WO2006109485A1 - 質量分析法 - Google Patents

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Junko Amano
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The Noguchi Institute
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
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    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/24—Nuclear magnetic resonance, electron spin resonance or other spin effects or mass spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to a molecular mass spectrometry method, a spectrum obtained by the method, information obtained from the spectrum, and a data aggregate in which the information is accumulated.
  • Mass spectrometry refers to ionizing a sample containing molecules, and converting the ionized molecules to mass Z charge.
  • Molecules such as sugars, sugar chains, proteins (including peptides), proteins including modifications with sugars (including peptides including modifications with sugars), nucleic acids, glycolipids, etc. have the same molecular weight and composition Therefore, detailed structural information cannot be obtained only by detecting molecular ions to determine the molecular weight using a mass spectrometer.
  • MS n (n> 1) analysis is caused by post source decay (PSD), in source decay (IS D), tandem mass, etc. after selecting a precursor ion after ionizing a biomolecule It is an analytical method that obtains molecular structure information by detecting product ions or selecting precursor ions from the generated product ions and repeating the same measurement.
  • Non-Patent Document 1 Sugahara, D. et al., Anal. Sci., 19, 167-169 (2003)
  • Non-Patent Document 2 Harvey, D.J., J. Mass Spectrom., 40, 642-653 (2005)
  • Non-Patent Document 3 Harvey, D.J., J. Am. Soc. Mass. Spectrom., 16, 647-659 (2005) Disclosure of the Invention
  • An object of the present invention is to generate a sufficient amount of parent ions at the same time, even at a smaller sample level, by labeling molecules, thereby facilitating ionization and stabilizing the produced ions, and at the same time MS This is to improve the sensitivity of MS n (n> l) even for a small amount of sample.
  • a further object of the present invention is to identify a binding position of a labeled compound in a molecule by MS n (n> l) analysis by the aforementioned method, and to provide a method for obtaining structural information of an analytical sample more easily and quickly. Is to provide.
  • the present inventor has found that, by stably labeling a molecule at a specific part on the molecule, the ion efficiency is improved and the generated ions are stabilized, thereby improving the sensitivity of MS. It was. Precursor ions generated in this way are sufficient for MS n (n> l) analysis, and it has been found that reproducible and structure-specific ions can be generated, which is highly sensitive, simple and rapid. Completed a method to obtain information.
  • Mass spectrometry of a molecule that is a sugar chain comprising: (1) labeling the reducing end of the molecule with a pyrene derivative compound having a hydrazide group or an amino group to obtain a labeled intermediate; (2) a step of reducing the labeled intermediate to obtain a reduction-labeled molecule, and (3) a step of performing MS n (n> l) analysis of the reduction-labeled molecule.
  • MS n n> l
  • Mass spectrometry of a molecule that is a sugar chain or a glycoprotein comprising: (1) a sugar in the molecule (2) labeling the acid chain product with a pyrene derivative compound having a hydrazide group or an amino group to obtain a labeled intermediate. And (3) reducing the labeled intermediate to obtain a reduction-labeled molecule, and (4) performing MS n (n> l) analysis of the reduction-labeled molecule.
  • Molecular mass spectrometry characterized by comprising;
  • Mass spectrometry of a molecule that is a protein or glycoprotein wherein (1) the molecule is labeled with a pyrene derivative compound using a carboxy group or an amino group in the molecule,
  • a molecular mass spectrometric method comprising the steps of: obtaining a molecule; and (2) performing an MS n (n> l) analysis of the labeled molecule
  • the present invention by combining a compound having a condensed polycyclic hydrocarbon with a molecule, the ionization efficiency is improved, and at the same time, the sensitivity of MS is improved, whereby the MS n (n> l ) Analysis can be facilitated and highly reliable structural information can be obtained.
  • the binding position of the sugar chain on the peptide is clarified, and a method for obtaining information useful for elucidating the function of the glycoprotein and the pathology can be provided.
  • FIG. 1A is a diagram showing a positive-ion MALDI-TOF MS spectrum obtained from reduction-labeled LNF-I in Example 2.
  • FIG. 1B is a diagram showing a positive-ion MALDI-TOF MS spectrum obtained from LNF-II reduced and labeled in Example 2.
  • FIG. 2A is a diagram showing a PSD-MSZMS spectrum obtained from the parent ion [M + Na] + of LNF—I reduced and labeled in Example 2.
  • FIG. 2B is a diagram showing a PSD-MSZMS spectrum obtained from the parent ion [M + Na] + of LNF-II reduced and labeled in Example 2.
  • FIG. 3A shows the reduction-labeled LNF-I parent ion [M + H] + in Example 3. It is a figure which shows the obtained ESI-MSZMS spectrum.
  • FIG. 3B is a view showing an ESI-MSZMS spectrum obtained from the parent ion [M + H] + of the reduced-labeled LNF— ⁇ in Example 3.
  • FIG. 4 is a diagram showing the fragment position and negative-ion MALDI-TOF MSZMS spectrum of compound (3) obtained in Example 4.
  • FIG. 5 is a diagram showing the fragment position and negative-ion MALDI-TOF MSZMS spectrum of compound (4) obtained in Example 4.
  • FIG. 6 is a diagram showing the fragment position and negative-ion MALDI-TOF MSZMS spectrum of compound (5) obtained in Example 4.
  • FIG. 7 is a diagram showing the fragment position and negative-ion MALDI-TOF MSZMS spectrum of compound (6) obtained in Example 5.
  • FIG. 8 shows negative-ion MALDI-TOF MS of compound (6) obtained in Example 5.
  • FIG. 9 is a diagram showing the fragment position and negative-ion MALDI-TOF MSZMS spectrum of compound (1) obtained by reduction labeling of the non-reducing end obtained in Example 6.
  • FIG. 10 is a diagram showing the fragment position and negative-ion MALDI-TOF MSZMS spectrum of the compound (2) obtained by reduction labeling of the non-reducing end obtained in Example 6.
  • a molecule in a sample is labeled with a compound having a condensed polycyclic hydrocarbon, and then MS n (n> l) analysis of the labeled molecule is performed. These steps will be described in detail.
  • “Molecules” include sugars, sugar chains, proteins, nucleic acids, complex carbohydrates (glycoproteins, glycolipids, etc.), including those prepared from nature and chemically or enzymatically prepared.
  • the term “protein” in the present invention includes a peptide, and the term “glycoprotein” in the present invention includes a glycopeptide. Also having a partial structure of molecules contained in the living body And those produced by imitating molecules contained in living organisms.
