WO2011027819A1 - 質量分析法 - Google Patents

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WO2011027819A1
WO2011027819A1 PCT/JP2010/065016 JP2010065016W WO2011027819A1 WO 2011027819 A1 WO2011027819 A1 WO 2011027819A1 JP 2010065016 W JP2010065016 W JP 2010065016W WO 2011027819 A1 WO2011027819 A1 WO 2011027819A1
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WO
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molecule
starting point
matrix
measured
matrix solution
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Application number
PCT/JP2010/065016
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English (en)
French (fr)
Inventor
天野純子
勤 西根
Original Assignee
公益財団法人野口研究所
島津製作所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/02—Details
    • H01J49/10—Ion sources; Ion guns
    • H01J49/16—Ion sources; Ion guns using surface ionisation, e.g. field-, thermionic- or photo-emission
    • H01J49/161—Ion sources; Ion guns using surface ionisation, e.g. field-, thermionic- or photo-emission using photoionisation, e.g. by laser
    • H01J49/164—Laser desorption/ionisation, e.g. matrix-assisted laser desorption/ionisation [MALDI]

Definitions

  • the present invention relates to mass spectrometry, and more particularly to mass spectrometry in which a measurement sample prepared by a specific method on a specific plate is provided to a mass spectrometer.
  • MS Mass spectrometry
  • sample ionization is an important process that determines whether analysis is possible and the quality of the spectrum obtained, and many ionization methods have been developed so far to efficiently ionize the sample.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization
  • ESI electrospray ionization
  • Mass spectrometers using these ionization methods are widely used in the bio field because they can be measured with a smaller amount of sample than NMR.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Non-Patent Documents 1 and 2.
  • Patent Documents 5 and 6 a technique for improving the sensitivity by precipitating matrix crystals containing sample molecules in a fine and uniform state has been proposed (for example, Patent Documents 5 and 6).
  • sweet spot This part is called “sweet spot”.
  • MALDI MALDI
  • the sample prepared by the conventional sample preparation method has a low ion generation amount, and eventually has to be measured using a special matrix. Even so, there were cases where an excellent sweet spot could not be found.
  • the MS repeatedly repeats selection and fragmentation of the ion derived from the molecule to be measured as the precursor ion, and further selects and fragments the generated ion as the precursor ion.
  • n (2 ⁇ n) analysis is essential.
  • the signal intensity of ions obtained by MS / MS (MS 2 ) measurement is reduced to about 1/10 of the previous stage ions. Therefore, by performing multi-stage MS (MS n (2 ⁇ n)) measurement, the information on the chemical structure becomes extremely large, but the detection sensitivity decreases, so that the necessity for improving ionization efficiency increases more and more. It will be.
  • the present invention has been made in view of the above-described background art, and the problem can be applied to a commonly used matrix for MALDI method, and the amount of ion generation of a sample containing a molecule to be measured at the time of laser irradiation,
  • An object of the present invention is to provide a mass spectrometry method capable of improving the ionization efficiency as compared with the conventional method.
  • a multi-step MS (MS n (2 ⁇ n)) measurement can be performed by preparing a measurement sample on the plate that makes it easy to reveal sweet spots, or displays many or many sweet spots.
  • MS MS n (2 ⁇ n)
  • An object of the present invention is to provide a mass spectrometry method capable of obtaining information on a high chemical structure.
  • the inventor first formed a starting point on the plate on which precipitation of matrix crystals started, when preparing a measurement sample on the measurement plate.
  • a sample or matrix solution By placing a sample or matrix solution in a region in contact with the starting point and drying the matrix solution, crystals can be precipitated from the starting point, and the peripheral portion of the starting point becomes a sweet spot with excellent ionization efficiency. I found out. At this time, it was discovered that it is more useful to crystallize with a spread rather than to make a matrix crystal in a smaller area.
  • the peripheral portion of the starting point is further increased.
  • the present invention has been completed by finding that it is a sweet spot with extremely excellent ionization efficiency.
  • the present invention forms a starting point on which a matrix crystal starts to be deposited on a plate, places a sample containing a molecule to be measured in a region in contact with the starting point, and then places a matrix solution, or contains a molecule to be measured.
  • Mass spectrometry characterized by placing a sample and a matrix solution at the same time, drying the matrix solution, precipitating crystals from the starting point to a region in contact with the starting point, and then obtaining a signal from the peripheral part of the starting point It provides the law.
  • the present invention provides a method in which, in the mass spectrometry described above, after placing a sample containing a molecule to be measured, a derivatizing agent is placed in a region in contact with the starting point to react with the molecule to be measured, and then a matrix solution is placed.
  • a mass spectrometry method is provided.
  • the above-mentioned problems can be solved and the above-mentioned problems can be solved, and it can be applied to a matrix generally used for the MALDI method, and the ion generation amount and ionization efficiency of a sample containing a molecule to be measured can be improved.
  • Mass spectrometry can be provided. That is, it is possible to provide a mass spectrometry method using a measurement sample having an excellent sweet spot.
  • Mass spectrometry can be provided. As a result, mass spectrometry is possible even when there is only a small amount of sample that would be less than the amount that can be analyzed with the usual method for preparing a measurement sample, and even when there is a sufficient amount, it is more reliable. High chemical structure information can be obtained easily and reliably.
  • the present invention can be applied to a small amount of molecules derived from biological samples or molecules in biological samples, for example, molecules such as sugars, proteins (including peptides), glycoproteins (including glycopeptides), nucleic acids, glycolipids, etc.
  • molecules such as sugars, proteins (including peptides), glycoproteins (including glycopeptides), nucleic acids, glycolipids, etc.
  • information useful for elucidating functions and pathological conditions can be obtained more suitably.
  • Example 3 the signal of the measurement target molecule was detected from which position of the matrix crystal by the optical micrograph (upper figure) showing the precipitation state of the matrix crystal containing the measurement target molecule and the raster scan of the mass spectrometer. It is the result (bottom figure) which investigated about ru.
  • Example 1 it is a figure of the optical micrograph which shows the state of precipitation of the matrix crystal containing a measuring object molecule
  • numerator. Left: [Au inner diameter] 0.9 mm
  • Right: [Au inner diameter] 0.6 mm
  • Example 1 it is the result of investigating from which position of a matrix crystal the signal of a measuring object molecule is detected by the raster scan of a mass spectrometer.
  • FIG. 1 is a diagram showing a mass spectrometry spectrum of a sample of 5 fmol in Example 2.
  • FIG. It is a figure of the optical microscope photograph of the signal of the measurement object molecule
  • B It is a figure which shows from which position the signal of a measuring object molecule
  • the present invention is a mass spectrometry characterized by having the following steps (1) to (4) as essential steps.
  • step (2) either one of the following (2a) or (2b) is performed.
  • another process may be inserted between each of the following processes, and an operation not described below can be added even in the following one process.
  • starting point where the matrix crystal starts to be deposited examples include the following.
  • A Regardless of the same or different material on the substrate, points on the minute, scratches, grooves, holes, protrusions, etc.
  • C Points on the traces of the dried reagent solution or solvent
  • C A point on a partition of a region having a different dielectric constant
  • D A step on the substrate is defined as a “separation” regardless of the same or different material, and a point on the partition. in this case.
  • the “region in contact with the starting point” may be at a higher level or at a lower level.
  • E A point on a partition where a film is formed with a high portion of a stepped portion on a substrate made of a film.
  • the “region in contact with the starting point” may be a film or a non-film. Further, even if the film is in the middle part of the plate and the film is on the “region in contact with the starting point”, the central part of the film is cut out, and the portion without the cut out film is in contact with the “starting point”. It may be a “region”.
  • the above “starting point from which the matrix crystal starts to be deposited” may be a point on the portion as described in the above (a) and (b), but for example, as in the above (c), (d) and (e) It is also preferable that the point is on the “break not allowing the matrix solution to pass”. If the matrix solution is allowed to pass freely, the starting point of crystallization is reduced, and it may be difficult to deposit matrix crystals in which many sweet spots are present.
  • the partition that does not allow the matrix solution to pass through is preferably a partition from a non-intrusion region where the matrix solution does not substantially flow. In the present invention, a region outside the “region in contact with the starting point” and where the matrix solution does not substantially flow is referred to as a “non-intrusion region”.
  • the shape of the “separator” is not particularly limited, and may be a straight line or a curved line.
  • the shape formed by the “break” is not particularly limited, but is preferably a substantially closed shape.
  • the matrix solution is dried to precipitate crystals from the starting point in the “region in contact with the starting point”, and then a signal is obtained from the peripheral portion of the starting point.
  • the “break” is a substantially closed shape, crystals are deposited inside the shape, that is, on the “region in contact with the starting point” side. If the “separation” is a substantially closed shape, the outside of the shape becomes the “non-intrusion region”.
  • the “substantially closed shape” may be any shape with no corners such as a perfect circle, ellipse, or cloud shape, or a shape with corners such as a polygon, a star shape, or a shape having a jagged circumference. Good. A figure without corners is preferred in that when the matrix solution is dried, good crystals are precipitated starting from the points on the partition and the number of sweet spots is increased. Particularly preferred is a perfect circle.
  • the point on the partition becomes the starting point for matrix crystallization when the matrix solution is dried. It is not necessary for all matrix crystals to be deposited starting from the points on the partition, but at least some of the matrix crystals are deposited starting from the points on the partition.
  • the present invention has been made by finding that there are many excellent sweet spots in the matrix crystal deposited from the point on the boundary, that is, in the peripheral part of the starting point which is the point on the boundary. is there.
  • peripheral of the starting point refers to the root where the matrix crystal starts to grow, that is, a part within 300 ⁇ m from the starting point.
  • There are many excellent sweet spots preferably within 200 ⁇ m from the starting point, particularly preferably within 100 ⁇ m from the starting point. If it is too far from the starting point, there may be no excellent sweet spots or the number of sweet spots may be reduced.
  • matrix crystals often grow away from the partition.
  • the matrix solution is placed in an area in contact with the starting point, so when the matrix solution is placed in the opposite direction from the one placed from the starting point ( If not).
  • a starting point on which precipitation of matrix crystals starts is formed on the plate.
  • the starting point preferably has the above characteristics. Although there is no particular limitation, a specific type of starting point having such characteristics and a specific method of making the starting point having such characteristics will be described below.
  • the “separation” where the “starting point” in the present invention is present is not particularly limited as long as it has the above-mentioned characteristics, but specific examples include a separation having different dielectric constants. Furthermore, it is particularly preferable that the dielectric constant at the surface of the non-intrusion region outside the “separator” is smaller than the dielectric constant at the surface of the region in contact with the starting point.
  • the matrix solution When drying, a crystal having a very excellent sweet spot can be deposited around the point (particularly the periphery inside the partition) starting from a point on the partition.
  • the dielectric constant on the surface of the non-intrusion region is made smaller than the dielectric constant in the inner region of the partition, and the matrix placed on the inner side of the partition (the region in contact with the starting point that is the point on the partition)
  • the matrix solution By confining the solution inside the partition, a meniscus that becomes concave around the partition cannot be formed, and when the matrix solution dries, a crystal having an extremely excellent sweet spot starts from a point on the partition. It can be deposited.
  • the surface of the region surrounded by the partition is a metal and the surface of the non-intrusion region is modified with an organic group.
  • the manufacturing method will be described below. However, the method for manufacturing a plate having such a partition is not limited to the following specific manufacturing method.
  • Modification of the plate surface with an organic group can be performed, for example, according to the Micro Contact Contact Printing method (Harvard University, Whitesides et al., Langmuir Vol. 10.1498-1511 (1994). For example, such polydimethylsiloxane.
