JP2011053086A - 分析方法 - Google Patents
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Landscapes
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
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Abstract
【解決手段】試料支持部材上の誘導体化した測定対象分子を分析する方法であって、該測定対象分子を含む試料及び誘導体化剤を試料支持部材上に載せて反応させ、反応後の試料支持部材上を、誘導体化剤と反応後の測定対象分子を実質的に溶解せず、誘導体化剤を溶解する洗浄用溶媒で洗浄した後に分析することを特徴とする分析方法。
【選択図】図3
Description
「測定対象分子を含む試料」は特に限定はないが、少量しか得られない試料、試料中に含まれる測定対象分子が少量である試料(純度が低い試料)、誘導体化剤を反応させることによって感度が上昇し易い試料、誘導体化剤を反応させて測定対象分子を分析し易く変化させることのできる試料、誘導体化した場合としない場合の差を分析したい試料、測定試料を調製する過程で損失が大きくならざるを得ない試料、誘導体化剤を反応させることによって測定対象分子の分析を妨げる夾雑分子の感度が低下する試料、特定の測定対象分子だけを区別して分析したい試料等が挙げられる。測定対象分子は、具体的には特に限定はないが、多糖、単糖等の糖;タンパク質(ペプチドを含む);糖タンパク質(糖ペプチドを含む)、糖脂質等の複合糖質;修飾タンパク質(修飾ペプチドを含む);核酸;生体代謝物等であることが、本発明の効果を発揮できるので好ましい。
本発明の分析方法は、測定対象分子を含む試料及び測定対象分子が、試料支持部材上に載るものである。本発明の分析方法は、試料支持部材上に測定試料を調製し、それを分析するものであれば特に限定はなく、具体的には例えば、質量分析(MS)、水晶天秤分析(QCM)、二次イオン質量分析(SIMS)、電子プローブマクロアナライザー(EPMA)(X線マイクロアナライザー(XMA))、イオンマイクロアナライザー(IMA))、蛍光X線分析(XFL、XRF、FX)、赤外分光分析、顕微赤外分光分析、ラマン分光分析、顕微ラマン分光分析、紫外可視分光分析、蛍光分析、時間分解蛍光分析、偏光分析、顕微質量分析、顕微イメージング、表面プラズモン共鳴測定、電気泳動、クロマトグラフィー等が挙げられる。
1.質量分析の種類
以下、質量分析を例にとって本発明を説明する。
質量分析(以下、「MS」と略記することがある)は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法(MALDI−MS)、エレクトロスプレーイオン化質量分析法(ESI−MS)等によって化学構造情報を得る。これらの分子は、分子イオン([M+Na]+、[M+H]+、[M−H]−等)生成が効率よく起こるかどうかが検出感度に大きく影響する。特に、糖は分子量及び組成が同一の異性体が複数存在するので、分子イオンをプリカーサーイオンとして選択し断片化し、更に生じたイオンをプリカーサーイオンとして選択し断片化することを繰り返すMSn(nは2以上の整数)解析が必須である。
しかしながら、生体試料等の場合は、採取又は入手できる絶対量が少ない場合が多く、検出感度を上げるしか方法はない。この問題に関して、本発明では、測定対象分子を誘導体化し、その誘導体化した測定対象分子を分析する。
誘導体化する場合に測定対象分子の有している好ましい官能基としては、誘導体化剤と反応しやすく、反応してできたものが質量分析において悪影響を及ぼさないものであれば特に限定はないが、アルデヒド基、カルボキシル基、アミノ基、メルカプト基又は水酸基が好ましい。すなわち、本発明における測定対象分子は、アルデヒド基、カルボキシル基、アミノ基、メルカプト基及び水酸基よりなる群から選ばれた1種以上の官能基を有するものであることが好ましい。
(a)アルデヒド基を有する測定対象分子
