오틴 표적 고정면에 뉴트라비딘 포획자를 갖춘 금 입자를 반응시킨 결과이다. AM-질량표지 1의 이황화물 신호(693.2)를 뚜렷이 볼 수 있다. 도 7(b)는 상기 비오틴 표적 고정면에 미오글로빈 포획자를 갖춘 금 입자(표 1의 금 입자 5)를 반응시킨 결과를 보여준다. 도 7(a) 와 7(b)의 신호 발생부는 AM-질량표지 1로 동일하지만, 포획자가 표적 분자에 대하여 특이성이 없는 7(b)의 경우는 693.2 신호가 나타나지 않는다. 도 7(c)는 표적 분자가 고정되지 않은 표적 고정면과 뉴트라비딘 금 입자를 반응시킨 질량 분석 결과이다. 7(c)에 쓰인 표적 고정면은 실시예 3의 ④ 단계를 마친 표적 고정면, 즉 AM-질량표지 1과 3으로 SAM 형성한 표적 고정면이다. 도 7의 결과를 보면 포획자와 표적 분자가 반응 혼합물 속에 존재하고, 그 사이에 특이적 결합성이 있을 때에만 본 발명에 따른 간접적 신호를 관찰할 수 있다는 것을 알 수 있다.
도 7에서는 표적 고정면과 금 입자 양쪽에 AM-질량표지가 공통적으로 포함되어 있었으므로, 693.2의 신호의 근원이 표적 고정면이 아니라고 완전히 배제하기는 어려웠다. 본 발명자들은 아래 도 8에 나타낸 실험을 통하여 금 입자로부터만 신호가 신호 발생부가 떨어져 나왔기 때문에 관측된 것이 아니라는 점을 분명히 하기 위하여 다음과 같은 대조군 실험을 수행하였다. 즉 표적 고정면의 SAM 구성 성분으로는 AM-질량표지 1을 사용하고, 금 입자의 신호 발생부로는 도 2의 AM-질량표지 5를 사용하여 어느 질량표지가 신호로서 관측되는지를 살폈다.
도 8(a)는 양성 대조군 실험으로서, AM-질량표지 1의 자기 조립형 단일층만을 표면에 갖춘 SAM 금판에 대하여 통상적인 MALDI-TOF 분석(DHB를 매트릭스 사용, 실시예 8 참조)한 결과이다. 표적 분자와 금 입자를 쓰지 않은 이 경우에 MALDI-TOF 질량 스펙트럼에서 AM-질량표지 1의 이황화물 신호를 볼 수 있다. 도 8(b)는 같은 SAM 금판에 대하여 역시 금 입자를 가하지 않고, 매트릭스 형성 없이 레이저 탈착 이온화 질량 분석한 결과이다. 이 경우 SAM 금판에서 유래하는 AM-질량표지 1의 이황화물 신호(693.2)가 관측되지 않음을 볼 수 있다. 도 8(c)는 AM-질량표지 5 신호 발생부를 갖춘 금 입자를 같은 SAM 금판에 가하고, 매트릭스 형성 없이 레이저 탈착 이온화 질량 분석한 결과이다. 도 8(c)의 질량 스펙트럼에서는 금 입자 유래의 AM-질량표지 5의 이황화물 신호(780.6)는 관측되지만, SAM 금판에서 유래하는 693.2 신호는 관측되지 않는다.
이처럼 본 발명에 따른 AM-질량표지를 사용하는 경우, 매트릭스 형성 없이 레이저 탈착 이온화 방식의 질량 분석이 가능할 뿐 아니라, 표적 고정면으로부터 비특이적 신호 발생?검출을 배제할 수 있어, 고도로 특이적인 표적 분자의 검출이 가능하다. 본 발명에 따른 질량 분석에서 질량 신호는 표적 고정면이 아닌 금 입자의 신호 발생부로터 유래한다.
<실시예 6> 항체 포획자를 가지는 표적 고정면의 제조
실시예 3, 4에서처럼 표적 분자를 고정하지 않고, 액체 상태의 시료에 존재하는 표적 분자의 분석을 위하여 상기 표 1의 금 입자 3과 4에 적용할 표적 고정면을 제조하였다. 이 표적 고정면은 금 입자와 별도로 표면에 포획자를 갖추고 있는데, 금 입자와 표적 고정면의 포획자로는 하나의 공통 표적 분자에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 사용하였다.