  • the plate material is prepared, and the plate material is dipped in an ethanol solution of octadecyl mercaptan for a predetermined time and air-dried, and then this plate material is stamped on the surface of a separately prepared gold (Au) substrate for 3 seconds.
  • the mercapto group of the above compound existing on the plate material reacts with the gold surface to form an Au—S bond, thereby forming donut-shaped self-assembled monolayers (SAMs) on the gold surface.
  • the gold substrate can be washed with ethanol and dried to obtain a plate whose surface is modified with an organic group.
  • the method of modifying the surface of the gold substrate with an organic group is not limited to the above stamp method, and various coating methods such as spin coating, roll coating, and screen printing can also be employed.
  • gold, silver, platinum, palladium, rhodium, ruthenium or alloys thereof capable of adsorbing thiol can be used.
  • gold that can be stably produced and that does not undergo surface oxidation in the atmosphere is preferred in practice.
  • the organic group used for the modification is an alkyl group having any carbon number such as a butyl group, an octyl group, a dodecyl group or a stearyl group, or a fluorine-substituted alkyl group; a monocycle such as a phenyl group, a thienyl group, a pyrrolyl group or a pyridyl group
  • aryl group of the formula condensed polycyclic aryl groups such as a naphthyl group, anthryl group, pyrenyl group, quinolyl group, indolyl group, acrylidinyl group, benzothiazolyl group, and the like.
  • an aryl group may be bonded as a substituent to the alkyl group, and an alkyl group may be bonded as a substituent to the aryl group.
  • functional groups such as COOH, SO 3 H, NH 2 , NO 2 , OH, COOCH 3 , and CN may be bonded.
  • the surface of the region in contact with the starting point is hydrophilic and the surface of the non-intruding region is hydrophobic, for example, to confine the matrix solution inside the partition.
  • the dielectric constant of the surface of the area surrounded by the partition is larger than the dielectric constant of the surface of the non-intrusion area in terms of creating the above state.
  • the matrix solution is an aqueous solution
  • the surface of the region surrounded by the partition (the region in contact with the starting point) is modified with gold
  • the surface of the non-intruding region is modified with an alkyl group or an aryl group.
  • a plate that is “Modified with gold” may be gold plating or metal gold itself.
  • the “alkyl group or aryl group” includes those having the above-described substituents bonded thereto.
  • a plate in which the surface of the non-intrusion region is modified with an alkyl group is particularly preferable because the dielectric constant of the surface of the non-intrusion region can be adjusted and the matrix solution can be easily prevented from passing through.
  • a plate in which the gold surface is left as it is as a region surrounded by a partition (a region in contact with the starting point) and the outside thereof is modified with an alkyl group or an aryl group (more preferably an alkyl group) is particularly preferable.
  • the above-described partition through which the matrix solution does not pass is a partition having a different height. That is, it is also preferable that the height of the region surrounded by the partition is different from the height of the non-intrusion region, and one of them is high, and the difference in height forms the partition.
  • the height value and “the angle of the bank or wall forming the height difference” are not particularly limited.
  • the partition through which the matrix solution does not pass is the presence or absence of a membrane.
  • a film is not particularly limited, but a material having a dielectric constant different from that of the plate is preferable. Specifically, siloxanes, polytetrafluoroethylene (PTFE), silicone, polyethylene, polypropylene, polystyrene, polyvinyl chloride, polycarbonate, polysulfone, polyethersulfone, polyarylate, polymethylpentene, 1,3-cyclohexadiene series
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • silicone silicone
  • polyethylene polypropylene
  • polystyrene polyvinyl chloride
  • polycarbonate polysulfone
  • polyethersulfone polyarylate
  • polymethylpentene 1,3-cyclohexadiene series
  • the film include a polymer.
  • the high part of the stepped portion on the substrate is made of a film, and the presence or absence of the film is a partition, and the point on the partition is the starting point for the precipitation of the matrix crystal.
  • the “region in contact with the starting point” where crystals are deposited may be a film or a non-film.
  • the central part of the film is hollowed out, and the surface part without the film is “A region in contact with the starting point” may be used.
  • ⁇ Plate In the present invention, it is indispensable to first form a starting point where the matrix crystal starts to be deposited on the plate before placing the sample or matrix on the plate.
  • the material of the plate surface is in contact with the starting point.
  • regions regions where crystals are deposited
  • examples thereof include metals or alloys such as gold, silver, platinum, palladium, and stainless steel; carbon and the like, and these surfaces may be modified at the molecular level with organic substances, inorganic substances, and the like.
  • the starting point for starting the precipitation of the matrix crystal is preferably a point on the outer periphery of 0.05 mm to 10 mm.
  • the length of the break is 0.05 mm to 10 mm, and the point on the break is the starting point. More preferably, it is 0.3 mm to 9 mm, and particularly preferably 3 mm to 7 mm. Outside this range, as shown in the examples, good crystals having a sweet spot are not concentrated around the starting point, and as a result, a good measurement sample may not be obtained.
  • Step (2) a method for preparing a measurement sample for mass spectrometry of the present invention will be described below. That is, first, (2) In the area in contact with the starting point, (2a) Place the sample containing the molecule to be measured, and then place the matrix solution, or (2b) Place the sample containing the molecule to be measured and the matrix solution at the same time. In the step (2), either one of the following (2a) or (2b) is performed. In the step (2a), for example, another operation such as placing a derivatizing agent to react with the molecule to be measured, or further washing the derivatizing agent can be inserted.
  • ⁇ Method (2a) a sample containing a molecule to be measured is placed, and then a matrix solution is placed.
  • the sample containing the molecule to be measured may be placed alone or in a solution.
  • the solvent may be removed by evaporation, or the matrix solution may be placed thereon without removing the solvent.
  • the solvent for dissolving the measurement target molecule is not particularly limited as long as it dissolves the measurement target molecule or “sample containing the measurement target molecule”, but water or the like is preferable.
  • the sample containing the molecule to be measured may be placed on at least the region in contact with the starting point on the plate, or may be placed outside the region in contact with the starting point.
  • the sample containing the molecule to be measured is very small, almost all of the trace sample is analyzed. It is particularly useful because it can be used for It is more useful when the sample containing the molecule to be measured is 10000 fmol (10 pmol) or less, more useful when it is 1000 fmol (1 pmol) or less, and particularly useful when it is 100 fmol (0.1 pmol) or less.
  • the “concentration of the molecule to be measured in the sample solution containing the molecule to be measured” in the method (2a) is not particularly limited, but is preferably 1 amol / ⁇ L to 1 ⁇ mol / ⁇ L, particularly preferably 100 amol / ⁇ L to 1 nmol / ⁇ L.
  • the thickness of the layer containing the molecule to be measured present on the plate is not particularly limited, but is preferably 5 ⁇ m or less, particularly preferably 1 ⁇ m or less. If the thickness of such a layer is too thick, when the matrix solution is dropped, it may not mix well with the matrix molecules, and the signal may decrease.
  • a solution in which only the matrix is dissolved in a solvent is dropped onto the plate and dried.
  • the meaning of “after placing the sample containing the molecule to be measured” is not limited to “immediately after placing the sample containing the molecule to be measured”, and other steps may be inserted.
  • a derivatizing agent is placed on the region in contact with the starting point and reacted with the molecule to be measured. After washing, a solution obtained by dissolving only the matrix in a solvent may be dropped on the plate and dried.
  • a solution in which only the matrix is dissolved in a solvent is dropped on the plate and dried.
  • the matrix is not particularly limited, and known ones can be used. 2,5-dihydroxybenzoic acid (hereinafter abbreviated as “DHBA”), 1,5-diaminonaphthalene, norharman (9H-pyrido [3, 4-b] indole), pyrene derivatives and the like.
  • the solvent is not particularly limited as long as it dissolves the matrix to be used, and examples thereof include water, acetonitrile, methanol, ethanol, and mixtures thereof.
  • the solvent here is preferably not only a matrix but also a molecule in which at least a part of the molecule to be measured is dissolved, and particularly preferably a solvent in which most of the molecule to be measured can be dissolved with the solvent used.
  • the matrix solution it is essential to place the matrix solution on the plate-shaped region in contact with the starting point, but it is preferable to place the matrix solution only on the region surrounded by the “separator”.
  • the matrix solution by dropping the matrix solution onto a part of the region in contact with the starting point, the matrix solution is spread over the entire region surrounded by the “separation”, and as a result, surrounded by the “separation”. In other words, the matrix solution is placed only in the region.
  • the volume of the matrix solution when the matrix solution is placed only in the region surrounded by the “separator” is preferably adjusted according to the area of the region surrounded by the “separator”. If the region surrounded by the “separator” is a perfect circle having a diameter of 1.4 mm, 0.2 ⁇ L to 20 ⁇ L is preferable, 0.3 ⁇ L to 2 ⁇ L is more preferable, and 0.5 ⁇ L to 1 ⁇ L is particularly preferable. When the area of the region surrounded by the “separator” increases or decreases from the area, it is preferable to increase or decrease the volume of the matrix solution to be placed in proportion to the area.
  • the concentration of the matrix solution is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 1000 mg / mL, more preferably 1 to 300 mg / mL, and particularly preferably 10 to 100 mg / mL.
  • the volume of the matrix solution to be placed is adjusted according to the area of the region surrounded by the “separator”, and the concentration of the matrix solution is around the region surrounded by the “separator”. It is preferable to determine the length by increasing or decreasing in proportion to the length (that is, the length of the “separation”). By doing so, the absolute amount of the matrix present in the peripheral part of the starting point can be adjusted.
  • ⁇ Method (2a ′) using a derivatizing agent in the method (2a) employs the method (2a) in the above step (2), and after placing the sample containing the molecule to be measured in step (2a), before placing the matrix solution. It is preferable to place a derivatizing agent in the region surrounded by the above “separator” and react with the molecule to be measured because the ion generation amount and ionization efficiency of the sample containing the molecule to be measured can be improved.
  • mass spectrometry having the following steps is preferable. (1) Forming a closed partition on the plate that is the starting point for matrix crystallization, (2) In the area surrounded by the separator, (2a ′) After placing a sample containing a molecule to be measured, a derivatizing agent is placed on the region surrounded by the partition to react with the molecule to be measured, and then a matrix solution is placed. (3) After drying the matrix solution to precipitate crystals starting from the points on the partition, (4) Mass spectrometry characterized by obtaining a signal from the peripheral portion of the starting point.
  • the step (2a ′) may include a step of washing the derivatizing agent after the derivatizing agent is placed and reacted with the molecule to be measured and before the matrix solution is placed.
  • the derivatizing agent is previously reacted with the molecule to be measured and then supplied to the plate, it may lead to sample loss. Therefore, when mass spectrometry is applied to a small amount of “molecules derived from living organisms or molecules in biological samples” such as sugars, glycoproteins, glycopeptides, etc., the method (2a ′), that is, a sample containing the molecule to be measured is used. It is preferable to place the derivatizing agent in the region surrounded by the above-mentioned partition and react with the molecule to be measured after the placement and before placing the matrix solution.
  • the derivatizing agent is not particularly limited as long as it reacts with a derivatized molecule to be measured, that is, a molecule to be subjected to mass spectrometry to increase ionization efficiency.
  • the ionization efficiency may be increased in the laser desorption ionization method, or the ionization efficiency may be increased in the electrospray ionization method.
  • a condensed polycyclic compound having a condensed polycycle such as naphthalene, anthracene, and pyrene in the molecule preferably exhibits the above effects. Therefore, it is particularly preferable.