  • a sugar chain obtained by chemically or enzymatically releasing a sugar, sugar chain, or complex carbohydrate is an aldehyde group of a sugar at the reducing end and an amino group or Condensation with a labeled compound that is a condensed polycyclic hydrocarbon derivative having a hydrazide group (-CONHNH)
  • the condensation reaction is usually performed by heating the sugar chain and the labeled compound in an organic solvent such as methanol or DMSO in the presence or absence of acetic acid as a catalyst. Then add a reducing agent such as NaCNBH or NaBH and add
  • a reducing agent may coexist from the beginning in the condensation reaction solution.
  • the stability of the parent ions such as [M + Na] + or [M- ⁇ is low and the sensitivity is poor.
  • a labeling compound for sugars, sugar chains, or complex carbohydrates that contain sialic acid, a condensed polycyclic hydrocarbon derivative having an amino group, a hydrazide group, a diazomethyl group, or the like is used as a labeling compound. It can be labeled by reacting the carboxy group of the acid with the amino group, hydrazide group, diazomethyl group, etc. of the label compound. This reaction is performed, for example, in the presence of water-soluble rubodiimide and N-hydroxysulfosuccinimide.
  • a labeled compound that is a condensed polycyclic hydrocarbon derivative having an amino group or hydrazide group
  • the aldehyde group generated by the above selective oxidation and the amino group or hydrazide group of the labeled compound are as described above.
  • sugars, sugar chains, or complex carbohydrates contain galactose at the non-reducing end.
  • the non-reducing end galactose is specifically moved to the C position by galactose oxidase. It can be acidified to form aldehyde groups.
  • the enzyme reaction can be performed, for example, in a neutral buffer solution at room temperature for 2 hours.
  • a labeled compound that is a condensed polycyclic hydrocarbon derivative having an amino group or a hydrazide group
  • a reduction-labeled molecule can be obtained by subjecting the group to a condensation reaction as described above to form a label-intermediate and then reducing the label-intermediate.
  • Proteins (including peptides) and glycoproteins (including glycopeptides) can be labeled with a carboxy group, amino group, or SH group contained therein.
  • a carboxyl group a condensed polycyclic hydrocarbon derivative having an amino group, a hydrazide group, a diazomethyl group, etc. is used as the labeling compound, and these groups can be combined with a protein or glycoprotein.
  • a labeled molecule can be obtained by reacting with a carboxy group therein.
  • a condensed polycyclic hydrocarbon derivative having a succi-midyl ester group, a sulfonyl chloride group or the like is used as a labeling compound, and these groups are combined with an amino group in a protein or glycoprotein.
  • the labeled molecule can be obtained by reacting with.
  • a condensed polycyclic hydrocarbon derivative having an odode group (I) is used as a labeling compound
  • Protein or Labeled molecules can be obtained by reacting with SH groups in glycoproteins.
  • the labeling compound is a condensed polycyclic hydrocarbon derivative.
  • Condensed polycyclic hydrocarbon derivative means a condensed polycyclic hydrocarbon moiety such as naphthalene, anthracene, pyrene, a reactive functional group capable of binding to the molecule to be analyzed, and, if necessary, the This refers to a compound having a spacer part that links the pyrene ring and the reactive functional group.
  • the label compound used in the present invention is preferably a pyrene derivative compound.
  • “Pyrene derivative compound” means a pyrene ring, a reactive functional group capable of binding to a molecule to be analyzed, and a spacer that links the pyrene ring and the reactive functional group as necessary.
  • a compound having a moiety is preferably a pyrene derivative compound.
  • 1-pyrenebutanoic a hydrazide (1-pyrenebutanoic a cid, hydrazide; PBH), 1-pyreneacetic acid, hydrazide, 1-pyrenepropionic acid hydrazide, 1-pyreneacetic acid, succinimidyl ester, 1-pyrenepropionic acid, succinimidyl ester, 1-pyrenebutionic acid, succinimidyl ester Noreestenole (1— pyrenebutanoic acid, succinimidyl ester), N— (1-pyrenebutanoyl) cysteic acid succinimidyl ester (N- (l-pyrenebutanoyl) cy steic acid, succinimidyl ester), N— (1-Hylene) ⁇ ⁇ Toset, To ( ⁇ — (1—pyrene) lod oacetamide), N— (1-pyrene) maleimide (N— (l—pyrene) maleimide (
  • Mass spectrometry means matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI), laser desorption (LD), fast electron impact (FAB), electrospray ionization (ESI), atmospheric pressure chemistry (APCI)
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization
  • LD laser desorption
  • FAB fast electron impact
  • ESI electrospray ionization
  • APCI atmospheric pressure chemistry
  • the condensed polycyclic hydrocarbon is bonded to the molecule, so that the ion efficiency increases.
  • the reduction label further stabilizes the molecular ion.
  • the sample solution needs to be easily vaporized by the ESI method.
  • Substances such as sugars, sugar chains, proteins, and glycoproteins are difficult to dissolve in a solution containing an organic solvent with high hydrophilicity, but by labeling a condensed polycyclic hydrocarbon derivative, Labeled substances become soluble in organic solvents and the ESI method can be applied to them.
  • the ionization method is not limited, but is preferably an ESI method or a MALDI method, and more preferably a MALDI method.
  • the spectrum obtained by the mass spectrometry method of the present invention described above can be used to identify the structure of molecules such as sugars, sugar chains, proteins, sugars and other modified proteins, nucleic acids, glycolipids, and the like. It is melted.
  • the structure information of the sugar chain part obtained from the spectral force and information such as the intramolecular binding position of the sugar chain part are methods for obtaining information useful for elucidating the function of the molecule or the pathology involved in the molecule. I will provide a. Therefore, the data aggregate in which the information obtained from the spectrum obtained by the mass spectrometry of the present invention is accumulated is combined with the computer system for querying the accumulated information and the mass spectrometry of the present invention. It can provide useful information for identifying the structure of a wide range of unknown molecules, elucidating their functions, and elucidating the pathologies involved in the molecules.
  • Ratato N fucopentaose I lacto-N-focopenta ose I, LNF- I , Compound of formula (1)
  • ratato N fucopentaose II lacto-N-foe opentaose II, LNF-II, compound of formula (2)
  • Gal, Glc, Fuc and GlcNAc each represent galactose, glucose, fucose and N-acetylyldarcosamine.
  • Each of the reduction-labeled LNF-I and reduction-labeled LNF-II obtained in Example 1 was dissolved in pure water, and these reduction-labeled sugars lpmol were applied to a MALDI target plate.
  • a matrix solution of 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHBA) dissolved in 40% acetonitrile-pure water was mixed with the labeled sugar solution on the target plate and dried.
