JPH08145949A - 還元性オリゴ糖の質量分析法 - Google Patents
還元性オリゴ糖の質量分析法Info
- Publication number
- JPH08145949A JPH08145949A JP6291230A JP29123094A JPH08145949A JP H08145949 A JPH08145949 A JP H08145949A JP 6291230 A JP6291230 A JP 6291230A JP 29123094 A JP29123094 A JP 29123094A JP H08145949 A JPH08145949 A JP H08145949A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- oligosaccharide
- reducible
- reducing
- mass
- ions
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Electron Tubes For Measurement (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】還元性オリゴ糖の還元末端に4−アミノ安息香
酸アルキルエステルを作用させて得られうるオリゴ糖を
大気圧イオン化法によってイオン化する工程を含むこと
を特徴とする還元性オリゴ糖の質量分析法、および該質
量分析法による質量スペクトルの情報から還元性オリゴ
糖の構造を解析することを特徴とする還元性オリゴ糖の
分析方法。 【効果】本発明質量分析法により、極めて微量な試料の
場合においても、還元性オリゴ糖の検出および分子量の
確認が可能になった。また、該分析法による質量スペク
トルの情報から還元性オリゴ糖の構造を容易に解析する
ことができるようになった。
酸アルキルエステルを作用させて得られうるオリゴ糖を
大気圧イオン化法によってイオン化する工程を含むこと
を特徴とする還元性オリゴ糖の質量分析法、および該質
量分析法による質量スペクトルの情報から還元性オリゴ
糖の構造を解析することを特徴とする還元性オリゴ糖の
分析方法。 【効果】本発明質量分析法により、極めて微量な試料の
場合においても、還元性オリゴ糖の検出および分子量の
確認が可能になった。また、該分析法による質量スペク
トルの情報から還元性オリゴ糖の構造を容易に解析する
ことができるようになった。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、還元性オリゴ糖の質量
分析法およびその利用に関するものである。
分析法およびその利用に関するものである。
【0002】
【従来の技術】還元性オリゴ糖とは、重合度(DP)2
から数10程度までの糖であって、その末端に位置する
構成単糖のアノマー炭素原子が置換を受けていない糖
(したがって、アルカリ溶液で還元性を有する)をい
う。このような還元性オリゴ糖が有する構造は、極めて
多様でかつ複雑である。近年、糖鎖関連化合物が有する
糖鎖が、生体の分化、増殖、受精、免疫や細胞、ウィル
ス、細菌等との相互作用に関与することが明らかになっ
てきており、この糖鎖を医薬品として利用しようという
研究が盛んになってきている。これは、糖鎖における多
様な構造が種々の生理作用、機能と深く関連するためで
あり、このため、その糖鎖の構造を明らかにすることは
極めて重要である。そこで最近では、質量分析法を利用
することによって還元性オリゴ糖を高感度で分析する方
法が用いられるようになってきた。
から数10程度までの糖であって、その末端に位置する
構成単糖のアノマー炭素原子が置換を受けていない糖
(したがって、アルカリ溶液で還元性を有する)をい
う。このような還元性オリゴ糖が有する構造は、極めて
多様でかつ複雑である。近年、糖鎖関連化合物が有する
糖鎖が、生体の分化、増殖、受精、免疫や細胞、ウィル
ス、細菌等との相互作用に関与することが明らかになっ
てきており、この糖鎖を医薬品として利用しようという
研究が盛んになってきている。これは、糖鎖における多
様な構造が種々の生理作用、機能と深く関連するためで
あり、このため、その糖鎖の構造を明らかにすることは
極めて重要である。そこで最近では、質量分析法を利用
することによって還元性オリゴ糖を高感度で分析する方
法が用いられるようになってきた。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】これまでに開発された
還元性オリゴ糖の質量分析法としては、例えば、還元性
オリゴ糖をメチル誘導体、アセチル誘導体、2−アミノ
ピリジン(PA)誘導体等の各種誘導体に導いた後、高
速原子衝撃イオン化(FAB)法でイオン化することに
よって質量分析する手法が知られているが、多様でかつ
複雑な構造を有する還元性オリゴ糖を分析するには、こ
れらの最新の方法においても未だ感度的に十分でなく、
また得られる構造に関する有益な情報が少ない等の点で
必ずしも満足できるものではなかった。
還元性オリゴ糖の質量分析法としては、例えば、還元性
オリゴ糖をメチル誘導体、アセチル誘導体、2−アミノ
ピリジン(PA)誘導体等の各種誘導体に導いた後、高
速原子衝撃イオン化(FAB)法でイオン化することに
よって質量分析する手法が知られているが、多様でかつ
複雑な構造を有する還元性オリゴ糖を分析するには、こ
れらの最新の方法においても未だ感度的に十分でなく、
また得られる構造に関する有益な情報が少ない等の点で
必ずしも満足できるものではなかった。
【0004】
【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは鋭意検討を行った結果、微量な試料の場合にお
