JPH08145949A - 還元性オリゴ糖の質量分析法 - Google Patents
還元性オリゴ糖の質量分析法Info
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- JPH08145949A JPH08145949A JP6291230A JP29123094A JPH08145949A JP H08145949 A JPH08145949 A JP H08145949A JP 6291230 A JP6291230 A JP 6291230A JP 29123094 A JP29123094 A JP 29123094A JP H08145949 A JPH08145949 A JP H08145949A
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- reducible
- reducing
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Abstract
(57)【要約】
【構成】還元性オリゴ糖の還元末端に４−アミノ安息香
酸アルキルエステルを作用させて得られうるオリゴ糖を
大気圧イオン化法によってイオン化する工程を含むこと
を特徴とする還元性オリゴ糖の質量分析法、および該質
量分析法による質量スペクトルの情報から還元性オリゴ
糖の構造を解析することを特徴とする還元性オリゴ糖の
分析方法。 【効果】本発明質量分析法により、極めて微量な試料の
場合においても、還元性オリゴ糖の検出および分子量の
確認が可能になった。また、該分析法による質量スペク
トルの情報から還元性オリゴ糖の構造を容易に解析する
ことができるようになった。
酸アルキルエステルを作用させて得られうるオリゴ糖を
大気圧イオン化法によってイオン化する工程を含むこと
を特徴とする還元性オリゴ糖の質量分析法、および該質
量分析法による質量スペクトルの情報から還元性オリゴ
糖の構造を解析することを特徴とする還元性オリゴ糖の
分析方法。 【効果】本発明質量分析法により、極めて微量な試料の
場合においても、還元性オリゴ糖の検出および分子量の
確認が可能になった。また、該分析法による質量スペク
トルの情報から還元性オリゴ糖の構造を容易に解析する
ことができるようになった。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、還元性オリゴ糖の質量
分析法およびその利用に関するものである。
分析法およびその利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】還元性オリゴ糖とは、重合度（ＤＰ）２
から数１０程度までの糖であって、その末端に位置する
構成単糖のアノマー炭素原子が置換を受けていない糖
（したがって、アルカリ溶液で還元性を有する）をい
う。このような還元性オリゴ糖が有する構造は、極めて
多様でかつ複雑である。近年、糖鎖関連化合物が有する
糖鎖が、生体の分化、増殖、受精、免疫や細胞、ウィル
ス、細菌等との相互作用に関与することが明らかになっ
てきており、この糖鎖を医薬品として利用しようという
研究が盛んになってきている。これは、糖鎖における多
様な構造が種々の生理作用、機能と深く関連するためで
あり、このため、その糖鎖の構造を明らかにすることは
極めて重要である。そこで最近では、質量分析法を利用
することによって還元性オリゴ糖を高感度で分析する方
法が用いられるようになってきた。
から数１０程度までの糖であって、その末端に位置する
構成単糖のアノマー炭素原子が置換を受けていない糖
（したがって、アルカリ溶液で還元性を有する）をい
う。このような還元性オリゴ糖が有する構造は、極めて
多様でかつ複雑である。近年、糖鎖関連化合物が有する
糖鎖が、生体の分化、増殖、受精、免疫や細胞、ウィル
ス、細菌等との相互作用に関与することが明らかになっ
てきており、この糖鎖を医薬品として利用しようという
研究が盛んになってきている。これは、糖鎖における多
様な構造が種々の生理作用、機能と深く関連するためで
あり、このため、その糖鎖の構造を明らかにすることは
極めて重要である。そこで最近では、質量分析法を利用
することによって還元性オリゴ糖を高感度で分析する方
法が用いられるようになってきた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】これまでに開発された
還元性オリゴ糖の質量分析法としては、例えば、還元性
オリゴ糖をメチル誘導体、アセチル誘導体、２−アミノ
ピリジン（ＰＡ）誘導体等の各種誘導体に導いた後、高
速原子衝撃イオン化（ＦＡＢ）法でイオン化することに
よって質量分析する手法が知られているが、多様でかつ
複雑な構造を有する還元性オリゴ糖を分析するには、こ
れらの最新の方法においても未だ感度的に十分でなく、
また得られる構造に関する有益な情報が少ない等の点で
必ずしも満足できるものではなかった。
還元性オリゴ糖の質量分析法としては、例えば、還元性