  • MS analysis was performed using a MALDI-T OF MS apparatus (Axima-CFR plus (Shimadzu / Kratos)).
  • Fig. 1A shows the spectrum obtained from reduction-labeled LNF-I
  • Fig. 1B shows the spectrum obtained from reduction-labeled LNF-II.
  • FIG. 2A shows the spectrum obtained from the reduced labeled LNF-I parent ion model
  • Fig. 2B shows the spectrum obtained from the reduced labeled LNF-II parent ion model.
  • Fig. 3A shows the spectrum obtained from the reduced labeled LNF-I parent ion
  • Fig. 3B shows the spectrum obtained from the reduced labeled LNF-II parent ion.
  • Example 1 Except for the power! The procedure of Example 1 was repeated to obtain labeled LNF-I and labeled LNF-II labeled with PBH. Each of labeled LNF-I and labeled LNF-II was subjected to MALDI-TOF MS analysis according to the procedure described in Example 2. And while Kaka, ionic strength of the label L NF-? I and labeled LNF- II force resulting parent ion, reducing labeling LNF- I and reduced-labeled LNF-[pi compared to the 1Z10 order in which was less, MS n (n> l) It was difficult to carry out the analysis.
  • the compounds (3) to (5) shown below were labeled by reduction using the pyrene derivative compound (PBH) by the method of Example 1, followed by MALDI equipped with a quadrupole ion trap (QIT). Negative-ion MALDI-T OF MSZMS measurement was performed using QIT-TOFMS (Axima-QIT (Shimadzu / Kratos)). Here, in the second-stage MS measurement, the parent ion of each compound was used as a precursor ion.
  • FIGS. 4 to 6 show the fragment positions of compounds (3) to (5) and the obtained spectra, respectively (in these figures, in order to clarify the fragment positions)
  • the O atom of the glycosidic bond is clearly shown (the figure below is the same).
  • ' 4 A, 2 ', 4 A, D and E types of ions are generated, which are characteristic fragment ions for each structure.
  • Non-Patent Documents 2 and 3 for example.
  • Non-Patent Document 3 2 ' 4 A, D using unlabeled sugar chains
  • ALDI-QIT-TOFMS (Axima-QIT (Shimadzu / Kratos)
  • FIG. 7 shows the fragment position of compound (6) and the spectrum obtained.
  • the arrows in the spectrum shown in Fig. 7 indicate the precursorion peak.
  • Example 6 Each has a blood group antigen H or Le a, a relationship of structural isomers LNF- I (Compound (1)) and LNF- II (Compound (2)) the non-reducing end of Nag the glucose at the reducing end A pyrene derivative compound was introduced into the end galactose and labeled. The specific method is shown below. First, in order to prevent the labeling of pyrene derivative compound from being introduced into the glucose at the reducing end, LNF-I and LNF-II are left in a sodium borohydride solution at a concentration of 10 mg / ml for 2 hours for reduction. did. Next, galactose oxidase (6 units) was collected and allowed to stand at 37 ° C.
  • This ion is derived from a sugar chain (FucZ Gal / GlcNAc trisaccharide) that is reductively labeled with PBH.
  • Detection of this ion revealed that both LNF-I and LNF-II have a ratatosamine structure with fucose at the non-reducing end.
  • an ion of mZz 528.2, in which the PBH-labeled Fucal-2Gal structure was released, was detected.