간략하게 AM-질량표지 1의 에탄올 용액과 AM-질량표지 2의 에탄올 용액을 99:5의 부피비로 혼합한 용액에 금 칩을 12시간 동안 담가 두었다. 이 금 칩을 무수 에탄올로 세척하고 질소하에서 건조하였다. 이 금 칩을 NHS(20 mg/mL PBS 용액) 7 μL와 EDC(20 mg/mL PBS 용액) 3 μL로 2시간 동안 처리하고 PBS로 세척한 다음 질소하에서 건조하였다. 해당 단일클론항체를 함유하는 3.3 μM PBS 용액 10 μL를 이 금 칩에 가하여 1시간 동안 배양한 다음, PBS로 세척하고 건조하고 4에서 보관하였다. 단일클론항체로는 항AFP 항체(표 1의 금 입자 3에 대응) 또는 항아디포넥틴 항체(표 1의 금 입자 4에 대응)를 사용하였다.
<실시예 7> 아디포넥틴, AFP 표적 분자의 액상 분석
실시예 6에서 제조한 표적 고정면과 실시예 2의 금 입자 3 또는 4를 각각 액상 시료 속의 AFP 또는 아디포넥틴 표적 분자에 대하여 적용하였다. 간략하게 실시예 6의 표적 고정면에 AFP 또는 아디포넥틴 항원을 5 μL 가하였는데, 최종 항원 농도는 1 pM부터 1 aM(=10-18 M)에 걸쳐 변화시켰다. 30분 뒤, 여기에 항체 포획자를 갖춘 금 입자의 현탁액(10 mg/mL PBS 현탁액) 10 μL를 가하고 30분 간 배양하였다. 이 포획 혼합물을 PBS와 증류수로 세척하고 질소로 건조한 다음, 매트릭스 형성 없이 곧바로 레이저 탈착 이온화 질량 분석하였다.
도 9는 질량 분석 결과를 보여준다. 도 9(a)는 아디포넥틴 표적 분자에 대하여 서로 다른 단일클론항체를 각각 금 입자와 표적 고정면의 포획자로 이용한 경우이다. 도 9(a)에서 금 입자의 신호 발생부에서 유래한 693.2 신호를 1 aM 수준의 낮은 시료 농도에서도 관측할 수 있어 본 발명에 따른 초고감도 검출 특성을 알 수 있었다. AFP를 대상으로 한 도 9(b)의 실험에서도 최소 10 aM 수준의 검출 한계를 확인할 수 있었다.
이처럼 본 발명의 신호 증폭 방식의 질량 분석법은 흔적량 수준의 표적 분자의 존재도 특이적으로 검출할 수 있는 장점을 가진다는 것을 실시예를 통하여 확인하였다.
<실시예 8> 표적 분자의 질량 분석 조건
질량분석 기기로는 AutoflexIII MALDI-TOF 질량 분석기(독일 Bruker Daltonics社)를 사용하였고, 이온화원으로는 SmartBeam 레이저를 사용하였다. 모든 질량 스펙트럼은 19 kV 가속 전압, 50 Hz 반복 속도의 양성 모드(positive mode)하에서 평균 1000 회 또는 500회로 측정하여 얻었다.
시료 속의 표적 분자가 포획된 포획 혼합물은 매트릭스 형성 없이 바로 질량 분석기에 투입하였다. 금 입자 또는 표적 고정면에서 AM-질량표지의 자기 조립형 단일층이 형성되었는지의 여부는 Reflectron Positive mode에서 MALDI-TOF 측정하였는데, 이 때는 2,5-디하이드록시벤조산(DHB, 5 mg/mL 아세토니트릴 용액)을 매트릭스로 사용하였다. AM-질량표지의 간접 신호가 아닌 표적 분자 단백질의 신호를 직접 확인한 실험에서는 Linear Positive mode에서 시나핀산(sinapinic acid (SA), 5 mg/mL 아세토니트릴 용액)을 매트릭스로 사용하여 측정하였다.