  • the “condensed polycyclic compound” means a reactivity capable of binding a molecule to be measured with a condensed polycyclic moiety which may partially contain a heterocyclic ring containing nitrogen, sulfur or oxygen molecules.
  • the derivatizing agent is capable of controlling the ionization cleavage position of the derivatized molecule, that is, the molecule subjected to mass spectrometry, by reacting with the molecule to be measured.
  • the derivatizing agent preferably has a reactive functional group such as an amino group, a hydrazide group, a diazomethyl group, a succinimidyl ester group, a sulfonyl chloride group, or an iodo group (—I).
  • a condensed polycyclic derivative compound in which the above group is bonded to a condensed polycycle such as a naphthalene ring, an anthracene ring, or a pyrene ring directly or through another group (spacer portion) Methyl iodide; diazomethane; trimethylsilyldiazomethane and the like.
  • a pyrene ring compound is particularly preferable in terms of increasing ionization efficiency of a derivatized molecule, that is, a molecule subjected to mass spectrometry, and controlling an ionization cleavage position.
  • the “pyrene ring compound” means a pyrene ring, a reactive functional group that can be bonded to the “molecule to be measured”, and, if necessary, a spacer that connects the pyrene ring and the reactive functional group. And a compound having a moiety.
  • 1-pyrenebutanoic acid, hydrazide (hereinafter abbreviated as “PBH”), 1-pyreneacetic acid, hydrazide, 1-pyrenepropionic acid hydrazide ( 1-pyrenepropionic acid, hydrazide), 1-pyreneacetic acid, succinimidyl ester, 1-pyrenepropionic acid, succinimidyl ester, 1-pyrenepropionic acid, succinimidyl ester Cynimidyl ester (1-pyrenebutanoic acid, succinimidyl ester), N- (1-pyrenebutanoyl) cysteic acid succinimidyl ester (N- (1-pyrenebutanoyl) cysteic acid, succinimidyl ester), N- (1-pyrene) iodoacetamide (N- (1-pyrene) iodoacetamide), N- (1-pyrene) iodomaleimide, N-
  • Preferred examples of the derivatizing agent include those obtained by replacing the pyrene ring with a naphthalene ring or an anthracene ring in the above specific compound. Also preferred are methyl iodide, diazomethane or trimethylsilyldiazomethane.
  • the molecule to be measured is a molecule having a sugar chain containing an aldehyde group, a reducing hydroxyl group, etc., and the derivatizing agent has an amino group, a hydrazide group or the like. The case where it is a thing is mentioned.
  • the molecule to be measured is a protein or glycoprotein having a carboxyl group, an amino group or a mercapto group, and the derivatizing agent has an amino group, a hydrazide group or a diazomethyl group.
  • the measurement target molecule may be a protein or glycoprotein having a carboxyl group
  • the derivatizing agent may be methyl iodide or trimethylsilyldiazomethane.
  • the reaction temperature of the molecule to be measured and the derivatizing agent is not particularly limited, but the reaction is preferably carried out at 40 to 100 ° C, particularly preferably 60 to 90 ° C. This is because not only the reaction rate increases by reacting at a temperature higher than room temperature, but also the reaction product remains in contact with the partition by increasing the rate at which the solvent dries. When the remaining reaction mixture overlaps on the partition, it becomes more certain that the crystals of the matrix are precipitated from the point on the partition and start from the point on the partition.
  • step (2) instead of the method (2a) described above, (2b) a sample containing the molecule to be measured and a matrix solution may be placed simultaneously.
  • a method known as “Drived Droplet method” is also possible.
  • the concentration of the molecule to be measured and the concentration of the matrix of the solution in the method (2b) are not particularly limited, and a solution that is simultaneously contained at the concentration described above in (2a) may be used.
  • the matrix solution is dried, and crystals are precipitated from the starting point to a region in contact with the starting point.
  • the matrix solution is dried to precipitate crystals starting from the points on the partition.
  • the drying method is not particularly limited, but it may be effective to promote drying by heating, cooling, sending air, depressurizing, or the like. At this time, a small amount of molecules that change the interfacial tension may be present. For example, a pyrene-labeled peptide present at the boundary or a pyrene derivatizing agent remaining in a trace amount after washing is preferable.
  • the crystal is deposited by standing vertically and starting from the point on the partition, since the lower part defines the starting point of the crystal (see Example 3).
  • FIG. 2 shows an optical micrograph of an example of a particularly preferred embodiment.
  • the crystal is particularly within the region surrounded by the partition (the perfect circle). It can be seen that the crystal has grown toward almost the center of the circle, and crystals have been deposited starting from the point on the boundary.
  • a solution containing the molecule to be measured and the matrix is formed on the plate, but there are surprisingly many sweet spots on the crystal surface where the solution starts to dry and first precipitates.
  • the present invention has been made by finding that there are many sweet spots specifically at the place where the matrix crystal starts to precipitate.
  • a signal is obtained from the peripheral portion of the starting point.
  • a signal is obtained from the peripheral part of the starting point which is a point on the (4) break.
  • FIG. 1 and FIG. 3 there are many sweet spots specifically around the starting point, which is the point on the break. This is remarkable when the starting point of the precipitation of the matrix crystal is a point on the outer periphery of 0.05 mm to 10 mm, more remarkable when it is a point on the outer periphery of 0.3 mm to 9 mm, 3 mm to This is particularly noticeable when the point is on the outer periphery of 7 mm. Further, it is more remarkable when the point is on the circumference having a diameter of 0.7 mm to 2 mm (see “0.9 mm” in FIG. 3).
  • the “measuring molecule” is not particularly limited, but is preferably a molecule derived from a living body or a molecule in a biological sample. Specifically, sugar, protein, peptide, glycoprotein, glycopeptide, nucleic acid, glycolipid, etc. It is preferable that the effect of the present invention can be further exhibited.
  • a “molecule to be measured” those prepared from natural products, those prepared by partially modifying natural products chemically or enzymatically, and those prepared chemically or enzymatically are also preferred. .
  • numerator contained in the biological body are also preferable.
  • the sample placed on the plate used for mass spectrometry may be only the “measuring molecule” itself, or one containing the “measuring molecule”, for example, a tissue of a living body, It may be a cell, body fluid or secretion (eg, blood, serum, urine, semen, saliva, tears, sweat, stool, etc.). That is, a biological sample may be used directly.
  • the molecule to be measured may be prepared by placing a sample on a plate and performing enzyme treatment or the like.
  • the above-mentioned molecules are often obtained in a small amount of sample to be analyzed, and in particular, obtained by chemically or enzymatically liberating complex carbohydrates such as sugars, glycoproteins, glycolipids, etc. Since there are a plurality of isomers having the same molecular weight and composition, the mass spectrometric method of the present invention is preferable since the above-described effects are exerted particularly on the chemical structure analysis of these molecules.
  • the measurement sample prepared by the preparation method described above exhibits the effects of the present invention described above. That is, if such a measurement sample is subjected to mass spectrometry, the amount of ion generation and ionization efficiency of the sample containing the molecule to be measured can be improved. That is, since an excellent sweet spot exists in such a measurement sample, sensitivity, accuracy, reproducibility and the like in mass spectrometry are improved.
  • Examples of the laser used for ionization include a nitrogen laser (337 nm), a YAG laser triple wave (355 nm), an NdYAG laser (256 nm), a carbon dioxide gas laser (2940 nm), and a nitrogen laser is preferable.
  • the ion separation and detection method is not particularly limited. Double focusing method, quadrupole focusing method (quadrupole (Q) filter method), tandem quadrupole (QQ) method, ion trap method, time of flight (TOF) ) Method or the like to separate and detect ionized molecules according to the mass / charge ratio (m / z). QIT-TOF is preferable.
  • MS n method Since molecules such as sugars, proteins, peptides, glycoproteins, glycopeptides, nucleic acids, and glycolipids contain many isomers having the same molecular weight and composition, this method improves ion generation efficiency and repeats molecular fragmentation n times (Hereinafter, sometimes abbreviated as “MS n method”) is preferable. Since the present invention can be measured even with a very small amount of sample containing the molecule to be measured, it is particularly preferred to apply the MS n method (2 ⁇ n) in which fragmentation is repeated n times for the measurement sample described above. By analyzing the ion containing the selected label by MS n method, the binding position in the molecule can be determined.
  • Example 1 Preparation of plate The surface of the plate was modified with octadecyl groups according to the Micro-Contact-Printing method. Specifically, a plate material made of polydimethylsiloxane hollowed in a perfect circle shape was prepared, and dipped in an ethanol dilution of octadecyl mercaptan (2 mM) for 10 minutes and air-dried. Subsequently, stamping was performed for 3 seconds on a separately prepared gold (Au) substrate. Thereafter, the gold (Au) substrate was washed with ethanol and dried. Five types of circular portions in which gold remained without being processed were respectively 0.6 mm, 0.7 mm, 0.8 mm, 0.9 mm, and 1.0 mm.
  • the inside of the circle on the plate (the portion where gold remains without being processed) is abbreviated as “Au”, and the portion outside the circle on the plate and processed is abbreviated as “C18”.
  • the circumference of “Au” is the “separator” in the present invention.
  • the substrate is silicon other than gold (hereinafter abbreviated as “Si”) or the like, the portion outside the circle on the plate and treated as described above is abbreviated as “C18”.
  • a solution containing a glycopeptide (5 fmol to 5 pmol) as a molecule to be measured was placed on a plate on which a matrix crystal precipitation started in advance as described above, and dried.
  • 0.25 ⁇ L of a DMSO solution containing 500 pmol of PDAM was added dropwise as a derivatizing agent, and pyrene derivatization was performed by heating to 80 ° C. and drying for about 5 minutes.
  • the matrix solution was dried by dropping a DHBA aqueous solution having the following concentration and liquid amount according to the inner diameter of Au.
  • Inner diameter of Au Length of outer circumference: concentration of matrix solution, dripping amount of matrix solution 0.6 mm: 1.9 mm: 15 mg / mL, 0.25 ⁇ L 0.7 mm: 2.2 mm: 18 mg / mL, 0.25 ⁇ L 0.8 mm: 2.5 mm: 20 mg / mL, 0.25 ⁇ L 0.9 mm: 2.8 mm: 18 mg / mL, 0.30 ⁇ L 1.0 mm: 3.1 mm: 15 mg / mL, 0.40 ⁇ L
  • the dripping amount of the matrix solution was adjusted to a preferable range according to the area of the region (Au) surrounded by the partition.
  • the concentration of the matrix solution is determined based on the dripping amount, and the length of the periphery of the region surrounded by the above-mentioned partition (that is, the length of the closed partition, the length of the outer periphery) Increased or decreased in proportion to
  • FIG. 2 shows a microscopic image of the sample / matrix crystal when the diameters of 0.6 mm and 0.9 mm are used.
  • the positive and negative ions of the crystallized product of glycopeptide and matrix were measured by a raster scan of a mass spectrometer (AXIMA-QIT, manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the signal intensity increased 5 to 8 times compared to the case of using a normal stainless steel plate (see the following comparative example). Since the area is small at a diameter of 0.6 mm, it was further concentrated and a slight improvement in signal intensity was observed. However, since measurement points are limited, the measurement is repeated with the same sample. MS n (n is an integer of 2 or more) measurement It was disadvantageous.