  • this method makes it possible to reduce and label sugar chains without releasing the sugar chains from the glycoprotein. Therefore, this method improves the ionic efficiency of the glycoprotein and makes it possible to analyze the sugar chain portion as it is.

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Abstract

　本発明の目的は、微量試料においてもＭＳｎ（ｎ＞１）解析を可能にするとともに、ＭＳｎ（ｎ＞１）解析によって分子中の標識化合物の結合位置を同定することによって簡便、迅速に構造情報を得る方法を提供することである。本発明においては、分子を安定に分子上の特定の部分に標識することによって、容易にイオンを生成、安定化させ、ＭＳの感度を向上させる。このようにして生じたプリカーサーイオンは、ＭＳｎ（ｎ＞１）解析に十分量であり、再現性よく構造特異的なイオンを生成させる。高感度で、簡便、迅速に構造情報を得ることができる。

Description

明 細 書
質量分析法
技術分野
[0001] 本発明は、分子の質量分析法、該方法によって得られるスペクトル、該スペクトルか ら得られる情報、および該情報を集積したデータ集積体に関する。
背景技術
[0002] 「質量分析法」とは、分子を含む試料をイオン化し、イオン化した分子を質量 Z電荷
(m/z)に従って分離し検出することによって構造情報を得る方法である。
[0003] 糖、糖鎖、タンパク質 (ペプチドを含む)、糖などによる修飾を含むタンパク質 (糖な どによる修飾を含むペプチドを含む）、核酸、糖脂質などの分子は、分子量および組 成が同一の構造異性体が存在するので、質量分析装置による分子量を知るための 分子イオンの検出のみでは詳細な構造情報が得られない。
[0004] そこで、 MSn(n> l)解析を行う。「MSn(n> 1)解析」とは、生体分子をイオン化し たのち、プリカーサ一イオンを選択して、 post source decay(PSD), in source decay(IS D)およびタンデムマスなどによって生じたプロダクトイオンを検出すること、あるいは、 生じたプロダクトイオンの中からプリカーサ一イオンを選択して、同様の測定を繰り返 すことによって、分子の構造情報を得る分析法である。
[0005] MSn(n> l)解析を行うためには、プリカーサ一イオンとなる親イオン（[M+Na] +、
[Μ + Η] +、 [Μ— ΗΓなど）が十分に生成する必要がある。し力しながら、前述のよう な生体試料由来の分子はそのままではイオン化されにくぐ十分な量の親イオンを得 ることが難しい。たとえば、糖鎖をそのままマトリクス支援レーザー脱離イオンィ匕一飛 行時間型質量分析法 (MALDI—TOF MS)で解析しょうとすると lOpmol以上を 要する。この問題に対して、 1ーピレンブタン酸ヒドラジド（1-pyrenebutanoic acid, hyd razide; PBH)を用いて糖鎖を標識する方法が提案されている（たとえば、非特許文 献 1参照)。しカゝしながら、該方法で標識された糖鎖の MALDI— TOF MSによる解 析では、非標識糖に比較して検出限界の低下 (すなわち MSの感度の改善)が認め られたものの、生体試料を MSn(n> l)解析に適用するのに必要とされるサブ pmol レベルにおける親イオンの生成は、未だ不十分であるのが現状である。
[0006] 非特許文献 1 : Sugahara, D. et al.， Anal. Sci., 19, 167-169 (2003)
非特許文献 2 : Harvey, D.J., J. Mass Spectrom., 40, 642-653 (2005)
非特許文献 3 : Harvey, D.J., J. Am. Soc. Mass. Spectrom., 16, 647—659 (2005) 発明の開示
[0007] 本発明の目的は、分子を標識することによって、イオン化の促進および生成イオン の安定ィ匕によって、より微量な試料レベルにぉ 、ても十分な量の親イオンを生成させ 、同時に MSの感度を向上させて、微量試料においても MSn(n> l)解析を可能に することである。本発明のさらなる目的は、前述の方法による MSn(n> l)解析によつ て、分子中の標識化合物の結合位置を同定し、分析試料の構造情報をより簡便かつ 迅速に得る方法を提供することである。
[0008] 本発明者は、分子を安定に分子上の特定の部分に標識することによって、イオンィ匕 効率の向上および生成したイオンの安定化を実現して、 MSの感度を向上させること を見いだした。このようにして生じたプリカーサ一イオンは、 MSn(n> l)解析に十分 量であり、再現性よく構造特異的なイオンを生成させることも見いだし、高感度で、簡 便、迅速に構造情報を得る方法を完成させた。
[0009] すなわち、
1. 縮合多環炭化水素を有する標識化合物を分子と結合させて標識された分子を 形成する工程と、該標識された分子の MSn(n> l)解析を行う工程とを備えたことを 特徴とする分子の質量分析法；
2. 標識化合物がピレン誘導体化合物であることを特徴とする 1.に記載の質量分 析法；
3. 糖鎖である分子の質量分析法であって、（1)該分子の還元末端をヒドラジド基ま たはアミノ基を有するピレン誘導体化合物で標識して、標識化中間体を得る工程と、 (2)標識ィ匕中間体を還元して、還元標識された分子を得る工程と、（3)該還元標識さ れた分子の MSn(n> l)解析を行う工程とを備えたことを特徴とする分子の質量分析 法；
4. 糖鎖または糖タンパク質である分子の質量分析法であって、（1)該分子中の糖 鎖部分のみを酸ィ匕して、酸化生成物を得る工程と、（2)酸ィ匕生成物をヒドラジド基ま たはアミノ基を有するピレン誘導体化合物で標識して、標識化中間体を得る工程と、 (3)標識ィ匕中間体を還元して、還元標識された分子を得る工程と、（4)該還元標識さ れた分子の MSn(n> l)解析を行う工程とを備えたことを特徴とする分子の質量分析 法；
5. タンパク質または糖タンパク質である分子の質量分析法であって、（1)該分子内 のカルボキシ基またはアミノ基を利用して、該分子をピレン誘導体ィ匕合物で標識し、 標識された分子を得る工程と、（2)該標識された分子の MSn(n> l)解析を行う工程 とを備えたことを特徴とする分子の質量分析法
6. 1.カゝら 5.のいずれかに記載の質量分析法によって得られるスペクトル；
7. 6.に記載のスペクトル力 得られる情報；および
8. 7.に記載の情報を集積したデータ集積体
である。
[0010] 本発明によると、分子に縮合多環炭化水素を有する化合物を結合させることによつ てイオン化効率を向上させ、同時に MSの感度を向上させることによって、分子の M Sn(n> l)解析を容易にし、信頼性の高い構造情報を得ることができる。また、本発 明によると、糖鎖の構造情報と同時に、糖鎖のペプチド上の結合位置が明確になり、 糖タンパク質の機能解明や病態の解明に有用な情報を得る方法を提供できる。 図面の簡単な説明
[0011] [図 1A]図 1Aは実施例 2において還元標識された LNF— Iから得られた positive-ion MALDI-TOF MSスペクトルを示す図である。