いても、還元性オリゴ糖の還元末端にある種の試薬を作
用させて得られうるオリゴ糖を特定なイオン化法によっ
てイオン化し、該イオン化により生成する分子イオン及
び多数のフラグメントイオンを質量数/電荷数(m/
z)に従って分離し、各イオンの強度を記録してm/z
の順序に並べた質量スペクトルから有益な情報が得られ
ることを見い出し、該情報から還元性オリゴ糖の構造を
より確実に解析することができることを見い出し、本発
明を完成した。すなわち、本発明は、還元性オリゴ糖の
還元末端に4−アミノ安息香酸アルキルエステルを作用
させて得られうるオリゴ糖を大気圧イオン化法によって
イオン化する工程を含むことを特徴とする還元性オリゴ
糖の質量分析法(以下、本発明質量分析法と記す。)、
さらに該質量分析法による質量スペクトルの情報から還
元性オリゴ糖の構造を解析することを特徴とする還元性
オリゴ糖の分析方法を提供するものである。
明者らは鋭意検討を行った結果、微量な試料の場合にお
いても、還元性オリゴ糖の還元末端にある種の試薬を作
用させて得られうるオリゴ糖を特定なイオン化法によっ
てイオン化し、該イオン化により生成する分子イオン及
び多数のフラグメントイオンを質量数/電荷数(m/
z)に従って分離し、各イオンの強度を記録してm/z
の順序に並べた質量スペクトルから有益な情報が得られ
ることを見い出し、該情報から還元性オリゴ糖の構造を
より確実に解析することができることを見い出し、本発
明を完成した。すなわち、本発明は、還元性オリゴ糖の
還元末端に4−アミノ安息香酸アルキルエステルを作用
させて得られうるオリゴ糖を大気圧イオン化法によって
イオン化する工程を含むことを特徴とする還元性オリゴ
糖の質量分析法(以下、本発明質量分析法と記す。)、
さらに該質量分析法による質量スペクトルの情報から還
元性オリゴ糖の構造を解析することを特徴とする還元性
オリゴ糖の分析方法を提供するものである。
【0005】以下、さらに詳細に本発明を説明する。ま
ず、分析目的である還元性オリゴ糖は、大気圧イオン化
法による質量分析に適するように、その還元末端に4−
アミノ安息香酸アルキルエステルを作用させる前処理を
行う。該前処理は、還元性オリゴ糖、4−アミノ安息香
酸アルキルエステル及び還元剤を通常溶媒に混合して反
応を行う。本反応に用いられる溶媒としては、たとえ
ば、メタノール、エタノール等のアルコールと水、ある
いは酢酸等の有機酸と水、との混合溶媒等があげられ
る。ここで混合される水の量は、還元性オリゴ糖を溶解
させるのに必要な少量の水を意味し、例えば、10%
(容量比)程度以下になるような量をあげることができ
る。本反応に用いられる4−アミノ安息香酸アルキルエ
ステルとしては、例えば、4−アミノ安息香酸メチルエ
ステル、4−アミノ安息香酸エチルエステル等をあげる
ことができる。該試薬の量は、還元性オリゴ糖に対し
て、大過剰量、好ましくは約400倍モル量から約50
0倍モル量である。また、還元剤としては、例えば、シ
アン化水素化ホウ素ナトリウム等を用いることができ
る。シアン化水素化ホウ素ナトリウムの場合、還元性オ
リゴ糖に対して、約200倍モル量から約300倍モル
量、好ましくは約240倍モル量から約260倍モル量
を使用するとよい。上記処理温度は、通常約70℃から
約90℃、好ましくは約75℃から約85℃の範囲であ
り、処理時間は通常約15分間から約90分間である。
処理終了後は、クロロホルム等の有機溶媒により未反応
4−アミノ安息香酸アルキルエステルを抽出除去し、減
圧下で濃縮(例えば、凍結乾燥等の方法)することによ
り、所望の誘導体を得ることができる。また、必要に応
じて、再結晶、クロマトグラフィー等の通常の方法によ
りさらに精製することもできる。
ず、分析目的である還元性オリゴ糖は、大気圧イオン化
法による質量分析に適するように、その還元末端に4−
アミノ安息香酸アルキルエステルを作用させる前処理を
行う。該前処理は、還元性オリゴ糖、4−アミノ安息香
酸アルキルエステル及び還元剤を通常溶媒に混合して反
応を行う。本反応に用いられる溶媒としては、たとえ
ば、メタノール、エタノール等のアルコールと水、ある
いは酢酸等の有機酸と水、との混合溶媒等があげられ
る。ここで混合される水の量は、還元性オリゴ糖を溶解
させるのに必要な少量の水を意味し、例えば、10%
(容量比)程度以下になるような量をあげることができ
る。本反応に用いられる4−アミノ安息香酸アルキルエ
ステルとしては、例えば、4−アミノ安息香酸メチルエ
ステル、4−アミノ安息香酸エチルエステル等をあげる
ことができる。該試薬の量は、還元性オリゴ糖に対し
て、大過剰量、好ましくは約400倍モル量から約50
0倍モル量である。また、還元剤としては、例えば、シ
アン化水素化ホウ素ナトリウム等を用いることができ
る。シアン化水素化ホウ素ナトリウムの場合、還元性オ
リゴ糖に対して、約200倍モル量から約300倍モル
量、好ましくは約240倍モル量から約260倍モル量
を使用するとよい。上記処理温度は、通常約70℃から
約90℃、好ましくは約75℃から約85℃の範囲であ
り、処理時間は通常約15分間から約90分間である。
処理終了後は、クロロホルム等の有機溶媒により未反応
4−アミノ安息香酸アルキルエステルを抽出除去し、減
圧下で濃縮(例えば、凍結乾燥等の方法)することによ
り、所望の誘導体を得ることができる。また、必要に応
じて、再結晶、クロマトグラフィー等の通常の方法によ
りさらに精製することもできる。
【0006】上記のように調製されたオリゴ糖を、大気
圧イオン化法のインターフェイスを装備した質量分析計
に導入することによって質量分析する。本発明で用いら
れる大気圧イオン化法としては、例えば、エレクトロス
プレー・イオン化法あるいはイオンスプレー・イオン化
法等をあげることができる。そして市販のインターフェ