  • the solution evaporates while maintaining the diameter of the C18 inner rim, and the crystal is precipitated first from the interface. Began to do. Thus, the place where the crystalline substance precipitated first was strong in the glycopeptide signal.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, a plate on which Au and C18 were arranged so as to have an inner diameter of 1.4 mm (outer periphery of 4.4 mm) was produced. In the same manner as in Example 1, the glycopeptide was dropped and dried to obtain a pyrene derivative. As the matrix solution, 0.5 ⁇ L of 20 mg / mL DHBA aqueous solution was used. MS measurement was performed in the same manner as in Example 1.
  • Example 3 In the same manner as in Example 2, the glycopeptide was dropped and dried to obtain a pyrene derivative. After placing 0.75 ⁇ L of a 10 mg / mL DHBA aqueous solution of the matrix solution, the plate was set up vertically and dried at room temperature to precipitate crystals.
  • Example 4 In the same manner as in Example 2, a plate on which Au and C18 were arranged and a plate on which Si and C18 were arranged so as to have an inner diameter of 1.4 mm (outer periphery: 4.4 mm) were produced.
  • the glycopeptide was dropped and dried to obtain a pyrene derivative.
  • the plate Before dropping the matrix solution, the plate was immersed in a solvent that dissolves the derivatizing agent in order to remove excess derivatizing agent (PDAM). Specifically, it was dipped in a beaker filled with xylene (manufactured by SIGMA) for 2 seconds, and this was repeated three times.
  • PDAM derivatizing agent
  • Comparative Example 1 The same operation as in Example 1 was performed using a stainless plate that was polished and expected to have a concentration effect. However, pyrene derivatization was performed by heating to 40 ° C. and drying for about 30 minutes, and MS measurement was performed. went.
  • the outer periphery of the crystal was a distorted circle and never became a perfect circle.
  • this crystal as shown in FIG. 5c, there were many sites where signals were detected on the outer periphery, but they were also observed inside.
  • a place where a signal is strongly detected is not specified, and there are problems such as a long measurement time and low sensitivity.
  • the measurement target molecules are localized in the periphery of the starting point on the partition before placing the matrix solution. It is considered that the matrix solution was dissolved in the dispersed glycopeptide and precipitated as a crystalline product of the glycopeptide and matrix from the starting point on the C18 and Au partition, and a good signal was detected from that portion.
  • the mass spectrometry method of the present invention can provide a measurement sample containing a lot of sweet spots with high ionization efficiency, thereby obtaining information on the chemical structure with high reliability. It is widely used not only for the chemical structure analysis of molecules in samples but also for the elucidation of functions and pathophysiology.

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Abstract

　一般に用いられているマトリックスにも適用可能で、測定対象分子のイオン生成量やイオン化効率を向上でき、試料が極めて微量であっても、イオン化効率や測定の再現性を向上させることによって、信頼性の高い化学構造についての情報を得ることができる質量分析法を提供することを課題とし、プレート上にマトリックス結晶の析出が始まる起点を形成し、該起点に接する領域に、測定対象分子を含む試料を載せ、次いでマトリックス溶液を載置し、又は測定対象分子を含む試料とマトリックス溶液を同時に載置し、該マトリックス溶液を乾燥させて、該起点から該起点に接する領域に結晶を析出させた後、該起点の周辺部分からシグナルを得ることを特徴とする質量分析法によって、上記課題を解決した。

Description

質量分析法
　本発明は質量分析法に関し、更に詳しくは、特定のプレートに特定の方法で調製された測定試料を質量分析装置に供する質量分析法に関するものである。
　「質量分析法（ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」（以下、「ＭＳ」と略記することがある）とは、測定対象分子を含む試料をイオン化し、測定対象分子由来のイオンを質量電荷比（質量／電荷（ｍ／ｚ））によって分離し検出することによって、その測定対象分子の化学構造に関する情報を得る方法である。
　ＭＳにおいて、試料のイオン化は、分析の可否や得られるスペクトルの質を左右する重要な過程であり、試料を効率よくイオンにするためにこれまで多くのイオン化法が開発されてきた。現在のところ、生体高分子のイオン化には、ソフトイオン化であるマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｌａｓｅｒ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（以下、「ＭＡＬＤＩ」と略記することがある）法やエレクトロスプレーイオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（以下、「ＥＳＩ」と略記することがある）法が主に用いられている。これらのイオン化法を用いた質量分析計は、ＮＭＲ等に比べて測定試料量が少なくても測定が可能であることから、バイオ分野でも広く用いられている。
　ＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いた特に例えば糖類等の分析は、ペプチドやタンパク質等に比べて困難であると考えられている。その根本的な理由のひとつに、糖類のイオン化の効率がペプチド等に比べて著しく悪く、高感度分析が困難であることが挙げられる。
　ＭＡＬＤＩ－ＭＳにおける試料のイオン化効率は、用いるマトリックスの種類、マトリックスへの添加剤、溶媒等の様々な要因により異なってくることが報告されており、感度良く測定するために特殊なマトリックスが開発されている（特許文献１、２、３、非特許文献１、２）。
　また、試料の性質そのものにも影響されるため、試料分子を誘導体化することでイオン化効率を向上させることも知られており、糖鎖の水酸基をメチル化する手法や、糖鎖の還元末端やシアル酸を誘導体化する手法が知られている（例えば、特許文献４、５）。
　また、試料分子を含有するマトリックスの結晶を微細で均一な状態で析出させることによって感度を向上させようとした技術も提案されている（例えば、特許文献５、６）。
　しかしながら、未だ、ＭＡＬＤＩのイオン化メカニズムは完全に解明されていないため、測定に用いるマトリックスの選択、試料の調製方法等は、経験的な知見に基づく場合が多い。一般に、マトリックスと試料は良く混ざり、混合結晶となる必要があると考えられている。しかし、固体結晶となるため不均一となり、更に、結晶が生成した場所すべてから測定対象分子由来のイオンが得られるわけでもなく、生成した結晶のごく一部分にレーザーを照射した場合のみ測定対象分子由来のイオンが得られる。
　この部分は、「スイートスポット（ｓｗｅｅｔ　ｓｐｏｔ）」と呼ばれ、ＭＡＬＤＩにおける測定の際は、まずスイートスポットを探し出すことが質の高いマススペクトルを得るために必要となるが、スイートスポットが結晶のどの部分であるかは経験によって探す他はない。また、スイートスポットを探し出し、そこにレーザー照射を行ったとしても、従来の試料の調製方法で調製したサンプルでは、イオン生成量が低く、結局は特殊なマトリックスを用いて測定するしかなく、また、たとえそうしても優れたスイートスポットが探し出せない場合があった。
　一方、分子量及び組成が同一の異性体が複数存在する化合物の場合、測定対象分子由来のイオンをプリカーサイオンとして選択し断片化し、更に生じたイオンをプリカーサイオンとして選択し断片化することを繰り返すＭＳｎ（２≦ｎ）解析が必須である。一般に、ＭＳ／ＭＳ（ＭＳ２）測定により得られるイオンのシグナル強度は前段階のイオンの約１／１０に減少する。従って、多段階ＭＳ（ＭＳｎ（２≦ｎ））測定を行うことによって化学構造に関する情報は極めて多くはなるが、検出感度は低下していくので、ますますイオン化効率の向上の必要性が増すこととなる。
　このように、極めて微量の測定対象分子を含む試料に対し、高感度で効率よく測定対象分子を質量分析する方法が強く望まれているが未だ十分な方法はなかった。特に、微量試料の感度向上のために、様々な濃縮を目的としたプレートが開発され市販されている。これらのいくつかを試したが、糖鎖や糖ペプチド解析には有用なものはなかった。すなわち、濃縮されることによってより、小さい面積のマトリックスの結晶が生成するので、ＭＳの感度は向上するが、構造同定に必須である２段階以降の多段階ＭＳ（ＭＳｎ（２≦ｎ））測定に十分な量の結晶が存在しなかった。
　更に、測定対象分子以外の夾雑分子も同時に濃縮されるので、必ずしも質の良いマススペクトルが得られる訳ではなかった。また、濃縮以外を目的として、測定対象分子を含む試料を載せる前のプレート表面の態様とプレート表面での測定試料の調製方法の両方に同時に着目し、優れたスイートスポットを得る方法は殆どなかった。
特開２００８－２６１８２４号公報 特開２００８－２６１８２５号公報 特開２００１－０１３１１０号公報 特開２００８－０５１７９０号公報 ＷＯ２００６／１０９４８５号公報 特開２００６－１８９３９１号公報
Snovida,S.I. et al.，J.Am.Soc. Mass spectrom.19 (2008) 1138-1146. Fukuyama,Y. et al.，Anal.Chem. 80 (2008) 2172-2179.