オリゴ糖をメチル誘導体、アセチル誘導体、２−アミノ
ピリジン（ＰＡ）誘導体等の各種誘導体に導いた後、高
速原子衝撃イオン化（ＦＡＢ）法でイオン化することに
よって質量分析する手法が知られているが、多様でかつ
複雑な構造を有する還元性オリゴ糖を分析するには、こ
れらの最新の方法においても未だ感度的に十分でなく、
また得られる構造に関する有益な情報が少ない等の点で
必ずしも満足できるものではなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは鋭意検討を行った結果、微量な試料の場合にお
いても、還元性オリゴ糖の還元末端にある種の試薬を作
用させて得られうるオリゴ糖を特定なイオン化法によっ
てイオン化し、該イオン化により生成する分子イオン及
び多数のフラグメントイオンを質量数／電荷数（ｍ／
ｚ）に従って分離し、各イオンの強度を記録してｍ／ｚ
の順序に並べた質量スペクトルから有益な情報が得られ
ることを見い出し、該情報から還元性オリゴ糖の構造を
より確実に解析することができることを見い出し、本発
明を完成した。すなわち、本発明は、還元性オリゴ糖の
還元末端に４−アミノ安息香酸アルキルエステルを作用
させて得られうるオリゴ糖を大気圧イオン化法によって
イオン化する工程を含むことを特徴とする還元性オリゴ
糖の質量分析法（以下、本発明質量分析法と記す。）、
さらに該質量分析法による質量スペクトルの情報から還
元性オリゴ糖の構造を解析することを特徴とする還元性
オリゴ糖の分析方法を提供するものである。
明者らは鋭意検討を行った結果、微量な試料の場合にお
いても、還元性オリゴ糖の還元末端にある種の試薬を作
用させて得られうるオリゴ糖を特定なイオン化法によっ
てイオン化し、該イオン化により生成する分子イオン及
び多数のフラグメントイオンを質量数／電荷数（ｍ／
ｚ）に従って分離し、各イオンの強度を記録してｍ／ｚ
の順序に並べた質量スペクトルから有益な情報が得られ
ることを見い出し、該情報から還元性オリゴ糖の構造を
より確実に解析することができることを見い出し、本発
明を完成した。すなわち、本発明は、還元性オリゴ糖の
還元末端に４−アミノ安息香酸アルキルエステルを作用
させて得られうるオリゴ糖を大気圧イオン化法によって
イオン化する工程を含むことを特徴とする還元性オリゴ
糖の質量分析法（以下、本発明質量分析法と記す。）、
さらに該質量分析法による質量スペクトルの情報から還
元性オリゴ糖の構造を解析することを特徴とする還元性
オリゴ糖の分析方法を提供するものである。
【０００５】以下、さらに詳細に本発明を説明する。ま
ず、分析目的である還元性オリゴ糖は、大気圧イオン化
法による質量分析に適するように、その還元末端に４−
アミノ安息香酸アルキルエステルを作用させる前処理を
行う。該前処理は、還元性オリゴ糖、４−アミノ安息香
酸アルキルエステル及び還元剤を通常溶媒に混合して反
応を行う。本反応に用いられる溶媒としては、たとえ
ば、メタノール、エタノール等のアルコールと水、ある
いは酢酸等の有機酸と水、との混合溶媒等があげられ
る。ここで混合される水の量は、還元性オリゴ糖を溶解
させるのに必要な少量の水を意味し、例えば、１０％
（容量比）程度以下になるような量をあげることができ
る。本反応に用いられる４−アミノ安息香酸アルキルエ
ステルとしては、例えば、４−アミノ安息香酸メチルエ
ステル、４−アミノ安息香酸エチルエステル等をあげる
ことができる。該試薬の量は、還元性オリゴ糖に対し
て、大過剰量、好ましくは約４００倍モル量から約５０
０倍モル量である。また、還元剤としては、例えば、シ
アン化水素化ホウ素ナトリウム等を用いることができ
る。シアン化水素化ホウ素ナトリウムの場合、還元性オ
リゴ糖に対して、約２００倍モル量から約３００倍モル
量、好ましくは約２４０倍モル量から約２６０倍モル量
を使用するとよい。上記処理温度は、通常約７０℃から
約９０℃、好ましくは約７５℃から約８５℃の範囲であ
り、処理時間は通常約１５分間から約９０分間である。
処理終了後は、クロロホルム等の有機溶媒により未反応
４−アミノ安息香酸アルキルエステルを抽出除去し、減
圧下で濃縮（例えば、凍結乾燥等の方法）することによ
り、所望の誘導体を得ることができる。また、必要に応
じて、再結晶、クロマトグラフィー等の通常の方法によ
りさらに精製することもできる。
ず、分析目的である還元性オリゴ糖は、大気圧イオン化
法による質量分析に適するように、その還元末端に４−
アミノ安息香酸アルキルエステルを作用させる前処理を
行う。該前処理は、還元性オリゴ糖、４−アミノ安息香
酸アルキルエステル及び還元剤を通常溶媒に混合して反
応を行う。本反応に用いられる溶媒としては、たとえ
ば、メタノール、エタノール等のアルコールと水、ある
いは酢酸等の有機酸と水、との混合溶媒等があげられ
る。ここで混合される水の量は、還元性オリゴ糖を溶解
させるのに必要な少量の水を意味し、例えば、１０％
（容量比）程度以下になるような量をあげることができ