イス(エレクトロスプレー・イオン化法)としては、例
えば、Finnigan Mat社製のAPI用インターフェイスが
あげられる。また、質量分析計としては、磁場型、四重
極型、イオントラップ型、フーリエ変換−イオンサイク
ロトロン共鳴型等の質量分析計をあげることができる
が、好ましくは、四重極型質量分析計をあげることがで
きる。より好ましくは、タンデム型の四重極型質量分析
計があげられる。なお、市販の四重極型質量分析計とし
ては、例えば、TSQ−700型クロマトグラフィー・
タンデム型質量分析計(Finnigan Mat社製)等があげら
れる。試料を、大気圧イオン化法のインターフェイスを
装備した質量分析計に導入する方法としては、例えば、
高速液体クロマトグラフィー、シリンジポンプ等をあげ
ることができる。好ましくはシリンジポンプを用いるこ
とがよい。
圧イオン化法のインターフェイスを装備した質量分析計
に導入することによって質量分析する。本発明で用いら
れる大気圧イオン化法としては、例えば、エレクトロス
プレー・イオン化法あるいはイオンスプレー・イオン化
法等をあげることができる。そして市販のインターフェ
イス(エレクトロスプレー・イオン化法)としては、例
えば、Finnigan Mat社製のAPI用インターフェイスが
あげられる。また、質量分析計としては、磁場型、四重
極型、イオントラップ型、フーリエ変換−イオンサイク
ロトロン共鳴型等の質量分析計をあげることができる
が、好ましくは、四重極型質量分析計をあげることがで
きる。より好ましくは、タンデム型の四重極型質量分析
計があげられる。なお、市販の四重極型質量分析計とし
ては、例えば、TSQ−700型クロマトグラフィー・
タンデム型質量分析計(Finnigan Mat社製)等があげら
れる。試料を、大気圧イオン化法のインターフェイスを
装備した質量分析計に導入する方法としては、例えば、
高速液体クロマトグラフィー、シリンジポンプ等をあげ
ることができる。好ましくはシリンジポンプを用いるこ
とがよい。
【0007】このようにして、還元性オリゴ糖の還元末
端に4−アミノ安息香酸アルキルエステルを作用させて
得られうるオリゴ糖を大気圧イオン化法によってイオン
化し、該イオン化により生成する分子イオン及び多数の
フラグメントイオンを質量数/電荷数(m/z)に従っ
て分離し、各イオンの強度を記録してm/zの順序に並
べた質量スペクトルの有益な情報(例えば、還元末端側
の各々のフラグメントイオンの質量差)から還元性オリ
ゴ糖の構造(例えば、構成単糖の配列)を解析すること
ができる。さらに必要に応じて、酵素や抗体を用いる生
化学的手法やNMR等のスペクトルによる解析手法、そ
の他の構成単糖成分分析手法等による解析を相補的に用
いると一層確実な構造解析が可能になる。また、従来の
質量分析方法による質量スペクトルでは、マトリクスや
不純物のイオンが混在することから解析が難しくなる場
合があったが、本発明質量分析法による質量スペクトル
では、プロダクトイオンを表すシグナルピークが明瞭に
なるために解析が容易になる。これは未知な還元性オリ
ゴ糖の構造解析上きわめて有用なことである。
端に4−アミノ安息香酸アルキルエステルを作用させて
得られうるオリゴ糖を大気圧イオン化法によってイオン
化し、該イオン化により生成する分子イオン及び多数の
フラグメントイオンを質量数/電荷数(m/z)に従っ
て分離し、各イオンの強度を記録してm/zの順序に並
べた質量スペクトルの有益な情報(例えば、還元末端側
の各々のフラグメントイオンの質量差)から還元性オリ
ゴ糖の構造(例えば、構成単糖の配列)を解析すること
ができる。さらに必要に応じて、酵素や抗体を用いる生
化学的手法やNMR等のスペクトルによる解析手法、そ
の他の構成単糖成分分析手法等による解析を相補的に用
いると一層確実な構造解析が可能になる。また、従来の
質量分析方法による質量スペクトルでは、マトリクスや
不純物のイオンが混在することから解析が難しくなる場
合があったが、本発明質量分析法による質量スペクトル
では、プロダクトイオンを表すシグナルピークが明瞭に
なるために解析が容易になる。これは未知な還元性オリ
ゴ糖の構造解析上きわめて有用なことである。
【0008】以下、実施例により詳細に説明するが、本
発明はこれに限定されるものではない。
発明はこれに限定されるものではない。
実施例1 〔4−アミノ安息香酸エチルエステルを用い
る還元性オリゴ糖の前処理方法〕 Wangらの方法(W.T.Wang,N.C.LeDonne Jr,B.Ackerman &
C.C.Sweeley;Anal.Chem.,141,366-381(1984) )に準じ
て行った。還元性オリゴ糖4mg(4.4μmol相当
量)に純水40μlを加えて混合した後、この混合液に
160μlの反応液〔4−アミノ安息香酸エチル(AB
EE):330mg,シアノ水素化ホウ素ナトリウム:
70mg,酢酸:82μl,メタノール:700μlか
らなる混合液〕を添加し、80℃30分間反応を行なっ
た。反応終了後、純水1mlを加え、クロロホルム1m
lで未反応ABEEを抽出除去した。回収した純水画分
を凍結乾燥した後、分取用液体クロマトグラフィー 試料量:10μl,10mg/ml H2 O カラム:Asahipak NH2 P−50(4.6mm 径X25cmL,
5μm) カラム温度:室温 移動相:AcCN-H2O(リニヤーグラジエント:5% H2Oから
100%H2O,30min ) 流量:1.0ml/min 検出:UV 254nm による精製を行うことによって、ABEEによる誘導体
(化1)を得た。
る還元性オリゴ糖の前処理方法〕 Wangらの方法(W.T.Wang,N.C.LeDonne Jr,B.Ackerman &