　本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、一般に用いられているＭＡＬＤＩ法用のマトリックスにも適用可能で、レーザー照射時の測定対象分子を含む試料のイオン生成量やイオン化効率を、従来法と比べて向上できる質量分析法を提供することにある。
　更に、具体的には、スイートスポットを現出させ易い、又はスイートスポットを多く若しくは広く現出させる測定試料をプレート上に調製し、多段階ＭＳ（ＭＳｎ（２≦ｎ））測定をも可能にする、それを用いた質量分析法を提供することにあり、それによって、測定対象分子を含む試料が極めて微量であっても、イオン化効率や測定の再現性を向上させることによって、信頼性の高い化学構造についての情報を得ることができる質量分析法を提供することにある。
　また、特に、糖、糖タンパク質、糖ペプチド等の微量な「生体由来の分子又は生体試料中の分子」に適用して、その機能解明や病態の解明に有用な情報を好適に得ることができる質量分析法を提供することにある。
　本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、測定プレート上に測定試料を調製するときに、プレート上に、まずマトリックス結晶の析出が始まる起点を形成し、次いで、該起点に接する領域に試料やマトリックス溶液を載置し、該マトリックス溶液を乾燥させることによって、該起点から結晶を析出させることができ、その起点の周辺部分が、イオン化効率に優れたスイートスポットとなることを見いだした。この時に、より小さい面積にマトリックス結晶を作成するよりも、むしろ、広がりをもって結晶化させた方が有用であることを発見した。
　また、測定対象分子を含む試料を載せた後に、上記起点に接する領域に誘導体化剤を載せて測定対象分子と反応させ、次いで、マトリックス溶液を載置すれば、更に、その起点の周辺部分が、イオン化効率に極めて優れたスイートスポットとなることを見いだして本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、プレート上にマトリックス結晶の析出が始まる起点を形成し、該起点に接する領域に、測定対象分子を含む試料を載せ、次いでマトリックス溶液を載置し、又は測定対象分子を含む試料とマトリックス溶液を同時に載置し、該マトリックス溶液を乾燥させて、該起点から該起点に接する領域に結晶を析出させた後、該起点の周辺部分からシグナルを得ることを特徴とする質量分析法を提供するものである。
　また、本発明は、上記の質量分析法において、測定対象分子を含む試料を載せた後、該起点に接する領域に誘導体化剤を載せて該測定対象分子と反応させ、次いでマトリックス溶液を載置する質量分析法を提供するものである。
　本発明によれば、前記問題点を解消し上記課題を解決し、ＭＡＬＤＩ法用に一般に用いられているマトリックスにも適用可能で、測定対象分子を含む試料のイオン生成量やイオン化効率を向上できる質量分析法を提供することができる。すなわち、優れたスイートスポットが存在する測定試料を用いた質量分析法を提供することができる。
　更に具体的には、試料を載せる前のプレートの態様と該プレート上での測定試料の調製方法を特定することによって、良好なスイートスポットを現出させ易い、又は良好なスイートスポットを多く若しくは広く現出させる質量分析法を提供することができる。その結果、通常の測定試料の調製方法では、分析可能な量未満になってしまうような微量試料しかない場合でも、質量分析が可能となり、また、量が十分あったときでも、より信頼性の高い化学構造情報を容易に確実に得ることができるようになる。
　また、本発明は微量な生体試料由来の分子や生体試料中の分子に適用できるので、例えば、糖、タンパク質（ペプチドを含む）、糖タンパク質（糖ペプチドを含む）、核酸、糖脂質等の分子の、化学構造解析はもちろん機能解明や病態の解明にも有用な情報をより好適に得ることができる。
実施例３において、測定対象分子を含むマトリックス結晶の析出の状態を示す光学顕微鏡写真（上の図）と、質量分析計のラスタースキャンによって、マトリックス結晶のどの位置から測定対象分子のシグナルが検出されるかについて調べた結果（下の図）である。 実施例１において、測定対象分子を含むマトリックス結晶の析出の状態を示す光学顕微鏡写真の図である。　　左：［Ａｕの内径］＝０．９ｍｍ　　右：[Ａｕの内径］＝０．６ｍｍ 実施例１において、質量分析計のラスタースキャンによって、マトリックス結晶のどの位置から測定対象分子のシグナルが検出されるかについて調べた結果である。　　左：［Ａｕの内径］＝０．９ｍｍ　　右：[Ａｕの内径］＝０．６ｍｍ 実施例２における、５ｆｍｏｌの試料での質量分析スペクトルを示す図である。 実施例２、比較例１及び参考例１の測定対象分子のシグナルと、参考例１の光学顕微鏡写真の図である。　　ａ：実施例２において、［Ａｕの内径］＝１．４ｍｍの正円のとき、どの位置から測定対象分子のシグナルが検出されるかを示す図である。　ｂ：参考例１においてマトリックス溶液をスプレーしたとき、どの位置から測定対象分子のシグナルが検出されるかを示す図である。　ｃ：比較例１において、（「起点に接する領域」にマトリックス溶液を載置して乾燥することをせず）、起点から「起点に接する領域」に結晶を析出させなかったとき、どの位置から測定対象分子のシグナルが検出されるかを示す図である。　ｄ：参考例１において、測定対象分子を含むマトリックス結晶の析出の状態を示す光学顕微鏡写真の図である。 比較例１における、１０ｆｍｏｌの試料での質量分析スペクトルを示す図である。 比較例１における、マトリックス結晶の析出の状態を示す光学顕微鏡写真の図である。
　以下、本発明について説明するが、本発明は以下の実施の具体的態様に限定されるものではなく、任意に変形して実施することができる。
　本発明は、以下の工程（１）ないし（４）を必須工程として有することを特徴とする質量分析法である。工程（２）では、下記（２ａ）又は（２ｂ）の何れか一方が行われる。なお、本発明は、下記のそれぞれの工程の間に別の工程を挿入してもよく、また、下記の１つの工程の中であっても、下記されていない操作を付加させることもできる。
（１）プレート上にマトリックス結晶の析出が始まる起点を形成し、
（２）該起点に接する領域に、
　（２ａ）測定対象分子を含む試料を載せ、次いでマトリックス溶液を載置し、又は
　（２ｂ）測定対象分子を含む試料とマトリックス溶液を同時に載置し、
（３）該マトリックス溶液を乾燥させて、該起点から該起点に接する領域に結晶を析出させた後、
（４）該起点の周辺部分からシグナルを得る。
＜工程（１）＞
　本発明の質量分析法では、プレート上に、まずマトリックス結晶の析出が始まる起点を形成することが必須である。
　上記した「マトリックス結晶の析出が始まる起点」としては、例えば、以下のものが挙げられる。
（ａ）基板上の、素材の同一、相違によらず、微小な、きず、溝、穴、突起物等の部分上の点
（ｂ）試薬溶液や溶媒等が乾いた跡の部分上の点
（ｃ）誘電率の異なる領域の区切り上の点
（ｄ）素材の同一、相違によらず、基板上の段差部分を「区切り」とし、その区切り上の点。この場合。上記「起点に接する領域」は、段差の高い方にあっても、低い方にあってもよい。
（ｅ）基板上の段差部分の高い部分が膜で作られていて、膜の有り無しの区切り上の点。この場合、上記「起点に接する領域」が、膜の方であっても膜でない方であってもよい。また、膜はプレートの中部分にあって、膜上が上記「起点に接する領域」であっても、膜の中心部分がくり抜いてあって、くり抜かれた膜の無い部分が上記「起点に接する領域」であってもよい。
　上記した「マトリックス結晶の析出が始まる起点」は、上記（ａ）及び（ｂ）のような部分上の点でもよいが、例えば、上記（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）のような「該マトリックス溶液を通過させない区切り」上の点であることも好ましい。該マトリックス溶液を自由に通過させてしまうと、結晶化の起点が少なくなり、スイートスポットが多く存在するマトリックス結晶が析出し難くなる場合がある。上記マトリックス溶液を通過させない区切りが、該マトリックス溶液が実質的に流れ込まない不侵入領域との区切りであることが好ましい。本発明では、「起点に接する領域」の外部であって、マトリックス溶液が実質的に流れ込まない領域を「不侵入領域」という。
　該「区切り」の形状は特に限定はなく、直線でも曲線でもよい。また、「区切り」が形作る形状も特に限定はないが、実質的に閉じた形状であることが好ましい。本発明においては、マトリックス溶液を乾燥させて、起点から「該起点に接する領域」に結晶を析出させた後、該起点の周辺部分からシグナルを得る。その際、「区切り」が実質的に閉じた形状であれば、その形状の内側、すなわち「該起点に接する領域」側に結晶を析出させる。「区切り」が実質的に閉じた形状であれば、その形状の外側が上記「不侵入領域」となる。
　上記「実質的に閉じた形状」は、正円、楕円、雲型図形等の角のない図形でも、多角形、星型図形、ギザギザの周囲を有する図形等の角のある図形でも、何れでもよい。角のない図形の方が、マトリックス溶液を乾燥させたときに、該区切り上の点を起点として良好な結晶が析出し、スイートスポットが多くなる点で好ましい。特に好ましくは正円である。
　上記区切り上の点が、マトリックス溶液を乾燥させた際にマトリックス結晶化の起点となる。すべてのマトリックス結晶が、上記区切り上の点を起点として析出する必要はないが、少なくとも、マトリックス結晶の幾つかは、かかる区切り上の点を起点として析出する。本発明は、かかる区切り上の点を起点として析出させたマトリックス結晶の中に、すなわち区切り上の点である起点の周辺部分に、優れたスイートスポットが多く存在することを見出してなされたものである。
　上記した「起点の周辺部分」とは、マトリックス結晶が成長し始めた根元、すなわち起点から３００μｍ以内の部分をいう。好ましくは起点から２００μｍ以内に、特に好ましくは起点から１００μｍ以内に、優れたスイートスポットが多く存在する。起点から離れ過ぎると、優れたスイートスポットが存在しなくなったり、スイートスポットの数が少なくなったりする場合がある。特に、濃縮効果を目的としたプレートは、区切りから離れたところにマトリックス結晶が成長することが多い。また、上記した区切りがある場合には、マトリックス溶液は該起点に接する領域に載置するので、該起点から載置した方とは逆方向になると、そもそもマトリックス溶液が載置されていない場合（流れ込んでいない場合）がある。
　本発明においては、プレート上に測定対象分子を含む試料を載せる前に、まずプレート上にマトリックス結晶の析出が始まる起点を形成させる。かかる起点は、上記特性を有していることが好ましい。特に限定はないが、かかる特性を有する起点の具体的種類、及びかかる特性を有する起点の具体的作り方に関して以下に説明する。
＜＜（ｃ）について＞＞
　本発明における「起点」が存在する「区切り」は、上記特性を有していれば特に限定はないが、具体的には例えば、誘電率が異なる区切りが挙げられる。更に、上記「区切り」の外側の上記不侵入領域の表面における誘電率が、上記該起点に接する領域の表面における誘電率より小さいことが特に好ましい。
　上記不侵入領域の表面における誘電率を、その内側の表面（該起点に接する領域の表面）における誘電率より小さくして、マトリックス溶液が該区切りを通過させないようにすることによって、該マトリックス溶液が乾燥していく際、該区切り上の点を起点として、その周辺（特に該区切りの内部の周辺）に、極めて優れたスイートスポットを有する結晶を析出させることができる。
　その点で、上記不侵入領域の表面における誘電率を、区切りの内側の領域における誘電率より小さくして、区切りの内側（区切り上の点である該起点に接する領域）に載置されたマトリックス溶液を、区切りの内側に閉じ込めることによって、区切り周辺で凹となるメニスカスはできず、該マトリックス溶液が乾燥していく際、該区切り上の点を起点として、極めて優れたスイートスポットを有する結晶を析出させることができる。