이상과 같이 본 발명의 바람직한 실시 태양의 예를 들어 본 발명의 기술적 사상을 설명하였다. 본 명세서의 상세한 설명과 실시예에 사용된 용어는 해당 분야에서 평균적인 기술자에게 본 발명을 상세히 설명하기 위한 목적으로 쓰인 것일 뿐, 어느 특정 의미로 한정하거나 청구범위에 기재된 발명의 범위를 제한하기 위한 의도가 아니었음을 밝혀 둔다.
도 1은 한 구체적 실시 태양을 들어 본 발명의 질량 신호 증폭 원리를 도식화한 그림으로서, AM-질량 표지를 신호 발생부로 채택한 질량 분석 시스템의 분석 과정을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 금 입자 또는 표적 고정면에 쓰일 수 있는 신호 발생부의 한 구체적 실시 태양으로서, 황-금 결합을 통하여 금의 표면에 고정시킬 수 있는 AM-질량표지 분자들의 구조식이다.
도 3은 도 2의 AM-질량표지 1과 AM-질량표지 2로 금 입자 또는 표적 고정면 표면에 자기 조립형 단일층(SAM)이 형성된 모습을 나타낸 그림이다. 도 3에서는 연결부 역할을 하는 AM-질량표지 2에 포획자를 연결하지 않은 상태이다.
도 4는 실시예 2에 따라 AM-질량표지1과 AM-질량표지 2를 표면에 연결하되, 포획자를 연결하지 않은 금 입자에서 자기 조립형 단일층 형성 여부를 질량 분석한 질량 스펙트럼이다.
도 5는 글루타티온 표적 분자를 고정한 표적 고정면의 표면에서 SAM 형성을 확인할 수 있는 MALDI-TOF 스펙트럼이다.
도 6은 글루타티온 표적 분자를 고정한 표적 고정면의 형성 과정에서 각 단계별로 AM-질량표지 분자가 SAM을 형성하는 것을 나타내는 질량 분석 스펙트럼이다. 도 6(a)와 6(c)는 비오틴 표적 고정면, 6(b)와 6(d)는 글루타티온(GSH) 표적 고정면의 분석 결과로서, 그래프 안의 백분율은 표적 고정면 표면의 표적 분자 고정밀도를 나타낸다.
도 7은 본 발명에 따른 AM-질량표지의 특이적 질량 신호 발생을 증명하기 위한 대조군 실험이다. 7(a)는 비오틴 표적 분자가 고정된 표적 고정면과 뉴트라비딘 포획자를 갖춘 금 입자를 반응시킨 경우의 질량 스펙트럼이고, 7(b)는 비오틴 표적 분자가 고정된 표적 고정면과 미오글로빈 포획자를 갖춘 금 입자를 반응시킨 경우의 질량 스펙트럼이며, 7(c)는 비오틴이 고정되지 않은 표적 고정면과 뉴트라비딘 포획자 금 입자를 반응시킨 질량 스펙트럼이다.
도 8은 본 발명에 따른 AM-질량표지의 특이적 질량 신호 발생을 증명하기 위한 대조군 실험이다. 8(a)는 도 2의 AM-질량표지 1의 SAM이 형성된 SAM 금판을 MALDI-TOF 분석한 질량 스펙트럼이고, 8(b)는 동일한 SAM 금판을 매트릭스 형성 없이 레이저 탈착 이온화 분석한 스펙트럼이며, 8(c)는 동일한 SAM 금판에 AM-질량표지 5의 SAM이 형성된 금 입자를 반응시킨 질량 스펙트럼이다.
도 9는 AFP 표적분자 또는 아디포넥틴 표적 분자를 액상에서 질량 분석한 결과를 나타낸 질량 스펙트럼이다.
Claims (21)
- 표면이 유기 분자로 개질된 금 입자로서, 상기 금 입자는표면 개질된 금 입자끼리 표면 개질된 물질을 매개체로 연결되어 있으며, 상기 표면에서 자기 조립형 단일층(self assembled monolayer)을 이루는 복수의 신호 발생부;상기 금 입자의 표면에 결합하고 있는 하나 이상의 한쪽 끝이 포획자에 연결되고 반대쪽 끝은 상기 금 입자에 연결된 연결부; 및상기 연결부에 연결되어 있으며 표적 분자에 특이적으로 결합하거나 특이적으로 반응을 일으키는 포획자를 갖추고 있되,상기 신호 발생부는 상기 금 입자의 질량 분석 과정에서 상기 금 나노입자로부터 유리되어 표적 분자와 질량이 구별되는 크기의 유기 양이온을 복수로 생성하는 산소를 포함하는 지방족 체인이면서 말단에 -SH기를 포함하는 유기 분자인 것을 특징으로 하는 표적 분자 포획과 신호 증폭을 위한 금 입자; 및분석 대상 시료를 표면에 고정시킬 수 있는 표적 고정면을 포함하는 분석 장치로서,상기 표적 고정면은 고상의 지지체를 갖추고 있어 상기 지지체 표면에 표적 분자의 존부(存否)를 분석할 시료를 공유결합 또는 비공유결합을 통하여 고정시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 표적 분자 분석 장치.