C.C.Sweeley;Anal.Chem.,141,366-381(1984) )に準じ
て行った。還元性オリゴ糖4mg(4.4μmol相当
量)に純水40μlを加えて混合した後、この混合液に
160μlの反応液〔4−アミノ安息香酸エチル(AB
EE):330mg,シアノ水素化ホウ素ナトリウム:
70mg,酢酸:82μl,メタノール:700μlか
らなる混合液〕を添加し、80℃30分間反応を行なっ
た。反応終了後、純水1mlを加え、クロロホルム1m
lで未反応ABEEを抽出除去した。回収した純水画分
を凍結乾燥した後、分取用液体クロマトグラフィー 試料量:10μl,10mg/ml H2 O カラム:Asahipak NH2 P−50(4.6mm 径X25cmL,
5μm) カラム温度:室温 移動相:AcCN-H2O(リニヤーグラジエント:5% H2Oから
100%H2O,30min ) 流量:1.0ml/min 検出:UV 254nm による精製を行うことによって、ABEEによる誘導体
(化1)を得た。
【化1】
【0009】実施例2 (各種の質量分析法による還元
性オリゴ糖の分析) 還元性オリゴ糖としてマルトペンタオースを用いた。該
還元性オリゴ糖を(1)ヨウ化メチルによる誘導化、
(2)酢酸による誘導化、(3)4−アミノ安息香酸エ
チルエステル(以下、ABEEと記す。)による誘導
化、または(4)2−アミノピリジン(以下、PAと記
す。)による誘導化で得られるメチル誘導体、アセチル
誘導体、、ABEEによる誘導体、またはPAによる誘
導体を調製〔(3)の誘導化方法は実施例1に記載し
た。また(3)以外の誘導化方法は下記の参考例に記載
した。〕し、調製された各種誘導体および非誘導化マル
トペンタオースを高速原子衝撃イオン化(FAB)法
〔正・負モード〕あるいはエレクトロスプレー・イオン
化(ESI)法〔正モード・負モード〕によって質量分
析した。そして、調製された各種誘導体および非誘導化
マルトペンタオースの各イオン化法におけるイオン化効
率を比較した。その結果を表1(非誘導化マルトペンタ
オースを試料にした場合のイオン化効率に対する各種誘
導体のイオン化効率の比で表す。)に示す。表1から明
らかなように、本発明質量分析法は他質量分析法に比較
して顕著な感度向上(特に非誘導化マルトペンタオース
−ESI法との比較において正及び負の両モードとも約
500倍程度向上)が認められた。そして本発明質量分
析法では、0.5-1pmolという微量でも明瞭なスペクトル
が得られることが判った。
性オリゴ糖の分析) 還元性オリゴ糖としてマルトペンタオースを用いた。該
還元性オリゴ糖を(1)ヨウ化メチルによる誘導化、
(2)酢酸による誘導化、(3)4−アミノ安息香酸エ
チルエステル(以下、ABEEと記す。)による誘導
化、または(4)2−アミノピリジン(以下、PAと記
す。)による誘導化で得られるメチル誘導体、アセチル
誘導体、、ABEEによる誘導体、またはPAによる誘
導体を調製〔(3)の誘導化方法は実施例1に記載し
た。また(3)以外の誘導化方法は下記の参考例に記載
した。〕し、調製された各種誘導体および非誘導化マル
トペンタオースを高速原子衝撃イオン化(FAB)法
〔正・負モード〕あるいはエレクトロスプレー・イオン
化(ESI)法〔正モード・負モード〕によって質量分
析した。そして、調製された各種誘導体および非誘導化
マルトペンタオースの各イオン化法におけるイオン化効
率を比較した。その結果を表1(非誘導化マルトペンタ
オースを試料にした場合のイオン化効率に対する各種誘
導体のイオン化効率の比で表す。)に示す。表1から明
らかなように、本発明質量分析法は他質量分析法に比較
して顕著な感度向上(特に非誘導化マルトペンタオース
−ESI法との比較において正及び負の両モードとも約
500倍程度向上)が認められた。そして本発明質量分
析法では、0.5-1pmolという微量でも明瞭なスペクトル
が得られることが判った。
【0010】
【表1】 ──────────────────────────────────── FAB ESI 備考 正 負 正 負 ──────────────────────────────────── メチル誘導体 11 0.1 − − アセチル誘導体 60 0.1 − − ABEEによる誘導 5 5 450 500 本発明 PAによる誘導体 3 1 100 30 非誘導化マルトペンタオース 1 1 1 1 ────────────────────────────────────
【0011】実施例3 (ABEEによる誘導体の質量
分析による質量スペクトルの情報に基づく構造解析) 実施例1によって得られるABEEによる誘導体をES
I用インターフェースでイオン化させた際に生じる1価
イオンを親イオンとしたプロダクトイオンの質量スペク
トルを測定した。正イオンモードでの質量スペクトルを
図1に、負イオンモードでの質量スペクトルを図2に示
す。その結果、正イオンモードでの質量スペクトル(図
1)には、還元性オリゴ糖の還元末端からの構造情報を
有するYシリーズ(図3および図5参照)のシークエン
スイオンを表すシグナルピークが認められ、上記シーク
エンスイオン間の質量差から、分子イオン〔MH+ 〕か
らヘキソース単位での脱離が生じるという化学構造上で
の情報を得ることができた(表2および図1参照)。一
方、負イオンモードでの質量スペクトル(図2)には、
還元性オリゴ糖の還元末端からの構造情報を有するZシ
リーズ(図4および図5参照)のシークエンスイオンを
表すシグナルピークが認められ、上記シークエンスイオ
ン間の質量差から、分子イオン〔Z2 +TFA〕- からヘキ
ソース単位での脱離が生じるという化学構造上での情報
を得ることができた(表2および図2参照)。また該ス
ペクトルには、非還元性オリゴ糖の還元末端からの構造