る。本反応に用いられる４−アミノ安息香酸アルキルエ
ステルとしては、例えば、４−アミノ安息香酸メチルエ
ステル、４−アミノ安息香酸エチルエステル等をあげる
ことができる。該試薬の量は、還元性オリゴ糖に対し
て、大過剰量、好ましくは約４００倍モル量から約５０
０倍モル量である。また、還元剤としては、例えば、シ
アン化水素化ホウ素ナトリウム等を用いることができ
る。シアン化水素化ホウ素ナトリウムの場合、還元性オ
リゴ糖に対して、約２００倍モル量から約３００倍モル
量、好ましくは約２４０倍モル量から約２６０倍モル量
を使用するとよい。上記処理温度は、通常約７０℃から
約９０℃、好ましくは約７５℃から約８５℃の範囲であ
り、処理時間は通常約１５分間から約９０分間である。
処理終了後は、クロロホルム等の有機溶媒により未反応
４−アミノ安息香酸アルキルエステルを抽出除去し、減
圧下で濃縮（例えば、凍結乾燥等の方法）することによ
り、所望の誘導体を得ることができる。また、必要に応
じて、再結晶、クロマトグラフィー等の通常の方法によ
りさらに精製することもできる。
【０００６】上記のように調製されたオリゴ糖を、大気
圧イオン化法のインターフェイスを装備した質量分析計
に導入することによって質量分析する。本発明で用いら
れる大気圧イオン化法としては、例えば、エレクトロス
プレー・イオン化法あるいはイオンスプレー・イオン化
法等をあげることができる。そして市販のインターフェ
イス（エレクトロスプレー・イオン化法）としては、例
えば、Finnigan Mat社製のＡＰＩ用インターフェイスが
あげられる。また、質量分析計としては、磁場型、四重
極型、イオントラップ型、フーリエ変換−イオンサイク
ロトロン共鳴型等の質量分析計をあげることができる
が、好ましくは、四重極型質量分析計をあげることがで
きる。より好ましくは、タンデム型の四重極型質量分析
計があげられる。なお、市販の四重極型質量分析計とし
ては、例えば、ＴＳＱ−７００型クロマトグラフィー・
タンデム型質量分析計（Finnigan Mat社製）等があげら
れる。試料を、大気圧イオン化法のインターフェイスを
装備した質量分析計に導入する方法としては、例えば、
高速液体クロマトグラフィー、シリンジポンプ等をあげ
ることができる。好ましくはシリンジポンプを用いるこ
とがよい。
圧イオン化法のインターフェイスを装備した質量分析計
に導入することによって質量分析する。本発明で用いら
れる大気圧イオン化法としては、例えば、エレクトロス
プレー・イオン化法あるいはイオンスプレー・イオン化
法等をあげることができる。そして市販のインターフェ
イス（エレクトロスプレー・イオン化法）としては、例
えば、Finnigan Mat社製のＡＰＩ用インターフェイスが
あげられる。また、質量分析計としては、磁場型、四重
極型、イオントラップ型、フーリエ変換−イオンサイク
ロトロン共鳴型等の質量分析計をあげることができる
が、好ましくは、四重極型質量分析計をあげることがで
きる。より好ましくは、タンデム型の四重極型質量分析
計があげられる。なお、市販の四重極型質量分析計とし
ては、例えば、ＴＳＱ−７００型クロマトグラフィー・
タンデム型質量分析計（Finnigan Mat社製）等があげら
れる。試料を、大気圧イオン化法のインターフェイスを
装備した質量分析計に導入する方法としては、例えば、
高速液体クロマトグラフィー、シリンジポンプ等をあげ
ることができる。好ましくはシリンジポンプを用いるこ
とがよい。
【０００７】このようにして、還元性オリゴ糖の還元末
端に４−アミノ安息香酸アルキルエステルを作用させて
得られうるオリゴ糖を大気圧イオン化法によってイオン
化し、該イオン化により生成する分子イオン及び多数の
フラグメントイオンを質量数／電荷数（ｍ／ｚ）に従っ
て分離し、各イオンの強度を記録してｍ／ｚの順序に並
べた質量スペクトルの有益な情報（例えば、還元末端側
の各々のフラグメントイオンの質量差）から還元性オリ
ゴ糖の構造（例えば、構成単糖の配列）を解析すること
ができる。さらに必要に応じて、酵素や抗体を用いる生
化学的手法やＮＭＲ等のスペクトルによる解析手法、そ
の他の構成単糖成分分析手法等による解析を相補的に用
いると一層確実な構造解析が可能になる。また、従来の
質量分析方法による質量スペクトルでは、マトリクスや
不純物のイオンが混在することから解析が難しくなる場
合があったが、本発明質量分析法による質量スペクトル
では、プロダクトイオンを表すシグナルピークが明瞭に
なるために解析が容易になる。これは未知な還元性オリ
ゴ糖の構造解析上きわめて有用なことである。
端に４−アミノ安息香酸アルキルエステルを作用させて
得られうるオリゴ糖を大気圧イオン化法によってイオン
化し、該イオン化により生成する分子イオン及び多数の
フラグメントイオンを質量数／電荷数（ｍ／ｚ）に従っ
て分離し、各イオンの強度を記録してｍ／ｚの順序に並
べた質量スペクトルの有益な情報（例えば、還元末端側
の各々のフラグメントイオンの質量差）から還元性オリ