非還元末端やC2、C4又はC6位のみに置換基をもつヘキソース等のように隣り合うジオールを持つ糖鎖は、過ヨウ素酸酸化によってアルデヒド基を生じるので、測定対象分子として好ましい。特に、シアル酸を含む糖鎖は、シアル酸のC7−9位のみを選択的に過ヨウ素酸で酸化してアルデヒド基を生じさせることができる。シアル酸のC7−9位の選択的酸化は、例えば、5mMのNaIO4水溶液中で0℃、10〜20分間にわたり反応させることによってなされる。かかる、シアル酸由来のアルデヒド基を有している測定対象分子は、後述するように、アミノ基、ヒドラジド基等を有する誘導体化剤と反応して、質量分析に供される誘導体化された分子を、容易に試料支持部材上で反応させて好適に得ることができるので、本発明の分析法で測定対象分子として好ましい。
R1CONHNH2 + R2CHO → R1CONHN=CHR2 (1)
[式中、R1、R2は、互いに独立に任意の有機基を示す。]
R1CONHN=CHR2 → R1CONHNH−CH2R2 (2)
[式中、R1、R2は、互いに独立に任意の有機基を示す。]
例えば、タンパク質や糖タンパク質は、その中に含まれるカルボキシル基、アミノ基、メルカプト基、水酸基等を用いて誘導体化剤と反応させることができる。
官能基を有する測定対象分子は、誘導体化剤を反応させることによって、質量分析に供される分子を得る。誘導体化剤は特に限定はないが、誘導体化された分子すなわち質量分析に供される分子のイオン化効率を高めるものであることが好ましい。レーザー脱離イオン化法においてイオン化効率を高めるものであっても、エレクトロスプレーイオン化法においてイオン化効率を高めるものであってもよい。測定対象分子のイオン化を妨害する夾雑分子のイオン化効率を低下するものであってもよい。質量分析法におけるマトリックス分子としての効果を有する化合物、又はそれらに後記する反応性官能基やスペーサ部分を更に有する化合物も好ましい。
好ましい「測定対象分子と誘導体化剤との組み合わせ」としては、測定対象分子がアルデヒド基を含有する糖鎖を有する分子であり、誘導体化剤がアミノ基又はヒドラジド基等を有するものである場合が挙げられる。また、好ましい組み合わせとしては、測定対象分子が、カルボキシル基、アミノ基又はメルカプト基を有するタンパク質若しくは糖タンパク質であり、誘導体化剤が、アミノ基、ヒドラジド基又はジアゾメチル基等を有するものである場合が挙げられ、更に、測定対象分子が、カルボキシル基を有するタンパク質若しくは糖タンパク質であり、誘導体化剤がヨウ化メチル又はトリメチルシリルジアゾメタン、PDAMである場合が挙げられる。
本発明においては、測定対象分子を含む試料及び誘導体化剤を、試料支持部材上に載せて反応させることを特徴としている。誘導体化は、質量分析に先立って通常は容器内で行われるが、反応操作や過剰の試薬除去の操作が多工程含まれ、時間と労力がかかることに加えて、試料が散逸したり、ある程度の量で操作をしなくてはならないため分析に供せずに無駄になる試料が出てきたりして、生体試料由来の測定対象分子等の微量分析には適用し難かった。
本発明の分析方法を質量分析に適用する場合、少なくとも下記工程を含む質量分析法が好ましい。
(1)測定対象分子を含む試料及び誘導体化剤を、質量分析法に用いる試料支持部材上に載せる工程
(2)測定対象分子を含む試料及び誘導体化剤を、試料支持部材上で反応させる工程
(3)洗浄用溶媒で試料支持部材上を洗浄する工程
(5)試料支持部材上の、反応して生成した測定対象分子を含む試料の誘導体を質量分析計に供する工程
(6)測定対象分子を含む試料の誘導体をイオン化する工程
(4)マトリックス溶液を試料支持部材上に載置して乾燥させ結晶を析出させる工程、
を行うことが、質量分析の感度向上のために特に好ましい。
「測定対象分子を含む試料」は、溶媒に溶解又は分散した状態で載せることが好ましい。特に好ましくは、均一に載せることができる点で溶解した方がよい。試料支持部材上に載せる「測定対象分子」の量は特に限定はないが、1amol〜100pmolが本発明の前記効果を奏するために好ましく、1fmol〜1pmolが特に好ましい。実際に試料支持部材上に載せる「測定対象分子を含む試料」の量は、「測定対象分子を含む試料」中の測定対象分子の含有量に比例して増量させる。