情報を有する2,4 Aシリーズ(図4および図5参照)の
シークエンスイオンを表すシグナルピークも認められ、
上記シークエンスイオン間の質量差から、分子イオン
〔M−H〕- からヘキソース単位での脱離が生じるとい
う化学構造上での情報を数多く得ることができた(表3
および図2参照)。以上のような有益な情報から還元性
オリゴ糖の構造を解析することが可能である。一方、A
BEEによる誘導体以外の実施例2に記載される誘導体
について、上記と同様な方法によって質量スペクトルを
測定したが、多くの情報を含む質量スペクトルを得るこ
とができず、化学構造上での情報の有益さという点で劣
った。
分析による質量スペクトルの情報に基づく構造解析) 実施例1によって得られるABEEによる誘導体をES
I用インターフェースでイオン化させた際に生じる1価
イオンを親イオンとしたプロダクトイオンの質量スペク
トルを測定した。正イオンモードでの質量スペクトルを
図1に、負イオンモードでの質量スペクトルを図2に示
す。その結果、正イオンモードでの質量スペクトル(図
1)には、還元性オリゴ糖の還元末端からの構造情報を
有するYシリーズ(図3および図5参照)のシークエン
スイオンを表すシグナルピークが認められ、上記シーク
エンスイオン間の質量差から、分子イオン〔MH+ 〕か
らヘキソース単位での脱離が生じるという化学構造上で
の情報を得ることができた(表2および図1参照)。一
方、負イオンモードでの質量スペクトル(図2)には、
還元性オリゴ糖の還元末端からの構造情報を有するZシ
リーズ(図4および図5参照)のシークエンスイオンを
表すシグナルピークが認められ、上記シークエンスイオ
ン間の質量差から、分子イオン〔Z2 +TFA〕- からヘキ
ソース単位での脱離が生じるという化学構造上での情報
を得ることができた(表2および図2参照)。また該ス
ペクトルには、非還元性オリゴ糖の還元末端からの構造
情報を有する2,4 Aシリーズ(図4および図5参照)の
シークエンスイオンを表すシグナルピークも認められ、
上記シークエンスイオン間の質量差から、分子イオン
〔M−H〕- からヘキソース単位での脱離が生じるとい
う化学構造上での情報を数多く得ることができた(表3
および図2参照)。以上のような有益な情報から還元性
オリゴ糖の構造を解析することが可能である。一方、A
BEEによる誘導体以外の実施例2に記載される誘導体
について、上記と同様な方法によって質量スペクトルを
測定したが、多くの情報を含む質量スペクトルを得るこ
とができず、化学構造上での情報の有益さという点で劣
った。
【0012】
【表2】 ──────────────────────────────────── Yシリーズのプロダクトイオン Zシリーズのプロダクトイオン m/Z ピーク差 m/Z ピーク差 ──────────────────────────────────── 〔MH+ 〕 978.1 − Y4 815.8 162.3 Y3 653.7 162.1 Y2 492.0 161.7 [ Z2 +TFA] - 586.7 − Y1 329.9 162.1 [ Z1 +TFA] - 424.7 162.0 ───────────────────────────────────
【0013】
【表3】
【0014】参考例 (還元性オリゴ糖における各種の
前処理方法) 還元性オリゴ糖としてマルトペンタオースを用いた。 (A)ヨウ化メチルによる誘導化方法 Ciucanu とKerek の方法[ I.Ciucanu and F.Kerek,Carb
ohydrate Research,131,209(1984)]に準じて行った。還
元性オリゴ糖50mg(0.28mmol相当量)にD
MSO1mlを加えて混合した後、この混合液に200
mgの粉末状NaOH(あるいは300mgの粉末状KOH )
を添加した。該混合液を攪拌しながらヨウ化メチル1m
lを加えた後、30分間(KOH の場合には60分間)攪
拌を続けた。反応終了後、純水1mlを加え、クロロホ
ルム1mlで3回抽出した。回収したクロロホルム画分
を純水1mlで3回洗浄した後、該クロロホルム画分を
濃縮し、目的とするメチル誘導体(化2)を得た。
前処理方法) 還元性オリゴ糖としてマルトペンタオースを用いた。 (A)ヨウ化メチルによる誘導化方法 Ciucanu とKerek の方法[ I.Ciucanu and F.Kerek,Carb
ohydrate Research,131,209(1984)]に準じて行った。還
元性オリゴ糖50mg(0.28mmol相当量)にD
MSO1mlを加えて混合した後、この混合液に200
mgの粉末状NaOH(あるいは300mgの粉末状KOH )
を添加した。該混合液を攪拌しながらヨウ化メチル1m
lを加えた後、30分間(KOH の場合には60分間)攪
拌を続けた。反応終了後、純水1mlを加え、クロロホ
ルム1mlで3回抽出した。回収したクロロホルム画分
を純水1mlで3回洗浄した後、該クロロホルム画分を
濃縮し、目的とするメチル誘導体(化2)を得た。
【化2】 (B)酢酸による誘導化による誘導化方法 Dellらの方法[ A.Dell and P.R.Tiller,Biochem.Biophy
s.Res.Commun.,135,1126(1986)] に準じて行った。還元
性オリゴ糖10mg(0.011mmol相当量)に無
水トリフルオロ酢酸:酢酸(2:1) 500μlを加
えて混合した後、この混合液を室温下で60分間攪拌し
た。反応終了後、窒素ガスを流して溶媒を蒸発させた。
残渣からのジクロロメタン2mlによる3回抽出で回収
された抽出液を純水1mlで洗浄した後、該ジクロロメ
タン画分を回収した。回収されたジクロロメタン画分に
窒素ガスを流して溶媒を蒸発させることによって、目的