- 제1항에 있어서,상기 금 입자는 포획자를 달리하는 여러 종류의 금 입자가 포함된 집합이며, 각 포획자별로 신호 발생부를 달리하는 것을 특징으로 하는 표적 분자 분석 장치.
- 제1항에 있어서,상기 표적 분자는 생분자인 것을 특징으로 하는 표적 분자 분석 장치.
- 제1항에 있어서,상기 포획자는 단백질, 펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 탄수화물-단백질 접합체(carbohydrate-protein conjugate), 지질-단백질 접합체 및 소형 유기 분자로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 표적 분자 분석 장치.
- 제4항에 있어서,상기 포획자는 단백질이고, 상기 연결부에 펩티드 결합으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 표적 분자 분석 장치.
- 제1항에 있어서,상기 신호 발생부는 한쪽 말단부가 알칸티올(alkanethiol) 부위로서, 금-황(Au-S) 결합을 통하여 상기 금 입자 표면에 결합하고 있으며,반대쪽에 에테르 말단부를 갖추고 있는 것을 특징으로 하는 표적 분자 분석 장치.
- 제6항에 있어서,상기 에테르 말단부는 에틸렌글리콜 단위를 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 분자 분석 장치.
- 제1항에 있어서,상기 질량 분석은 레이저 탈착 이온화-비행시간(laser desorption ionization-time of flight) 방식인 것을 특징으로 하는 표적 분자 분석 장치.
- 삭제
- 제1항에 있어서,상기 고상의 지지체는 유리, 실리콘, 금속, 반도체 및 플라스틱으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 표적 분자 분석 장치.
- 제1항에 있어서,상기 표적 고정면은 바이오칩인 것을 특징으로 하는 표적 분자 분석 장치.
- 제1항에 있어서,상기 표적 고정면은금-황(Au-S) 결합을 통하여 상기 표적 고정면의 표면과 연결되며, 상기 표면에서 자기 조립형 단일층(self assembled monolayer)을 이루는 복수의 신호 발생부;상기 표적 고정면 표면에 결합하고 있는 하나 이상의 연결부; 및상기 연결부에 결합하고 표적 분자를 공유결합 또는 비공유결합을 통하여 고정하는 포획자를 갖추고 있되,상기 신호 발생부는 상기 금 입자의 질량 분석 과정에서 상기 금 나노입자로부터 유리되어 표적 분자 및 상기 금 입자의 신호 발생부와 질량이 구별되는 크기의 유기 양이온을 복수로 생성하는 산소를 포함하는 지방족 체인이면서 말단에 -SH기를 포함하는 유기 분자인 것을 특징으로 하는 표적 분자 분석 장치.
- 제12항에 있어서,상기 표적 고정면의 신호 발생부는 에테르 말단부와 상기 에테르 말단부에 연결되고 상기 금 입자의 표면에 결합한 알칸티올부를 함유하는 것을 특징으로 하는 표적 분자 분석 장치.
- 제13항에 있어서,상기 에테르 말단부는 에틸렌글리콜 단위를 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 분자 분석 장치.
- 제12항에 있어서,상기 금 입자의 포획자와 상기 표적 고정면의 포획자는 상기 표적 분자에 특이적으로 결합하는 동일한 항체 또는 서로 다른 항체인 것을 특징으로 하는 표적 분자 분석 장치.