ゴ糖の構造（例えば、構成単糖の配列）を解析すること
ができる。さらに必要に応じて、酵素や抗体を用いる生
化学的手法やＮＭＲ等のスペクトルによる解析手法、そ
の他の構成単糖成分分析手法等による解析を相補的に用
いると一層確実な構造解析が可能になる。また、従来の
質量分析方法による質量スペクトルでは、マトリクスや
不純物のイオンが混在することから解析が難しくなる場
合があったが、本発明質量分析法による質量スペクトル
では、プロダクトイオンを表すシグナルピークが明瞭に
なるために解析が容易になる。これは未知な還元性オリ
ゴ糖の構造解析上きわめて有用なことである。
【０００８】以下、実施例により詳細に説明するが、本
発明はこれに限定されるものではない。
発明はこれに限定されるものではない。
実施例１ 〔４−アミノ安息香酸エチルエステルを用い
る還元性オリゴ糖の前処理方法〕 Wangらの方法（W.T.Wang,N.C.LeDonne Jr,B.Ackerman &
C.C.Sweeley;Anal.Chem.,141,366-381(1984) ）に準じ
て行った。還元性オリゴ糖４ｍｇ（４．４μｍｏｌ相当
量）に純水４０μｌを加えて混合した後、この混合液に
１６０μｌの反応液〔４−アミノ安息香酸エチル（ＡＢ
ＥＥ）：３３０ｍｇ，シアノ水素化ホウ素ナトリウム：
７０ｍｇ，酢酸：８２μｌ，メタノール：７００μｌか
らなる混合液〕を添加し、８０℃３０分間反応を行なっ
た。反応終了後、純水１ｍｌを加え、クロロホルム１ｍ
ｌで未反応ＡＢＥＥを抽出除去した。回収した純水画分
を凍結乾燥した後、分取用液体クロマトグラフィー 試料量：10μｌ，10mg/ml Ｈ2 Ｏ カラム：Asahipak ＮＨ2 Ｐ−５０（4.6mm 径Ｘ25cmL,
５μｍ） カラム温度：室温 移動相：AcCN-H2O（リニヤーグラジエント：5% H2Oから
100%H2O,30min ） 流量：１．０ml/min 検出：ＵＶ 254nm による精製を行うことによって、ＡＢＥＥによる誘導体
（化１）を得た。
る還元性オリゴ糖の前処理方法〕 Wangらの方法（W.T.Wang,N.C.LeDonne Jr,B.Ackerman &
C.C.Sweeley;Anal.Chem.,141,366-381(1984) ）に準じ
て行った。還元性オリゴ糖４ｍｇ（４．４μｍｏｌ相当
量）に純水４０μｌを加えて混合した後、この混合液に
１６０μｌの反応液〔４−アミノ安息香酸エチル（ＡＢ
ＥＥ）：３３０ｍｇ，シアノ水素化ホウ素ナトリウム：
７０ｍｇ，酢酸：８２μｌ，メタノール：７００μｌか
らなる混合液〕を添加し、８０℃３０分間反応を行なっ
た。反応終了後、純水１ｍｌを加え、クロロホルム１ｍ
ｌで未反応ＡＢＥＥを抽出除去した。回収した純水画分
を凍結乾燥した後、分取用液体クロマトグラフィー 試料量：10μｌ，10mg/ml Ｈ2 Ｏ カラム：Asahipak ＮＨ2 Ｐ−５０（4.6mm 径Ｘ25cmL,
５μｍ） カラム温度：室温 移動相：AcCN-H2O（リニヤーグラジエント：5% H2Oから
100%H2O,30min ） 流量：１．０ml/min 検出：ＵＶ 254nm による精製を行うことによって、ＡＢＥＥによる誘導体
（化１）を得た。
【化１】
【０００９】実施例２ （各種の質量分析法による還元
性オリゴ糖の分析） 還元性オリゴ糖としてマルトペンタオースを用いた。該
還元性オリゴ糖を（１）ヨウ化メチルによる誘導化、
（２）酢酸による誘導化、（３）４−アミノ安息香酸エ
チルエステル（以下、ＡＢＥＥと記す。）による誘導
化、または（４）２−アミノピリジン（以下、ＰＡと記
す。）による誘導化で得られるメチル誘導体、アセチル
誘導体、、ＡＢＥＥによる誘導体、またはＰＡによる誘
導体を調製〔（３）の誘導化方法は実施例１に記載し
た。また（３）以外の誘導化方法は下記の参考例に記載
した。〕し、調製された各種誘導体および非誘導化マル
トペンタオースを高速原子衝撃イオン化（ＦＡＢ）法
〔正・負モード〕あるいはエレクトロスプレー・イオン
化（ＥＳＩ）法〔正モード・負モード〕によって質量分
析した。そして、調製された各種誘導体および非誘導化
マルトペンタオースの各イオン化法におけるイオン化効
率を比較した。その結果を表１（非誘導化マルトペンタ
オースを試料にした場合のイオン化効率に対する各種誘
導体のイオン化効率の比で表す。）に示す。表１から明
らかなように、本発明質量分析法は他質量分析法に比較
して顕著な感度向上（特に非誘導化マルトペンタオース
−ＥＳＩ法との比較において正及び負の両モードとも約
５００倍程度向上）が認められた。そして本発明質量分
析法では、0.5-１pmolという微量でも明瞭なスペクトル
が得られることが判った。
性オリゴ糖の分析） 還元性オリゴ糖としてマルトペンタオースを用いた。該
還元性オリゴ糖を（１）ヨウ化メチルによる誘導化、
（２）酢酸による誘導化、（３）４−アミノ安息香酸エ
チルエステル（以下、ＡＢＥＥと記す。）による誘導
化、または（４）２−アミノピリジン（以下、ＰＡと記