反応は、溶媒を留去してから(乾燥してから)行ってもよく、溶媒の留去と同時に(乾燥しながら)行ってもよい。反応温度に関しては、試料支持部材を0℃〜120℃に維持することにより行うことが好ましい。反応温度は特に好ましくは、20℃〜100℃であり、より好ましくは40℃〜90℃である。反応時間は反応の種類毎に及び/又は溶媒の種類毎に、最適な範囲を選べばよいが、溶媒が乾く時間が好ましい。通常1分〜24時間、好ましくは2分〜20分である。
本発明の分析方法では、測定対象分子を含む試料及び誘導体化剤を試料支持部材上で反応させた後に、洗浄用溶媒で試料支持部材上を洗浄する。「洗浄用溶媒」とは、前述のように、「誘導体化剤と反応後の測定対象分子」を実質的に溶解せず、誘導体化剤を溶解する溶媒をいう。ここで、「実質的に溶解せず」とは、全く溶解しないことには限定されず、若干の溶解は許容されるが、分析に支障がでる程には溶解されない状態をいう。
レーザー脱離イオン化法を用いる場合、マトリックス分子を共存させてもよい。すなわち、上記質量分析が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)質量分析であることが、本発明の効果をより奏するために特に好ましい。具体的には、上記工程(3)の後、マトリックス溶液を載置して、MALDI−MS用の測定試料を調製する。
質量分析に用いられる質量分析計は公知のものが使用できる。レーザー脱離イオン化法によって測定する場合、反応終了後、溶媒を除去した試料支持部材をそのまま質量分析計に供することができる。MALDI法によって測定する場合、反応終了後、溶媒を除去した試料支持部材にマトリックスを載せた後、そのまま質量分析計に供することができる。ESI法によって測定する場合は、試料支持部材上の測定対象分子を含む試料を、酢酸アンモニウム水溶液−アセトニトリル混液等に溶解して、フローインジェクションあるいはカラムを介して液体クロマトグラフ質量分析計に注入する。この場合、試料支持部材はオートサンプラーに供するサンプル管が好ましい。
イオン化する方法については特に限定はなく、大気圧イオン化(APCI)法、電子衝撃でイオン化したアルゴンやキセノンを中性原子にあてて生じた中性イオンビームを試料にあてるFAB法、レーザー脱離イオン化(LDI)法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)法等が挙げられる。
表面にマトリックス結晶化の起点となる閉じた境界が形成されており、該境界で囲まれた領域の表面におけるマトリックス溶液の接触角が、上記境界の外の領域の表面におけるマトリックス溶液の接触角より小さい試料支持部材が、本発明の分析方法が質量分析である場合に、より好ましい試料支持部材となる。また、該境界で囲まれた領域の表面における水の接触角が、上記境界の外の領域の表面における水の接触角より小さい試料支持部材が、特に好ましい試料支持部材となる。マトリックス溶液の溶媒が水や水を主成分とするものである場合には、上記境界で囲まれた領域の表面は親水性で、上記境界の外の領域の表面は疎水性であることが好ましい。その中でも、上記境界で囲まれた領域の表面が金で修飾され、上記境界の外の領域の表面がアルキル基又はアリール基で修飾されている上記試料支持部材が更に好ましい。
本発明の分析方法を質量分析に適用した場合の実施例を以下に示す。Micro・Contact・Printing法に従って、プレートへのオクタデシル基の導入を行なった。以下、その表面を「C18」と略記する。具体的には、ポリジメチルシロキサン製の版材を準備し、オクタデシルメルカプタンのエタノール希釈液(2mM)に10分間浸して風乾した。次いで、別途準備した金(Au)基板に3秒間スタンプした。その後、基板をエタノールで洗浄し、乾燥した。内側に1.4mm径の金露出部分を残し、その外側に5mm径のドーナツ状にC18基を導入したものを作製した。以下、オクタデシル基の導入がなされなかった中心部分を「Au」と略記する。