　このような区切りを有するプレートとして、該区切りで囲まれた領域の表面が金属であり、上記不侵入領域の表面が有機基で修飾されているものが特に好ましい。以下に、その作製方法について説明する。ただし、このような区切りを有するプレートの作製方法としては、以下の具体的作製方法に限定される訳ではない。
　プレート表面の有機基による修飾は、例えば、Ｍｉｃｒｏ・Ｃｏｎｔａｃｔ・Ｐｒｉｎｔｉｎｇ法（Ｈａｒｖａｒｄ大、Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ・Ｖｏｌ．１０．１４９８～１５１１（１９９４）に従って行うことができる。例えば、このようなポリジメチルシロキサン製の版材を準備し、この版材を、オクタデシルメルカプタンのエタノール希釈液に所定時間浸して風乾する。次いで、この版材を別途準備した金（Ａｕ）基板の表面に３秒間スタンプする。
　このようにすれば、版材の上に存在する上記化合物のメルカプト基が金表面と反応してＡｕ－Ｓ結合を生じ、金表面にドーナツ型の自己組織化単分子膜（ＳＡＭｓ）を形成する。最後に、金基板をエタノールで洗浄、乾燥し、表面が有機基で修飾されたプレートを得ることができる。
　金基板の表面を有機基で修飾する方法は、上記スタンプ法に限られず、スピンコート、ロールコート、スクリーン印刷等の各種塗布方法を採用することもできる。
　ここで使用する基板の金属材料としては、チオールが吸着可能な金、銀、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム又はこれらの合金が使用可能である。これらの中でも、大気中で表面酸化が進行しない、安定に作製可能な金が実用上好ましい。
　修飾に用いる上記有機基は、ブチル基、オクチル基、ドデシル基、ステアリル基等の任意の炭素数のアルキル基またはフッ素置換したアルキル基；フェニル基、チエニル基、ピロリル基、ピリジル基等の単環式のアリール基；ナフチル基、アンスリル基、ピレニル基、キノリル基、インドリル基、アクリリジニル基、ベンゾチアゾリル基等の縮合多環式のアリール基等が挙げられる。また、一種類の有機基のみでなく、複数種類の有機基をプレート表面に導入することもできる。また、上記アルキル基にはアリール基が置換基として結合していてもよく、上記アリール基にはアルキル基が置換基として結合していてもよい。また、ＣＯＯＨ、ＳＯ３Ｈ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、ＣＮ等の官能基が結合していてもよい。
　マトリックス溶液の溶媒が水溶液である場合には、上記起点に接する領域の表面は親水性で、上記不侵入領域の表面は疎水性であることが、マトリックス溶液を区切りの内側に閉じ込める等のために好ましい。すなわち、区切りで囲まれた領域の表面の誘電率が、不侵入領域の表面の誘電率より大きいことが、上記状態を作り出せる点で好ましい。
　具体的には、上記マトリックス溶液が水溶液であり、上記区切りで囲まれた領域（該起点に接する領域）の表面が金で修飾され、上記不侵入領域の表面がアルキル基又はアリール基で修飾されているプレートを用いることが特に好ましい。「金で修飾」とは、金めっきでもよいし、金属金自体であってもよい。また、「アルキル基又はアリール基」は、上記したような置換基が結合したものも含まれる。不侵入領域の表面の誘電率を調節できる点、マトリックス溶液を通過させないようにし易い点等から、特に好ましくは上記不侵入領域の表面がアルキル基で修飾されているプレートである。また、金表面を、区切りで囲まれた領域（起点に接する領域）としてそのまま残し、その外側をアルキル基又はアリール基（より好ましくはアルキル基）で修飾したプレートが特に好ましい。
＜＜（ｄ）について＞＞
　上記したマトリックス溶液を通過させない区切りが、高さの異なる区切りであることも特に好ましい。すなわち、上記区切りで囲まれた領域と上記不侵入領域の高さが異なり、どちらかが高くなっていて、その高さの違いが区切りを形成していることも好ましい。高さの値や「高さの違いを形成する土手又は壁の角度」は特に限定されない。
＜＜（ｅ）について＞＞
　上記マトリックス溶液を通過させない区切りが膜の有り無しであることも好ましい。かかる膜としては、特に限定はないが、プレートとは誘電率が異なる材質が好ましい。具体的には、シロキサン類、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、シリコーン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリレート、ポリメチルペンテン、１，３－シクロヘキサジエン系重合体等の膜が挙げられる。
　基板上の段差部分の高い部分が膜で作られていて、膜の有り無しが区切りであって、その区切り上の点が、マトリックス結晶の析出が始まる起点となる。この場合、結晶が析出する上記「起点に接する領域」が、膜の方であっても膜でない方であってもよい。また、膜はプレートの中部分にあって、膜の表面が、結晶が析出する「起点に接する領域」であっても、膜の中心部分がくり抜いてあって、膜の無い表面部分が、上記「起点に接する領域」であってもよい。
＜＜プレート＞＞
　本発明においては、試料やマトリックス等をプレート上に載せる前に、まずプレート上にマトリックス結晶の析出が始まる起点を形成することは必須であるが、該プレート表面の材質に関しては、該起点に接する領域（結晶を析出させる領域）でも、それ以外の領域でも、特に限定はない。例えば、金、銀、白金、パラジウム、ステンレス等の金属若しくは合金；カーボン等が挙げられ、これらの表面は、有機物、無機物等で、分子レベルで修飾されていてもよい。
　上記マトリックス結晶の析出が始まる起点は、０．０５ｍｍ～１０ｍｍの外周上の点であることが好ましい。言い換えると、区切りの長さが０．０５ｍｍ～１０ｍｍであり、その区切り上の点を起点とすることが好ましい。より好ましくは０．３ｍｍ～９ｍｍであり、特に好ましくは３ｍｍ～７ｍｍである。この範囲外だと、実施例にも示した通り、スイートスポットを有する良好な結晶が該起点の周辺部分に集中せず、結果として良好な測定試料が得られない場合がある。
＜工程（２）＞
　次に、本発明の質量分析法の測定試料の調製方法を以下に説明する。すなわち、まず、
（２）該起点に接する領域に、
　（２ａ）測定対象分子を含む試料を載せ、次いでマトリックス溶液を載置し、又は
　（２ｂ）測定対象分子を含む試料とマトリックス溶液を同時に載置する。
　上記工程（２）では、下記（２ａ）又は（２ｂ）の何れか一方が行われる。工程（２ａ）の中には、例えば、誘導体化剤を載せて該測定対象分子と反応させる、又はその後、更にこの誘導体化剤を洗浄する等、他の操作を挿入することもできる。
＜＜（２ａ）の方法＞＞
　上記（２ａ）の方法では、測定対象分子を含む試料を載せ、次いでマトリックス溶液を載置する。測定対象分子を含む試料は、単身で載せてもよいし溶液にして載せてもよい。溶液で載せた場合は、溶媒を蒸発させて除いてもよいし、溶媒を除かずにその上からマトリックス溶液を載置してもよい。測定対象分子を溶解する溶媒は、測定対象分子又は「測定対象分子を含む試料」を溶解するものならば特に限定はないが、水等が好ましい。
　測定対象分子を含む試料は、プレート上の少なくとも上記起点に接する領域に載せればよく、上記起点に接する領域の外に載せてもよい。
　（２ａ）の方法は、別の容器でマトリックス溶液と混合しその一部をプレートに滴下する必要がなく、測定対象分子を含む試料が極めて微量である場合に、その微量試料のほとんど全量を分析に供することができるため特に有用である。測定対象分子を含む試料が１００００ｆｍｏｌ（１０ｐｍｏｌ）以下の場合により有用であり、１０００ｆｍｏｌ（１ｐｍｏｌ）以下の場合により有用であり、１００ｆｍｏｌ（０．１ｐｍｏｌ）以下の場合に特に有用である。
　（２ａ）の方法における「測定対象分子を含む試料溶液中における測定対象分子の濃度」は特に限定はないが、１ａｍｏｌ／μＬ～１μｍｏｌ／μＬが好ましく、１００ａｍｏｌ／μＬ～１ｎｍｏｌ／μＬが特に好ましい。溶媒を蒸発させた後（乾燥後）に、プレート上に存在する測定対象分子を含有する層の厚さは特に限定はないが、５μｍ以下が好ましく、１μｍ以下が特に好ましい。かかる層の厚さが厚すぎると、マトリックス溶液を滴下した場合にマトリックス分子とうまく混和しない可能性があり、シグナルが低下する場合がある。
　（２ａ）の方法においては、測定対象分子を含む試料を載せた後に、マトリックスのみを溶媒に溶解した溶液を上記プレートに滴下して乾燥する。「測定対象分子を含む試料を載せた後に」の意味は、「測定対象分子を含む試料を載せた直後に」には限定されず、他の工程が挿入されていてもよい。例えば、後述するように、測定対象分子を含む試料を載せた後に、上記起点に接する領域に誘導体化剤を載せて該測定対象分子と反応させ、ある場合には、更に過剰の誘導体化剤を洗浄し、その後にマトリックスのみを溶媒に溶解した溶液を上記プレートに滴下して乾燥してもよい。
　（２ａ）の方法においては、マトリックスのみを溶媒に溶解した溶液を上記プレートに滴下して乾燥する。マトリックスとしては特に限定はなく、公知のものが使用可能であり、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（以下、「ＤＨＢＡ」と略記する）、１，５－ジアミノナフタレン、ｎｏｒｈａｒｍａｎ（９Ｈ－ピリド［３，４－ｂ］インドール）、ピレン誘導体等が挙げられる。
　上記溶媒は、用いるマトリックスを溶解するものであれば特に限定はないが、例えば、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、それらの混合物等が挙げられる。ここでの溶媒は、マトリックスのみならず、測定対象分子も少なくともその一部は溶解するものが好ましく、用いた溶媒で測定対象分子の大部分を溶解できるものであることが特に好ましい。測定対象分子とマトリックスの何れをも溶解できる溶媒を用いることによって、下層の測定対象分子がマトリックス分子と共に溶媒に溶解し、下層の測定対象分子が測定試料の表面に移動し、そこが優れたスイートスポットになる。
　本発明では、プレート状の上記起点に接する領域にマトリックス溶液を載置することが必須であるが、上記「区切り」で囲まれた領域のみにマトリックス溶液を載置することが好ましい。特に好ましい態様は、該起点に接する領域の一部に、該マトリックス溶液を滴下することによって、該マトリックス溶液が上記「区切り」で囲まれた領域全体に広がり、その結果、上記「区切り」で囲まれた領域のみにマトリックス溶液を載置されることである。こうすることによって、該マトリックス溶液を乾燥させたとき、該区切り上の点を起点として結晶が析出し易くなり、該起点の周辺部分がスイートスポットになる。
　上記「区切り」で囲まれた領域のみにマトリックス溶液を載置する場合のマトリックス溶液の体積は、上記「区切り」で囲まれた領域の面積に応じて調整することが好ましいが、例えば、該上記「区切り」で囲まれた領域が直径１．４ｍｍの正円であるならば、０．２μＬ～２０μＬが好ましく、０．３μＬ～２μＬがより好ましく、０．５μＬ～１μＬが特に好ましい。該上記「区切り」で囲まれた領域の面積が上記面積から増減した場合は、その面積に比例して、載置するマトリックス溶液の体積を増減することが好ましい。
　上記マトリックス溶液の濃度は特に限定はないが、０．１～１０００ｍｇ／ｍＬが好ましく、１～３００ｍｇ／ｍＬがより好ましく、１０～１００ｍｇ／ｍＬが特に好ましい。上記したように、載置するマトリックス溶液の体積は上記「区切り」で囲まれた領域の面積に応じて調整し、その上で、マトリックス溶液の濃度は上記「区切り」で囲まれた領域の周囲の長さ（すなわち、上記「区切り」の長さ）に比例して、増減させて決定することが好ましい。そうすることによって、起点の周辺部分に存在するマトリックスの絶対量を調節できる。