す。）による誘導化で得られるメチル誘導体、アセチル
誘導体、、ＡＢＥＥによる誘導体、またはＰＡによる誘
導体を調製〔（３）の誘導化方法は実施例１に記載し
た。また（３）以外の誘導化方法は下記の参考例に記載
した。〕し、調製された各種誘導体および非誘導化マル
トペンタオースを高速原子衝撃イオン化（ＦＡＢ）法
〔正・負モード〕あるいはエレクトロスプレー・イオン
化（ＥＳＩ）法〔正モード・負モード〕によって質量分
析した。そして、調製された各種誘導体および非誘導化
マルトペンタオースの各イオン化法におけるイオン化効
率を比較した。その結果を表１（非誘導化マルトペンタ
オースを試料にした場合のイオン化効率に対する各種誘
導体のイオン化効率の比で表す。）に示す。表１から明
らかなように、本発明質量分析法は他質量分析法に比較
して顕著な感度向上（特に非誘導化マルトペンタオース
−ＥＳＩ法との比較において正及び負の両モードとも約
５００倍程度向上）が認められた。そして本発明質量分
析法では、0.5-１pmolという微量でも明瞭なスペクトル
が得られることが判った。
【００１０】
【表１】 ──────────────────────────────────── ＦＡＢ ＥＳＩ 備考 正 負 正 負 ──────────────────────────────────── メチル誘導体 １１ ０．１ − − アセチル誘導体 ６０ ０．１ − − ＡＢＥＥによる誘導 ５ ５ ４５０ ５００ 本発明 ＰＡによる誘導体 ３ １ １００ ３０ 非誘導化マルトペンタオース １ １ １ １ ────────────────────────────────────
【００１１】実施例３ （ＡＢＥＥによる誘導体の質量
分析による質量スペクトルの情報に基づく構造解析） 実施例１によって得られるＡＢＥＥによる誘導体をＥＳ
Ｉ用インターフェースでイオン化させた際に生じる１価
イオンを親イオンとしたプロダクトイオンの質量スペク
トルを測定した。正イオンモードでの質量スペクトルを
図１に、負イオンモードでの質量スペクトルを図２に示
す。その結果、正イオンモードでの質量スペクトル（図
１）には、還元性オリゴ糖の還元末端からの構造情報を
有するＹシリーズ（図３および図５参照）のシークエン
スイオンを表すシグナルピークが認められ、上記シーク
エンスイオン間の質量差から、分子イオン〔ＭＨ+ 〕か
らヘキソース単位での脱離が生じるという化学構造上で
の情報を得ることができた（表２および図１参照）。一
方、負イオンモードでの質量スペクトル（図２）には、
還元性オリゴ糖の還元末端からの構造情報を有するＺシ
リーズ（図４および図５参照）のシークエンスイオンを
表すシグナルピークが認められ、上記シークエンスイオ
ン間の質量差から、分子イオン〔Ｚ2 +TFA〕- からヘキ
ソース単位での脱離が生じるという化学構造上での情報
を得ることができた（表２および図２参照）。また該ス
ペクトルには、非還元性オリゴ糖の還元末端からの構造
情報を有する2,4 Ａシリーズ（図４および図５参照）の
シークエンスイオンを表すシグナルピークも認められ、
上記シークエンスイオン間の質量差から、分子イオン
〔Ｍ−Ｈ〕- からヘキソース単位での脱離が生じるとい
う化学構造上での情報を数多く得ることができた（表３
および図２参照）。以上のような有益な情報から還元性
オリゴ糖の構造を解析することが可能である。一方、Ａ
ＢＥＥによる誘導体以外の実施例２に記載される誘導体
について、上記と同様な方法によって質量スペクトルを
測定したが、多くの情報を含む質量スペクトルを得るこ
とができず、化学構造上での情報の有益さという点で劣
った。
分析による質量スペクトルの情報に基づく構造解析） 実施例１によって得られるＡＢＥＥによる誘導体をＥＳ
Ｉ用インターフェースでイオン化させた際に生じる１価
イオンを親イオンとしたプロダクトイオンの質量スペク
トルを測定した。正イオンモードでの質量スペクトルを
図１に、負イオンモードでの質量スペクトルを図２に示
す。その結果、正イオンモードでの質量スペクトル（図
１）には、還元性オリゴ糖の還元末端からの構造情報を
有するＹシリーズ（図３および図５参照）のシークエン
スイオンを表すシグナルピークが認められ、上記シーク
エンスイオン間の質量差から、分子イオン〔ＭＨ+ 〕か
らヘキソース単位での脱離が生じるという化学構造上で
の情報を得ることができた（表２および図１参照）。一
方、負イオンモードでの質量スペクトル（図２）には、
還元性オリゴ糖の還元末端からの構造情報を有するＺシ
リーズ（図４および図５参照）のシークエンスイオンを
表すシグナルピークが認められ、上記シークエンスイオ
ン間の質量差から、分子イオン〔Ｚ2 +TFA〕- からヘキ
ソース単位での脱離が生じるという化学構造上での情報
を得ることができた（表２および図２参照）。また該ス
ペクトルには、非還元性オリゴ糖の還元末端からの構造
情報を有する2,4 Ａシリーズ（図４および図５参照）の
シークエンスイオンを表すシグナルピークも認められ、
上記シークエンスイオン間の質量差から、分子イオン