[図 1B]図 1Bは実施例 2において還元標識された LNF— IIから得られた positive-ion MALDI-TOF MSスペクトルを示す図である。
[図 2A]図 2Aは実施例 2において還元標識された LNF— Iの親イオン [M + Na] +か ら得られた PSD— MSZMSスペクトルを示す図である。
[図 2B]図 2Bは実施例 2において還元標識された LNF— IIの親イオン [M + Na] +か ら得られた PSD— MSZMSスペクトルを示す図である。
[図 3A]図 3Aは実施例 3において還元標識された LNF— Iの親イオン [M + H] +から 得られた ESI— MSZMSスペクトルを示す図である。
[図 3B]図 3Bは実施例 3において還元標識された LNF— Πの親イオン [M + H] +から 得られた ESI— MSZMSスペクトルを示す図である。
[図 4]図 4は実施例 4にて得られた、化合物（3)のフラグメント位置および negative-ion MALDI-TOF MSZMSスペクトルを示す図である。
[図 5]図 5は実施例 4にて得られた、化合物（4)のフラグメント位置および negative-ion MALDI-TOF MSZMSスペクトルを示す図である。
[図 6]図 6は実施例 4にて得られた、化合物（5)のフラグメント位置および negative-ion MALDI-TOF MSZMSスペクトルを示す図である。
[図 7]図 7は実施例 5にて得られた、化合物（6)のフラグメント位置および negative-ion MALDI-TOF MSZMSスペクトルを示す図である。
[図 8]図 8は実施例 5にて得られた、化合物（6)の negative- ion MALDI-TOF MS
ZMS分析により得られた mZz= 1138のプリカーサ一イオンのフラグメント位置およ び negative- ion MALDI-TOF MS3スペクトルを示す図である。
[図 9]図 9は実施例 6にて得られた、非還元末端を還元標識された化合物（1)のフラ グメント位置および negative- ion MALDI-TOF MSZMSスペクトルを示す図で ある。
[図 10]図 10は実施例 6にて得られた、非還元末端を還元標識された化合物（2)のフ ラグメント位置および negative- ion MALDI-TOF MSZMSスペクトルを示す図で ある。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明では、試料中の分子を縮合多環炭化水素を有する化合物で標識し、その後 に標識した分子の MSn(n> l)解析を行う。これらの工程について詳述する。
[0013] (1)分子の標識
「分子」とは、糖、糖鎖、タンパク質、核酸、複合糖質 (糖タンパク質、糖脂質など)な どであって、天然から調製する他、化学的または酵素学的に調製するものを含む。な お、本発明における用語「タンパク質」はペプチドを含み、本発明における用語「糖タ ンパク質」は糖ペプチドを含む。また、生体に含まれる分子の部分構造を有するもの や生体に含まれる分子を模倣して作製されたものを含む。
[0014] 糖、糖鎖、または複合糖質力も化学的あるいは酵素学的に遊離して得た糖鎖 (以 下糖鎖とする）は、還元末端にある糖のアルデヒド基と、アミノ基あるいはヒドラジド基（ -CONHNH )などを有する縮合多環炭化水素誘導体である標識化合物とを縮合
2
反応させて標識ィ匕中間体を形成し、次いで該標識ィ匕中間体を還元することによって 還元標識された分子を与える。縮合反応は、通常、メタノールまたは DMSOなどの 有機溶媒中で、触媒としての酢酸などの存在下または非存在下において、糖鎖と標 識化合物とを加温して行う。その後、 NaCNBH、 NaBHなどの還元剤をカ卩えて、加
3 4
温または室温で還元反応を行う。あるいはまた、縮合反応溶液中に始めから還元剤 を共存させる場合もある。還元末端の糖のアルデヒド基と PBHとを縮合させることによ り標識する従来法では、 [M + Na] +あるいは [M— ΗΓなどの親イオンの安定性が 低く感度が劣っていたが、本発明により、還元反応をさらに行うことで親イオンが多く 生成し十分な感度を得ることが見 、だされた。
[0015] また、糖、糖鎖または複合糖質の中でもシアル酸を含むものについては、アミノ基、 ヒドラジド基、ジァゾメチル基などを有する縮合多環炭化水素誘導体を標識化合物と して用いて、シアル酸のカルボキシ基と、標識ィ匕合物のアミノ基、ヒドラジド基、ジァゾ メチル基などとを反応させることによって標識できる。この反応は、例えば、水溶性力 ルボジイミドおよび N—ヒドロキシスルホスクシンイミド存在下で行う。
[0016] さらに、シアル酸を含む糖、糖鎖、または複合糖質は、シアル酸の C 位のみを選
7-9
択的に過ヨウ素酸酸ィ匕してアルデヒド基を生じさせることができる。シアル酸の C 位
7-9 の選択的酸化は、 5mMの NalO水溶液中で 0°C、 10〜20分間にわたり反応させる
4
ことによって実施することができる。アミノ基あるいはヒドラジド基などを有する縮合多 環炭化水素誘導体である標識化合物を用いて、上記の選択的酸化により生じたアル デヒド基と、標識ィ匕合物のアミノ基あるいはヒドラジド基を前述のように縮合反応させ て標識ィ匕中間体を形成し、次いで該標識ィ匕中間体を還元することによって還元標識 された分子を得ることがでさる。
[0017] あるいは、多くの糖、糖鎖、または複合糖質は、非還元末端にガラクトースを含む。
その非還元末端のガラクトースを特異的にガラクトースォキシダーゼによって C位を 酸ィ匕しアルデヒド基を生じさせることができる。酵素反応は、たとえば、中性の緩衝液 中で、室温、 2時間で行うことができる。アミノ基あるいはヒドラジド基などを有する縮 合多環炭化水素誘導体である標識ィ匕合物を用いて、上記の酵素的酸ィ匕により生じ たアルデヒド基と、標識ィ匕合物のアミノ基あるいはヒドラジド基を前述のように縮合反 応させて標識ィ匕中間体を形成し、次いで該標識ィ匕中間体を還元することによって還 元標識された分子を得ることができる。
[0018] シアル酸やガラクトースに標識を行うこれらの方法を、糖タンパク質 (糖ペプチドを 含む)分子上のシアル酸やガラクトースに適用することが可能である。その場合、糖タ ンパク質分子を標識できるので、該分子のイオンィ匕効率が高くなり、 MSが高感度に なる。また、本発明は糖鎖を遊離することなぐ分子上の糖鎖を標識することができる ので、糖鎖を含むタンパク質の MSn(n> l)解析により、タンパク質のペプチド鎖上の 糖鎖結合位置が特定できる。さら〖こ、標識された糖鎖部分の MSn(n> l)解析により 、糖鎖構造情報を得ることができる。糖タンパク質の機能を解明する上で、糖鎖がぺ プチド鎖上のどこの位置に、どのような構造を有して、付加しているのかを明らかにす ることは極めて重要である。さらに、多くの場合、複数の異なる構造の糖鎖がペプチド 鎖の複数の結合位置に結合して 、るので、糖鎖の位置と構造の対応を明確にする 必要がある。本発明によってこれらの情報を得ることが可能になる。