実施例1と同様であるが、トルエンの代わりに脱水キシレン類(キシレン異性体及びエチルベンゼン混合物、和光純薬工業)で洗浄したところ、実施例1と同様な結果が得られた。
実施例1と同様に誘導体化後、洗浄を滴下でなく、ビーカーに満たした溶媒(トルエン、p−キシレン、又はエチルベンゼン)にプレートを入れて数秒後引き上げ、乾く前にふたたび溶媒に浸すことを3回繰り返して行った。図4に示したように何れの溶媒でも低分子領域のノイズがほとんどなくなり洗浄の効果が明白であった。また、滴下でなく、溶媒に浸漬しても糖ペプチドを失うことなく検出可能であった。
実施例1において、ピレン誘導体化後にトルエンで洗浄しない以外は実施例1と同様の操作を行い、MS測定を行った。図2に、ピレン誘導体化後(e)及びマトリックス溶液乾燥後(f)の光学顕微鏡写真を示した。図2(f)には、過剰な誘導体化剤によって一部マトリックスの結晶物が生成しない箇所が見られた。
通常のステンレスプレートを用いて、実施例1と同様な操作を行い、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)質量分析を実施した。図5に、ピレン誘導体化後(a)、トルエン洗浄後(b)及びマトリックス溶液乾燥後(c)の光学顕微鏡写真を示した。トルエン洗浄後に過剰の試薬が除去されていることが分かった。ウェルの外側に溝があり、また、実施例1のプレートのような表面処理が施されていないので、トルエンによる洗浄が完全には行えなかったが、図6上段に示すように、低分子側の試薬由来のノイズが軽減され、測定対象分子である糖ペプチドのシグナルm/z=2282が顕著に検出された。
実施例4と同様な操作を行ったが、ピレン誘導体化後、トルエンで洗浄しないでMS測定を行った。図5に、ピレン誘導体化後(e)及びマトリックス溶液乾燥後(f)の光学顕微鏡写真を示した。
ヒト血清アルブミン5μgを、10mMジチオスレイトールの10mM重炭酸アンモニウム中で55°C、45分処理した後、15mMヨードアセタミドを加えて室温暗所で反応させた。その反応混合物に0.1%RapiGest SF(ウォーターズ)を加え、100℃、5分間処理した後、トリプシン水溶液1μg/2μL、25mM重炭酸アンモニウム中で37℃、3時間反応させた。
実施例5において、誘導体化しない以外は実施例5と同様にして、測定試料を作製し測定を行った。ポジティブイオンスペクトルの結果を図7aに示した。誘導体化をしないと、洗浄の有無にかかわらず、白矢印で示したアルブミン由来ペプチドのみが検出され、糖ペプチドは検出できなかった。
測定対象分子として実施例1と同じ糖ペプチド2を10fmol用いて、誘導体化をエッペンチューブ内で行い、反応混合物全量をプレートに置いたが、図8下に示したように、質量分析がそもそもできないことが分かった。
一方、比較例4と同量の糖ペプチド2を用いて、プレート上で直接誘導体化、洗浄を行った結果、明確なシグナルが得られた(図8上)。
Claims (6)
- 試料支持部材上の誘導体化した測定対象分子を分析する方法であって、該測定対象分子を含む試料及び誘導体化剤を試料支持部材上に載せて反応させ、反応後の試料支持部材上を、誘導体化剤と反応後の測定対象分子を実質的に溶解せず、誘導体化剤を溶解する洗浄用溶媒で洗浄した後に分析することを特徴とする分析方法。
- 上記洗浄が、上記洗浄用溶媒の試料支持部材上への滴下、又は上記試料支持部材の上記洗浄用溶媒への浸漬を含む操作である請求項1に記載の分析方法。
- 上記誘導体化剤が縮合多環誘導体化合物であり、上記洗浄用溶媒が芳香族炭化水素系溶媒である請求項1又は請求項2に記載の分析方法。
- 上記誘導体化剤がピレン誘導体化合物であり、上記洗浄用溶媒がトルエン、キシレン若しくはエチルベンゼン、又はこれらの組合せである請求項3に記載の分析方法。
- 上記分析が質量分析である請求項1ないし請求項4の何れかの請求項に記載の分析方法。
- 上記質量分析が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)質量分析である請求項5に記載の分析方法。
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