〔Ｍ−Ｈ〕- からヘキソース単位での脱離が生じるとい
う化学構造上での情報を数多く得ることができた（表３
および図２参照）。以上のような有益な情報から還元性
オリゴ糖の構造を解析することが可能である。一方、Ａ
ＢＥＥによる誘導体以外の実施例２に記載される誘導体
について、上記と同様な方法によって質量スペクトルを
測定したが、多くの情報を含む質量スペクトルを得るこ
とができず、化学構造上での情報の有益さという点で劣
った。
【００１２】
【表２】 ──────────────────────────────────── Ｙシリーズのプロダクトイオン Ｚシリーズのプロダクトイオン ｍ／Ｚ ピーク差 ｍ／Ｚ ピーク差 ──────────────────────────────────── 〔ＭＨ+ 〕 978.1 − Ｙ4 815.8 162.3 Ｙ3 653.7 162.1 Ｙ2 492.0 161.7 [ Ｚ2 +TFA] - 586.7 − Ｙ1 329.9 162.1 [ Ｚ1 +TFA] - 424.7 162.0 ───────────────────────────────────
【００１３】
【表３】
【００１４】参考例 （還元性オリゴ糖における各種の
前処理方法） 還元性オリゴ糖としてマルトペンタオースを用いた。 （Ａ）ヨウ化メチルによる誘導化方法 Ciucanu とKerek の方法[ I.Ciucanu and F.Kerek,Carb
ohydrate Research,131,209(1984)]に準じて行った。還
元性オリゴ糖５０ｍｇ（０．２８ｍｍｏｌ相当量）にＤ
ＭＳＯ１ｍｌを加えて混合した後、この混合液に２００
ｍｇの粉末状NaOH（あるいは３００ｍｇの粉末状KOH ）
を添加した。該混合液を攪拌しながらヨウ化メチル１ｍ
ｌを加えた後、３０分間（KOH の場合には６０分間）攪
拌を続けた。反応終了後、純水１ｍｌを加え、クロロホ
ルム１ｍｌで３回抽出した。回収したクロロホルム画分
を純水１ｍｌで３回洗浄した後、該クロロホルム画分を
濃縮し、目的とするメチル誘導体（化２）を得た。
前処理方法） 還元性オリゴ糖としてマルトペンタオースを用いた。 （Ａ）ヨウ化メチルによる誘導化方法 Ciucanu とKerek の方法[ I.Ciucanu and F.Kerek,Carb
ohydrate Research,131,209(1984)]に準じて行った。還
元性オリゴ糖５０ｍｇ（０．２８ｍｍｏｌ相当量）にＤ
ＭＳＯ１ｍｌを加えて混合した後、この混合液に２００
ｍｇの粉末状NaOH（あるいは３００ｍｇの粉末状KOH ）
を添加した。該混合液を攪拌しながらヨウ化メチル１ｍ
ｌを加えた後、３０分間（KOH の場合には６０分間）攪
拌を続けた。反応終了後、純水１ｍｌを加え、クロロホ
ルム１ｍｌで３回抽出した。回収したクロロホルム画分
を純水１ｍｌで３回洗浄した後、該クロロホルム画分を
濃縮し、目的とするメチル誘導体（化２）を得た。
【化２】 （Ｂ）酢酸による誘導化による誘導化方法 Dellらの方法[ A.Dell and P.R.Tiller,Biochem.Biophy
s.Res.Commun.,135,1126(1986)] に準じて行った。還元
性オリゴ糖１０ｍｇ（０．０１１ｍｍｏｌ相当量）に無
水トリフルオロ酢酸：酢酸（２：１） ５００μｌを加
えて混合した後、この混合液を室温下で６０分間攪拌し
た。反応終了後、窒素ガスを流して溶媒を蒸発させた。
残渣からのジクロロメタン２ｍｌによる３回抽出で回収
された抽出液を純水１ｍｌで洗浄した後、該ジクロロメ
タン画分を回収した。回収されたジクロロメタン画分に
窒素ガスを流して溶媒を蒸発させることによって、目的
とするアセチル誘導体（化３）を得た。
s.Res.Commun.,135,1126(1986)] に準じて行った。還元
性オリゴ糖１０ｍｇ（０．０１１ｍｍｏｌ相当量）に無
水トリフルオロ酢酸：酢酸（２：１） ５００μｌを加
えて混合した後、この混合液を室温下で６０分間攪拌し
た。反応終了後、窒素ガスを流して溶媒を蒸発させた。
残渣からのジクロロメタン２ｍｌによる３回抽出で回収
された抽出液を純水１ｍｌで洗浄した後、該ジクロロメ
タン画分を回収した。回収されたジクロロメタン画分に
窒素ガスを流して溶媒を蒸発させることによって、目的
とするアセチル誘導体（化３）を得た。
【化３】 （Ｃ）２−アミノピリジンによる誘導化方法 近藤らの方法[ A.Kondo,J.Suzuki,N.Kuraya,S.Hase,I.K
ate,T.Ikenaka,Agric.Biol.Chem.,54,2169(1990)] に準
じて行った。なお、本誘導化は市販キット（Takara Pal
Station Pyridyl amination reagent :糖鎖分析用）及
び市販装置（Takara Pal Station モデル4000：糖鎖ピ
リジルアミノ化自動装置）を用いて行った。還元性オリ
ゴ糖４５ｎｇ−４５μｇ（５０ｐｍｏｌ−５０ｎｍｏｌ
