JP4820444B2 - プレート上での測定対象分子の局在化方法、およびこれを用いた質量分析法 - Google Patents
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Description
(1)上記のいずれかの方法により、プレート上で生体試料中の測定対象分子を局在化する工程、および
(2)上記工程(1)で局在化された測定対象分子に対して、MSn測定を行なう工程であって、nは1以上の整数である工程
を含む質量分析法を包含する。
(1)上記のいずれかの方法により、上記第1プレート上の生体試料中の測定対象分子、および上記第2プレート上の生体試料中の測定対象分子の少なくとも一方を局在化する工程、および
(2)上記工程(1)で局在化された測定対象分子に対して、MSn測定を行なう工程であって、nは1以上の整数である工程
を含む質量分析法を包含する。
本発明のプレート上での測定対象分子を局在化する方法(タイプ1)は、(A)測定対象分子を局在化する少なくとも1種の化合物を結合させたプレートを用意する工程と、(B)上記プレート上に、少なくとも1種の測定対象分子を含む生体試料を載置する工程と、(C)上記生体試料にマトリックスを含む溶液を滴下、乾燥して、上記プレート上で上記測定対象分子を局在化する工程とを含む方法である。ここで、測定対象分子とは、当該局在化方法を実施した後に行なう質量分析法において測定対象とする分子を意味する。
(プレート)
プレートは、生体試料中の測定対象分子および夾雑分子の少なくとも一方を捕捉することが可能な官能基が結合されているものであれば特に限定されず、金属プレート、非金属膜のいずれとすることもできる。また、プレートはその表面を平面状、凹凸状等、いかなる形状とすることもでき、さらに多孔性とすることもできる。さらに、プレートには所定の官能基が直接結合されていなくてもよく、例えば、プレートと当該官能基との間のスペーサ部分またはポリマーが介在していてもよい。
以下に、このようなタイプ1−1〜1−3のプレートの一例として、アリール基を結合させたプレートの作成方法を説明する。
(測定対象分子)
「測定対象分子」とは、糖、糖鎖、タンパク質、核酸、複合糖質(糖タンパク質、糖脂質など)などであって、天然から調製する他、化学的または酵素学的に調製するものを含む。なお、本発明における用語「タンパク質」はペプチドを含み、本発明における用語「糖タンパク質」は糖ペプチドを含む。タンパク質は糖鎖、リン酸などを含めて修飾がなされていてもよい。また、生体に含まれる分子の部分構造を有するものまたは生体に含まれる分子を模倣して作製されたものを含む。
生体試料の載置工程では、誘導体化後の測定分子または誘導体化しない測定分子を、適当な溶媒に溶解し、ピペットまたは自動スポッターなどの滴下装置でプレート上に滴下する。乾燥は、室温に放置しても、分子が変化しなければ加温してもよい。必要に応じて、引き続き誘導体化反応を行なう。
(マトリックス)
事後的な質量分析におけるマトリックスの役割は、照射されたレーザーの光エネルギーを吸収しマトリックス自身がイオン化を起こして測定対象分子との間でプロトンまたは電子などを受け渡すというものである。マトリックスは、その種類によって固有の光エネルギー吸収帯があるので、照射するレーザーによって使用するマトリックスも異なる。また、マトリックスは、光エネルギーの吸収以外にも、測定対象分子を分子レベルで均一に分散させる分散剤としての役割も有する。このため、測定する分子の違い(タンパク質、核酸、糖類、脂質など)によってマトリックスを適宜選択することが重要である。
マトリックスを溶解する溶媒としては、アセトン、メタノール、エタノール、アセトニトリル等、およびこれらと水との混液を使用することができる。特に、アセトニトリルと水との混液を使用することが、試料およびマトリックスとよく混和し、その後の局在化を実現する点で好ましい。高い局在化を達成するためには、溶媒濃度を適宜選択することが好ましい。具体的には、溶媒濃度は、測定試料によって選択する必要がある。溶媒濃度、例えば、アセトニトリル濃度は、0〜100%とすることが好ましく、特に、40〜90%とすることが、乾燥時間および/または乾燥過程を制御できる点で特に好ましい。
マトリックスと溶媒との混合は、特に限定するものではなく、公知のいかなる技術を使用することもできる。例えば、DHBA(高純度マトリックス試薬、島津ジーエルシー製)5mgを、40%のアセトニトリルを含有する水0.5mlに溶解し、最終濃度10mg/ml溶液を用時調製する。この際、必要に応じて遠心分離した上清を用いる。
プレート上で前記測定対象分子を局在化する工程では、まず、測定試料を載置した部位を覆うようにマトリックス溶液をピペットまたは自動スポッターなどの滴下装置でプレート上に滴下する。この段階で、測定対象分子が再溶解してマトリックスとの混合溶液となる。
[プレートを用意する工程]
タイプ2において、プレートを用意する工程には、(A1)第1プレート上に測定対象分子を局在化する第1の化合物を結合する工程と、(A2)第2プレート上に測定対象分子を局在化する、第1化合物とは異なる第2の化合物を結合する工程とが含まれる。
タイプ2において、測定対象分子を含む生体試料を載置する工程には、(B1)第1プレートおよび第2プレートの間に、少なくとも1種の測定対象分子を含む生体試料を挟み、乾燥する工程と、(B2)第1プレートおよび第2プレートを分離する工程とが含まれる。