とするアセチル誘導体(化3)を得た。
s.Res.Commun.,135,1126(1986)] に準じて行った。還元
性オリゴ糖10mg(0.011mmol相当量)に無
水トリフルオロ酢酸:酢酸(2:1) 500μlを加
えて混合した後、この混合液を室温下で60分間攪拌し
た。反応終了後、窒素ガスを流して溶媒を蒸発させた。
残渣からのジクロロメタン2mlによる3回抽出で回収
された抽出液を純水1mlで洗浄した後、該ジクロロメ
タン画分を回収した。回収されたジクロロメタン画分に
窒素ガスを流して溶媒を蒸発させることによって、目的
とするアセチル誘導体(化3)を得た。
【化3】 (C)2−アミノピリジンによる誘導化方法 近藤らの方法[ A.Kondo,J.Suzuki,N.Kuraya,S.Hase,I.K
ate,T.Ikenaka,Agric.Biol.Chem.,54,2169(1990)] に準
じて行った。なお、本誘導化は市販キット(Takara Pal
Station Pyridyl amination reagent :糖鎖分析用)及
び市販装置(Takara Pal Station モデル4000:糖鎖ピ
リジルアミノ化自動装置)を用いて行った。還元性オリ
ゴ糖45ng−45μg(50pmol−50nmol
相当量)にカップリング試薬(2-Aminopyridine/酢酸:
3mg/ml)20μlを加え、90℃で60分間反応した。
反応終了後、該反応混合物に還元試薬(Borane-dimethy
lamine complex/酢酸)20μlを添加し、80℃、6
0分間反応した。反応終了後、トリエチルアミン/メタ
ノール20μlおよびトルエン40μlを加えて混合し
た後、この混合液に窒素ガスを流しながら、60℃で1
0分間減圧下で乾固した。得られた残渣にメタノール2
0μlおよびトルエン40μlを加えて再び混合した
後、この混合物に窒素ガスを流しながら、60℃で10
分間減圧下で乾固した。得られた残渣にトルエン50μ
lを加えて再び混合した後、この混合物に窒素ガスを流
しながら、60℃で10分間減圧下で乾固することによ
って、PAによる誘導体(化4)を得た。
ate,T.Ikenaka,Agric.Biol.Chem.,54,2169(1990)] に準
じて行った。なお、本誘導化は市販キット(Takara Pal
Station Pyridyl amination reagent :糖鎖分析用)及
び市販装置(Takara Pal Station モデル4000:糖鎖ピ
リジルアミノ化自動装置)を用いて行った。還元性オリ
ゴ糖45ng−45μg(50pmol−50nmol
相当量)にカップリング試薬(2-Aminopyridine/酢酸:
3mg/ml)20μlを加え、90℃で60分間反応した。
反応終了後、該反応混合物に還元試薬(Borane-dimethy
lamine complex/酢酸)20μlを添加し、80℃、6
0分間反応した。反応終了後、トリエチルアミン/メタ
ノール20μlおよびトルエン40μlを加えて混合し
た後、この混合液に窒素ガスを流しながら、60℃で1
0分間減圧下で乾固した。得られた残渣にメタノール2
0μlおよびトルエン40μlを加えて再び混合した
後、この混合物に窒素ガスを流しながら、60℃で10
分間減圧下で乾固した。得られた残渣にトルエン50μ
lを加えて再び混合した後、この混合物に窒素ガスを流
しながら、60℃で10分間減圧下で乾固することによ
って、PAによる誘導体(化4)を得た。
【化4】
【0015】
【発明の効果】本発明質量分析法により、極めて微量な
試料の場合においても、還元性オリゴ糖の検出および分
子量の確認が可能になった。また、該分析法による質量
スペクトルの有益な情報から還元性オリゴ糖の構造を解
析することができるようになった。
試料の場合においても、還元性オリゴ糖の検出および分
子量の確認が可能になった。また、該分析法による質量
スペクトルの有益な情報から還元性オリゴ糖の構造を解
析することができるようになった。
【図1】ABEEによる誘導体をESI用インターフェ
ースでイオン化させた際に生じる1価イオン〔M+H〕
+ を親イオンとしたプロダクトイオンに関する正モード
における質量スペクトルを示す図である。
ースでイオン化させた際に生じる1価イオン〔M+H〕
+ を親イオンとしたプロダクトイオンに関する正モード
における質量スペクトルを示す図である。
【図2】ABEEによる誘導体をESI用インターフェ
ースでイオン化させた際に生じる1価イオン〔M−H〕
+ を親イオンとしたプロダクトイオンに関する負モード
における質量スペクトルを示す図である。
ースでイオン化させた際に生じる1価イオン〔M−H〕
+ を親イオンとしたプロダクトイオンに関する負モード
における質量スペクトルを示す図である。
【図3】ABEEによる誘導体の還元末端からの構造情
報を有するYシリーズのシークエンスイオンに関する化
学構造式を示す図である。ここで「Y」とは、Yシリー
ズのプロダクトイオンを意味する。
報を有するYシリーズのシークエンスイオンに関する化
学構造式を示す図である。ここで「Y」とは、Yシリー
ズのプロダクトイオンを意味する。
【図4】ABEEによる誘導体の還元末端からの構造情
報を有するZシリーズ、及び非還元末端からの構造情報
を有する2 ,4 A、Cシリーズのシークエンスイオンに
関する化学構造式を示す図である。ここで「Y」とは、
Yシリーズのプロダクトイオンを意味し、
「2 ,4 -A」、「C」とは、2 ,4 A、Cシリーズのプ
ロダクトイオンを意味する。
報を有するZシリーズ、及び非還元末端からの構造情報
を有する2 ,4 A、Cシリーズのシークエンスイオンに
関する化学構造式を示す図である。ここで「Y」とは、