相当量）にカップリング試薬（2-Aminopyridine/酢酸：
3mg/ml）２０μｌを加え、９０℃で６０分間反応した。
反応終了後、該反応混合物に還元試薬（Borane-dimethy
lamine complex／酢酸）２０μｌを添加し、８０℃、６
０分間反応した。反応終了後、トリエチルアミン／メタ
ノール２０μｌおよびトルエン４０μｌを加えて混合し
た後、この混合液に窒素ガスを流しながら、６０℃で１
０分間減圧下で乾固した。得られた残渣にメタノール２
０μｌおよびトルエン４０μｌを加えて再び混合した
後、この混合物に窒素ガスを流しながら、６０℃で１０
分間減圧下で乾固した。得られた残渣にトルエン５０μ
ｌを加えて再び混合した後、この混合物に窒素ガスを流
しながら、６０℃で１０分間減圧下で乾固することによ
って、ＰＡによる誘導体（化４）を得た。
ate,T.Ikenaka,Agric.Biol.Chem.,54,2169(1990)] に準
じて行った。なお、本誘導化は市販キット（Takara Pal
Station Pyridyl amination reagent :糖鎖分析用）及
び市販装置（Takara Pal Station モデル4000：糖鎖ピ
リジルアミノ化自動装置）を用いて行った。還元性オリ
ゴ糖４５ｎｇ−４５μｇ（５０ｐｍｏｌ−５０ｎｍｏｌ
相当量）にカップリング試薬（2-Aminopyridine/酢酸：
3mg/ml）２０μｌを加え、９０℃で６０分間反応した。
反応終了後、該反応混合物に還元試薬（Borane-dimethy
lamine complex／酢酸）２０μｌを添加し、８０℃、６
０分間反応した。反応終了後、トリエチルアミン／メタ
ノール２０μｌおよびトルエン４０μｌを加えて混合し
た後、この混合液に窒素ガスを流しながら、６０℃で１
０分間減圧下で乾固した。得られた残渣にメタノール２
０μｌおよびトルエン４０μｌを加えて再び混合した
後、この混合物に窒素ガスを流しながら、６０℃で１０
分間減圧下で乾固した。得られた残渣にトルエン５０μ
ｌを加えて再び混合した後、この混合物に窒素ガスを流
しながら、６０℃で１０分間減圧下で乾固することによ
って、ＰＡによる誘導体（化４）を得た。
【化４】
【００１５】
【発明の効果】本発明質量分析法により、極めて微量な
試料の場合においても、還元性オリゴ糖の検出および分
子量の確認が可能になった。また、該分析法による質量
スペクトルの有益な情報から還元性オリゴ糖の構造を解
析することができるようになった。
試料の場合においても、還元性オリゴ糖の検出および分
子量の確認が可能になった。また、該分析法による質量
スペクトルの有益な情報から還元性オリゴ糖の構造を解
析することができるようになった。
【図１】ＡＢＥＥによる誘導体をＥＳＩ用インターフェ
ースでイオン化させた際に生じる１価イオン〔Ｍ＋Ｈ〕
+ を親イオンとしたプロダクトイオンに関する正モード
における質量スペクトルを示す図である。
ースでイオン化させた際に生じる１価イオン〔Ｍ＋Ｈ〕
+ を親イオンとしたプロダクトイオンに関する正モード
における質量スペクトルを示す図である。
【図２】ＡＢＥＥによる誘導体をＥＳＩ用インターフェ
ースでイオン化させた際に生じる１価イオン〔Ｍ−Ｈ〕
+ を親イオンとしたプロダクトイオンに関する負モード
における質量スペクトルを示す図である。
ースでイオン化させた際に生じる１価イオン〔Ｍ−Ｈ〕
+ を親イオンとしたプロダクトイオンに関する負モード
における質量スペクトルを示す図である。
【図３】ＡＢＥＥによる誘導体の還元末端からの構造情
報を有するＹシリーズのシークエンスイオンに関する化
学構造式を示す図である。ここで「Ｙ」とは、Ｙシリー
ズのプロダクトイオンを意味する。
報を有するＹシリーズのシークエンスイオンに関する化
学構造式を示す図である。ここで「Ｙ」とは、Ｙシリー
ズのプロダクトイオンを意味する。
【図４】ＡＢＥＥによる誘導体の還元末端からの構造情
報を有するＺシリーズ、及び非還元末端からの構造情報
を有する2 ,4 Ａ、Ｃシリーズのシークエンスイオンに
関する化学構造式を示す図である。ここで「Ｙ」とは、
Ｙシリーズのプロダクトイオンを意味し、
「2 ,4 -Ａ」、「Ｃ」とは、2 ,4 Ａ、Ｃシリーズのプ
ロダクトイオンを意味する。
報を有するＺシリーズ、及び非還元末端からの構造情報
を有する2 ,4 Ａ、Ｃシリーズのシークエンスイオンに
関する化学構造式を示す図である。ここで「Ｙ」とは、
Ｙシリーズのプロダクトイオンを意味し、
「2 ,4 -Ａ」、「Ｃ」とは、2 ,4 Ａ、Ｃシリーズのプ
ロダクトイオンを意味する。
【図５】質量分析スペクトルにおける還元性オリゴ糖の
各フラグメントイオンに関する系統的な命名法を表す図
である。非還元末端側に電荷を有するフラグメントイオ
ンはＡ，Ｂ，Ｃと名付け、還元末端側に電荷を有するフ
ラグメントイオンはＸ，Ｙ，Ｚとする。ＡとＸは環開裂
を示すフラグメントイオンで、コンマで区切った上付き
文字により開裂した２本の結合を示す。