[0019] タンパク質 (ペプチドを含む）および糖タンパク質 (糖ペプチドを含む）は、その中に 含まれるカルボキシ基、アミノ基、または SH基を用いて標識することができる。カルボ キシ基を用いて標識する場合には、アミノ基、ヒドラジド基、ジァゾメチル基などを有 する縮合多環炭化水素誘導体を標識ィ匕合物として用い、それらの基と、タンパク質ま たは糖タンパク質中のカルボキシ基とを反応させることによって標識された分子を得 ることができる。一方、アミノ基を用いて標識する場合には、スクシ-ミジルエステル基 、塩化スルホニル基などを有する縮合多環炭化水素誘導体を標識化合物として用い 、それらの基と、タンパク質または糖タンパク質中のアミノ基とを反応させることによつ て標識された分子を得ることができる。さらに、タンパク質または糖タンパク質に含ま れるシスティン残基の SH基を用いて標識する場合には、ョード基（一 I)などを有する 縮合多環炭化水素誘導体を標識化合物として用い、それらの基と、タンパク質または 糖タンパク質中の SH基とを反応させることによって標識された分子を得ることができ る。
[0020] (2)標識化合物
標識化合物は、縮合多環炭化水素誘導体である。「縮合多環炭化水素誘導体」と は、ナフタレン、アントラセン、ピレンなどの縮合多環炭化水素部分と、分析対象の分 子と結合することが可能である反応性官能基と、必要に応じて該ピレン環と該反応性 官能基とを連結するスぺーサ一部分とを有する化合物をいう。
[0021] 本発明で用いる標識ィ匕合物は、好ましくはピレン誘導体ィ匕合物である。「ピレン誘 導体化合物」とは、ピレン環と、分析対象の分子に結合することが可能である反応性 官能基と、必要に応じて該ピレン環と該反応性官能基とを連結するスぺーサ部分とを 有する化合物をいう。具体的には、 1ーピレンブタン酸ヒドラジド（1-pyrenebutanoic a cid, hydrazide; PBH)、 1—ピレン酢酸ヒトフンド (1- pyreneacetic acid, hydrazide)、 1 —ピレンプロピオン酸ヒドラジド (1— pyrenepropionic acid, hydrazide)、 1—ピレン酢酸 スクシニミジノレエステノレ (1- pyreneacetic acid, succinimidyl ester)、 1—ピレンプロピ オン酸スクシニミジノレエスァノレ (1— pyrenepropionic acid, succinimidyl ester)、 1—ピレ ンブタン酸スクシ-ミジノレエステノレ (1— pyrenebutanoic acid, succinimidyl ester)、 N— ( 1 -ピレンブタノィル）システィン酸スクシ-ミジルエステル (N-(l-pyrenebutanoyl)cy steic acid, succinimidyl ester)、 N— (1—ヒレン)ョ ~~ト セト , ト (Ν— (1— pyrene) lod oacetamide)、 N— (1ーピレン)ョードマレイミド (N—(l— pyrene) maleimide)、 N— (1— ピレンメチル）ョードアセトアミド（N- (1- pyrenemethyl) iodoacetamide)、 1—ピレンメチ ノレョ ~~トァセァ ~~ト (1— pyrenemethyl lodoacetate)、 /' ノピレン (aminopyrene)、丄一 ピレンメチルァミン（1-pyrenemethyl amine)、 1—ピレンプロピルアミン（3- (1-pyrenyl) propylamine)^ 1—ピレンブチノレアミン (4— (1— pyrenyl)butylamine)、 1—ピレンスノレホン 酸クロリド（l-pyrenesulfonyl chloride)などが挙げられる。好ましくは、 PBHである。
[0022] (3)質量分析法
「質量分析法」とは、マトリクス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI)法、レーザー 脱離 (LD)法、高速電子衝撃 (FAB)法、エレクトロスプレーイオンィ匕 (ESI)法、大気 圧化学 (APCI)法などのイオン化方法によって分子を含む試料をイオンィ匕し、次!、 で、飛行時間法 (タイムォブフライト法、 TOF法）、二重収束法、四重極集束法などを 用いて、イオン化した分子を質量 Z電荷比 (mZz)に従って分離し検出する方法で ある。
[0023] MALDI法にぉ 、ては、縮合多環炭化水素が分子に結合して 、ることで、イオンィ匕 効率があがるが、還元標識によって、さらに分子イオンが安定になる。
[0024] また、 ESI法にぉ 、ては、試料溶液が容易に気化される必要がある。糖、糖鎖、タン パク質、糖タンパク質などの物質は、親水性が高ぐ有機溶媒を含有する溶液に溶か すことは困難であるが、縮合多環炭化水素誘導体を標識することによって、標識され た物質が有機溶媒に可溶性となり、それらに対して ESI法を適用できるようになる。
[0025] 本発明においてイオン化法は限定されないが、好ましくは、 ESI法、または MALDI 法であり、より好ましくは、 MALDI法である。
[0026] 糖、糖鎖、タンパク質、糖など修飾を含むタンパク質、核酸、糖脂質などの分子は、 分子量および組成が同一の構造異性体が存在するので、縮合多環炭化水素誘導 体による標識化後、プリカーサ一イオンの生成を高めて、 MSn(n> l)解析を行い、 異性体に特異的なイオンを生成して構造情報を得ることができる。糖ペプチドゃ糖タ ンパク質の糖鎖部分に標識した分子を MSn(n> l)解析する場合、標識を含むプロ ダクトイオンを選択することによって、分子中の糖鎖結合位置を決定することができる
[0027] 以上に記載された本発明の質量分析法によって得られるスペクトルは、糖、糖鎖、 タンパク質、糖など修飾を含むタンパク質、核酸、糖脂質などの分子の構造を特定す る上で油溶である。また、該スペクトル力 得られる糖鎖部分の構造情報および該糖 鎖部分の分子内結合位置のような情報は、当該分子の機能解明あるいは当該分子 が関与する病態の解明に有用な情報を得る方法を提供する。したがって、本発明の 質量分析法によって得られるスペクトルカゝら得られる情報を集積したデータ集積体は 、集積された情報の照会を行うコンピュータシステムおよび本発明の質量分析法と組 み合わせることによって、広範な構造未知の分子の構造の特定、機能の解明および 当該分子が関与する病態の解明に有用な情報を提供することができる。
実施例 [0028] (実施例 1) 糖鎖の標識
それぞれ血液型抗原 Hまたは Leaを有し、互 ヽに分子量および組成式が同一で構 造異性体の関係にある糖鎖であるラタトー N フコペンタオース I (lacto-N-focopenta ose I、 LNF— I、式（1)の化合物）およびラタトー N フコペンタオース II (lacto- N- foe opentaose II、 LNF— II、式（2)の化合物）をピレン誘導体化合物（PBH)で標識し、 次!ヽで還元して還元標識糖を得た。
[0029] [化 1]
Fuc 1 -2Gal 1 - GlcNAcp 1 -3Gal l-4Glc ( 1 )
[0030] [化 2]
Gai i-3GlcNAc l-3Galpl-4Glc (2)
4
uc l
[0031] (式中、 Gal、 Glc、 Fucおよび GlcNAcは、それぞれはガラクトース、グルコース、フコ ースおよび N ァセチルダルコサミンを示す。）
[0032] 具体的には、糖 lnmolをねじふた付きガラス反応管に力卩ぇ乾固させた。 500nmol の PBHをメタノール 20 Lに溶解して反応管にカ卩え、さらにメタノールで希釈した酢 酸 (酢酸:メタノール = 1 : 8, vZv) 2 Lを加えてふたを完全に閉めた。よく撹拌後、 80°Cで 20分間カロ熱し、 1Mの NaOH水溶液カ卩えて中和した。 1. 7Mの NaBH溶液