タイプ2において、プレート上で測定対象分子を局在化する工程は、(C)第1プレートおよび第2プレート上にマトリックスを含む溶液を滴下し乾燥して、プレート上で測定対象分子を局在化する工程である。
本発明の測定対象分子の質量分析方法は、
(1)プレート上での測定対象分子を局在化する方法(タイプ1)により、プレート上で測定対象分子を局在化する工程、および
(2)上記工程(1)で局在化された測定対象分子に対して、MSn測定を行なう工程であって、nは1以上の整数である工程
を含む方法である。
工程1は、上記したプレート上での測定対象分子の局在化方法を行なう工程である。当該工程は、上述したとおりである。
工程2は、工程1で局在化された測定対象分子に対して、MSn測定を行なう工程であって、nは1以上の整数である工程である。
本発明の測定対象分子の質量分析方法は、
(1)プレート上での測定対象分子を局在化する方法(タイプ2)により、プレート上で生体試料中の測定対象分子を局在化する工程、および
(2)前記工程(1)で局在化された測定対象分子に対して、MSn測定を行なう工程であって、nは1以上の整数である工程
を含む方法である。
1−1.フェニルプレートの作成
Micro・Contact・Printing法に従って、プレートへのフェニル基導入を行なった。具体的には、ポリジメチルシロキサン製の板材を準備し、ベンジルメルカプタン [α−トルエンチオール]のエタノール希釈液(2mM)に10分間浸して風乾した。次いで、別途準備したAu基板に3秒間スタンプした。その後、基板をエタノールで洗浄し、乾燥してフェニルプレートを得た。本例では、プレートにフェニル基を全面コートしたため、上記板材として、Au基板よりも大きなものを使用した。
上記のように事前に作成したプレート上に、糖鎖1(500fmol)を載置し、乾燥させた。その上に、1−ピレニルジアゾメタン500pmol含有DMSO溶液0.25μLを滴下し、25分にわたって40℃に加熱して乾燥させることにより、一部ピレン標識化された標識糖鎖1を得た。マトリックスとしてDHBA(10mg/ml溶液、40%アセトニトリル)0.5μLを、試料を覆うように滴下し室温で乾燥して、図1に示す標識糖鎖含有測定試料1を調製した。
フェニルプレートの代わりに一般に汎用されているステンレスプレートを用いて、実施例1と同様にスキャンを行なった。その結果を以下に示す。
市販の糖タンパク質前立腺特異抗原を電気泳動後、リジルエンドプロテアーゼCでゲル内消化し、ペプチドNグリコシダーゼF消化を行ない、さらにC18チップ素通り画分を得た。この画分を試料として実施例1で作成したフェニルプレートに載置し、以下実施例1と同様にスキャンを行なった。その結果を以下に示す。
実施例3は、フェニルプレートを用いて糖ペプチドおよびペプチドの局在化を行った例である。まず、PSA−ACT由来糖ペプチドの精製は、以下のようにして行った。即ち、0.6mLチューブにPSA−ACT0.5μgを含む50mM重炭酸アンモニウム水溶液95μLと、10U/μLサーモライシン水溶液の5μLとを加えて混合溶液を撹拌し、56.5℃で一晩インキュベーションした。この混合溶液を遠心エバポレーターで乾燥して乾燥物を得、当該乾燥物に、0.8%トリフルオロ酢酸(TFA)を150μL加え、ヒートブロックを用い、80℃で40秒反応させてアシアロ化を行ったサンプルを得た。
実施例4は、C18プレートとフェニルプレートとの間に、糖ペプチドおよびペプチドを挟んで局在化を行った例である。まず、C18プレートおよびフェニルプレートの作製は、以下のようにして行った。即ち、フェニルプレートは実施例1と同様に作成した。なお、測定試料溶液を保持させるために、直径3mmの穴の空いたPDMS(polydimethylsiloxane)樹脂製のシート(厚さ100μm、外形はフェニルプレートと略同形状)を作製し、貼り付けた。貼り付けは、PDMSシートの自己吸着により、接着剤等は用いていない。C18プレートについてもフェニルプレートと同様に作製した。ポリジメチルシロキサン製の板材を準備し、[1−オクタデカンチオール]のエタノール希釈液(2mM)に10分間浸して風乾した。次いで、別途準備したAu基板に3秒間スタンプした。その後、基板をエタノールで洗浄し、乾燥した。本例では、プレートにC18を全面コートしたため、上記板材として、Au基板よりも大きなものを使用した。
糖ペプチドの調製は実施例3と同様に行った。
アミノプレートに糖ペプチドおよびペプチドを載せて、または、C8プレートおよびアミノプレートの間に糖ペプチドおよびペプチドを挟んで局在化を行った。これらの例では、プレートの種類以外は実施例3および4と同様な操作を行った。実施例5において、C8プレートおよびアミノプレートの間に糖ペプチド等を挟んで局在化し、その後、これらのプレートを分離した後のアミノプレートに関する結果を、図20,21に示す。これに対し、実施例5において、アミノプレートに糖ペプチド等を載せて局在化し、その後、当該アミノプレートに関する結果を図22,23に示す。これらの図において、図20、22は、ピレン標識を行わずにMS測定した結果を示し、図21、23は、ピレン標識を行ってMS測定した結果を示す。
1.(A)測定対象分子を局在化する少なくとも1種の化合物を結合させたプレートを用意する工程と、
(B)前記プレート上に、少なくとも1種の測定対象分子を含む生体試料を載置する工程と、