＜＜＜（２ａ）の方法中で誘導体化剤を使用した（２ａ’）の方法＞＞＞
　更に、本発明は、上記工程（２）で（２ａ）の方法を採用し、かつ、工程（２ａ）において、測定対象分子を含む試料を載せた後であり、マトリックス溶液を載置する前に、上記「区切り」で囲まれた領域に誘導体化剤を載せて該測定対象分子と反応させることが、測定対象分子を含む試料のイオン生成量やイオン化効率を向上できるために好ましい。
　すなわち、本発明においては、以下の工程を有する質量分析法が好ましい。
（１）プレート上にマトリックス結晶化の起点となる閉じた区切りを形成し、
（２）該区切りで囲まれた領域に、
　（２ａ’）測定対象分子を含む試料を載せた後、該区切りで囲まれた領域に誘導体化剤を載せて測定対象分子と反応させ、次いでマトリックス溶液を載置し、
（３）該マトリックス溶液を乾燥させて該区切り上の点を起点として結晶を析出させた後、
（４）該起点の周辺部分からシグナルを得ることを特徴とする質量分析法。
　また、上記工程（２ａ’）は、誘導体化剤を載せて測定対象分子と反応させた後であってマトリックス溶液を載置する前に、誘導体化剤を洗浄する工程を含んでもよい。
　誘導体化剤を、予め測定対象分子と反応させてからプレートに供給すると、試料のロスに繋がる場合がある。従って、糖、糖タンパク質、糖ペプチド等の微量な「生体由来の分子又は生体試料中の分子」に質量分析法を適用する場合、（２ａ’）の方法、すなわち、測定対象分子を含む試料を載せた後であり、マトリックス溶液を載置する前に、上記区切りで囲まれた領域に誘導体化剤を載せて測定対象分子と反応させることが好ましい。
　誘導体化剤は、誘導体化された測定対象分子すなわち質量分析に供される分子と反応して、イオン化効率を高めるものであれば特に限定はない。レーザー脱離イオン化法においてイオン化効率を高めるものであっても、エレクトロスプレーイオン化法においてイオン化効率を高めるものであってもよい。
　かかる誘導体化剤の化学構造は上記効果を奏するものであれば特に限定はないが、その分子内にナフタレン、アントラセン、ピレン等の縮合多環を有する縮合多環化合物等が上記効果を好適に奏するので特に好ましい。ここで「縮合多環化合物」とは、窒素、硫黄又は酸素分子を含む複素環を一部に含んでいてもよい縮合多環部分と、測定対象分子とを結合することが可能である反応性官能基と、要すれば、該縮合多環部分と該反応性官能基とを連結するスペーサ部分とを有する化合物をいう。
　誘導体化剤は、測定対象分子と反応することによって、誘導体化された分子すなわち質量分析に供される分子の、イオン化切断位置を制御できるようにするものであることが特に好ましい。
　誘導体化剤は、アミノ基、ヒドラジド基、ジアゾメチル基、スクシニミジルエステル基、塩化スルホニル基、ヨード基（－Ｉ）等の反応性官能基を有することが好ましい。特に好ましい誘導体化剤としては、具体的には、ナフタレン環、アントラセン環、ピレン環等の縮合多環に、上記基が直接若しくは他の基（スペーサ部分）を介して結合した縮合多環誘導体化合物；ヨウ化メチル；ジアゾメタン；トリメチルシリルジアゾメタン等が挙げられる。
　このうち、誘導体化された分子すなわち質量分析に供される分子のイオン化効率を高めたり、イオン化切断位置を制御できるようにしたりする点等で、ピレン環化合物が特に好ましい。ここで「ピレン環化合物」とは、ピレン環と、「測定対象分子」に結合することが可能である反応性官能基と、要すれば該ピレン環と該反応性官能基とを連結するスペーサ部分とを有する化合物をいう。
　具体的には、１－ピレンブタン酸ヒドラジド（1-pyrenebutanoic acid, hydrazide）（以下、「ＰＢＨ」と略記する）、１－ピレン酢酸ヒドラジド（1-pyreneacetic acid, hydrazide）、１－ピレンプロピオン酸ヒドラジド（1-pyrenepropionic acid, hydrazide）、１－ピレン酢酸スクシニミジルエステル（1-pyreneacetic acid, succinimidyl ester）、１－ピレンプロピオン酸スクシニミジルエステル（1-pyrenepropionic acid, succinimidyl ester）、１－ピレンブタン酸スクシニミジルエステル（1-pyrenebutanoic acid, succinimidyl ester）、Ｎ－（１－ピレンブタノイル）システイン酸スクシニミジルエステル（N-(1-pyrenebutanoyl)cysteic acid, succinimidyl ester）、Ｎ－（１－ピレン）ヨードアセトアミド（N-(1-pyrene) iodoacetamide）、Ｎ－（１－ピレン）ヨードマレイミド（N-(1-pyrene) maleimide）、Ｎ－（１－ピレンメチル）ヨードアセトアミド（N-(1-pyrenemethyl) iodoacetamide）、１－ピレンメチルヨードアセテート（1-pyrenemethyl iodoacetate）、アミノピレン（aminopyrene）、１－ピレンメチルアミン（1-pyrenemethyl amine）、１－ピレンプロピルアミン（3-(1-pyrenyl)propylamine）、１－ピレンブチルアミン（4-(1-pyrenyl)butylamine）、１－ピレンスルホン酸クロリド（1-pyrenesμＬfonyl　chloride）、１－ピレニルジアゾメタン（1-pyrenyldiazomethane）（以下、「ＰＤＡＭ」と略記する）、１－ピレンカルバルデヒド　ヒドラゾン（1-pyrenecarbaldehyde hydrazone）、１－ピレニルチオシアネート（1-pyrenylthiocyanate）、１－ピレニルイソチオシアネート（1-pyrenylisothiocyanate）等が好ましいものとして挙げられる。このうち最も好ましくはＰＢＨ又はＰＤＡＭである。
　誘導体化剤としては、上記具体的化合物において、ピレン環を、ナフタレン環又はアントラセン環に代えたものも好ましいものとして挙げられる。また、ヨウ化メチル、ジアゾメタン又はトリメチルシリルジアゾメタンも好ましい。
　好ましい「測定対象分子と誘導体化剤との組み合わせ」としては、測定対象分子がアルデヒド基、還元性水酸基等を含有する糖鎖を有する分子であり、誘導体化剤がアミノ基又はヒドラジド基等を有するものである場合が挙げられる。また、好ましい組み合わせとしては、測定対象分子が、カルボキシル基、アミノ基又はメルカプト基を有するタンパク質若しくは糖タンパク質であり、誘導体化剤が、アミノ基、ヒドラジド基又はジアゾメチル基等を有するものである場合が挙げられ、更に、測定対象分子が、カルボキシル基を有するタンパク質若しくは糖タンパク質であり、誘導体化剤がヨウ化メチル又はトリメチルシリルジアゾメタンである場合が挙げられる。これらの組み合わせは、測定対象分子及び誘導体化剤を、容易にプレート上で反応させることができる点、イオン化を阻害しない点、反応が選択的である点、一般に微量での分析の必要性が高いので、前記効果を奏し易い点等から好ましい。
　測定対象分子と誘導体化剤の反応温度は特に限定はないが、４０～１００℃で反応させることが好ましく、６０～９０℃で反応させることが特に好ましい。室温より高い温度で反応させることによって、反応速度が増加するだけでなく、溶媒が乾く速度を高めることによって、区切りに接して反応生成物が残るようになるからである。この反応混合物の残存が区切り上に重なることによって、区切り上の点からマトリックスの結晶を析出させ、区切り上の点を起点とすることがより確実になる。
＜＜（２ｂ）の方法＞＞
　工程（２）では、上記した（２ａ）の方法に代えて、（２ｂ）測定対象分子を含む試料とマトリックス溶液を同時に載置してもよい。（２ｂ）の方法では、「Ｄｒｉｅｄ　Ｄｒｏｐｌｅｔ法」として知られている方法も可能である。
　（２ｂ）の方法における溶媒としては特に限定はないが、例えば、水、アセトニトリル、メタノール、エタノール、それらの混合溶媒等が挙げられる。
　（２ｂ）の方法における溶液の、測定対象分子の濃度及びマトリックスの濃度は特に限定はなく、それぞれ（２ａ）で上記した濃度で同時に含む溶液を用いればよい。
＜工程（３）＞
　本発明においては、該マトリックス溶液を乾燥させて、該起点から該起点に接する領域に結晶を析出させる。工程（２）の後、（３）該マトリックス溶液を乾燥させて、上記区切り上の点を起点として結晶を析出させることが好ましい。乾燥方法は特に限定されないが、加温する、冷却する、風を送る、減圧する等によって乾燥を促進することが効果的な場合がある。この時に、界面張力を変化させるような分子が微量存在するとよい。例えば、区切りに存在するピレン標識されたペプチドや、洗浄後に微量に残っているピレン誘導体化剤等がよい。また、垂直に立てて乾燥させて、上記区切り上の点を起点として結晶を析出させることも、下方が結晶の起点を規定するので好ましい（実施例３参照）。
　図２に特に好ましい態様の一例の光学顕微鏡写真を示すが、該区切り（図２の場合は正円）を起点として、結晶が上記区切り（正円）で囲まれた領域内に、特に該正円のほぼ中心に向かって成長しており、該区切り上の点を起点として結晶が析出していることが分かる。プレート上で、測定対象分子とマトリックスを含む溶液ができるが、その溶液が乾燥し始めて最初に析出しだした結晶表面に、意外にもスイートスポットが多い。本発明は、マトリックス結晶が析出し始めた場所に特異的にスイートスポットが多いことを見出してなされたものである。
＜工程（４）＞
　本発明においては、上記起点の周辺部分からシグナルを得る。上記工程（３）の後、（４）区切り上の点である起点の周辺部分からシグナルを得ることが好ましい。図１、図３に示したように、区切り上の点である起点の周辺部分に特異的にスイートスポットが多い。このことは、マトリックス結晶の析出が始まる起点が、０．０５ｍｍ～１０ｍｍの外周上の点であるとき顕著であり、０．３ｍｍ～９ｍｍの外周上の点であるときより顕著であり、３ｍｍ～７ｍｍの外周上の点であるとき特に顕著である。また、直径０．７ｍｍ～２ｍｍの円周上の点であるである場合に更に顕著である（図３の「０．９ｍｍ」参照）。
＜測定対象分子＞
　「測定対象分子」は特に限定はないが、生体由来の分子又は生体試料中の分子であることが好ましく、具体的には、糖、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、核酸、糖脂質等であることが、本発明の効果をより発揮できるので好ましい。「測定対象分子」としては、天然物から調製されるもの、天然物を化学的又は酵素学的に一部改変して調製されるものの他、化学的又は酵素学的に調製されるものも好ましい。また、生体に含まれる分子の部分構造を有するものや生体に含まれる分子を模倣して作製されたものも好ましい。また、質量分析法に用いるプレート上に載せる試料、すなわち、測定対象分子を含む試料としては、「測定対象分子」そのものだけでもよいし、「測定対象分子」を含むもの、例えば、生体の組織、細胞、体液や分泌物（例えば、血液、血清、尿、精液、唾液、涙液、汗、糞便等）等でもよい。すなわち、直接生体試料を用いてもよい。また、試料をプレート上に載せ、酵素処理等を行なって、測定対象分子を調製してもよい。
　上記した分子は、分析に供される試料が少量である場合が多く、また特に、糖、糖タンパク質、糖脂質等の複合糖質等又はそれらから化学的若しくは酵素学的に遊離させて得たものは、分子量や組成が同一の異性体が複数存在するので、本発明の質量分析法は、それら分子の化学構造解析に対して特に上記効果を奏するので好ましい。
　前記した調製方法で調製された測定試料は前記した本発明の効果を奏する。すなわち、かかる測定試料を質量分析法に供すれば、測定対象分子を含む試料のイオン生成量やイオン化効率を向上させることができる。すなわち、かかる測定試料には優れたスイートスポットが存在するので、質量分析法における感度、精度、再現性等が向上する。
＜質量分析法＞