4
30 /z Lをカ卩えて 40°Cで 30分間反応させ、さらに 1. 7Mの NaBH溶液 10 /z Lを加え
4
て 40°Cで 30分間反応させた。純水 400 μ Lおよびクロ口ホルム 400 μ Lを加えてよく 振った後静置した。下層のクロ口ホルムを捨て、新しいクロ口ホルム 400 Lをカロえて もう一度抽出した。上層を取り乾固させた。 Sep-pak C
18カートリッジをメタノール、 続いて純水で洗浄し、乾固した反応物を純水に溶解してカートリッジに通した。純水 でカートリッジを洗浄し、次に、ァセトニトリル一純水（ァセトニトリル：水 = 6 :4, v/v) で溶出することによって、 PBHで標識され還元された LNF— Iおよび LNF— Π (以後 、それぞれ、還元標識 LNF— Iおよび還元標識 LNF— IIと称する）を得た。得られた 還元標識 LNF— Iおよび還元標識 LNF— IIは、遮光して 30°Cにお 、て保存した。 [0033] (実施例 2)
実施例 1で得られた還元標識 LNF— Iおよび還元標識 LNF— IIのそれぞれを純水 に溶解し、それら還元標識糖 lpmolを MALDIターゲットプレートに塗布した。 2, 5 —ジヒドロキシ安息香酸 (DHBA)を 40%ァセトニトリル—純水に溶解させたマトリクス 溶液を、ターゲットプレート上の標識糖溶液と混合し、そして乾固した。 MALDI-T OF MS装置（Axima— CFR plus(Shimadzu/Kratos))を用いて MS分析を行った 。図 1 Aに還元標識 LNF— Iから得られたスペクトルを示し、図 1Bに還元標識 LNF— IIから得られたスペクトルを示す。図 1 Aおよび図 1B力 分力るように、いずれの還元 標識糖からも mZz = 1162. 5である [M + Na] +が十分量検出された。
[0034] 次いで、上記で得られた親イオンをプリカーサ一イオンとして PSD— MSZMS (す なわち MS2)分析を行った。図 2Aに還元標識 LNF— I親イオンカゝら得られたスぺタト ルを示し、図 2Bに還元標識 LNF— II親イオンカゝら得られたスペクトルを示す。図 2A および図 2Bから分かるように、還元標識 LNF— IIからのみ mZz= 1000のイオン（ 図 2Bにおいて、矢印を付して示したピーク）が検出され、還元標識 LNF— Iからは当 該イオンは検出されな力つた。すなわち、この構造特異的に生成したイオンによって 、還元標識 LNF— Iおよび還元標識 LNF— IIの両異性体を区別することができた。
[0035] (実施例 3)
LCポンプに接続した ESI— MS装置 LCQ(Thermo Electron)を用いて、実施例 1で 得られた還元標識 LNF— Iおよび還元標識 LNF— IIのそれぞれの MS分析を行つ た。還元標識 LNF— Iおよび還元標識 LNF— IIのそれぞれは、 50%ァセトニトリル 純水に溶解させて lpmolZmLの溶液とし、該溶液の lmLを ESI— MS装置に注 入した。また、移動相として、 0. 1%TFAを含む純水 Z90%ァセトニトリル—純水（5 0Z50)を用い、移動相の流速は、 3mLZminであった。
[0036] 上記の MS分析で得られた mZz= 1140. 5の親イオン [M+H] +をプリカーサ一 イオンとして選択し、 MSZMS測定を行った。図 3Aに還元標識 LNF— I親イオンか ら得られたスペクトルを示し、図 3Bに還元標識 LNF - II親イオンカゝら得られたスぺク トルを示す。図 3Aおよび図 3B力 分力るように、還元標識 LNF— IIのみから特異的 に、 m/z = 978のイオン（図 3Bにおいて、矢印を付して示したピーク）が検出され、 両異性体を区別することができた。
[0037] (比較例 1)
LNF— Iおよび LNF— Πのそれぞれについて、還元剤 NaBHによる還元を行わな
4
力つたことを除！、て実施例 1の手順を繰り返して、 PBHで標識された標識 LNF— Iお よび標識 LNF— IIを得た。標識 LNF— Iおよび標識 LNF— IIのそれぞれを、実施例 2に記載の手順に従って MALDI— TOF MS分析を行った。しカゝしながら、標識 L NF— Iおよび標識 LNF— II力 得られた親イオンのイオン強度は、還元標識 LNF— Iおよび還元標識 LNF—Πに比較して 1Z10以下であったため、 MSn(n> l)解析を 実施することは困難であった。
[0038] (実施例 4)
以下に示す化合物（3)〜（5)を、実施例 1の方法でピレン誘導体ィ匕合物（PBH)を 用いた還元標識した後に、四重極型イオントラップ (QIT)を装備した MALDI— QIT -TOFMS ( Axima - QIT(Shimadzu/Kratos))を用いて negative— ion MALDI— T OF MSZMS測定を行った。ここで、 2段階目の MS測定においては、各化合物の 親イオンをプリカーサ一イオンとして用いた。
[0039] [化 3]
Gaipi -4G!cNAcpi -2Man«1
X 6
Μ8ηβ1 -4GlcNAc i -4GlcNAc
GalfH -4GlcNAc(31 -2Man«1
Galf31 -4GIcNAc|31 -2Mana1 χ
6
Mant¾1 -4GlcNAcf¾1 -4GlcNAc
Gal(51 -4GIcNAcf31 -4Mana1
パ
Gal 1 -4GlcNAc|31
Gal|31 -4GlcNAc[¾1 \
6
Galpl -4GlcNAc| 1 -2Man 1
Figure imgf000013_0001
Manpl -4Θ!οΝΑο 1 -4GlcNAc
3
Ga)p>1 -4GlcNAc|n -4Mana1 , GaIfi1 -4GlcNAc|31 ,
[0040] (式中、 Manは、マンノースを示す。）
[0041] 図 4〜図 6に、それぞれ化合物（3)〜（5)のフラグメント位置および得られたスぺタト ルを示す (これらの図にぉ 、ては、フラグメント位置を明確にするためにグリコシド結 合の O原子を明示した。以下の図も同様である）。図 4〜6に示されるように、各構造 に特徴的なフラグメントイオンである ' 4A、 2' 4A、 Dおよび Eのタイプのイオンが生成
4 5
した。 negative- MSZMS測定においてこれらのイオンを検出することは、構造同定 に有効である（たとえば、非特許文献 2および 3参照)。たとえば、非特許文献 2にお いては、 2—ァミノ安息香酸を用いて還元標識をおこなっている力 °' 4Aイオンのみ
4 が検出されている。一方、非特許文献 3においては、非標識糖鎖を用いて、 2' 4A、 D
5 および Eイオンが検出されている。それら文献に対して、本発明のピレン誘導体化合 物を用いた還元標識方法を用いることによって、より多くの種類の構造特異的なィォ ンを生成できることが分力 た。したがって、本発明の方法は、ピレン誘導体化合物 を用いる還元標識によって高感度の検出が可能となる点に加えて、構造同定のため により多くの情報量が得られる点において、極めて有用である。
[0042] (実施例 5)
以下に示すィ匕合物（6)を、実施例 1の方法で PBHを用いた還元標識した後に、 M
ALDI - QIT - TOFMS (Axima - QIT(Shimadzu/Kratos))を用 、て negative— ion