Yシリーズのプロダクトイオンを意味し、
「2 ,4 -A」、「C」とは、2 ,4 A、Cシリーズのプ
ロダクトイオンを意味する。
【図5】質量分析スペクトルにおける還元性オリゴ糖の
各フラグメントイオンに関する系統的な命名法を表す図
である。非還元末端側に電荷を有するフラグメントイオ
ンはA,B,Cと名付け、還元末端側に電荷を有するフ
ラグメントイオンはX,Y,Zとする。AとXは環開裂
を示すフラグメントイオンで、コンマで区切った上付き
文字により開裂した2本の結合を示す。
各フラグメントイオンに関する系統的な命名法を表す図
である。非還元末端側に電荷を有するフラグメントイオ
ンはA,B,Cと名付け、還元末端側に電荷を有するフ
ラグメントイオンはX,Y,Zとする。AとXは環開裂
を示すフラグメントイオンで、コンマで区切った上付き
文字により開裂した2本の結合を示す。
Claims (2)
- 【請求項1】還元性オリゴ糖の還元末端に4−アミノ安
息香酸アルキルエステルを作用させて得られうるオリゴ
糖を大気圧イオン化法によってイオン化する工程を含む
ことを特徴とする還元性オリゴ糖の質量分析法。 - 【請求項2】請求項1記載の還元性オリゴ糖の質量分析
法による質量スペクトルの情報から還元性オリゴ糖の構
造を解析することを特徴とする還元性オリゴ糖の分析方
法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6291230A JPH08145949A (ja) | 1994-11-25 | 1994-11-25 | 還元性オリゴ糖の質量分析法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6291230A JPH08145949A (ja) | 1994-11-25 | 1994-11-25 | 還元性オリゴ糖の質量分析法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH08145949A true JPH08145949A (ja) | 1996-06-07 |
Family
ID=17766165
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6291230A Pending JPH08145949A (ja) | 1994-11-25 | 1994-11-25 | 還元性オリゴ糖の質量分析法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH08145949A (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002004936A1 (en) * | 2000-07-11 | 2002-01-17 | Japan Science And Technology Corporation | Probe for mass spectrometry of liquid sample |
JP2006317464A (ja) * | 2000-07-11 | 2006-11-24 | Japan Science & Technology Agency | 液状試料の質量分析用プローブ |
JP2008051790A (ja) * | 2006-03-15 | 2008-03-06 | Noguchi Inst | 微量質量分析法 |
JP2009092677A (ja) * | 2005-03-31 | 2009-04-30 | Noguchi Inst | 質量分析法 |
JP2012032416A (ja) * | 2006-03-15 | 2012-02-16 | Noguchi Institute | 微量質量分析法 |
-
1994
- 1994-11-25 JP JP6291230A patent/JPH08145949A/ja active Pending
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002004936A1 (en) * | 2000-07-11 | 2002-01-17 | Japan Science And Technology Corporation | Probe for mass spectrometry of liquid sample |
JP2006317464A (ja) * | 2000-07-11 | 2006-11-24 | Japan Science & Technology Agency | 液状試料の質量分析用プローブ |
US7301018B2 (en) | 2000-07-11 | 2007-11-27 | Japan Science And Technology Corporation | Probe for mass spectrometry of liquid sample |
JP2009092677A (ja) * | 2005-03-31 | 2009-04-30 | Noguchi Inst | 質量分析法 |
JP2008051790A (ja) * | 2006-03-15 | 2008-03-06 | Noguchi Inst | 微量質量分析法 |
JP2012032416A (ja) * | 2006-03-15 | 2012-02-16 | Noguchi Institute | 微量質量分析法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Park et al. | Application of Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry to oligosaccharides | |