- 질량 분석을 이용하여 시료 내 표적 분자의 존부를 검출하는 방법에 있어서,(i) 상기 시료를 고상의 지지체에 접촉시켜 시료 속 물질을 상기 고상의 지체 표면 위에 고정시킨 표적 고정면을 얻는 단계;(ii) 금 입자에 연결된 포획자가 표적 분자와 특이적으로 결합하는 조건 하에서, 금 입자와 상기 표적 고정면을 접촉시켜 포획 혼합물을 생성하는 단계;(iii) 상기 포획 혼합물에서 비특이적으로 결합한 금 입자를 제거하는 선별 단계 및(iv) 상기 (iii) 단계를 마치고 포획 혼합물에 남은 금 입자를 질량 분석하는 단계를 포함하고,여기서 상기 금 입자는 표면이 유기 분자로 개질된 금 입자로서, 상기 금 입자는 표면 개질된 금 입자끼리 표면 개질된 물질을 매개체로 연결되어 있으며, 상기 표면에서 자기 조립형 단일층(self assembled monolayer)을 이루는 복수의 신호 발생부;상기 금 입자의 표면에 결합하고 있는 하나 이상의 한쪽 끝이 포획자에 연결되고 반대쪽 끝은 상기 금 입자에 연결된 연결부; 및 상기 연결부에 연결되어 있으며 표적 분자에 특이적으로 결합하거나 특이적으로 반응을 일으키는 포획자를 갖추고 있되, 상기 신호 발생부는 상기 금 입자의 질량 분석 과정에서 상기 금 나노입자로부터 유리되어 표적 분자와 질량이 구별되는 크기의 유기 양이온을 복수로 생성하는 산소를 포함하는 지방족 체인이면서 말단에 -SH기를 포함하는 유기 분자인 것을 특징으로 하는 표적 분자 포획과 신호 증폭을 위한 금 입자인 표적 분자의 질량 분석 검출 방법.
- 질량 분석을 이용하여 시료 내 표적 분자의 존부를 검출하는 방법에 있어서,(i) 상기 시료와 금 입자에 상기 표적 분자와 결합하는 포획자가 고상 지지체 표면에 고정되어 있는 포획 고정면을 서로 접촉시켜 포획 혼합물을 생성하는 단계;(ii) 상기 포획 혼합물에서 비특이적으로 결합한 금 입자를 제거하는 선별 단계 및(iii) 상기 (ii) 단계를 마치고 포획 혼합물에 남은 금 입자를 질량 분석하는 단계를 포함하고,여기서 상기 금 입자는 표면이 유기 분자로 개질된 금 입자로서, 상기 금 입자는 표면 개질된 금 입자끼리 표면 개질된 물질을 매개체로 연결되어 있으며, 상기 표면에서 자기 조립형 단일층(self assembled monolayer)을 이루는 복수의 신호 발생부;상기 금 입자의 표면에 결합하고 있는 하나 이상의 한쪽 끝이 포획자에 연결되고 반대쪽 끝은 상기 금 입자에 연결된 연결부; 및 상기 연결부에 연결되어 있으며 표적 분자에 특이적으로 결합하거나 특이적으로 반응을 일으키는 포획자를 갖추고 있되, 상기 신호 발생부는 상기 금 입자의 질량 분석 과정에서 상기 금 나노입자로부터 유리되어 표적 분자와 질량이 구별되는 크기의 유기 양이온을 복수로 생성하는 산소를 포함하는 지방족 체인이면서 말단에 -SH기를 포함하는 유기 분자인 것을 특징으로 하는 표적 분자 포획과 신호 증폭을 위한 금 입자인 표적 분자의 질량 분석 검출 방법.
- 제17항에 있어서,상기 비특이적으로 결합한 금 입자를 제거하는 단계는 상기 포획 혼합물의 세척을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 분자의 질량 분석 검출 방법.
- 제17항에 있어서,상기 질량 분석은 상기 포획 혼합물에 대한 무매트릭스(無matrix) 방식의 레이저 탈착 이온화에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 표적 분자의 질량 분석 검출 방법.
- 제17항에 있어서,상기 질량 분석은 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화-비행시간 질량 분석(MALDI-TOF mass spectrometry)으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 표적 분자의 질량 분석 검출 방법.
- 제17항에 있어서,상기 포획 혼합물의 선별 단계와 질량 분석 단계 사이에,상기 선별된 포획 혼합물로부터 금 입자를 분리하는 단계를 더 포함하고,상기 질량 분석 단계는 상기 분리된 금 입자를 대상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 표적 분자의 질량 분석 검출 방법.
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