MALDI-TOF MSZMS測定を行った。
[0043] [化 4]
Fuc«1 3
Gaip1 ~4GicNAcp1 ヽ
6
Gai|¾1 -4Glc ( 6 )
Fuc l -2Gai|J)1 -3GlcNAc|¾1 '
[0044] ここで、 2段階目の MS測定においては、 mZz (質量 Z電荷比） = 1650の [M— H Γイオンをプリカーサ一イオンとして用いた。図 7に、化合物（6)のフラグメント位置お よび得られたスペクトルを示す。図 7に示したスペクトル中の矢印は、プリカーサーィ オンのピークを示す。図 7に示したスペクトルにおいては、 6位側の側鎖にフコースが 存在することを示す m/z = 570のイオン、および Fuc a l— 0— 2Gal構造が脱離し たことを示す mZz= 1324のイオンが検出された。
[0045] さらに、 mZz = 1138のイオン（3位側の側鎖である Fuc a l ~ 2Gal β 1— 3GlcN Acが脱離したイオン）をプリカーサ一イオンとして用いて、 negative-ion MALDI— T OF MS3測定を行った。図 8に、フラグメント位置および得られたスペクトルを示す。 図 8に示したスペクトル中の矢印は、プリカーサ一イオンのピークを示す。図 8に示し たスペクトルにおいては、 6位側の側鎖にフコースが存在することを示す m/z = 570 のイオンに加えて、 Gal jS 1— 4 (Fuc o; 1— 3) GlcNAc構造が存在するときに生じる mZz = 364のイオンが検出された。
[0046] 以上の negative- ion MALDI-TOF MS,MS測定および negative- ion MALDI
-TOF MS3測定の結果から、化合物（6)の構造を簡単に同定することができた。
[0047] (実施例 6) それぞれ血液型抗原 Hまたは Leaを有し、構造異性体の関係にある LNF— I (化合 物（1) )および LNF— II (化合物（2) )を、還元末端のグルコースではなぐ非還元末 端のガラクトースにピレン誘導体ィ匕合物を導入して標識した。以下に、具体的方法を 示す。最初に、還元末端のグルコースにピレン誘導体化合物の標識が導入されない ようにするために、 LNF— Iおよび LNF— IIを、 2時間にわたって濃度 10mg/mlの 水素化ホウ素ナトリウム溶液中に放置して還元した。次いで、ガラクトースォキシダー ゼ（6単位）をカ卩えて、 37°Cでー晚放置して、ガラクトースを酸ィ匕しアルデヒド基を生 成させた。反応終了後、酵素をメタノールにより変性させた後、フィルターを用いて反 応液を濾過して、酵素を除去した。そして、濾液を乾固させ、実施例 1の方法により、 PBHを用いて残留物を還元標識した。
[0048] この反応生成物を、 M ALDI - QIT - TOFMS ( Axima - QIT(Shimadzu/Kratos) )を用いて負イオンの MS測定を行った。その結果、 mZz= 1138の [M— ΗΓィォ ンが得られ、 LNF— Iおよび LNF— IIの両方が PBHによって還元標識されたことが 確認された。
[0049] さらに得られた mZz = 1138の [M— H]—イオンをプリカーサ一イオンとして用 、て 、 MALDI— QIT— TOFMS (Axima - QIT(Shimadzu/Kratos))を用いて negative- i on MALDI -TOF MSZMS測定を行った。図 9および図 10に、それぞれ LNF— Iおよび LNF— IIに関するフラグメント位置および得られたスペクトルを示す。
[0050] 図 9および図 10から分かるように、 LNF—Iおよび LNF—IIの両方から mZz = 794 . 3のイオンが検出された。このイオンは PBHを用いて還元標識された糖鎖 (FucZ Gal/GlcNAcの 3糖）に由来するものである。このイオンの検出によって、 LNF— I および LNF— IIの両方力 非還元末端にフコースを有するラタトサミン構造を有する ことが分かった。また、図 9に示されるように、 PBH標識された Fuc a l— 2Gal構造が 遊離した mZz = 528. 2のイオンが検出された。実施例 5においても同構造が検出さ れていることから、 PBH還元標識が糖鎖の還元末端であっても、非還元末端であつ ても、該 2糖構造が遊離することが分力つた。さらに、図 10に示されるように、 PBHに より還元標識された LNF—Πからは mZz = 692. 2および 343. 1のイオンが検出さ れた。これらのイオンの検出は、フコースが N—ァセチルダルコサミンと結合している ことを示す。
以上のように、ピレン誘導体化合物を用いて非還元末端にお!、て糖鎖の還元標識 を行うことによって、非還元末端部に存在する血液型抗原の分析が可能となる。また 、糖タンパク質を分析する場合、この方法は、糖鎖を糖タンパク質カゝら遊離させること なしに、糖鎖を還元標識することを可能にする。したがって、この方法は、糖タンパク 質のイオンィ匕効率を向上させるとともに、糖タンパク質のままで糖鎖部分を解析する ことを可能にする。

Claims

請求の範囲 [1] 分子の質量分析法であって、縮合多環炭化水素を有する標識化合物を分子と結 合させて標識された分子を形成する工程と、該標識された分子の MSn(n> l)解析 を行う工程とを備えたことを特徴とする分子の質量分析法。 [2] 前記標識化合物がピレン誘導体化合物であることを特徴とする請求項 1に記載の 質量分析法。 [3] 分子の質量分析法であって、該分子は、糖鎖であり、および (1)該分子の還元末端をヒドラジド基またはアミノ基を有するピレン誘導体化合物で 標識して、標識ィヒ中間体を得る工程と、 (2)標識ィ匕中間体を還元して、還元標識された分子を得る工程と、 (3)該還元標識された分子の MSn (n > 1)解析を行う工程と を備えたことを特徴とする分子の質量分析法。 [4] 分子の質量分析法であって、該分子は、糖鎖および糖タンパク質力も成る群力も選 択され、および
(1)該分子中の糖鎖部分のみを酸ィ匕して、酸化生成物を得る工程と、
(2)酸化生成物をヒドラジド基またはアミノ基を有するピレン誘導体化合物で標識して 、標識ィ匕中間体を得る工程と、
(3)標識ィ匕中間体を還元して、還元標識された分子を得る工程と、
(4)該還元標識された分子の MSn (n > 1)解析を行う工程と
を備えたことを特徴とする分子の質量分析法。
[5] 分子の質量分析法であって、該分子は、タンパク質および糖タンパク質力も成る群 から選択され、および
(1)該分子内のカルボキシ基、アミノ基または SH基を利用して、該分子をピレン誘導 体化合物で標識し、標識された分子を得る工程と、
(2)該標識された分子の MSn (n > 1)解析を行う工程と
を備えたことを特徴とする分子の質量分析法。
[6] 請求項 1から 5の 、ずれかに記載の質量分析法によって得られるスペクトル。
[7] 請求項 6に記載のスペクトル力 得られる情報。 [8] 請求項 7に記載の情報を集積したデータ集積体。
PCT/JP2006/305800 2005-03-31 2006-03-23 質量分析法 WO2006109485A1 (ja)

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