Devakumar et al. | Fragmentation of oligosaccharide ions with 157 nm vacuum ultraviolet light | |
Gerber et al. | Analysis of rates of multiple enzymes in cell lysates by electrospray ionization mass spectrometry | |
US20140227793A1 (en) | Compositions and methods for glycan sequencing | |
Naggar et al. | Competing fragmentation processes in tandem mass spectra of heparin-like glycosaminoglycans | |
Cui et al. | Metal ion adducts in the structural analysis of ginsenosides by electrospray ionization with multi‐stage mass spectrometry | |
Schaller-Duke et al. | Electron transfer dissociation and collision-induced dissociation of underivatized metallated oligosaccharides | |
JP5170566B2 (ja) | 質量分析法 | |
Dahlquist et al. | Demonstration of carbonium ion intermediate during lysozyme catalysis. | |
Pfeifer et al. | Structural characterization of sulfadiazine metabolites using H/D exchange combined with various MS/MS experiments | |
JPH08145948A (ja) | 還元性オリゴ糖の質量分析法 | |
JPH08145949A (ja) | 還元性オリゴ糖の質量分析法 | |
Murthy et al. | The repeating sequence of the capsular polysaccharide of Staphylococcus aureus M | |
JP2004317398A (ja) | 質量分析法 | |
Lin et al. | A new naphthimidazole derivative for saccharide labeling with enhanced sensitivity in mass spectrometry detection | |
Claeys et al. | Charge‐remote and charge‐proximate fragmentation processes in alkali‐cationized fatty acid esters upon high‐energy collisional activation. A new mechanistic proposal | |
Hermannová et al. | Arrival time distributions of product ions reveal isomeric ratio of deprotonated molecules in ion mobility–mass spectrometry of hyaluronan‐derived oligosaccharides | |
Torvinen et al. | Glucosylthioureidocalix [4] arenes: Synthesis, conformations and gas phase recognition of amino acids | |
US20230184751A1 (en) | Flow chemistry system and method for carbohydrate analysis | |
Still et al. | Metabolism of isopropyl-3-chlorocarbanilate by cucumber plants | |
An et al. | Suppression of sialylated by sulfated oligosaccharides in negative MALDI‐FTMS | |
Perdivara et al. | Enhanced electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry of long‐chain polysaccharides | |
Brown et al. | Chemistry of buprestins A and B. Bitter principles of jewel beetles (Coleoptera: Buprestidae) | |
YAMAMOTO et al. | Isolation of sugar compounds of asparagine, phenylalanine, tyrosine and valine from cured tobacco leaves | |
Kiely et al. | Delta-dicarbonyl sugars. IV. Oxidation of Carbohydrates with Chromic Acid. Synthesis of 6-Acetamido-6-deoxy-D-xylo-hexos-5-ulose |