各フラグメントイオンに関する系統的な命名法を表す図
である。非還元末端側に電荷を有するフラグメントイオ
ンはＡ，Ｂ，Ｃと名付け、還元末端側に電荷を有するフ
ラグメントイオンはＸ，Ｙ，Ｚとする。ＡとＸは環開裂
を示すフラグメントイオンで、コンマで区切った上付き
文字により開裂した２本の結合を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】還元性オリゴ糖の還元末端に４−アミノ安
息香酸アルキルエステルを作用させて得られうるオリゴ
糖を大気圧イオン化法によってイオン化する工程を含む
ことを特徴とする還元性オリゴ糖の質量分析法。 - 【請求項２】請求項１記載の還元性オリゴ糖の質量分析
法による質量スペクトルの情報から還元性オリゴ糖の構
造を解析することを特徴とする還元性オリゴ糖の分析方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6291230A JPH08145949A (ja) | 1994-11-25 | 1994-11-25 | 還元性オリゴ糖の質量分析法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6291230A JPH08145949A (ja) | 1994-11-25 | 1994-11-25 | 還元性オリゴ糖の質量分析法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08145949A true JPH08145949A (ja) | 1996-06-07 |
Family
ID=17766165
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6291230A Pending JPH08145949A (ja) | 1994-11-25 | 1994-11-25 | 還元性オリゴ糖の質量分析法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08145949A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002004936A1 (en) * | 2000-07-11 | 2002-01-17 | Japan Science And Technology Corporation | Probe for mass spectrometry of liquid sample |
| JP2006317464A (ja) * | 2000-07-11 | 2006-11-24 | Japan Science & Technology Agency | 液状試料の質量分析用プローブ |
| JP2008051790A (ja) * | 2006-03-15 | 2008-03-06 | Noguchi Inst | 微量質量分析法 |
| JP2009092677A (ja) * | 2005-03-31 | 2009-04-30 | Noguchi Inst | 質量分析法 |
| JP2012032416A (ja) * | 2006-03-15 | 2012-02-16 | Noguchi Institute | 微量質量分析法 |
-
1994
- 1994-11-25 JP JP6291230A patent/JPH08145949A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002004936A1 (en) * | 2000-07-11 | 2002-01-17 | Japan Science And Technology Corporation | Probe for mass spectrometry of liquid sample |
| JP2006317464A (ja) * | 2000-07-11 | 2006-11-24 | Japan Science & Technology Agency | 液状試料の質量分析用プローブ |
| US7301018B2 (en) | 2000-07-11 | 2007-11-27 | Japan Science And Technology Corporation | Probe for mass spectrometry of liquid sample |
| JP2009092677A (ja) * | 2005-03-31 | 2009-04-30 | Noguchi Inst | 質量分析法 |
| JP2008051790A (ja) * | 2006-03-15 | 2008-03-06 | Noguchi Inst | 微量質量分析法 |
| JP2012032416A (ja) * | 2006-03-15 | 2012-02-16 | Noguchi Institute | 微量質量分析法 |
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