　イオン化に用いられるレーザーとしては、窒素レーザー（３３７ｎｍ）、ＹＡＧレーザー３倍波（３５５ｎｍ）、ＮｄＹＡＧレーザー（２５６ｎｍ）、炭酸ガスレーザー（２９４０ｎｍ）等が挙げられるが、窒素レーザーが好ましい。イオンの分離検出方法は特に限定はなく、二重収束法、四重極集束法（四重極（Ｑ）フィルター法）、タンデム型四重極（ＱＱ）法、イオントラップ法、飛行時間（ＴＯＦ）法等を用いて、イオン化した分子を質量／電荷比（ｍ／ｚ）に従って分離し検出する。好ましくは、ＱＩＴ－ＴＯＦである。
　糖、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、核酸、糖脂質等の分子は、分子量や組成が同じ異性体を多く含むので、イオンの生成効率を向上させ、分子のフラグメント化をｎ回繰り返す方法（以下、「ＭＳｎ法」と略記することがある）が好ましい。本発明は、測定対象分子を含む試料が極めて微量でも測定が可能であるので、前記した測定試料に対しフラグメント化をｎ回繰り返すＭＳｎ法（２≦ｎ）に適用することが特に好ましい。ＭＳｎ法により、選択した標識を含むイオンを解析することで、分子中の結合位置等を決定できる。
　以下に、実施例及び比較例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限りこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
プレートの作製
　Ｍｉｃｒｏ・Ｃｏｎｔａｃｔ・Ｐｒｉｎｔｉｎｇ法に従って、プレート表面をオクタデシル基で修飾を行なった。具体的には、正円状にくりぬいたポリジメチルシロキサン製の版材を準備し、オクタデシルメルカプタンのエタノール希釈液（２ｍＭ）に１０分間浸して風乾した。次いで、別途準備した金（Ａｕ）基板に３秒間スタンプした。その後、金（Ａｕ）基板をエタノールで洗浄し、乾燥した。処理されずに金が残った部分が、それぞれ０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１．０ｍｍの円形のもの５種を作製した。
　以下、プレート上の円の内部（処理されずに金が残った部分）を「Ａｕ」と略記し、プレート上の円の外部であり、処理された部分を「Ｃ１８」と略記する。「Ａｕ」の円周が、本発明における「区切り」である。
　また、基板が金以外のシリコン（ケイ素）（以下「Ｓｉ」と略記する）等の場合も、プレート上の円の外部であり、上記のように処理された部分を「Ｃ１８」と略記する。
　上記のように事前にマトリックス結晶の析出が始まる区切りを形成したプレート上に、測定対象分子として糖ペプチド（５ｆｍｏｌ～５ｐｍｏｌ）を含有する溶液０．５～２０μＬを載せ、乾燥させた。その上に、誘導体化剤としてＰＤＡＭ５００ｐｍｏｌ含有ＤＭＳＯ溶液０．２５μＬを滴下し、約５分にわたって８０℃に加熱して乾燥させることにより、ピレン誘導体化を行った。
　マトリックス溶液は、Ａｕの内径に応じて以下に示す濃度および液量のＤＨＢＡ水溶液を滴下し乾燥させた。
　Ａｕの内径：外周の長さ：マトリックス溶液の濃度，マトリックス溶液の滴下量
　０．６ｍｍ：１．９ｍｍ：　１５ｍｇ／ｍＬ，　０．２５μＬ
　０．７ｍｍ：２．２ｍｍ：　１８ｍｇ／ｍＬ，　０．２５μＬ
　０．８ｍｍ：２．５ｍｍ：　２０ｍｇ／ｍＬ，　０．２５μＬ
　０．９ｍｍ：２．８ｍｍ：　１８ｍｇ／ｍＬ，　０．３０μＬ
　１．０ｍｍ：３．１ｍｍ：　１５ｍｇ／ｍＬ，　０．４０μＬ
　マトリックス溶液の滴下量は、該区切りで囲まれた領域（Ａｕ）の面積に応じて、それぞれ好ましい範囲に調整した。また、マトリックス溶液の濃度は、滴下量を決定した上で、それを勘案して、更に上記区切りで囲まれた領域の周囲の長さ（すなわち、閉じた区切りの長さ、外周の長さ）に比例して増減させた。
　０．６ｍｍ～１．０ｍｍの何れの場合でも、外側のＣ１８部分の表面には、糖ペプチドとマトリックスの結晶物は何れも形成されず、Ｃ１８とＡｕの区切り上の起点の周辺部分に結晶物が生成した。すなわち、正円状に結晶物が生成した。０．６ｍｍおよび０．９ｍｍ径を用いた時の試料・マトリックス結晶物の顕微鏡像を図２に示す。
　糖ペプチドとマトリックスの結晶物を質量分析計（ＡＸＩＭＡ－ＱＩＴ、島津製作所社製）のラスタースキャンによって、ポジティブおよびネガティブイオンを測定した。
　何れの内径のものでも、通常のステンレスプレートを用いた場合（以下の比較例参照）に比較して、５～８倍シグナル強度が上昇した。０．６ｍｍ径では面積が小さいため、より濃縮されて若干のシグナル強度の向上が認められたが、測定点が限られるので、同一試料で測定を繰り返すＭＳｎ（ｎは２以上の整数）測定には不利であった。
　試料・マトリックス結晶物のどの位置からシグナルが検出されるかについて調べた結果、図３に示したように、０．６ｍｍでも、０．９ｍｍでも良好なシグナルが検出された。ただし、０．６ｍｍ径の場合では、特に結晶物の縁（区切りの周辺部分）にシグナルが集中しているわけではなかったが、０．９ｍｍ径では結晶物の外縁にそって、極めて良好なシグナル（スイートスポット）が多数検出された。このように、糖ペプチドのシグナルが結晶物の外縁（区切り上の起点の周辺部分）に検出されるのは、０．７ｍｍ径以上であった。
　マトリックス溶液が乾く様子を顕微鏡で観察すると、溶液はＣ１８の内縁である円周いっぱいに広がった液摘となった後は、その直径を保ったまま蒸発し、その界面から最も早く結晶物が析出し始めた。このようにして最初に結晶物が析出したところは糖ペプチドのシグナルが強かった。
実施例２
　実施例１と同様にして、内径１．４ｍｍ（外周４．４ｍｍ）となるように、ＡｕおよびＣ１８を配したプレートを作製した。実施例１と同様にして、糖ペプチドを滴下、乾燥し、ピレン誘導体化した。マトリックス溶液は、２０ｍｇ／ｍＬのＤＨＢＡ水溶液０．５μＬを用いた。実施例１と同様にＭＳ測定を行った。
　図４にそのマススペクトルを示したが、従来のステンレスプレートで測定した場合（以下の比較例１参照）に比較して検出感度が極めて向上し、５ｆｍｏｌの試料でも良好なスペクトルを示し、ＭＳｎ（ｎは２以上の整数）測定が可能であった。
　顕微鏡で観察したところ、結晶物は１．４ｍｍ径の正円状に析出しており、かつ図５ａに示したように、シグナルが強く観察されるところはその正円の内部であり正円の縁にそって存在した。この結果は再現性がよく、Ｃ１８とＡｕの界面が結晶物の析出の起点を決定しており、結晶物の析出し始める界面すなわちＡｕの円の縁で、糖ペプチドのシグナルが強かった。
実施例３
　実施例２と同様にして、糖ペプチドを滴下、乾燥し、ピレン誘導体化した。マトリックス溶液１０ｍｇ／ｍＬのＤＨＢＡ水溶液０．７５μＬを載せた後、プレートを垂直に立てて室温で乾燥させ結晶物を析出させた。
　実施例１と同様にＭＳ測定を行った。その結果、図１に示したように、区切りの下方から（矢印の部分）結晶物が析出し始めたが、その部分は糖ペプチドのシグナルも強いことが分かった。
実施例４
　実施例２と同様にして、内径１．４ｍｍ（外周４．４ｍｍ）となるように、ＡｕおよびＣ１８を配したプレート、並びに、ＳｉおよびＣ１８を配したプレートを作製した。実施例２と同様にして、糖ペプチドを滴下、乾燥し、ピレン誘導体化した。
　マトリックス溶液を滴下する前に、余剰の誘導体化剤（ＰＤＡＭ）を除くため、プレートを、誘導体化剤を溶解する溶媒に浸漬した。具体的には、キシレン（ＳＩＧＭＡ社製）を満たしたビーカーに２秒間浸し引き上げ、これを３回繰り返した。また、キシレンに代えてトルエン（ＳＩＧＭＡ社製）でも同様に行った。
　余剰のＰＤＡＭが除去されたプレートは、その後十分に乾燥させた。マトリックス溶液は、１０ｍｇ／ｍＬのＤＨＢＡ水溶液０．７５μＬを用いた。
　実施例１と同様にＭＳ測定を行った。その結果、ＡｕでもＳｉでも、また、キシレンでもトルエンでも、結晶物は１．４ｍｍ径の正円状に析出しており、実施例２と同様に、シグナルが強く観察されるところはその正円の内部であり正円の縁にそって存在した。更に、これまでは、低ｍ／ｚ領域に誘導体化剤に由来するクラスターピークが強く検出されていたが、適度なキシレンまたはトルエン洗浄により、これらの誘導体化剤が効率良く取り除かれたため、ノイズの少ないマススペクトルを取得することができた。
比較例１
　磨いて濃縮効果が期待されたステンレスプレートを用いて、実施例１と同様な操作であるが、ただし、４０℃に加熱して約３０分間乾燥させることにより、ピレン誘導体化を行い、ＭＳ測定を行った。
　図７に示したように、２ｍｍ径の外側に溝があるが、マトリックス結晶はそこまで広がらず平らな面の中で生成した。区切りはあるが、区切りに接しないでマトリックス溶液が乾いた。その結果、糖ペプチド５ｆｍｏｌでは検出することは難しく、図６に示したように１０ｆｍｏｌでかろうじて検出した。しかし、この量ではＭＳ２測定はきわめて困難である。
　この場合、多くは結晶物の外周は歪な円形であり正円になることはなかった。この結晶物では、図５ｃに示したように、シグナルが検出される部位が外周に多いが内部にも認められた。このように、通常の起点も、起点の存在する通常の区切りもないプレートでは、シグナルが強く検出されるところが特定されず、測定に時間がかかる、感度が低い等の問題があった。
参考例１
　実施例２と同様に、１．４ｍｍとなるように、ＡｕとＣ１８を配したプレートを用いて、糖ペプチドを滴下、乾燥し、ピレン誘導体化した。
　マトリックス溶液として５０ｍｇ／ｍＬのＤＨＢＡ、７０％アセトニトリル溶液を、エアースプレーを用いて噴霧し乾燥させた。図５ｄに示したように、大きな結晶物とならずにドット状に析出した。この結晶物をＭＳ測定すると、図５ｂに示したように、外周に偏在せずに１．４ｍｍ径の円内に分散してシグナルが検出された。このことは、ピレン誘導体化後の糖ペプチドは、１．４ｍｍ径の円内に均一に分散していることが明らかになった。
　上記の結果から、マトリックス溶液を載置前に、測定対象分子が区切り上の起点の周辺部分に局在化しているということではなく、実施例１、２の場合は、このＡｕ内に均一に分散している糖ペプチドをマトリックス溶液が溶解し、Ｃ１８とＡｕの区切り上の起点から、糖ペプチドとマトリックスの結晶物として析出し、その部分から良好なシグナルが検出されたと考えられる。
　本発明の質量分析法は、イオン化効率の良いスイートスポットを多く含む測定試料を提供でき、それによって信頼性の高い化学構造についての情報を得ることができるので、微量な生体試料由来の分子や生体試料中の分子の化学構造解析はもちろん、機能解明や病態の解明の分野にも広く利用されるものである。
　本願は、２００９年９月２日に出願した日本の特許出願である特願２００９－２０２１９７に基づくものであり、その出願の全ての内容はここに引用し、本願発明の明細書の開示として取り込まれるものである。

Claims (6)

  1. 　プレート上にマトリックス結晶の析出が始まる起点を形成し、該起点に接する領域に、測定対象分子を含む試料を載せ、次いでマトリックス溶液を載置し、又は測定対象分子を含む試料とマトリックス溶液を同時に載置し、該マトリックス溶液を乾燥させて、該起点から該起点に接する領域に結晶を析出させた後、該起点の周辺部分からシグナルを得ることを特徴とする質量分析法。
  2. 　請求項１に記載の質量分析法において、測定対象分子を含む試料を載せた後、誘導体化剤を載せて該測定対象分子と反応させ、次いでマトリックス溶液を載置する請求項１に記載の質量分析法。
  3. 　上記マトリックス結晶の析出が始まる起点が、該マトリックス溶液を通過させない区切り上の点である請求項１又は請求項２に記載の質量分析法。
  4. 　上記マトリックス溶液を通過させない区切りが、該マトリックス溶液が実質的に流れ込まない不侵入領域との区切りである請求項３に記載の質量分析法。
  5. 　上記不侵入領域の表面の誘電率が、上記起点に接する領域の表面の誘電率と異なる請求項４に記載の質量分析法。
  6. 　上記マトリックス溶液を通過させない区切りが、高さの異なる区切りである請求項３又は請求項４に記載の質量分析法。
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