(C)前記生体試料にマトリックスを含む溶液を滴下、乾燥して、前記プレート上で前記測定対象分子を局在化する工程と、
を含むことを特徴とする、プレート上での測定対象分子を局在化する方法。
2.前記化合物が、アリール基、ジヒドロキシボリル基、アルキル基、アミノ基、またはヒドロキシル基を含むことを特徴とする、1に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
3.前記アリール基が、フェニル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基、ナフチル基、アンスリル基、ピレニル基、キノリル基、インドリル基、アクリリジニル基、またはベンゾチアゾリル基であることを特徴とする、2に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
4.前記アルキル基が、C4〜C18のアルキル基であることを特徴とする、2に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
5.前記生体試料が少なくとも2種の測定対象分子を含み、前記工程(A)において、前記プレートの少なくとも2つの領域に異なる化合物を結合させ、前記工程(C)において、少なくとも2つの領域で異なる測定対象分子を局在化することを特徴とする、1〜4のいずれかに記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
6.前記生体試料が少なくとも1種の夾雑分子をさらに含み、前記工程(A)において、前記プレートの少なくとも2つの領域に異なる化合物を結合させ、前記工程(C)において、前記プレートの1つの領域では測定対象分子を、別の領域では夾雑分子を局在化することを特徴とする、1〜4のいずれかに記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
7.工程(B)および工程(C)の間に、
(B’)前記生体試料を誘導体化する工程
をさらに含むことを特徴とする、1〜6のいずれかに記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
8. 測定対象分子の質量分析方法であって、
(1)請求項1〜7のいずれかに記載の方法により、プレート上で生体試料中の測定対象分子を局在化する工程、および
(2)前記工程(1)で局在化された測定対象分子に対して、MSn測定を行なう工程であって、nは1以上の整数である工程
を含むことを特徴とする質量分析法。
Claims (7)
- (A1)第1プレート上に測定対象分子を局在化する第1の化合物を結合する工程と、
(A2)第2プレート上に測定対象分子を局在化する、前記第1化合物とは異なる第2の化合物を結合する工程と、
(B1)前記第1プレートおよび前記第2プレートの間に、少なくとも1種の測定対象分子を含む生体試料を挟み、乾燥する工程と、
(B2)前記第1プレートおよび前記第2プレートを分離する工程と、
(C)前記第1プレートおよび前記第2プレート上にマトリックスを含む溶液を滴下し乾燥して、前記第1プレートおよび前記第2プレートの少なくとも一方上で前記測定対象分子を局在化する工程と、
を含むことを特徴とする、プレート上での測定対象分子の局在化方法。 - 前記第1化合物および第2化合物のそれぞれは、アリール基、ジヒドロキシボリル基、アルキル基、アミノ基、またはヒドロキシル基を含むことを特徴とする、請求項1に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
- 前記アリール基が、フェニル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基、ナフチル基、アンスリル基、ピレニル基、キノリル基、インドリル基、アクリリジニル基、またはベンゾチアゾリル基であることを特徴とする、請求項2に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
- 前記アルキル基が、C4〜C18のアルキル基であることを特徴とする、請求項2に記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
- 前記生体試料が少なくとも1種の夾雑分子をさらに含み、前記工程(C)において、少なくとも1種の夾雑分子を前記第2プレートで局在化することを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。
- 工程(B2)および工程(C)の間に、
(B’)前記第1プレート上の前記生体試料、および前記第2プレート上の前記生体試料の少なくとも一方を誘導体化する工程
をさらに含むことを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載のプレート上での測定対象分子の局在化方法。 - 測定対象分子の質量分析方法であって、
(1)請求項1〜6のいずれかに記載の方法により、前記第1プレート上の生体試料中の測定対象分子、および前記第2プレート上の生体試料中の測定対象分子の少なくとも一方を局在化する工程、および
(2)前記工程(1)で局在化された測定対象分子に対して、MSn測定を行なう工程であって、nは1以上の整数である工程
を含むことを特徴とする質量分析法。
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